O protozoário parasita Cryptosporidium parvum tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente. Para estudos moleculares, a maioria das técnicas para extração do DNA requer o uso de kits importados para concentrar, romper a parede muito resistente do oocisto e purificar o DNA das matrizes das amostras. O objetivo do estudo foi desenvolver um método simples e rápido, baseado na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar Cryptosporidium em fezes preservadas. Oocistos foram concentrados das amostras fecais pela flutuação em gradiente de sacarose. Dos oocistos purificados foi extraído o DNA genômico através de incubação em tampão de lise contendo 70 mM -mercaptoetanol, digerido com proteinase K e extraído com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico. A padronização foi iniciada com a PCR única para detectar Cryptosporidium spp usando um par de primer genérico (AWA). Para identificar C. parvum foi realizada a PCR única com o par de primer especifico (LAX). Para aumentar a sensibilidade do método, foi testada a nested-PCR, usando o primer externo XIA. Foram analisadas 39 amostras de DNA do bezerro padrão, 52 amostras de 17 pacientes e 45 amostras de 14 animais. Os resultados foram: 54,28% de positividade na PCR AWA, e 71,42% na nested-PCR XIA/AWA, 67,74% na PCR LAX e 44,44% na nested-PCR XIA/LAX das amostras do bezerro. A positividade geral nas amostras de pacientes e de animais foi: 34,48% pela PCR and 54,83% pela nested-PCR para Cryptosporidium spp e 16,00% pela PCR e 50,00% pela nested-PCR para C. parvum. O emprego do corante Vistra Green melhorou significativamente a visualização do gel. Os resultados mostram que este método simples e de baixo custo pode ser melhorado para aplicação na rotina do laboratório. / The protozoan parasite Cryptosporidium parvum has become recognised as important emerging human pathogens. For molecular studies, most of the techniques to extract genomic DNA require the use of imported kits to concentrate, rupture the very resistant oocyst wall, and purify the DNA from the samples matrix. The aim of this study was to develop a simple and rapid method based on polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptosporidium in preserved faeces. Oocysts were concentrated from faecal specimens by flotation on sucrose gradient. Genomic DNA was prepared from purified oocysts by adding a lysis buffer containing 70 mM -mercaptoethanol, digested with proteinase K and extracted with phenol-chlorophorm-isoamyl. The standardization was started by performing a one step PCR to detect Cryptosporidium spp using a generic set of primer (AWA). To detect C. parvum a one step PCR was assayed using the specific primer (LAX). To increase the sensitivity of the method, were tested nested-PCR assays, using an outer primer (XIA). Thirty nine DNA samples were analysed from the standard calf, 52 samples from 17 patients and 45 samples from 14 animals. The results were: 54.28% positive samples by single PCR AWA, 71.42% by nested-PCR, 67.74% by single PCR LAX and 44.44% by nested-PCR for the standard calf. The overall positivity for human and animal samples were: 34.48% by single PCR and 54.83% by nested-PCR for Cryptosporidium spp and 16.00% by single PCR and 50.00% by nested-PCR for C. parvum. Using Vistra Green for staining agarose gel, yielded the visualisation of the amplicons. These results show that this simple and cheap method could be improved to be used on the routine laboratory work.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007-Vanessa de Almeida Raia.pdf: 1677171 bytes, checksum: e3f8cffe7eb95e4096f3adf06552ae0c (MD5) Previous issue date: 2007-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / To fill some gaps on intrinsic mechanisms of the biology of the oviposition and embryogenesis of R. (B.) microplus and R. (R.) sanguineus, was evaluated the variability protein in eggs per day of posture and incubation. For this, engorged female laid eggs in controlled environment chamber (27 ? 1oC, 80 ? 5% UR, and darkness). As soon as the female initiated the oviposition, egg samples of 50 mg was collected daily, conditioned in eppendorf tube and preserved in freezer - 20?C, characterizing the period of posture. Samples of 50 mg was removed from a fresh egg mixture and put in perforated eppendorf tube, kept in environment chamber (27 ? 1oC, 80 ? 5% UR, and darkness). Daily, one tube was transferred to freezer -20?C until the first larva hatch. Thus a sequence of different stage of embryogenesis was obtained. The Bradford method was used to measure the protein concentration and subsequently, the electrophoresis profiles was performed in SDS-PAGE. The protein concentrations was correlated with the oviposition and embryogenesis days using the Pearson (r) correlation and for this, the data was transformed in logarithmic value [log (X+1)] after the normality to be discarded (test of Shapiro-Wilk). During oviposition the protein concentrations of the eggs of R. (B.) microplus and R. (R.) sanguineus remained constant until the last days when abrupt increase was observed. In both of species, variation in the concentration of protein was observed during all embryonic period. The number of detectable bands of proteins decreasing during oviposition and embryogenesis days, but in the last days a new band was found. It can inferred that the proteins variation in the eggs of R. (B.) microplus and R. (R.) sanguineus is correlated with the days oviposition and incubation. The ticks R. (B.) microplus and R. (R.) sanguineus have a different oviposition profile proteins model that can be use as phenetic feature. As well, a different way of degradation of protein for each species was characterized. / Objetivando preencher algumas lacunas sobre mecanismos intr?nsecos da biologia da oviposi??o e embriog?nese de R. (B.) microplus e R. (R.) sanguineus, foi avaliada a variabilidade prot?ica dos ovos por dia de postura e incuba??o. Para tal, f?meas ingurgitadas foram colocadas para efetuar postura em estufa biol?gica sob condi??es controladas (27 ? 1oC, 80 ? 5% UR, escotofase). Ap?s in?cio da postura, amostras di?rias de 50 mg de ovos foram coletadas, acondicionadas e preservadas a 20?C, caracterizando o per?odo de postura. A partir de um pool de ovos rec?m colocados, foram obtidas al?quotas de 50 mg que acondicionadas em tubos de eppendorf perfurados foram mantidas em estufa biol?gica nas mesmas condi??es controladas descritas acima. Desde a separa??o das al?quotas at? o surgimento da primeira larva, diariamente uma amostra foi transferida para freezer ? -20?C, obtendo-se assim ovos seq?encialmente em diferentes momentos da embriog?nese. Para dosagem das prote?nas utilizou-se o m?todo de Bradford, e os perfis eletrofor?ticos foram tra?ados atrav?s de eletroforese em gel de poliacrilamida. Os dados das concentra??es prot?icas foram correlacionados com os dias de postura e de embriog?nese. Para isso, utilizou-se o coeficiente de correla??o de Pearson (r), com os dados da concentra??o transformados logar?timicamente [log (X+1)]. Os dados foram transformados ap?s o descarte da normalidade (teste de Shapiro-Wilk). De modo geral as concentra??es das prote?nas nos ovos de R. (B.) microplus e R. (R.) sanguineus durante a postura mantiveram-se constantes at? os ?ltimos dias quando se observou aumento abrupto das concentra??es. Nas duas esp?cies, foram observadas varia??es nas concentra??es das prote?nas durante o per?odo embrion?rio. Ainda em ambas esp?cies, na an?lise das bandas prot?icas, o n?mero de bandas detect?veis diminuiu ao longo do per?odo de postura e embriog?nese, sendo observado nos ?ltimos dias surgimento de uma nova banda. Pode-se depreender que a varia??o na concentra??o das prote?nas dos ovos de R. (B.) microplus e R. (R.) sanguineus est? correlacionada com os dias de postura e incuba??o, atrav?s do aumento na concentra??o de prote?nas ? medida que o final da postura e eclos?o da larva se aproximam. Devido ?s diferen?as entre os perfis prot?icos de R. (B.) microplus e R.(R.) sanguineus ao longo dos dias de postura, conclui-se que as prote?na s disponibilizadas aos ovos durante o per?odo de postura s?o diferentes entre estas duas esp?cies e que os zimogramas podem ser utilizados como marcadores fen?ticos. Ainda pode-se concluir que, ao longo da embriog?nese, devido ao desaparecimento e surgimento de bandas prot?icas, as prote?nas dispon?veis para o embri?o de R. (B.) microplus e R.(R.) sanguineus s?o biotransformadas de modo que h? um perfil de degrada??o particular para cada esp?cie.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-10-04T16:19:04Z No. of bitstreams: 1 2011 - B?rbara Amorim Silva.pdf: 5390134 bytes, checksum: 32ec2143250d4b2b5d5a8de98ea88d9d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T16:19:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011 - B?rbara Amorim Silva.pdf: 5390134 bytes, checksum: 32ec2143250d4b2b5d5a8de98ea88d9d (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / The castor bean (Ricinus communis L) is a plant family Euphorbiaceae. Considered an oil of high economic value because this has a clearly defined market for the oil extracted from its seeds. The cake, which is a residue of this extraction, stands out for its high protein content. Among the proteins found in the cake stands ricin, a cytotoxin, which not allows its use as an alternative protein source for animal feed. In this study was used the extrusion-cooking technology, combined application of calcium hydroxide Ca(OH)2 in order to inactivate the protein fraction containing ricin. The extrusion process of cake castor oil was carried out using a Brabender DS20 cannon short. Was used the response surface methodology to investigate the effect of the interaction of parameters in the study. Was used a central composite design in order to evaluate the moisture effects (14%, 16%, 18%, 20%, and 21%), temperature (116?C, 130?C, 150?C, 170?C and 180?C) and concentration of Ca(OH)2.. As a comparative sample was used castor beans which were crushed to extract oil and cake which used as a sample without heat treatment, as standard. For the evaluation of physical-chemical, it was utilized methods of AOAC. The quantification of proteins was realized using the method of Bradford and the protein profile was electrophoresis-SDS-PAGE. Was used to mark the Biorad electrophoresis the methodology observed using the of preparation of the gels described by LaemmLi (1970). The results indicated that most of the different treatments performed totally changed the structure of ricin. Indizatily the possibility of total hydr?lise of this macromolecule. The application of extracts of castor oil in the gel electrophoresis allowed the observation of a clear chain A (RTA) and 38 kDa molecular weight B (RTB) molecular weight 36kDa. For the crude protein extract of bran molar mass chains A and B were approximately 37 kDa and 35 kDa respectively. The levels of protein extracted from the bran decreased 89% after extrusion. The results indicated that all treatments changed entirely the structure of ricin with the possibility of their having been a total hydrolysis of the polymer. According to tests performed and observed results, we conclude that the thermoplastic extrusion process is a suitable technology to decrease the activity of ricin / A mamoneira (Ricinus communis L.) ? uma planta da fam?lia Euforbi?cea que vem sendo muito estudada como fonte alternativa na produ??o de biodisel. O farelo, res?duo gerado ap?s a extra??o do ?leo da semente utilizando solvente, apresenta alto teor de prote?nas. Dentre as prote?nas encontradas na torta destaca-se a ricina, uma citotoxina, que inviabiliza sua utiliza??o como fonte prot?ica alternativa para alimenta??o animal. No presente estudo empregamos a extrus?o termopl?stica, associada ? aplica??o de hidr?xido de c?lcio Ca (OH)2 com o objetivo de inativar a fra??o prot?ica que contem a ricina. O processo de extrus?o do farelo de mamona foi realizado utilizando uma extrusora BRABENDER DS20 de canh?o curto. Utilizou-se a metodologia de superf?cie de resposta para verificar o efeito da intera??o dos par?metros estabelecidos no estudo. Foi utilizado um delineamento composto central rotacional a fim de avaliar os efeitos dos n?veis de umidade (14%, 16%, 20% e 21%), temperatura (116?C, 130?C, 150?C, 170?C e 180?C) e concentra??o Ca(OH)2.. Como amostra comparativa foi utilizada sementes de mamona da cultivar Paragua?? as quais foram esmagadas em prensa expeller at? extrair o ?leo e cuja torta foi utilizada como padr?o por apresentar maior integridade das cadeias polipept?dicas. Para a avalia??o das caracter?sticas f?sico-qu?micas, foram utilizados m?todos da AOAC, para quantifica??o de prote?nas foi utilizado o m?todo de Bradford e para avalia??o do perfil prot?ico foi utilizada a eletroforese- SDS-PAGE, atrav?s do sistema de eletroforese da marca Biorad com a metodologia de prepara??o dos g?is descrita por Laemmli (1970). Os m?todos de purifica??o usando a di?lise e precipita??o com sulfato de am?nio favoreceu para um bom rendimento quanto ao teor de prote?na, principalmente a ricina. A aplica??o dos extratos da torta de mamona no gel de eletroforese permitiu a observa??o n?tida das cadeias A (RTA) massa molar 38 kDa e B (RTB) massa molar 36kDa. Para o extrato prot?ico do farelo bruto a massa molar das cadeias A e B ficaram em torno 37 kDa e 35 kDa respectivamente. Os n?veis de prote?na extra?da do farelo diminu?ram 89% ap?s a extrus?o. Os resultados indicaram que todos os tratamentos realizados modificaram totalmente a estrutura da ricina, com possibilidade de ter havido hidr?lise total desta macromol?cula. De acordo com os ensaios realizados e resultados observados, conclui-se que o processo de extrus?o termopl?stica ? uma tecnologia adequada para diminuir a atividade da ricina. Palavras-chave: Citotoxina, Eletroforese

O líquido folicular é o microambiente do oócito durante sua maturação in vivo que é, em parte constituído por exsudato do soro sanguíneo e por substâncias produzidas localmente, que estão relacionados com a atividade metabólica das células ovarianas. Tais substâncias podem ser essenciais para a proliferação e diferenciação das células somáticas bem como na maturação e posterior fertilização de um oócito competente. A busca por biomarcadores capazes de predizer a saúde de um folículo ou a capacidade do oócito em se tornar um embrião saudável é objeto de estudo na medicina reprodutiva humana e veterinária. Para tanto é essencial o conhecimento a nível molecular dos constituintes do liquido folicular e suas funções. O objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil proteico do líquido folicular de éguas submetidas à indução de ovulação, com dois diferentes protocolos usuais na prática clínica, utilizando eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida. Para tanto 19 amostras de liquido folicular de éguas que tiveram sua ovulação induzida por dois diferentes protocolos (1000UI hCG IV, Grupo H, ou 1000UI hCG IV + 1,5mg de acetato de deslorelina IM, Grupo H + G) foram submetidos a eletroforese 2D e posterior análise dos géis no PDQuest. Os valores de proteína total foram significativamente diferente nos Grupo H e Grupo H+G, 63,97 ± 6,97 e 73,07 ± 6,42, respectivamente. O número máximo de spots em um mesmo gel foi de 157 e o mínimo de 34, com média de 90 spots para o Grupo H e 83 spots para o Grupo H+G. Os 19 géis foram avaliados e a porcentagem máxima de spots relacionados foi de 52% e a mínima de 0%. Com média de 37,8% de similaridade entre spots para o Grupo H e 22% para o Grupo H+G. Estes resultados são de grande importância devido à escassez de trabalhos com proteômica de liquido folicular de éguas induzidas a ovulação e demonstram que a associação entre hCG e acetato de deslorelina aumenta a concentração de proteínas no líquido folicular em folículos pré-ovulatórios (>35 mm). / Follicular fluid is the oocyte microenvironment during its in vivo maturation. It is partly composed by blood serum exudate, and also by locally produced substances, related to ovarian cells metabolic activity. These substances may be essential for somatic cells proliferation and differentiation, as well as on the oocyte maturation and fertilization. The search for biomarkers able to predict oocyte ability to grow into a healthy embryo are targets on human and veterinary reproductive medicine. It is essential to know the components of follicular fluid and their functions. The aim of the present study was to evaluate protein profile of the follicular fluid in mares with inducted ovulation, in two different protocols, using 2D electrophoresis in polyacrylamide gel. 19 follicular fluid samples from mares in which ovulation induction was performed with two different protocols (1000UI hCG IV or 1000UI hCG IV + 1,5mg deslorelin acetate IM), submitted to 2D electrophoresis, and gel analysis on PDQuest. Total protein values were significantly different in Group H and Group H+G, 63,97 ± 6,97 and 73,07 ± 6,42, respectively. The highest number of spots on a same gel was 157 and the minimum was 34, with a mean of 90 spots to Group H and 83 spots for Group H+G. All of the19 gels were evaluated according to MasterGel and the highest percent of related spots was 52% and the lowest, 0%, with mean similarity between spots 37,8% to Group H and 22% to Group H+G. These results are of great importance, due to lack of works on follicular fluid proteomics using fluid from mares with induced ovulation, and demonstrate that the association hCG + deslorelin acetate increase proteins concentration on pre-ovulatory follicles fluid.

O presente estudo teve por objetivo comparar a composição da saliva de adolescentes com lesões de cárie ativas com a de jovens livres de lesões de cárie. Doze adolescentes com idade média de 15,2 (desvio padrão = 1,6) anos foram divididos em três grupos de acordo com acometimento pela cárie dentária: Grupo CA - participantes com o mínimo de quatro lesões cariosas cavitadas ativas (n=4), classificadas com os escores 5 e/ou 6 pelo Sistema Internacional de Detecção e Avaliação de Cárie (ICDAS, do inglês International Caries Detection and Assessment System); Grupo MB - adolescentes (n = 4) com pelo menos quatro lesões cariosas iniciais ativas (ICDAS 1 e/ou 2); e grupo CO - composto de participantes sem lesões de cárie ativas (n = 4). Proteínas provenientes de saliva estimulada (20 ?g) foram submetidas a espectrometria de massa e eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) em três experimentos independentes. Valores densitométricos de quinze bandas de diferentes pesos moleculares dos géis SDS-PAGE foram mensurados e analisados por análise de variância ( p<0,05). Espectrometria de massa foi realizada para identificar e caracterizar o proteoma das bandas que mostraram diferenças em três diferentes géis. A quantificação relativa consistiu na realização de eletroforese SDS-PAGE contendo proteínas salivares dos grupos MB e CO pareadas lado a lado de acordo com a concentração de proteínas total. As bandas foram analisadas densitometricamente e as proteínas nelas contidas foram também quantificadas por espectrometria de massa. Resultados encontrados na análise com SDS-PAGE revelaram que quatro bandas de alto e baixo peso molecular do grupo MB se mostraram estatisticamente quando comparadas ao grupo CO. As amostras do grupo CA não mostraram diferenças na comparação ao grupo CO. A análise por espectrometria de massa revelou o conteúdo proteico das amostras de saliva e das bandas eletroforéticas dos géis SDS-PAGE que demonstraram diferenças. A análise quantitativa relativa mostrou as diferenças entre os grupos nas bandas de alto, médio e baixo pesos moleculares, bem como das proteínas nelas presentes. Este estudo concluiu que existem diferenças na composição proteômica da saliva de adolescentes acometidos por cárie quando comparados a jovens sem lesões ativas, principalmente quando se considerou lesões de cárie iniciais. / This study aimed to compare the salivary protein content of adolescents presenting active caries lesions with caries-free persons. Twelve adolescents with average age of 15.2 (standard deviation=1.6) years old were divided into three groups according to the caries occurrence: Group CA - participants with at least four active cavitated caries lesions (n = 4), classified as scores 5 and/or 6 according to the International Caries Detection and Assessment System (ICDAS); Group MB - adolescents (n = 4) in which subjects showed at least four cavitated active lesions (ICDAS 5 and 6), group MB (n=4) with at least four active initial caries lesions (scores 1 and/or 2 of ICDAS); and group CO - with subjects with no active caries lesions (n = 4). Proteins from stimulated saliva (20 ?g) were submitted to sodium-dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in three independent experiments. Densitometric values from fifteen bands of different molecular weights were measured and analyzed with analysis of variance (p<0.05). Mass spectrometry was used to identify and characterize the proteome from electrophoretic bands. Relative quantification consisted in submit to SDS-PAGE salivary protein samples paired by total protein concentration from groups MB and CO. Electrophoretic bands were densitometrically analyzed, and their protein content were quantified with mass spectrometry. Results from SDS-PAGE revealed that four bands of high and low molecular weight from group MB were statistically higher when compared to group CO. Samples from group CA did not show differences when compared to group CO. Mass spectrometry showed the protein content from SDS-PAGE electrophoretic bands. Relative quantitative analysis showed differences among groups in bands of high, middle and low molecular weights, as well in their proteins. This study concludes that there are differences in the proteomic composition of saliva from adolescents with active caries lesions when compared to persons with no active caries lesions, mainly considering initial active caries lesions.

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil proteico do plasma seminal equino utilizando eletroforese bidimensional de gel de acrilamida (2D-PAGE) e determinar se algumas das proteínas presentes estavam relacionadas com a congelabilidade do sêmen. O plasma seminal foi coletado de dez garanhões, de alta e baixa congelabilidade de sêmen, provenientes do Haras Estatal da Baixa Saxônia, na cidade de Celle, na Alemanha e rotineiramente utilizados em programas de inseminação artificial. Vinte e cinco bandas proteicas foram encontradas nos géis bidimensionais (12%) e sete delas foram identificadas por MALDI-MS. Das 25 proteínas encontradas nas amostras de plasma seminal dos garanhões, duas bandas proteicas apresentaram densidade óptica superior (P<0,05) nas amostras de garanhões de alta congelabilidade o sêmen: as bandas 5 (80-85 kDa, pI 7,54), que foi identificada como CRISP3 e a 45 (18,2 kDa, pI 5,0-5,2) identificada como HSP-2. Contrariamente a banda 7 (75,4 kDa, pI 6,9 – 7,4), identificada como lactoferrina, a 15 (26,7 kDa, pI 5,51) identificada como calicreína, a 25 (25 kDa, pI 7,54) como CRISP3 e a 35 (13,9 kDa, pI 3,8 – 4,2) que foi identificada como HSP-1, apresentaram valores de densidade óptica superior (P<0,05) nos reprodutores de baixa congelabilidade do sêmen. As proteínas foram identificadas através de espectometria de massa MALDI-MS. As evidências encontradas neste experimento mostram que existem diferenças no perfil proteico dos reprodutores de alta e baixa congelabilidade do sêmen, sugerindo as proteínas CRISP3 e a HSP-2 como possíveis marcadores da alta congelabilidade de sêmen de garanhões. / The objective of this study was to evaluate protein profile of equine seminal plasma using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and to find if any of these proteins were related to semen freezability. Seminal plasma was collected from 10 stallions of high and low semen freezability routinely used in AI programs from the State Stud of Lower Saxony and Artificial Insemination Center. Twenty five protein spots were identified from the 2 D gel (12%), seven of which were present in all samples. Of the 25 proteins found in the research stallions, two spots showed superior relative content (P<0.05) in seminal plasma samples collected from stallions with high semen freezability: the spots 5 (80-85 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 45 (18.2 kDa, pI 5.0-5.2) was identified as HSP-2. Conversely, the spot 7 (75.4 kDa, pI 6.9 – 7.4) was identified as lactoferrin, 15 (26.7 kDa, pI 5.51) was identified as kallikrein, 25 (25 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 35 (13.9 kDa, pI 3.8 – 4.2) was identified as HSP-1, showed superior relative protein content (P<0.05) on seminal plasma samples from stallions with low semen freezability. The proteins were identified by MALDI-MS. There were differences in the seminal plasma protein profile between stallions with high and low semen freezability. It may be suggested that CRISP3 and HSP-2 may be considered possible seminal plasma markers of high semen freezability.

A transferência de imunidade passiva colostral é muito importante tanto para a saúde do neonato quanto para o seu desempenho. Com o objetivo de estudar a relação entre a eficiência ou não no estabelecimento da imunidade passiva colostral em neonatos e a suas interrelações com aspectos de desempenho e produção destes animais foram colhidas amostras de sangue de 354 bezerras com 30 horas de vida (24 a 36 h) em 10 propriedades localizadas no centro leste do Estado do Paraná, Brasil. Determinações bioquímicas do soro das amostras foram realizadas para avaliar a qualidade de transferência de imunidade passiva. A proteína sérica total foi determinada pelo método do Biureto e a albumina pelo método do verde de bromocresol para o cálculo das taxas de globulinas obtidas pela diferença entre os teores séricos de proteína e albumina. A fração gamaglobulina foi determinada por eletroforese. Uma análise multivariada, incluindo os teores séricos de proteína total, globulinas e gamaglobulinas, foi utilizada para determinar três grupos conforme à qualidade da transferência de imunidade passiva colostral apresentada (Proc cluster, SAS), a saber: baixa, moderada e alta. Durante o estudo, os produtores anotaram as informações referentes a práticas de manejo adotado na atenção a vaca (parturiente) e ao bezerro, incluindo os dados que poderiam ter influência sobre a transferência de imunidade passiva colostral. Os dados das bezerras, enquanto neonatas e depois quando adultas foram colhidos para a determinação da influência a curto e a longo prazo da falha da transferência de imunidade passiva (FTIP) colostral. Observou-se que os dados de escore de condição corporal da mãe da bezerra, da quantidade de colostro ingerida na primeira mamada e o momento em que ela foi realizada, da morbidade e da mortalidade das bezerras estavam relacionados com a FTIP (P<0,05). Os pesos ao nascer e ao primeiro mês de vida, assim como a freqüência de bezerras analisadas que pariram na propriedade não estavam relacionados diretamente com a qualidade da transferência de imunidade passiva. Fatores como a distocia, idade ao primeiro serviço e a produção média diária de leite não diferiram estatisticamente entre os grupos de baixa, moderada e alta transferência de imunidade passiva (P>0,05). Mas quando se correlacionou por regressão os dados de produção de leite das vacas que quando bezerras apresentaram teores de gamaglobulinas menores que 1,6 g/dL obteve-se valores de r2=0,47 (P=0,0005). Com os resultados desta pesquisa pode-se afirmar que práticas muito simples de manejo como fornecer pelo menos 2 L de colostro até 2 horas após o nascimento e a vaca parir numa boa condição corporal (ECC = 3 ou 3,5) podem prevenir a falha na transferência de imunidade passiva. A FTIP tem como conseqüências: maiores taxas de morbidade e mortalidade, primeiro parto mais tardio e diminuição do número de novilhas de reposição, podendo ainda estar correlacionada a menores produções leiteiras. / Adequate passive transfer of maternal immunoglobulin is important for optimal health and performance in newborn calves. Blood samples were collected from 354 dairy calves, ranging from 24 to 36 hours of age, between July 2005 and May 2006 on 10 farms in the middle-eastern region of the state of Parana, Brazil. The objective was to study the relationship and effectiveness of the transfer of colostral passive immunity and its contributing factors as related to the development and production of animals. For each sample collected, total serum protein was determined by the biuret method and albumin by bromocresol green method, and the difference was used to evaluate the globulins. Electrophoresis was used to determine the -globulin fraction of the sample. A multivariable analysis, including total serum protein, globulins and gamma globulin, was used to create 3 groups to classify the quality of the transfer of colostral passive immunity (cluster procedure, SAS): failure or inadequate group, marginal group and adequate group. During the study, breeders were asked to provide information on calf and pre-partum cow management practices, including details on colostrum feeding. Data from the calves while newborn and as heifers was gathered to determine the long and short term effect of the failure of passive immunity transfer (FPIT). Body condition score of the mother at calving, quantity of colostrum ingested, timing of ingestion, morbidity and mortality of calves and age at calving time were related to FPIT (P<0,05). The weight of the calves after birth and at one month of age and the frequency of calves that became cows in the farm were not directly related to failure. Dystocia, age at first service in days, and milk production did not differ statistically (P>0,05). However, when a regression was performed based on data of milk production from calves that had serum gamma globulins levels below 1,6g/dL, a correlation was identified (r2=0.47; P=0.0005). Basic management practices can prevent failure of passive immunity transfer by feeding calves 2 L of colostrum within 2 hours of life and ensuring that the cow calves with a good body condition score (BCS = 3 or 3.5). FPIT is responsible for higher morbidity and mortality rates, a delay in first parturition, a decrease in the number of replacement heifers and it can also be responsible for less milk production.

Durante a evolução da doença renal crônica (DRC) em cães, um dos mecanismos importantes envolvidos na autoperpetuação e progressão da lesão renal envolvem, teoricamente, o comprometimento inicial do glomérulo pelo mecanismo de hiperfiltração glomerular, e este processo pode acarretar no desenvolvimento de microalbuminúria ou de proteinúria pela presença de proteínas de alto peso molecular (albumina). Com o progredir da doença, as altas concentrações de proteína no filtrado glomerular pode também desencadear lesões tubulares e intersticiais, ocasionando a perda urinária também de proteínas de baixo peso molecular (PM) pelo comprometimento da reabsorção dessas proteínas pelos túbulos renais. Outras teorias de progressão da lesão renal também são suscitadas tais como o comprometimento inicial da porção túbulo-intersticial. Assim, espera- -se que durante a evolução da DRC, a avaliação das proteínas urinárias quanto à qualidade (determinação de albumina e os pesos moleculares) e a quantidade possam trazer informações relevantes sobre a velocidade de progressão e o local da lesão renal. O objetivo deste estudo foi de avaliar, sequencialmente, a albuminúria e a proteinúria (pelos métodos quantitativos e qualitativos - eletroforese de proteínas) dos cães com DRC nos estágios 1, 2 ou 3 ao longo do período de pelo menos 5 meses, e verificar a existência de alterações na intensidade ou no aparecimento de proteinúria e/ou albuminuria. Dezesseis cães (Grupo 1= 5 cães do estágio 1; Grupo 2= 5 cães do estágio 2 e Grupo 3= 6 cães do estágio 3), 9 fêmeas e 7 machos de raças variadas e idades entre 24 a 168 meses, foram acompanhados por 5 a 18 meses e os exames clínico e laboratorial realizados a cada 30 dias. Os cães dos Grupos 1 e 2 apresentaram bom controle clínico, entretanto o Grupo 3 apresentou evolução mais rápida da doença (3 cães vieram a óbito). No Grupo 1, o aumento da razão proteína:creatinina urinária (RPC; variação de 0,154 a 1,14) foi observada somente em um dos cães (no 1) e esta não era decorrente de albuminúria, mas sim da presença de proteínas de baixo peso molecular (lesão tubular) e também foi constatada diminuição progressiva da taxa de filtração glomerular pelo o aumento das concentrações de cistatina C sérica; os demais cães deste grupo apresentaram RPC e razão albumina:creatinina urinária (RAC) normais, entretanto com predomínio de proteínas de baixo peso molecular em 2 cães. No Grupo 2 fato semelhante também foi constatado, nos cães no 6 (inicialmente hipertenso) e 8 em que a RPC variou de 4,89 a 12,77 e 0,5 a 1,0, respectivamente; no cão no6 foi não foi detectada macroalbuminuria, mas somente microalbuminúria e com o predomínio de proteínas de baixo PM (lesão tubular), como também no cão no 8 (ausência de micro ou macroalbuminuria) em que houve o predomínio de 78 a 100% de proteínas de baixo PM e com 3 a 6 bandas. No Grupo 3, proteinúria foi constatada nos cães de no 11, 13 e 15 e a microalbuminúria somente no cão no11; o predomínio de proteínas de baixo PM foi observada nos cães no 11 e 13 e proteinúria mista no cão no 15. Assim, a avaliação sequencial ou seriada da proteinúria, pelo conjunto de informações obtido pela RPC, RAC e eletroforese de proteínas urinárias nos com cães com doença renal crônica, ao longo de um período, trouxe informações mais precisas acerca da qualidade das proteínas, identificando os segmentos do néfron que provavelmente foram comprometidos ao longo da evolução da doença. / During the course of chronic kidney disease (CKD) in dogs, one of the mechanisms involved in the autoperpetuation and progression of renal disease, in theory, is glomerular hyperfiltration, and this process may result in the development of microalbuminuria or proteinuria due to the presence of high molecular weight proteins (albumin). As the disease progresses, the presence of high concentrations of proteins in the glomerular filtrate may also cause the development of interstitial and tubular injuries, and in consequence the presence of low molecular weight proteins in urine as the impairment of tubular reabsorption mechanism of proteins is affected. Other theories of progression of renal injury are also raised such as the initial involvement of the tubulointerstitial segment. Thus, it is expected that during the course of CKD, the evaluation of the quality (determination of albumin and molecular weights) and quantity of urinary proteins may indicate relevant information about the location and rate of progression of renal injury. The objective of this study was to evaluate, longitudinally, albuminuria and proteinuria (by quantitative and qualitative methods - protein electrophoresis) of dogs with CKD in stages 1, 2 and 3 over the period of at least 5 months, and observe the changes in intensity or the appearance of proteinuria and / or albuminuria. Sixteen dogs (Group 1 = 5 dogs in stage 1, Group 2 = 5 dogs in stage 2 and Group 3 = 6 dogs in stage 3), 9 females and 7 males of various breeds and ages ranging from 24 to 168 months, were followed-up for 5-18 months and medical and laboratory monitoring data were recorded every 30 days. Dogs of Groups 1 and 2 showed good clinical control, however the Group 3 had a progressive deterioration of the disease (3 dogs died). In Group 1, the increase in urinary protein-to-creatinine ratio (UPC; ranging from 0.154 to 1.14) was observed in only one dog (no. 1) and albuminuria was not involved, however low molecular weights proteins (LMWP) were detected (tubular injury) and also the progressive decrease in glomerular filtration rate was noticed by the increase of serum concentrations of cystatin C; the remaining dogs in this group demonstrated normal UPC and UAC (urinary albumin-to-creatinine ratio), however the predominance of LMWP in 2 dogs was observed. In Group 2, similar findings were also noticed in CKD dogs no. 6 (initially hypertensive) and 8 , UPC ranged from 4.89 to 12.77 and 0.5 to 1.0, respectively; dog no. 6 demonstrated no macroalbuminuria but only microalbuminuria, and the predominance of LMWP (tubular injury) was observed as well as the dog no. 8 that had 78 to 100% of LMWP with 3 to 6 bands and no micro or macroalbuminuria was detected. Group 3 presented proteinuria in dogs no. 11, 13 and 15 and microalbuminuria was only observed in dog no. 11; the predominance of LMWP was noticed in dogs no.11 and 13, and mixed proteinuria in dog no. 15. Thus, the sequential or longitudinal study of proteinuria by means of several information obtained of UPC, UAC and urine protein electrophoresis in dogs with chronic kidney disease, followed-up over a period, could give more accurate information about the quality of proteins, allowing the possible identification of the segments of the nephron involved that could probably be affected throughout the course of the disease.

A cada ano a malária mata cerca de um milhão de pessoas. Segundo a OMS, 3,3 bilhões de pessoas, metade da população mundial, estão expostas à doença, principalmente em países subdesenvolvidos. Os fármacos utilizados no tratamento da malária incluem: cloroquina, primaquina, quinina, mefloquina, doxiclina, clindamicina e artemisina. A extensa resistência do parasita Plasmodium falciparum ao medicamento sintético cloroquina re-estabeleceu a quinina, um alcalóide encontrado na planta do gênero Cinchona, como droga antimalarial. A quinidina, o diastereoisômero da quinina, é usada como droga antiarrítmica e no tratamento de fibrilação arterial. Os estereoisômeros, cinchonina e cinchonidina, não são usados como medicamentos, embora mostrem efeitos similares àqueles da quinina e da quinidina. Os efeitos cardíacos da quinidina impossibilita seu uso como antimalarial. Outro alcalóide presente na espécie Cinchona é a hidroquinidina, que assim como a quinidina também apresenta atividade antiarrítmica. Os extratos vegetais são base para a produção de fitoterápicos, porém sem padronização o produto perde qualidade e a indústria não pode garantir a eficácia apregoada já que desconhece a concentração do princípio ativo no produto à venda. A portaria RDC 48/04 de 16.03.04 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabeleceu uma legislação específica, que se baseia na &#8220;garantia da qualidade&#8221;, exigindo a reprodutibilidade dos fitoterápicos produzidos, que só pode ser garantida com a utilização de extratos padronizados. De acordo com essa tendência, o objetivo do presente trabalho é o desenvolvimento de métodos de análise para os principais alcalóides da Cinchona por eletroforese capilar, podendo ser usada em caracterização de drogas vegetais, no controle de qualidade de extratos, bem como em possíveis adulterações. As determinações dos cinco principais alcalóides da Cinchona foram realizadas por eletroforese capilar de zona (CZE), utilizando como eletrólito TEA (1,1% v/v) com pH ajustado para 2,5 com ácido fosfórico e 20 mmol L-1 de &#945;-ciclodextrina, com tempo total de análise inferior a 12 minutos. A otimização das condições de análise foi realizada através da realização de experimentos de planejamento fatorial 32+1, sendo as variáveis do estudo a concentração de TEA e de &#945;-ciclodextrina. Com o uso de seletores quirais também foi desenvolvido um método para análise confirmatória dos alcalóides através do acoplamento de eletroforese capilar à espectrometria de massas, utilizando a estratégia de &#8220;partial filling&#8221;. Com objetivo de verificar o efeito do solvente na separação dos presentes alcalóides foi realizado um estudo do mecanismo de separação modulada por solvente em meio micelar (MEKC) e em meio não-aquoso (NACE). / Every year, malaria kills about one million people. According to OMS, 3.3 billion people, half of the world population, are exposed to the disease, mostly in underdeveloped countries. The pharmaceuticals used in the treatment of malaria include: chloroquine, primaquine, quinine, mefloquine, doxyclyne, clindamicina and artemisin. The increased resistance of the parasite Plasmodium falciparum to the synthetic pharmaceutical chloroquine reestablished quinine, an alkaloid found in the genus Cinchona, as antimalarial drug. Quinidine, the diasteroisomer of quinine, is used as antiarrhythmic drug in the treatment of arterial fibrillation. The diastereoisomers cinchonine and cinchonidine are not employed as pharmaceuticals although present similar effects to quinine and quinidine. The cardiac effects of quinidine hinders its use as antimalarial. Another alkaloid found in Cinchona is hydroquinidine, which similarly to quinidine also presents antiarrhythmic activity. Herbal extracts are the basis of phytotherapic production, however, with no standardization, the product lacks quality and the industry cannot guarantee its alleged efficacy, since there is no knowledge of the active principle concentration in the product put to sale. The ANVISA protocol (RDC 48/04 published on March16, 2004) established a specific legislation based on the &#8220;guarantee of quality&#8221;, which demands the reprodutibility of the produced phytotherapic, only achievable with standardized extracts. Following this tendency, the aim of this work was to develop methods of analysis for the main alkaloids of Cinchona using capillary electrophoresis, to apply in the characterization of herbal drugs, in the quality control of extracts as well as in the searching of possible adulterations. The determinations of five main alkaloids of Cinchona were carried out by capillary zone electrophoresis (CZE) using an electrolyte composed of 1.1% (v,v) TEA adjusted to pH 2.5 with phosphoric acid containing 20 mmol L-1 &#945;-cyclodextrin, providing a less than 12 min total analysis time. The optimization of analytical conditions was conducted experimentally by a 32+1 factorial design where the studied variables were TEA and &#945;-cyclodextrin concentrations. With the use of chiral selectors a confirmatory analytical method for alkaloids was also developed with the coupling of capillary electrophoresis and mass spectrometry employing a strategy called &#8220;partial filling&#8221;. With the purpose of verifying solvent effects on the separation of the alkaloids under investigation, studies of the separation mechanism as modulated by solvent in micelar medium (MEKC), and non aqueous medium (NACE) were conducted.

A malária é a doença que mais mortes causa no mundo. O uso de fármacos antimaláricos representa a solução mais eficaz para o combate e controle da doença e o interesse pelo desenvolvimento de novos fármacos é grande devido a problemas de resistência. Existe uma grande variedade de fármacos antimaláricos, sendo que muitos deles são quirais, vendidos e administrados como mistura racêmica. Nas últimas décadas, houve um aumento no interesse quanto aos aspectos farmacodinâmicos e farmacocinéticos de fármacos quirais, devido ao conhecimento de que um dos isômeros pode ser mais ativo ou mais tóxico que o outro. Sendo assim, tem-se a necessidade do desenvolvimento de métodos analíticos enantiosseletivos, e a eletroforese capilar tem emergido como uma técnica de separação quiral com alto poder de resolução. Além disso, a inexistência de métodos oficiais para fármacos antimaláricos e os poucos estudos que relatam aplicações na análise de formulações farmacêuticas, demandam o desenvolvimento e validação de novos métodos para tal finalidade. Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de dois métodos analíticos, não quiral e quiral, para a determinação de fármacos antimaláricos em formulações farmacêuticas por eletroforese capilar. O método não quiral utilizou eletroforese capilar de zona, sendo otimizado para a separação de 7 fármacos antimaláricos (cloroquina, hidroxicloroquina, primaquina, quinidina, quinina, quinacrina e mefloquina) com um eletrólito composto por 45 mmol L-1 de tampão citrato, pH 4,50, e apresentou um tempo de análise de 10 minutos, permitindo a separação dos diastereoisômeros quinina e quinidina sem a adição de aditivos. O método quiral utilizou eletroforese capilar de zona modificada por ciclodextrina e foi otimizado para separação enantiosseletiva de cloroquina, mefloquina, hidroxicloroquina, primaquina, quinina e quinidina com um eletrólito composto por 50 mmol L-1 de tampão citrato, e 2% de S-&#946;-CD, pH 2,7. A separação dos fármacos antimaláricos e seus enantiômeros foi alcançada com tempo de análise de 12 minutos. Os métodos desenvolvidos foram validados de acordo com os protocolos oficiais, apresentando características adequadas e foram aplicados na determinação de cloroquina, hidroxicloroquina e mefloquina em formulações farmacêuticas. Como figuras de mérito para o método não quiral, tem-se: linearidade (R2 > 0,99), LD (7,43 - 24,4 &#181;mol L-1), LQ (22,5 - 73,8 &#181;mol L-1), precisão intermediária (0,76 - 1,7% RSD), recuperação (97,8 - 102,2%). Para o método quiral, tem-se: linearidade (R2 > 0,99), LD (7,43 - 9,58 &#181;mol L-1), LQ (22,8 - 29,0 &#181;mol L-1), precisão intermediária (0,50 - 1,8% RSD), recuperação (97,7 - 102,5%). Um ensaio de robustez para ambos os métodos foi realizado para comparar os resultados obtidos aplicando-se pequenas variações de tensão e temperatura. Observou-se que não existe uma diferença significativa entre os resultados, a um nível de confiança de P = 95 %. / Malaria is a disease that causes a large number of deaths worldwide. The use of antimalarial drugs is the most effective solution to combat and control the disease and interest in the development of new antimalarial drugs is still of great importance due to resistance issues. There is a wide variety of antimalarial drugs, many of which are chiral, sold and administered as racemic mixtures. In recent decades there has been an increased interest regarding the pharmacodynamic and pharmacokinetic aspects of chiral drugs, due to the knowledge that one of the isomers can be more active or more toxic than the other. Thus, there is a need for the development of enantioselective analytical methods, and capillary electrophoresis has emerged as a chiral technique separation with high resolving power. Moreover, the lack of official methods for antimalarial drugs and the few studies reporting applications in the analysis of pharmaceutical formulations, demands the development and validation of new methods for this purpose. This work aims at the development of two analytical methods, non-chiral and chiral, for the determination of antimalarial drugs in pharmaceutical formulations by capillary electrophoresis. The non-chiral method used capillary zone electrophoresis, being optimized for the separation of 7 antimalarial drugs (chloroquine, hydroxychloroquine, primaquine, quinidine, quinine, quinacrine and mefloquine) with an electrolyte consisting of 45 mmol L-1 of citrate buffer, pH 4.50, and had an analysis time of 10 minutes, allowing separation of isolated diasteroisomers quinine and quinidine without any additives. The chiral method used capillary zone electrophoresis modified by cyclodextrin and was optimized for enantioselective separation of chloroquine, mefloquine, hydroxychloroquine, primaquine, quinine and quinidine with an electrolyte consisting of 50 mmol L-1 citrate buffer and 2% S-&#946;-CD, pH 2.7. The separation of the antimalarial drugs and their enantiomers was achieved in less than 12 minutes. The proposed methods were validated following official protocols, with adequate results and were used for determination of chloroquine, hydroxychloroquine, and mefloquine in pharmaceutical formulations. Figures of merit for the non-chiral method include: linearity (R2> 0.99), LD (7.43 to 24.4 &#181;mol L-1), LQ (22.5 to 73.8 &#181;mol L-1), intermediary precision (0.76 to 1.7% RSD), and recovery (from 97.8 to 102.2%). For the chiral method, we have: linearity (R2> 0.99), LD (7.43 to 9.58 &#181;mol L-1), LQ (22.8 to 29.0 &#181;mol L-1), intermediary precision (0.50 to 1.8% RSD), and recovery (from 97.7 to 102.5%). For both methods a robustness test was performed to compare the results obtained by applying slight variations in voltage and temperature. It was observed that there is no significant difference between the results, a confidence level P = 95%.