A colibacilose é uma enfermidade importante na avicultura por causar prejuízos econômicos e danos à carcaça. Escherichia coli é um micro-organismo oportunista e a complexidade da infecção se deve a diversidade de sorotipos, variados fatores de virulência e baixa capacidade de estimular a imunidade cruzada. Assim, a compreensão dos mecanismos de virulência que ocorrem no hospedeiro, pode resultar no desenvolvimento de métodos diagnósticos e profiláticos. Neste estudo, 85 pintinhos foram divididos em quatro grupos, sendo três infectados com diferentes sorogrupos de Escherichia coli (O2, O78, O119) e um vacinado com Poulvac® E.coli (Pfizer®). As lesões sugestivas de colibacilose foram avaliadas e qualificadas aos 35 dias de idade, e em seguida realizada a colheita de sangue para a obtenção do soro. Foram obtidas proteínas in vitro dos sorogrupos de E. coli utilizados na infecção experimental e da vacina (mutante de Escherichia coli O78). Estas foram separadas por eletroforese unidimensional em gel de acrilamida utilizando dodecil sulfato de sódio (SDS) e foram submetidas a reação de western blot com a mistura de soros de cada grupo estudado e também com o pool de soros de aves livres de patógenos específicos (SPF), usadas como controle negativo. O perfil eletroforético revelou a presença de várias proteínas dos diferentes sorogrupos de E. coli quando cultivadas no meio casaminoácido e levedura. Houve diferenças entre os sorotipos, mas também proteínas comuns. Foi possível estabelecer uma relação entre virulência, quantidades de proteínas específicas e taxa de reisolamento. / The colibacillosis is a serious disease in poultry industry to cause economic losses and damage to carcass. Escherichia coli is an opportunistic microorganism and the complexity of infection is due to the diversity of serotypes, several virulence factors and low ability to stimulate cross-immunity. Thus understanding of virulence mechanisms that occur in the host, may result in development of diagnostic and prophylactic methods. In this study, 85 chicks were divided into four groups being infected with three different serogroups of E. coli (O2, O78, O119) and vaccinated with Poulvac E. coli ® (Pfizer ®). The lesions suggestive of colibacillosis were evaluated at 35 days of age, and then the blood sample are collected to obtain the serum. Proteins were obtained in vitro from serogroups of E. coli used in experimental infection and vaccine (mutant of Escherichia coli O78). These were separated by one-dimensional electrophoresis on acrylamide gels using sodium dodecyl sulfate (SDS) and then reacted by western blot with the pool of sera from each group and also with the pool of sera from specific pathogen free poultry used as negative control. The electrophoretic pattern showed the presence of many proteins of different serogroups of E. coli when grown in the broth casaminoacid and yeast. There were differences among serotypes, but also common proteins. It was possible to establish a relationship between virulence and reisolation rate.

Orientador: Elizabeth Moreira dos Santos Schmidt / Banca: Ivan Roque de Barros Filho / Banca: Regina Kiomi Takahira / Resumo: Neste estudo foi avaliado o proteinograma sérico de leitões neonatos pela eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) em amostras de soro obtidas ao nascimento, antes da ingestão do colostro, e 48 horas após o nascimento. Foi também avaliada a eficácia da imunização passiva, após a ingestão do colostro, pela determinação da atividade sérica da enzima gama glutamiltransferase (GGT) no soro desses animais. Amostras de 1,0mL de sangue foram coletadas por venopunção da jugular de 40 leitões, nestes dois momentos. Houve aumento significativo (p<0,05) para as concentrações das proteínas séricas totais após a ingestão do colostro devido o aumento significativo (p<0,05) das concentrações séricas de IgG de cadeia pesada e leve nos leitões após a ingestão do colostro. As concentrações séricas da enzima GGT apresentaram diminuição significativa (p<0,05) após a ingestão do colostro. Foi observada a presença da fração ceruloplasmina no traçado eletroforétrico, antes e após a ingestão do colostro. Além disso, uma proteína de 23kDa, não-identificada nominalmente, foi observada no traçado eletroforético dos leitões e apresentou aumento significativo (p<0,05) após a ingestão do colostro / Abstract: Não disponível / Mestre

O ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), substância utilizada como autoindutor nos sistemas de Quorum Sensing da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, foi utilizado como um modelo de estudos para a análise de moléculas secretadas por populações celulares utilizando técnicas eletroanalíticas. Cultivos celulares provenientes de três linhagens diferentes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri foram utilizados para os estudos. Uma linhagem selvagem (WT), que produzia DSF em quantidades naturalmente observadas, e duas linhagens geneticamente modificadas. Em uma linhagem (&#916;C) a modificação genética resultava em elevada produção de DSF, para a segunda (&#916;F) o resultado era a anulação da produção do autoindutor. As principais técnicas analíticas utilizadas foram: voltametria cíclica, eletroforese capilar e cromatografia líquida (com detecção UV-Vis e acoplada a espectrometria de massas), sendo a última para efeitos de comparação. Procedimentos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos foram realizados como etapas de pré-tratamento de amostras, visando diminuir a quantidade de interferentes e realizar uma pré-concentração do analito. Três metodologias principais foram adotadas. Uma primeira voltada para a diferenciação dos cultivos celulares, analisando-se ou os sobrenadantes provenientes dos cultivos ou os extratos resultantes dos pré-tratamentos desses sobrenadantes, tendo como principal foco a identificação de um sinal diferencial entre os cultivos que correspondesse às quantidades de DSF, ou seja, inexistente para a linhagem &#916;F, de alta intensidade para linhagem &#916;C e de intensidade intermediária para a linhagem WT. A segunda metodologia foi baseada no uso de uma molécula modelo para realizar experimentos e obter dados como parâmetros físico-químicos, o ácido láurico (ácido dodecanóico) foi escolhido por sua semelhança estrutural e facilidade de obtenção, curvas de calibração e experimentos de separação de moléculas com estrutura semelhante foram realizados com a técnica de eletroforese capilar. Uma terceira metodologia foi desenvolvida utilizando o padrão do ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), curvas de calibração foram obtidas com o padrão isolado apresentando ótimas linearidades, tanto com a técnica de eletroforese capilar quanto com cromatografia líquida com detecção UV-Vis, experimentos de adição de padrão às amostras também foram executados. Os experimentos realizados com as amostras não apresentaram os resultados esperados, os problemas foram associados principalmente à quantidade de interferentes na amostra e a baixa concentração do analito nos cultivos, sendo que os métodos de extração realizados não foram suficientes para solucioná-los. O insucesso da técnica de voltametria cíclica foi associado ao envenenamento do eletrodo, devido à alta quantidade de compostos orgânicos presentes na amostra, e dúvidas relacionadas à eletroatividade do DSF. As dificuldades encontradas com a técnica de eletroforese capilar foram associadas à alta força iônica da amostra, presença de interferentes e baixa concentração do analito nos cultivos. Mesmo os experimentos realizados com cromatografia líquida acoplada a detecção com espectrometria de massas não atenderam às expectativas, dificultando a elucidação dos problemas encontrados até então e impossibilitando o desenvolvimento de uma metodologia que atendesse aos objetivos propostos. / Cis-11-methyl-2-dodecenoic acid, also known as DSF (autoinducer of the Quorum Sensing system used by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri) was explored as a study model for the cell secreted molecules analysis by electroanalytical techniques. Cell cultures from three different cell lines of the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri were used for this study. A wild type (WT), which produced DSF in naturally observed quantities and two genetically modified ones. One of the lines (&#916;C) had a genetic modification that resulted in an elevated production of DSF, and the other (&#916;F) had a modification that stopped DSF production. Main analytical techniques used were: cyclic voltammetry, capillary electrophoresis and liquid chromatography (with UV-Vis detection and coupled with mass spectrometry), this last one was used with comparison purposes. Liquid-liquid extractions with organic solvents were realized as sample pre-treatment steps aiming the reduction of interfering species and analyte pre-concentration. Three main methodologies were adopted. One based in the differentiation of cell cultures analyzing or the cell culture supernatants or the resulting extracts from the pre-treatment steps. The main focus was the identification of a differential signal between the cultures that corresponded to the DSF quantities, in other words, null for the &#916;F line, high intensity for the &#916;C line and a an intermediary intensity for the WT line. The second methodology was based in experiments with a model molecule to obtain some data such as physical-chemistry parameters. Lauric acid (dodecanoic acid) was chosen for its structural similarity and easily acquisition. Calibration curves and similar structure molecules separation experiments were realized using capillary electrophoresis. Third and last methodology was developed using standard cis-11-methyl-2-dodecenoic acid (DSF). Calibration curves were obtained with the isolated standard showing great linearities using both capillary electrophoresis and liquid chromatography with UV-Vis detection. Experiments of standard addiction to the samples were also realized. Experiments using the samples did not show the expected results. Problems found were mainly associated with high amount of interfering species and low analyte concentration at the cultures, extraction methods used were not enough to solve this. The failures with the cyclic voltammetric techniques were associated to electrode poisoning, due to the high amount of organic compounds present at the sample, and DSF lack of electroactivity. Difficulties found with capillary electrophoresis were associated with the samples high ionic strength, presence of interfering species and low analyte concentration. Even liquid chromatography coupled with mass spectrometry experiments didn\'t attended the expectations. Making it difficult to elucidate the problems and not allowing the development of a methodology that could achieve the proposed objectives.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A adenosina desaminase (ADA â E.C.3.5.4.4.) à uma enzima fundamental no catabolismo das purinas. Ela catalisa a desaminaÃÃo da adenosina ou 2âdeoxi-adenosina produzindo amÃnia e inosina ou 2â-deoxi-inosina, respectivamente. Sua atividade à expressa por 2 isoenzimas presentes em 3 isoformas. A ADA1 (36kDa) ou ADA1 ligada ao CD26 (280kDa) sÃo amplamente distribuÃdas nos tecidos. Sua aÃÃo à particularmente importante porque altos nÃveis de 2âdeoxi-adenosina sÃo tÃxicos para as cÃlulas do sistema imunolÃgico. A ADA2 (100kDa) à normalmente encontrada no soro e sintetizada somente pelo sistema monocÃtico-macrofÃgico. A importÃncia biolÃgica da ADA2 ainda nÃo està totalmente estabelecida, principalmente devido as suas caracterÃsticas cinÃticas. O presente trabalho teve como objetivo discriminar as isoenzimas da adenosina desaminase humana atravÃs de eletroforese em gel de agarose e pelo modelo proposto por Vale e Almeida (1998), bem como realizar um estudo descritivo retrospectivo sobre o perfil dos exames de ADA no Estado do CearÃ. As amostras de lÃquido ascÃtico, pleural e pericÃrdico foram submetidas à eletroforese em agarose a 1% a 80 V por 7 horas. O gel foi fatiado e cada fatia foi incubada em adenosina (22 ou 0,55mM) por 20 horas para a detecÃÃo da amÃnia liberada pela reaÃÃo enzimÃtica. Os resultados encontrados a partir da eletroforese foram comparados com os resultados achados pelo modelo de Vale e Almeida (1998). O lÃquido pleural à o fluido que à mais frequentemente solicitado para a determinaÃÃo da ADA, seguido pelos lÃquidos ascÃtico, cefalorraquidiano, pericÃrdico e soro. Observamos que os valores de atividade enzimÃtica sÃo influenciados pelo tipo de lÃquido corporal onde a enzima se encontra, podendo estar relacionada Ãs barreiras corporais, tais como a barreira hematoencefÃlica. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que o modelo matemÃtico proposto pode ser usado em laboratÃrios clÃnicos para discriminar as isoenzimas da ADA. / Adenosine deaminase (ADA â E.C.3.5.4.4.) is a fundamental enzyme in the catabolism of the purines. It catalyzes the deamination of adenosine or 2âdeoxy-adenosine producing ammonium and inosine or 2â-deoxyinosine, respectively. Its activity is expressed by two isoenzymes presented in three isoforms. ADA1 (36 kDa) and ADA1 bound to CD26 (280kDa) are widely distributed in the body tissues. Their action is particularly important because high levels of 2âdeoxy-adenosine are toxic for the immune system cells. ADA2 (100kDa) is normally found in serum and is synthesized only in monocyte-macrophage system. The biological importance of ADA2 is not yet fully clear, especially for its kinetics characteristics. The objective of the present work was to discriminate the isoenzymes of human adenosine deaminase using agarose electrophoresis and by mathematical model proposed by Vale and Almeida (1998). In addition, we performed a study of the profile of ADA tests in State of Ceara (Brazil). Samples of of ascites, pleural and pericardial effusion were submitted to electrophoresis in 1% agarose at 80V for 7 hours. The gel was sliced and each slice was incubated in adenosine (22 or 0,55mM) for 20 hours to detect the ammonium released by enzymatic reaction. The results found from electrophoresis were compatible with the model proposed by Vale and Almeida (1998). The pleural fluid is the most frequently requested for the determination of ADA, followed by ascitic fluid, cerebrospinal fluid, pericardial fluid and serum. We observed that the value of enzymatic activity is influenced by corporal fluid type where the enzyme is localized. These data can be associated with the corporal barrier, like brain barrier. We concluded that the proposed mathematical model could be used in clinical laboratories to discriminate ADA isoenzymes to improve the diagnostic method.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-02-17T14:00:34Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gerson Francisco Duarte Júnior - 2015.pdf: 3229718 bytes, checksum: 81bfec5942eb1f9b2ce2a8218a18cdba (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-02-18T11:48:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gerson Francisco Duarte Júnior - 2015.pdf: 3229718 bytes, checksum: 81bfec5942eb1f9b2ce2a8218a18cdba (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-18T11:48:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gerson Francisco Duarte Júnior - 2015.pdf: 3229718 bytes, checksum: 81bfec5942eb1f9b2ce2a8218a18cdba (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-07-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The current work describes some instrumental advances on contactless conductivity detection (C4D) as well as the development of ionic electrodes to be coupled on microchips electrophoresis (MSE). Firstly, was constructed a high-resolution C4D detector based on openC4D electronic. Frequency and amplitude was optimized resulting in 400 kHz and 4 Vpp, respectively, for optimal values. These conditions was able to be used in different MSE devices including polymethylmethacrylate, polydimethysiloxane and polyester-toner. For liquid electrodes fabrication, channels were engraved on a polymeric plate using a CO2 laser system and sealed with adhesive membrane. After that, PDMS microchip was reversibly sealed against the polymer membrane. The electrode channels were filled with different ionc solutions (KCl, NaCl and LiCl). The KCl solution with 2 mol/L provide the best peak intensity. Then analytical performance of the ionic electrode was test in a separation of K+, Na+ e Li+ (300 μmo/L each). A good separation was observed and limit of detection achieved were 28, 40 and 58 μmol/L for K+, Na+ e Li+, respectively. The biggest advantage the use of ionic electrode are related of easiness fabrication process, simplicity and lower cost per device. Additionally, a commercial system of MSE-C4D was propose in a separation of sugars. The analytical separation was realized under the alkaline condition (pH>12), in order to provide the negative charge for sugars. After optimization of buffer and experimental conditions, a mixture containing fructose, galactose, glucose, lactose and sucrose was separated in less 3 min. / O presente trabalho descreve alguns avanços instrumentais relacionados à construção de um detector condutométrico de alta resolução e também ao uso de eletrodos iônicos para detecção condutométrica sem contato (C4D) acoplada aos microssistemas eletroforéticos (MSE). Além disso, o trabalho também descreve o desenvolvimento de metodologia para a análise de açúcares voltadas à aplicações na produção do etanol de 2ª geração. Inicialmente, foi construído e otimizado um detector condutométrico para MSE baseado na eletrônica OpenC4D. Os valores de frequência e amplitude obtidos com a otimização foram de 400 kHz e 4 Vpp, respectivamente. Com os valores otimizados, o detector se mostrou versátil ao utilizá-lo em MSE fabricados em diferentes substratos. Para a construção dos eletrodos iônicos, primeiramente foram gravados canais em placas poliméricas e selados com uma membrana adesiva. Um microchip de PDMS foi selado reversivelmente contra este suporte. Em comparação aos eletrodos metálicos, os eletrodos iônicos oferecem algumas vantagens, tais como, simplicidade, facilidade de fabricação, e baixo custo por dispositivo. Diferentes soluções foram avaliadas como eletrodos, dentre as quais a solução de KCl 2 mol/L forneceu os melhores resultados em termos de intensidade de sinal. O desempenho analítico dos novos eletrodos foi avaliado para a separação de uma mistura padrão de K+, Na+ e Li+ (300 μmol/L cada). Neste estudo, foram obtidos limites de detecção entre 28 e 58 μmol/L. Estes valores são comparáveis aos obtidos com os convencionais eletrodos metálicos. Uma metodologia para separação de frutose, glicose e sacarose utilizando um sistema comercial de MSE-C4D foi proposta. As análises foram baseadas na utilização de um pH alcalino (>12) que garante a ionização destas espécies para a forma aniônica. Após a otimização das condições experimentais onde um tampão composto por NaOH/Na2HPO4 75/10 mmol/\L foi o que forneceu melhores resultados em temos de resolução entre par frutose e glicose. com estas condições uma mistura contendo frutose, galactose, glicose, lactose e sacarose foi separada em um tempo de 3 min.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-08-10T10:25:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Roger Cardoso Moreira - 2015.pdf: 8605588 bytes, checksum: 30a0478ee44e03b86b3d5b0eec4354c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-10T12:09:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Roger Cardoso Moreira - 2015.pdf: 8605588 bytes, checksum: 30a0478ee44e03b86b3d5b0eec4354c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-10T12:09:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Roger Cardoso Moreira - 2015.pdf: 8605588 bytes, checksum: 30a0478ee44e03b86b3d5b0eec4354c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-12-01 / This study describes the development of an analytical methodology for the separation of quaternary amines using nonaqueous electrophoresis microchips coupled with capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D). Initially, preliminary experiments were performed to evaluate two electrokinetic modes for sample introduction on chip, known as gated and floating approaches. Gated injection showed repeatability slightly better than floating mode. In addition, it also provided better analytical responses on the C4D system. During the development of analytical methodology for NAME-C4D, the electrolyte composition was optimized to ensure satisfactory separations on electrophoresis microchips. The electrolyte composed of sodium deoxycholate (NaDCHA) at concentration of 10 mmol/L dissolved in a mixture of MeOH/ACN at the ratio 90:10 (v/v) exhibited separations with high efficiency and resolution above 1. Then, it was realized the optimization of potential injection, separation and detection parameters (frequency and amplitude). Running electrolyte was prepared in both DMSO and DMF, however, the use of a mixture containing MeOH/ACN provided best analytical performance. The best results were obtained with electrolyte containing 10% ACN and 90% MeOH. In addition, different electrolyte compositions were also evaluated, but the electrolyte containing NaDCHA offered results slightly better when compared to others. The optimization of running buffer allowed the separation of nine quaternary amines in electrophoresis channels with effective length of 7.0 cm with analysis time lower than 120 s. The peak resolution was higher than 1 and the calculated separation efficiencies ranged from 77.000 to 185.000 pratos/m. This excellent performance was achieved using NAME conditions under high electric fields. The developed methodology was used for the analysis of quaternary amines in samples containing high salinity levels through the standard addition method. Linear correlation coefficients were obtained up to 0,990 for eight quaternary amines. Lastly, the use of NAME-C4D allowed to observe a strong dependence of the detector response according to the carbon number of quaternary amine molecules. / O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma metodologia analítica para separação de aminas quaternárias utilizando eletroforese não aquosa em microchips (NAME, do inglês non-aqueous microchip electrophoresis) com detecção condutométrica sem contato acoplada capacitivamente (C4D, do inglês capacitively coupled contactless conductivity detection). Inicialmente foi realizado um estudo para avaliação de dois modos de introdução da amostra nos microchips, denominados de gated e floating. O modo gated apresentou repetitividade ligeiramente melhor que o modo floating, além de proporcionar melhores respostas do detector C4D. No desenvolvimento da metodologia utilizando NAME-C4D, foi realizado um estudo para encontrar a composição ideal do eletrólito para as separações eletroforéticas. O eletrólito constituído de deoxicolato de sódio (NaDCHA), na concentração de 10 mmol/L, dissolvido em uma mistura de MeOH/ACN na proporção 90:10 (v/v), apresentou separações com alta eficiência e resolução superior a 1. A partir de então, foi realizada a otimização dos potenciais de injeção, separação e dos parâmetros de detecção (frequência e amplitude). Durante o desenvolvimento da metodologia, foram avaliados eletrólitos preparados em outros dois solventes, DMSO e DMF. Porém, a mistura de MeOH/ACN como solvente forneceu os melhores resultados, desta maneira também foi avaliada a adição de diferentes proporções de MeOH/ACN. Os melhores resultados foram obtidos com o eletrólito contendo 10% de ACN e 90% de MeOH. Na sequência, foram avaliadas diferentes composições do eletrólito, com a adição de outros compostos em substituição ao NaDCHA. Todos os eletrólitos avaliados apresentaram ótimas separações, porém o eletrólito com NaDCHA apresentou resultados ligeiramente superiores. Com a otimização da metodologia desenvolvida, obteve-se separações eletroforéticas de nove aminas quaternárias em microssistema contendo comprimento efetivo de 7,0 cm, com um tempo de análise inferior a 120 s. As separações apresentaram resolução superior a 1 e valores de eficiência entre 77,000 e 185,000 pratos/m, uma vez que com a utilização de solventes orgânicos, foi possível a aplicação de campos elétricos elevados. A metodologia desenvolvida foi avaliada através da determinação das aminas quaternárias, pelo método de adição de padrão, em uma matriz com elevada salinidade. Foram obtidos coeficientes de correlação lineares acima de 0,990 para oito aminas quaternárias. Durante o desenvolvimento do trabalho, foi observada uma clara dependência das respostas analítica em função da quantidade de carbono da molécula.

Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de metodologias para análise de metais pesados em águas de abastecimento (sistema Guarapiranga) e em água de chuva por métodos voltamétricos, a quantificação de cátions e ânions por eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (EC-DCC), a construção de eletrodos de prata a partir de CD-Rs e sua aplicação para medidas potenciométricas, amperométricas e voltamétricas, a confecção de microeletrodos de ouro explorando técnicas de micro-fabricação com toner e sua aplicação como detector amperométrico em eletroforese capilar e o uso de máscaras de toner para construção de redes de microeletrodos de ouro, platina e carbono. Para o desenvolvimento de metodologia para monitorar chumbo, cobre e mercúrio em águas de abastecimento e em água de chuva, enfatizou-se a utilização de dispositivos semidescartáveis de ouro construídos a partir de CD-Rs utilizando técnicas eletroanalíticas de redissolução. O limite de detecção para 300 s de pré-concentração foi calculado em 80, 90 e 100 ng L-1 para Pb2+, Cu2+ e Hg2+, respectivamente. O volume mínimo de amostra necessário para esta análise é de 0,5 mL. Para analisar estes metais em amostras de águas coletadas do sistema Guarapiranga, foi implementado um método alternativo simples e de baixo custo para eliminação da matéria orgânica presente nestas amostras. Este método permite o pré-tratamento de um grande número de amostras simultaneamente. Em adição à quantificação de metais pesados, ao longo deste trabalho também foi otimizada uma metodologia para o monitoramento de vários outros íons (Cl-, NO3-, SO42-, CH3COO-, F-, PO43-, NH4+, K+, Na+, Ca2+, Mg2+ e Li+) em águas do sistema Guarapiranga utilizando equipamento de eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (EC-DCC) construído no laboratório. O limite de detecção para estes íons foi calculado em 0,23, 0,43, 0,50, 4,26, 0,75, 1,00, 0,09, 0,18, 0,19, 0,20, 0,19 e 0,23 mg L-1, respectivamente. Além da utilização de eletrodos de ouro, ao longo desta tese também foi desenvolvida metodologia para a construção de sensores a partir de CD-Rs de prata. São discutidas as diferentes etapas envolvidas na elaboração destes dispositivos, é apresentada a sua caracterização e são mostrados os resultados obtidos por voltametria de redissolução para análise de chumbo, por amperometria/FIA para análise de cianeto e por potenciometria/FIA para análise de cloreto. A aplicação de técnicas de micro-fabricação com toner para desenvolver detectores amperométricos de ouro para eletroforese capilar foi outro assunto estudado. Estes sensores foram acoplados a um sistema de eletroforese capilar utilizando uma célula do tipo \"wall-jet\". A potencialidade deste tipo de detecção em eletroforese capilar foi demonstrada com a análise simultânea de iodeto, ácido ascórbico, dipirona e paracetamol. O limite de detecção para estes íons foi calculado em 0,1, 0,5, 3,1 e 1,1 µmol L-1, respectivamente. O uso de máscaras de toner para construir redes de microeletrodos de ouro, platina e carbono é outro tópico apresentado nesta tese. Informações detalhadas sobre as etapas e parâmetros envolvidos na construção deste tipo de sensor são apresentadas. O desempenho, assim como algumas características peculiares destes dispositivos são demonstradas através do uso de sistemas químicos conhecidos e os resultados obtidos comparados com os de um eletrodo convencional. / This study describe the development of methodologies for the analysis of heavy metals in drinking water supply (Guarapiranga system) and in rain water by using voltammetric methods, for the quantification of cations and anions by capillary electrophoresis using contactless conductometric detection (CE-CCD), the construction of silver electrodes utilizing recordable CDs and its application for potentiometric, amperometric and voltammetric analysis, the confection of microelectrodes utilizing microfabrication techniques with toner and its application as electrochemical detector in capillary electrophoresis and the utilization of toner masks to construct gold, platinum and carbon microelectrodes arrays. In the development of methodologies for lead, copper and mercury monitoring for natural waters and in rain water, was emphasized the utilization of semi-disposable gold electrodes constructed from recordable CDs, utilizing stripping analysis techniques. The detection limit utilizing 300 s pre-concentration time was calculated as 80, 90 and 100 ng L-1 for Pb2+, Cu2+ e Hg2+, respectively. The minimum sample volume for each analysis is 0.5 mL. For the analysis of these metals in waters samples collected in the Guarapiranga dam, a simple and alternative low cost method to eliminate the organic mater present in these samples was implemented. This method permits the pre-treatment of many samples simultaneously. In addition to the quantification of heavy metals, in the course of this work, the methodology for monitoring many other ions (Cl-, NO3-, SO42-, CH3COO-, F-, PO43-, NH4+, K+, Na+, Ca2+, Mg2+ e Li+) in the waters from Guarapiranga dam utilizing capillary electrophoresis with contactless conductometric detection (CE-CCD), an instrument constructed in the laboratory was also optimized. The detection limit for these ions was calculated as 0.23, 0.43, 0.50, 4.26, 0.75, 1.00, 0.09, 0.18, 0.19, 0.20, 0.19 e 0.23 mg L-1, respectively. Apart from the utilization of gold electrodes, on this work, we also developed a new methodology for the construction of sensors starting from silver CD-Rs. The different steps involved in the manufacture of these devices are discussed, its characterization is presented and the results obtained utilizing voltammetry for lead analysis, FIA/amperometry for the analysis of cyanide and FIA/potentiometry for the analysis of chloride. The utilization of microfabrication techniques with toner to develop amperometric gold detectors for capillary electrophoresis applications was another subject investigated. These sensors were coupled a capillary electrophoresis system using a wall-jet type cell. The potentiality of this type of detection for capillary electrophoresis was demonstrated for the simultaneous analysis of iodide, ascorbic acid, dipyrone and paracetamol. The detection limit for these ions was calculated as 0.1, 0.5, 3.1 and 1.1 µmol L-1, respectively. The utilization of masks made with toner to construct arrays of gold, platinum and carbon microelectrodes is another topic presented in this thesis. Detailed information about the steps and factors involved in the construction of this kind of sensor are presented. The performance as well as some peculiar characteristics of these devices are demonstrated utilizing well know chemical systems and the results obtained compared to the ones of a conventional electrode.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de extração hormonal à partir de fezes de onça-pintada (Panthera onca) e validar uma metodologia de análise destes extratos por eletroforese capilar, verificando a eficiência analítica desta técnica no estudo dos metabólitos de esteróides sexuais em fezes, com o intuito de utilização futura desta metodologia na rotina dos laboratórios de endocrinologia. Foram testados sete tratamentos para as amostras de fezes liofilizadas: quatro protocolos de extração em diferentes solventes, um de hidrólise ácida e dois protocolos de extração em fase sólida (SPE). O protocolo de extração em acetonitrila foi satisfatório como pré-tratamento da amostra e aliado à SPE C-18 apresentou bons resultados no que diz respeito à sensibilidade, precisão, recuperação e tempo de análise. Com base nos resultados obtidos, a eletroforese capilar pode ser considerada uma ótima alternativa para a prospecção de metabólitos de hormônios, podendo ser utilizada em análises de rotina nos laboratórios de endocrinologia animal, sobretudo naqueles que se dedicam às metodologias não-invasivas de avaliação da função reprodutiva em animais selvagens. / The objective of this work was to develop a protocol of hormonal extraction from jaguar feces (Panthera onca) and validate a methodology of analysis of these extracts with capillary electrophoresis, verifying the analytical efficiency of this technique in the study of the steroids metabolites in feces, with the objective of future use of this methodology in the routine of the endocrinology laboratories. Seven treatments were tested for the samples: four extraction protocols in different solvents, one of acid hydrolysis and two extraction protocols in solid phase (SPE). The extraction protocol in acetonitrila was satisfactory as pre-treatment of the samples and ally to SPE C-18, it presented good results with respect to the sensibility, precision, recovery and time of analysis. Based on the obtained results, the capillary electrophoresis can be considered a great alternative for the research of metabolites of hormones, it could also be used in routine analyses in the endocrinology laboratories, mainly in those that are devoted to the non-invasive evaluation methodologies of the reproductive function in wild animals.

A tuberculose é a segunda maior causa de mortes por doença infecciosa no mundo depois do HIV. A pirazinamida, um dos fármacos utilizados no tratamento atual, é um pró-fármaco do ácido pirazinóico que tem ação relevante contra Mycobacterium tuberculosis latentes, possui alta atividade bactericida sendo capaz de eliminar micobactérias intracelulares como nos macrófagos, por exemplo. A observação de que micobactérias resistentes à pirazinamida ainda são suscetíveis aos ésteres do ácido pirazinóico direcionou as pesquisas no desenvolvimento de derivados ésteres como pró-fármaco, com a vantagem de que as esterases presentes nas micobactérias possibilitam a ativação do pró-fármaco. O éster do ácido pirazinóico, pirazinoato de etila, apresenta como vantagem a fácil obtenção por apenas uma etapa de reação. A estruturação de fármacos em nanopartículas poliméricas traz como vantagens a melhora na estabilidade e alta capacidade de carreamento do fármaco. A nanoestruturação de ativos cria a necessidade de métodos capazes de quantificar os componentes presentes. Neste contexto, a eletroforese capilar apresenta-se como uma técnica analítica de baixo custo e tem como vantagem a diminuição do tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver a nanoestruturação do éster pirazinoato de etila e quantificar o mesmo nas nanopartículas pela técnica de eletroforese capilar. O éster do ácido pirazinóico foi caracterizado por ponto de fusão, calorimetria exploratória diferencial, análise elementar, espectroscopia no infravermelho e ressonância magnética nuclear. As nanopartículas obtidas pelo método de nanoprecipitação foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz, potencial Zeta, pH, calorimetria exploratória diferencial e microscopia eletrônica de varredura. Um método por eletroforese capilar foi desenvolvido e validado de acordo com os guias ANVISA e ICH. O método apresentou boa linearidade (R2>0,99), precisão (DPR< 3%) e exatidão (recuperação de 99% ±0,2). O método desenvolvido foi usado para quantificar o éster contido nas nanopartículas e a eficiência da encapsulação do fármaco foi determinada. / Tuberculosis the second leading cause of deaths from infectious diseases after HIV. Pyrazinamide, one of the drugs available in therapy of tuberculosis, is a prodrug from pirazinoic acid wich is active against latent bacilli, besides the high bacterial activity since it is capable to eliminate within macrophages. Since bacteria which is not susceptible to pyrazinamide is still susceptible to pyrazinoic acid esters, has directed research on developing pirazinoic acid esters derivative as prodrug, with the advantage this is activated for mycobacterial esterases. Pyrazinoic acid ester, ethyl pyrazinoate, it has the advantage to be done in only one reaction step and simply obtaining. Structured drugs in polymeric nanoparticles presenting advantages such as stability improvement and high drug carrying capacity. The drugs nanostructuring makes necessary methods to this quantifying. In this context, capillary electrophoresis represents an analytical technique low cost and the advantage of the shorter analysis. The aim of this work was the nanostructuring of ethyl pyrazinoate ester and quantify this in nanoparticles by capillary electrophoresis. The pyrazinoic ester was characterized by melting point, differential scanning calorimetry, elemental analysis, infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance. Nanoparticles were prepared by nanoprecipitation method and were characterized by dynamic light scattering, zeta potential, pH, differential scanning calorimetry and scanning electron microscopies. A capillary electrophoresis method was developed and validated in accordance with the requirements of ANVISA and ICH guidelines. The method showed good linearity (R2>0,99), precision (RSD < 3%) and accuracy (recovery 99% ±0,2). The method was used to quantify the ester loaded in nanoparticles and the entrapment efficiency was determined.

A colibacilose é uma enfermidade importante na avicultura por causar prejuízos econômicos e danos à carcaça. Escherichia coli é um micro-organismo oportunista e a complexidade da infecção se deve a diversidade de sorotipos, variados fatores de virulência e baixa capacidade de estimular a imunidade cruzada. Assim, a compreensão dos mecanismos de virulência que ocorrem no hospedeiro, pode resultar no desenvolvimento de métodos diagnósticos e profiláticos. Neste estudo, 85 pintinhos foram divididos em quatro grupos, sendo três infectados com diferentes sorogrupos de Escherichia coli (O2, O78, O119) e um vacinado com Poulvac&reg; E.coli (Pfizer&reg;). As lesões sugestivas de colibacilose foram avaliadas e qualificadas aos 35 dias de idade, e em seguida realizada a colheita de sangue para a obtenção do soro. Foram obtidas proteínas in vitro dos sorogrupos de E. coli utilizados na infecção experimental e da vacina (mutante de Escherichia coli O78). Estas foram separadas por eletroforese unidimensional em gel de acrilamida utilizando dodecil sulfato de sódio (SDS) e foram submetidas a reação de western blot com a mistura de soros de cada grupo estudado e também com o pool de soros de aves livres de patógenos específicos (SPF), usadas como controle negativo. O perfil eletroforético revelou a presença de várias proteínas dos diferentes sorogrupos de E. coli quando cultivadas no meio casaminoácido e levedura. Houve diferenças entre os sorotipos, mas também proteínas comuns. Foi possível estabelecer uma relação entre virulência, quantidades de proteínas específicas e taxa de reisolamento. / The colibacillosis is a serious disease in poultry industry to cause economic losses and damage to carcass. Escherichia coli is an opportunistic microorganism and the complexity of infection is due to the diversity of serotypes, several virulence factors and low ability to stimulate cross-immunity. Thus understanding of virulence mechanisms that occur in the host, may result in development of diagnostic and prophylactic methods. In this study, 85 chicks were divided into four groups being infected with three different serogroups of E. coli (O2, O78, O119) and vaccinated with Poulvac E. coli &reg; (Pfizer &reg;). The lesions suggestive of colibacillosis were evaluated at 35 days of age, and then the blood sample are collected to obtain the serum. Proteins were obtained in vitro from serogroups of E. coli used in experimental infection and vaccine (mutant of Escherichia coli O78). These were separated by one-dimensional electrophoresis on acrylamide gels using sodium dodecyl sulfate (SDS) and then reacted by western blot with the pool of sera from each group and also with the pool of sera from specific pathogen free poultry used as negative control. The electrophoretic pattern showed the presence of many proteins of different serogroups of E. coli when grown in the broth casaminoacid and yeast. There were differences among serotypes, but also common proteins. It was possible to establish a relationship between virulence and reisolation rate.