Neste trabalho, foram desenvolvidos métodos para determinação de espécies neutras por eletroforese capilar (CE) com detecção condutométrica sem contato (CCD). Estratégias baseadas em eletroforese capilar em solução livre (FSCE) e cromatografia micelar eletrocinética (MEKC) foram utilizadas em três casos: misturas de álcoois alifáticos, misturas de açúcares e salbutamol. Estas substâncias foram escolhidas por apresentarem ampla distribuição de características químicas. Os n-álcoois possuem regiões polares e apoIares distintas ao longo da cadeia carbônica, sendo que em solução aquosa se apresentam invariavelmente como espécies neutras. Os açúcares, apesar das longas cadeias carbônicas, possuem grande número de hidroxilas uniformemente distribuídas e podem ser ionizados a valores elevados de pH. Já o salbutamol, pode ser encontrado como espécie catiônica, neutra ou aniônica, dependendo do pH do meio. A melhor aproximação para os álcoois foi MEKC, que permitiu a separação e detecção da ordem de 10-4 mol·L-1 para cinco isômeros de pentanol. A utilização de eletrólito de corrida com pH 12,1 permitiu a determinação de frutose, glicose, galactose e sacarose da ordem de 10-5 moI&middotL-1 por FSCE em capilares de 20 µm. Salbutamol pode ser detectado como cátion e ânion em FSCE em limites de detecção da ordem de dez vezes menores que aquele obtido para a espécie neutra por MEKC. Como o mecanismo pelo qual ocorre a detecção condutométrica em MEKC não era ainda bem conhecido, foram desenvolvidos experimentos que ajudassem a elucidá-Io. Medidas de condutividade, viscosidade e análise de impedância de soluções tampão com dodecilsulfato de sódio (SDS) com n-álcoois e experimentos com soluções similares em MEKC demonstraram que a resposta observada com CCD é bastante complexa, pois vários fenômenos contribuem para o comportamento da condutividade na região dos analitos. Os principais fenômenos, os quais não estavam sendo devidamente considerados em modelos anteriores, são a dissociação e a ionização provocadas pelos analitos sobre as micelas. Estes fenômenos seriam particularmente significativos para as mobilidades das espécies envolvidas nas micelas, provocando a propagação de vacâncias que seriam então detectadas. / In the present work, analytical methods for determination of neutral species based on capillary electrophoresis (CE) with contactless conductivity detection (CCD) were developed. Free solution capillary electrophoresis (FSCE) and micelar electrokinetic chromatography (MEKC) were applied to three cases: mixtures of aliphatic alcohols, mixtures of sugars, and salbutamol. These substances were selected due to their distinctiveness. The alcohols have well-defined polar and apoIar regions in their carbonic chain and are typical non-ionic species in aqueous medium. The sugars have a great number of hydroxyl groups along the carbonic chain, which give a polar nature and can be ionized at high pH values. The salbutamol is amphoteric. The best approach for the alcohols was MEKC that allowed separation of five pentanol isomers with limit of detection of 10-4 mol·L-1. A running electrolyte with pH 12.1 allowed determination of 10-5 mol·L-1 of fructose, glucose, galactose, and sucrose, using FSCE with 20-µm inner diameter capillary. The sensitivity for the cationic and anionic forms of albuterol in FSCE was about ten times greater than that one achieved by MEKC for the neutral species. Since the conductivity detection in MEKC was not clearly understood, some experiments were carried out in order to improve the knowledge about it. Conductivity and viscosity measurement as well as impedance analysis of buffered sodium dodecyl sulfate solution with n-alcohols and experiments using similar conditions in MEKC showed that CCD response is complex, because several phenomena contribute to the solution conductivity in the region of the analytes. The main phenomena, which are not properly considered in the previous models, are the effects of the analytes on the dissociation and ionization of the micelles. These phenomena would be responsible for the vacancies detected as negative peaks, which would be formed by the augment of the mobilities of the species involved in the micelle formation.

O topiramato (TPM) é um fármaco antiepiléptico utilizado para o controle de crises epilépticas generalizadas e parciais em adultos e crianças. A determinação da concentração plasmática do TPM em associação com as observações clínicas é de suma importância, uma vez que permite o ajuste individual da dose administrada ao paciente, diminuindo a incidência de reações adversas e melhorando a adesão ao tratamento. No presente trabalho, dois métodos bioanalíticos foram desenvolvidos e validados para análise do TPM em amostras de plasma, por eletroforese capilar utilizando os detectores DAD (detecção indireta) e C4D Lite (detecção condutométrica). A análise eletroforética para ambos os métodos foi realizada em um capilar de sílica fundida de 75 ?m de diâmetro interno e 40 cm de comprimento efetivo. O eletrólito de corrida foi composto por trietanolamina (TEA) 15 mmol L-1 para a detecção condutométrica e TEA 15 mmol L-1, ácido 3,5 dinitrobenzóico (DNB) 5 mmol L-1 e brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) 0,4 mmol L-1 para detecção indireta. As injeções foram feitas no modo hidrodinâmico a 0,8 psi por 5 segundos e a tensão aplicada foi de -20 e 20 kV para detecção indireta e condutométrica, respectivamente. Nestas condições, o TPM migrou em 2,5 min. O preparo das amostras foi realizado por extração líquido-líquido (LLE), usando éter metil-terc-butílico (MTBE) como solvente extrator e utilizando 500 e 200 ?L de plasma para o método com detecção indireta e condutométrica, respectivamente. Os métodos foram validados de acordo com os guias oficiais da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e European Medicine Agency e apresentaram linearidade no intervalo de concentração plasmática de 1-30 ?g mL-1 e valores de precisão e exatidão abaixo de 15 %, além de serem seletivos. Assim, ambos os métodos foram aplicados com sucesso em amostras de plasma de pacientes em tratamento com o TPM. Embora os detectores universais geralmente apresentem um maior limite de detecção comparado com detectores seletivos, o método com detecção condutométrica desenvolvido neste trabalho apresentou como vantagem maior sensibilidade em relação método indireto (DAD). Além disso, apresentou também vantagens como simplicidade e baixo custo, mostrando viabilidade na aplicação para análises de rotina. / Topiramate (TPM) is an antiepileptic drug that has been used as an agent for the control of partial and generalized seizures in both adults and children patients. The determination of the plasmatic concentration of TPM in association with clinical observations is of utmost importance for the individual adjustment of the administered dose to the patient. In the present work, two bioanalytical methods have been developed and validated for TPM analysis in plasma samples by capillary electrophoresis using DAD (indirect detection) and C4D Lite detectors (conductometric detection). The electrophoretic analysis for both methods were performed on a fused silica capillary of 75 ?m of internal diameter and 40 cm effective length. The background electrolyte was composed of triethanolamine (TEA) 15 mmol L-1 for conductometric detection and TEA 15 mmol L-1, 3,5 dinitrobenzoic acid (DNB) 5 mmol L-1 and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 0.4 mmol -1 for indirect detection. The injections were carried out in hydrodynamic mode, at 0.8 psi for 5 seconds, and the voltage applied were -20 e 20 kV for indirect and conductometric detection, respectively. Under these conditions, TPM migrated in 2.5 min. The sample preparation was carried out by liquid liquid extraction (LLE) using methyl tert-butyl ether (MTBE) as solvent, and using 500 and 200 ?L of plasma samples for direct and conductometric detection, respectively. The methods were validated according to the official guides of the Agência Nacional de Vigilância Sanitária and European Medicine Agency, and showed linearity in plasmatic concentration range of 1-30 mg L-1, precision and accuracy values below 15%, beside selectivity. Both methods have been applied successfully to analysis of plasma samples of patients in treatment with TPM. Although universal detectors have a higher quantification limit compared with selective detectors, the method with conductometric detection developed in this work presented greater sensitivity than indirect method (DAD). Furthermore, it also presented advantages such as simplicity and low cost, showing feasibility in applying to routine analysis.

Em bovinos, o sucesso no estabelecimento da gestação depende de interações entre o concepto e o útero. Tais interações ocorrem através de moléculas presentes no ambiente uterino. Falhas nesse processo causam 30-40% de perdas de gestação. As proteínas são constituintes desse ambiente e possuem um importante papel nesse processo. Objetivou-se na presente dissertação caracterizar o perfil protéico do ambiente uterino de fêmeas bovinas, ciclando ou prenhes, durante o período crítico, utilizando eletroforese bidimensional. O objetivo específico foi comparar a composição protéica de lavados uterinos obtidos in vivo, por sonda de folley ou post-mortem no dia 18 após o estro de vacas não inseminadas ou gestantes. Para a obtenção das amostras, 48 fêmeas bovinos tiveram seu ciclo estral sincronizado e foram alocadas aleatoriamente para receberem lavagens in vivo por sonda de folley (12 inseminadas e sete não inseminadas) ou para receberem lavagens post-mortem (12 inseminadas e cinco não inseminadas) no dia 18 após o estro. Após a coleta, os lavados foram processados e submetidos à eletroforese bidimensional. Os géis foram analisados utilizando o programa Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Healthcare) para determinação do ponto isoelétrico (PI) e peso molecular relativo (PMR) das proteínas nos diferentes grupos e análise da densidade óptica. Foram selecionadas 178 proteínas presentes nos lavados. Em relação à distribuição das proteínas de acordo com o ponto isoelétrico, 74% (132/178) apresentaram PI entre 5,5 e 8, em relação ao peso molecular, 44% (79/178) das proteínas possuíam PMR menor que 50KDa enquanto 54% (95/178) entre 50 e 100KDa. Nos lavados realizados por sonda de folley (FC ou FP) foram selecionadas 151 proteínas, sendo 96 nos lavados de animais cíclicos e 86 nos prenhes. Os lavados realizados post-mortem (PMC ou PMP) apresentaram apenas 54 proteínas, das quais 24 estiveram presentes nos lavados PMC e 36 nos lavados PMP. Em relação ao estado reprodutivo 115 proteínas foram encontradas nos lavados dos animais cíclicos (FC ou PMC), enquanto 104 proteínas foram selecionadas nos lavados de animais prenhes (FP e PMP). Entre os lavados realizados por sonda de folley (FC e FP) 31 proteínas foram comuns entre os estados, enquanto entre os lavados realizados post-mortem (PMC e PMP) apenas seis proteínas estiveram presentes em ambos os lavados. Nos lavados realizados em animais ciclando (FC e PMC) cinco proteínas estiveram presentes em ambos os tipos de lavados, enquanto nos lavados realizados em animais prenhes (FP e PMP) 18 proteínas foram comuns em ambos os tipos de lavado. Entre os lavados FC e PMP ou FP e PMC, 15 e 6 proteínas, respectivamente, foram comuns. As proteínas presentes exclusivamente nos lavados de vacas prenhes, possivelmente estão envolvidas no diálogo materno-embrionário durante o processo de estabelecimento da gestação. Proteínas detectadas exclusivamente nos lavados obtidos via sonda de folley podem ser devidas ao influxo de proteínas do soro sanguíneo em resposta à manipulação do trato reprodutivo durante a obtenção dos lavados. Esperava-se uma maior efetividade dos lavados realizados post-mortem em relação aos realizados por sonda de folley. Entretanto os lavados obtidos por sonda de folley foram melhores por identificar um maior numero de proteínas, permitindo identificar diferenças maiores entre os lavados de animais ciclando e prenhes. Concluiu-se que a eletroforese bidimendional constitui um método adequado para avaliar quantitativamente o perfil protéico do ambiente uterino bovino e que tanto o estado reprodutivo quanto o método de obtenção de lavados uterinos modificam sua composição protéica. Novos estudos são necessários para se obter a seqüência de aminoácidos das proteínas localizadas para que se conheça sua identidade e função na gestação inicial de bovinos. / In the cattle, the outcome for the establishment of pregnancy depends on interactions between conceptus and uterus. These interactions occur through molecules presents in the uterine environment. Failure in this process causes 30-40% of loss in gestation. The proteins are component of this environment and have a important role in this process. The aim of this dissertation was to characterize the protein profile of the uterine environment in cows, cyclic or pregnant, during the critical period, using two-dimensional electrophoresis. The specific aim was to compare the protein composition of uterine washings recovered in vivo, through a folley catheter, with washings recovered post-mortem at day 18 after estrus of not inseminated or pregnant cows. To obtain the samples 48 cows had their estrous synchronized and here aleatoric put in the group to receive washings in vivo through the folley catheter (12 inseminated and seven not inseminated) or to be washed post-mortem (12 inseminated and five not inseminated) at day 18 after estrus. After the recover, the washings were proceeded and submitted to two-dimensional electrophoresis. The gels were analyzed using the software Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Heathcare) to determine the isoelectric point (PI) and relative molecular weight (PMR) of the proteins presents in the different groups and analysis of the optical density. One hundred and seventy eight proteins were presents in the washings. The distribution of the proteins according to the PI, 74% (132/178) had PI between 5,5 and 8 and according to the PMR 44% (79/178) of the proteins showed PMR lower than 50KDa, while 54% (95/178) had PMR between 50 and 100KDa. In the washings recovered through the folley catheter (FC and FP) 151 proteins were selected, being 96 from the cyclic cows and 86 from the pregnant cows. The washings recovered post-mortem (PMC and PMP) showed only 54 proteins, from those 24 were present in the cyclic animals and 36 in the pregnant animals. According to the reproductive status 115 proteins were found in the washings from the cyclic animals (FC and PMC), while 104 proteins were selected from the washings of the pregnant animals (FP and PMP). Among the washings recovered through the folley catheter (FC and FP) 31 proteins were the same between the reproductive status. While in the washings recovered post-mortem (PMC and PMP) only six proteins were present in both washings. In washings done in the cyclic animals (FC and PMC) five proteins were presents in both kind of washings, while in washings done in the pregnant animals (FP and PMP) 18 proteins were the same in both kind of washings. Among the washings FC and PMP or FP and PMC, 15 and six proteins, respectively were the same. The proteins presents exclusively in the washings of the pregnant animals are probably involved with the embryo-maternal interplay during the process of pregnancy establishment. Proteins detected exclusively in the washings recovered through the folley catheter may be inflow of proteins from the serum, in response to the uterine manipulation during the process of washing. It was expected a better effect from the washings post-mortem than the ones through the folley catheter. However the washings from the folley catheter had a better result, because they identified a greater number of proteins which allowed identify greater differences between the washings from cyclic and pregnant animals. In conclusion, the two-dimensional electrophoresis is a adequate method to analyze the quantitatively proteins profile of the uterine environment in the cow and that both the reproductive status and the method to obtain the uterine washings modify the proteins composition. New studies are necessary to obtain the amino acids sequence of the proteins found so that we know their identity and function in the beginning of pregnancy in the cow.

A proteinúria de origem renal é um indicador de lesão e atua na progressão da doença renal crônica em cães. Na rotina clínica, várias são as recomendações em relação à terapia de manutenção, que visam minimizar ou retardar a progressão da doença. Com o recente progresso na pesquisa sobre a terapia com as células tronco mesenquimais (CTM), tem-se discutido sobre a possibilidade de minimização dos mecanismos inflamatórios e imunológicos de autoperpetuação da lesão renal com a sua utilização, assim a análise sequencial das proteínas urinárias por métodos qualitativos, tais como a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e a imunodetecção das proteínas por Western Blot pode trazer subsídios para esta avaliação. Portanto, como hipótese, suscita-se que a administração de CTM em cães com DRC possa trazer benefícios com o intuito de minimizar o desenvolvimento da proteinúria, contribuindo para o retardo na velocidade de progressão da doença renal. Trata-se de um estudo prospectivo, longitudinal e duplo-cego em que foram avaliados 22 cães com DRC, tratados com solução fisiológica (SF) ou CTM e avaliados a cada 30 a 45 dias em 12 momentos, divididos em grupos de acordo com o estágio da doença, grupo A (estágio 2, SF:n=6, CTM:n=3) e grupo B (estágio 3, SF:n=6, CTM:n=7). Observou-se que os cães do Grupo B apresentaram proteinúria mais intensa, maior porcentagem de proteínas de alto peso molecular, maior imunodetecção de albumina, proteínas ligadas ao retinol e a vitamina D e menor imunodetecção de proteína de Tamm-Horsfall ao longo do acompanhamento, quando comparado ao Grupo A. Os resultados obtidos nesse estudo não permitiram definir conclusões contundentes de que a terapia com a CTM tenha trazido alterações importantes que indicassem o seu benefício. Os dados sugerem que os cães nos estágios iniciais da DRC (estágio 2) poderiam ser os mais favorecidos com a referida terapia, entretanto mais estudos contemplando um número maior de animais, como o maior tempo de acompanhamento devem ser conduzidos para tal investigação. / Protein of renal origin is an indicator of injury and acts on the progression of chronic kidney disease in dogs. In the clinical routine, several recommendations regarding maintenance therapy are aimed at minimizing or delaying the progression of the disease. With the recent progress in the research on mesenchymal stem cell therapy (CTM), it has been discussed the possibility of minimizing the inflammatory and immunological mechanisms of self-perpetuation of the renal lesion with its use, thus the sequential analysis of the urinary proteins by qualitative methods such as polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the immunodetection of proteins by Western blot can prove the efficacy of the therapy. Therefore, as hypothesis, it is suggested that the administration of CTM in dogs with CKD can fetch benefits in order to minimize the development of proteinuria, contributing to the delay in the rate of progression of renal disease. This is a prospective, longitudinal, double-blind study in which 22 dogs with CKD were treated with physiological solution (SF) or CTM and evaluated every 30 to 45 days in 12 moments divided into groups according to (stage 2, SF: n = 6, CTM: n = 3) and group B (stage 3, SF: n = 6, CTM: n = 7). Group B dogs were found to have more intense proteinuria, a higher percentage of high molecular weight proteins, greater albumin immunodetection as well as retinol-binding protein and vitamin D-binding protein, and decreased Tamm-Horsfall protein immunodetection throughout follow-up, when compared to Group A. The results obtained in this study did not allow to draw conclusive conclusions that CTM therapy brought important changes that indicated its benefit. The data suggest that dogs in the early stages of CKD (stage 2) could be the most favored with such therapy, however more studies contemplating a larger number of animals, such as longer follow-up, should be conducted for such investigation.

Estudou-se o perfil de proteínas de plasma seminal de touros das raças Nelore (Bos taurus primigerus indicus) e Simental (Bos taurus primigerus taurus), criados a campo, em regime de acasalamento múltiplo e manejo extensivo, na região de Dourados/MS, a fim de analisar a relação entre estas proteínas e características ligadas ao desempenho reprodutivo de touros. Coletaram-se amostras de sêmen no período de inverno (Julho/2001) e verão (Fevereiro/2002), realizando-se inicialmente o exame andrológico nos animais, e em seguida a análise padrão do sêmen. O plasma seminal foi, então, submetido à dosagem de proteínas totais, à dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliação da ocorrência de lipoperoxidação, e à eletroforese bidimensional de proteínas. Para análise do perfil proteico de plasma seminal da cada raça, foram utilizados os seguintes parâmetros: comparação entre os períodos de inverno e verão; comparação de grupos de amostras separados de acordo com a quantificação de características ligadas ao desempenho reprodutivo (morfologia espermática, dosagem de proteína total e dosagem de TBARS); e comparação de grupos de amostras separados de acordo com classificações para avaliação da capacidade reprodutiva, previamente descritas na literatura (Breeding Soundness Evaluations – BSEs). Os touros da raça Simental demonstraram menor adaptação às condições ambientais tropicais, com valores mais altos de defeitos espermáticos maiores, proteína total e dosagem de TBARS no período de verão. Observou-se grande variabilidade no perfil proteico entre as raças Nelore e Simental e, dentro de cada raça, encontrou-se expressiva variação individual. O perfil de proteínas de plasma seminal de touros Nelore apresentou 155 spots, entre os quais 04 se destacaram como possíveis marcadores de características ligadas ao desempenho reprodutivo. Já na raça Simental foram identificados 248 spots, com destaque para 04 spots, que demonstraram maior potencial como marcadores de características de interesse para a reprodução. Os resultados mostram que o perfil de proteínas de plasma seminal está relacionado ao desempenho reprodutivo de touros, fazendo-se necessários maiores estudos sobre as proteínas que se destacaram como marcadores, a fim de identificar as funções que elas exercem no trato reprodutivo e nos eventos ligados à fertilização. / Seminal plasma proteins profiles from Nelore (Bos taurus primigerus indicus) and Simmental (Bos taurus primigerus taurus) bulls, used for multiple-sire breeding under range conditions, at Dourados/MS region, were studied aiming to analyze the relation between these proteins and traits linked to bulls’ reproductive performance. Semen samples were collected in the winter (July/2001) and summer (February/2002). Initially, an andrological examination was performed, followed by standard semen analysis. Seminal plasma was subjected to total protein quantification, thiobarbituric acid reactive substances quantification (TBARS, to evaluate lipid peroxidation), and two-dimensional protein electrophoresis. To analyze seminal plasma protein profile of each breed, the following parameters were used: comparison between winter and summer, comparison among groups of samples divided by quantification of traits linked to reproductive performance (sperm morphology, total protein quantification, TBARS quantification) and comparison among groups of samples divided by breeding soundness evaluations (BSEs), previously reported in literature. Simmental bulls showed lower adaptability to tropical environment conditions, with higher values of major sperm defects, total protein and TBARS in the summer. A great variability was observed in the protein profile between Nelore and Simmental breeds, and, for each breed it was found great individual variability too. Nelore seminal plasma protein profile presented 155 spots, 04 of which were considered potential markers for traits linked to reproductive performance. For Simmental breed, 248 spots were identified, with special interest for 04 spots, which showed higher potential as markers to reproductive characteristics. Results show that seminal plasma protein profile is related to bulls’ reproductive performance. Further studies about those proteins which are potential markers are needed, to determine their function at bulls’ reproductive system and in the events related to fertilization.

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética recessiva e hereditária, ligada ao cromossomo X, caracterizada pela ausência ou insuficiência da proteína distrofina no sarcolema das fibras musculares. É uma doença muscular progressiva, que afeta um em cada 3.500 meninos. Atualmente, os cães da raça Golden Retriever, portadores da distrofia muscular do Golden Retriever (GRMD), que exibem mudanças musculares, patogenia, bem como o fenótipo, comparáveis aos vistos nos casos de DMD, vêm sendo considerados o melhor modelo animal para o estudo da DMD. Nos GRMDs a fraqueza muscular inicia-se a partir do segundo mês de vida e é progressiva, portanto, a expectativa de vida destes cães é muito reduzida. Histologicamente, os músculos mostram necrose, fibrose e regeneração. As manifestações patológicas da GRMD já se iniciam na vida intra-uterina com o desenvolvimento de lesões nos músculos da língua. A hipertrofia da língua está associada com disfunção da faringe e do esôfago, o que resulta em disfagia,regurgitação e sialorréia. O objetivo desse estudo foi avaliar no modelo animal, utilizando cães golden retrievers normais e afetados pela distrofia muscular de duchenne, a proteína na urina e o peso molecular das proteínas urinárias, além de acompanhar a bioquímica sérica. Durante quatro meses seis cães machos com distrofia muscular e idade entre dois e seis anos tiveram amostras de urina coletadas a cada duas semanas e amostras de sangue coletadas uma vez por mês, e três cães normais foram avaliados para estabelecer uma comparação. Nas amostras sanguíneas foram realizados exames para avaliar a função renal e a urina foi usada para a mensuração de proteína, creatinina e a realização da eletroforese. Não foi encontrado indício de lesão renal nos exames realizados nas amostras de sangue e também na relação proteína:creatinina nas amostras de urina. Na análise das eletroforeses, foi encontrado diferenças na quantidade de bandas protéicas apresentadas entre os animais normais e os cães com distrofia muscular. Os cães com distrofia apresentam uma maior distribuição de bandas de alto peso molecular que não são encontradas nos cães normais, além de terem ainda uma maior quantidade de proteínas de baixo peso molecular. Apesar de se manterem dentro dos parâmetros estabelecidos para lesão renal, os cães com distrofia, tem bandas protéicas que não são vistas em animais normais e que mantém a integridade do parênquima renal. / Duchennes Muscular Dystrophy (DMD) is a lethal childhood disease, a X-linked recessive disorder, caused by mutations of the dystrophyn gene, a protein that has a vital role in maintaining muscle structure and function. DMD is a progressive muscular disease, which affects 1:3500 born boys. At this moment, the dogs with Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD), are the best animal model to study DMD. GRMD dog exhibits muscle changes, pathogenesis and phenotype comparable with the DMD boys. In GRMDs, the muscular weakness beginning with 60 days of life and this is progressive. Histologically, the muscles show necrosis, fibrosis, degeneration and regeneration. The pathogenesis manifests in utero with the development of lingual muscle lesions. The tongue hypertrophy is associated with pharyngeal and esophageal dysfunction, and results in dysphagia, regurgitation and drooling. The aim of this research was investigates in normal dogs and in dogs affected by the Duchene muscular dystrophy the protein in the total urinary proteins and their separation with SDS-PAGE. During four months, six male dogs between two and six years were evaluated. The blood was examined once a month and the urine twice a month, three normal dogs were examined to establish a comparison between both. In blood samples were carried out tests to evaluate renal function and urine was used for the measurement of protein, creatinine and for electrophoresis. We found no evidence of kidney damage in tests performed on blood samples and also in the protein: creatinine ratio in urine samples. In the analysis of electrophoresis, we found differences in the amount of protein bands presented between normal dogs and dogs with muscular dystrophy. GRMD dogs have a wider distribution of bands with high molecular weight, which are not found in normal dogs. In addition they have a greater amount of protein with low molecular weight. While staying within the parameters established for renal injury, the dogs with dystrophy, has protein bands not seen in normal animals that maintains the integrity of the renal parenchyma.

A crescente demanda por produtos farmacêuticos tem como consequência a necessidade de elaboração de novos procedimentos analíticos que, via de regra, apresentem características como: elevada frequência analítica, simplicidade, ausência de substâncias altamente tóxicas, e com baixo custo para o controle de qualidade dos fármacos lançados no mercado. Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de procedimentos para determinação de N-acetilcisteína (NAC), nimesulida (NMS), trimetoprima (TMP) e sulfametoxazol (SMX) em formulações farmacêuticas usando técnicas eletroanalíticas e métodos de separação. Na determinação da NAC foi usado um eletrodo de grafite pirolítico modificado com ftalocianina de cobalto (CoPc) em 0,1 mol L-1 de NaOH. Este sensor mostrou intensa catálise para NAC produzindo um aumento na corrente anódica de cerca de 700 vezes quando comparado com o eletrodo limpo. Um procedimento em FIA foi proposto usando este sensor, e a curva analítica foi linear no intervalo 5,0 × 10-5 a 1,0 × 10-3 mol L-1, com coeficiente de correlação maior que 0,999. O DPR de 1,1% (n = 13) foi obtido para uma solução contendo 5,0 × 10-4 mol L-1 de NAC. Além disso o método apresentou LD e LQ de 9,0 ×10-7 mol L-1 e 3,0 × 10-6 mol L-1, respectivamente. A determinação eletroanalítica de NMS foi conduzida em solução de 1,0 mol L-1 de NaOH usando eletrodo de carbono vítreo, meio em que não ocorre envenenamento da superfície do eletrodo. Desse modo, um método eletroanalítico usando voltametria de onda quadrada foi elaborado para análise de NMS. Nas condições ótimas de análise o método apresentou uma faixa linear no intervalo de 4,3 × 10-5 a 4,2 × 10-4 mol L-1, com limite de detecção de 3,2 × 10-6 mol L-1. A precisão do método foi avaliada em um mesmo dia de análise por sucessivas medidas voltamétricas (n = 10) em solução de hidróxido de sódio 1,0 mol L-1 contendo 1,0 × 10-4 mol L-1 de NMS, sem a necessidade de renovação da superfície do eletrodo. Os resultados para esta série de medidas foram avaliados e o DPR calculado foi somente 1,2%, indicando que nessas condições o eletrodo apresentou uma resposta estável além de não sofrer qualquer efeito de envenenamento. Para a determinação simultânea de TMP e SMX foi desenvolvido um método analítico empregando eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (C4D). Usando uma solução 10 mmol L-1 lítio-fosfato (pH 7,1 ) como tampão de corrida, a faixa linear de trabalho obtida para ambos os analitos foi de 12,5 a 200 × 10-6 mol L-1 com R > 0,999. Nas condições de análise foram obtidos LDs de 1,1 × 10-6 mol L-1 para a TMP, e 3,3 × 10-6 mol L-1 para o SMX com um tempo total de análise de 2,6 minutos. / The growing demand for pharmaceutical products has created need for developing new analytical procedures that, as a rule, exhibit characteristics like, high sampling rate, simplicity, absence of highly toxic substances, and low cost for quality control of drugs launched in market. In this work, electroanalytical and capillary electrophoresis methods for determination of N-acetylcysteine (NAC), nimesulide (NMS), trimethoprim (TMP) and sulfamethoxazole (SMX) in pharmaceutical formulations were proposed. For NAC determinations a pyrolytic graphite electrode modified with CoPc in 0.1 mol L-1 NaOH was used. This new sensor showed to be catalytic for this compound producing an anodic current increase of 700 times when compared with bare electrode. A FIA procedure was proposed using this new sensor, and the method showed a linear response in a range of 5.0 × 10-5 to 1.0 × 10-3 mol L-1 with correlation coefficient better than 0.999. RSD of 1.1% (n = 13) was obtained for a solution containing 5.0 × 10-4 mol L-1 NAC. Furthermore the method presented DL and QL of 9.0 × 10-7 mol L-1 and 3.0 × 10-6 mol L-1, respectively. NMS electroanalytical determination was conducted in a 1.0 mol L-1 NaOH solution using a glassy carbon electrode. In strongly alkaline medium it was verified that NMS does not produce poisoning of the electrode surface. Thus an electroanalytical method using square wave voltammetry was proposed for analysis of NMS. In the optimal analysis conditions proposed method showed a linear response in a range of 4.3 × 10-5 to 4.2 × 10-4 mol L-1, with detection limit of 3.2 × 10-6 mol L-1. Accuracy of the method was evaluated on the same day by successive voltammetric measurements (n = 10) in a 1.0 mol L-1 sodium hydroxide solution containing 1.0 × 10-4 mol L-1 of NMS without the needing to renew electrode surface. Results for this series of measures were calculated and standard deviation was of only 1.2%, suggesting that in these conditions the electrode showed a stable response in addition to suffer no poisoning effects. For simultaneous determination of TMP and SMX an analytical method using capillary electrophoresis with contactless conductivity detection (C4D) was developed. Using a 10 mmol L-1 lithium-phosphate (pH 7.1) solution as running buffer, a linear response range for both analytes was obtained ranging through 12.5 to 200 × 10-6 mol L-1 with R> 0.999. Under these analysis conditions, DL of 1.1 × 10-6 mol L-1 for TMP, and 3.3 × 10-6 mol L-1 for SMX were obtained, with a total analysis time of only 2.6 minutes.

Orientador: Maria da Gloria Buzinaro / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: Os rotavírus são os principais agentes causadores de diarreias em várias espécies animais e nos seres humanos, causando grandes prejuízos econômicos e de saúde pública. Uma característica marcante desse vírus é a grande diversidade genotípica das estirpes circulantes. Informações sobre genotipagem são imprescindíveis para estabelecer mecanismos de vigilância epidemiológica da infecção por rotavírus. O presente trabalho teve como objetivo discutir a epidemiologia de rotavírus na espécie bovina por meio de estudos desenvolvidos entre os anos 2006 e 2010, no Laboratório de Rotavirose da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (FCAV/Unesp). Foram obtidas 803 amostras de fezes de bezerros, na faixa etária de 1 a 90 dias, com e sem diarreia, de 48 rebanhos de gado bovino leiteiro e de corte localizados no Estado de São Paulo. As amostras foram caracterizadas com base nos testes de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). O teste de PAGE indicou animais positivos em 33,3% (16/48) dos rebanhos e 6,1% (49/803) das amostras analisadas. Nos rebanhos leiteiros foram detectados animais infectados por rotavírus nas diferentes faixas etárias de até 90 dias de idade, enquanto nos rebanhos de corte alta frequência (22,8%) de amostras positivas foi verificada em bezerros entre 1 e 15 dias (P<0,05). A análise do perfil do genoma no PAGE identificou sete eletroferótipos, característicos de rotavírus do grupo A, indicando grande diversidade genômica do rotavírus nos rebanhos estudados. A caracterização molecular dos genótipos G (VP7) e P (VP4) pela RT-PCR identificou o genótipo G6P[5] como o mais comum. Foram construídos mapas que analisaram a distribuição espacial dos rotavírus detectados. O trabalho de identificação do rotavírus é de grande valia, uma vez que... / Abstract: Rotavirus is the major causative agent of diarrhea in several animal species and humans, causing large economic and public health damage. A striking feature of this virus is the great genotypic diversity of circulating strains. Genotyping information is essential to establish surveillance mechanisms of rotavirus infection. This study aimed to discuss the epidemiology of rotavirus in cattle through studies conducted between 2006 and 2010, the Rotavirus Disease Laboratory of the Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences of the Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho" (FCAV / UNESP), 803 samples of feces of calves were obtained, ranging in age from 1 to 90 days, with and without diarrhea, 48 herds of dairy and beef cattle in the State of São Paulo. The samples were characterized on the basis of electrophoresis tests on polyacrylamide gel (PAGE) and then reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The PAGE test indicated positive animals in 33.3% (16/48) of the herds and 6.1% (49/803) of the samples. In dairy herds infected animals were detected rotavirus in different age groups (P> 0.05), while in the high frequency cut herds (22.8%) of positive samples was observed in calves between 1 to 15 days (P <0,05). The genome profile analysis in PAGE identified seven eletropherotypes characteristic of rotavirus group A, indicating a high genomic diversity of rotavirus in the herds. The molecular characterization of genotype G (VP7) and P (VP4) by RT-PCR identified the genotype G6P [5] as the most common. Maps were constructed to analyze the spatial distribution of detected rotavirus. Rotavirus identification work is of great value, since it is evident that different genotypes agent is spread in São Paulo presenting different forms of production / Mestre

O presente estudo teve por objetivo comparar a composição da saliva de adolescentes com lesões de cárie ativas com a de jovens livres de lesões de cárie. Doze adolescentes com idade média de 15,2 (desvio padrão = 1,6) anos foram divididos em três grupos de acordo com acometimento pela cárie dentária: Grupo CA - participantes com o mínimo de quatro lesões cariosas cavitadas ativas (n=4), classificadas com os escores 5 e/ou 6 pelo Sistema Internacional de Detecção e Avaliação de Cárie (ICDAS, do inglês International Caries Detection and Assessment System); Grupo MB - adolescentes (n = 4) com pelo menos quatro lesões cariosas iniciais ativas (ICDAS 1 e/ou 2); e grupo CO - composto de participantes sem lesões de cárie ativas (n = 4). Proteínas provenientes de saliva estimulada (20 ?g) foram submetidas a espectrometria de massa e eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) em três experimentos independentes. Valores densitométricos de quinze bandas de diferentes pesos moleculares dos géis SDS-PAGE foram mensurados e analisados por análise de variância ( p<0,05). Espectrometria de massa foi realizada para identificar e caracterizar o proteoma das bandas que mostraram diferenças em três diferentes géis. A quantificação relativa consistiu na realização de eletroforese SDS-PAGE contendo proteínas salivares dos grupos MB e CO pareadas lado a lado de acordo com a concentração de proteínas total. As bandas foram analisadas densitometricamente e as proteínas nelas contidas foram também quantificadas por espectrometria de massa. Resultados encontrados na análise com SDS-PAGE revelaram que quatro bandas de alto e baixo peso molecular do grupo MB se mostraram estatisticamente quando comparadas ao grupo CO. As amostras do grupo CA não mostraram diferenças na comparação ao grupo CO. A análise por espectrometria de massa revelou o conteúdo proteico das amostras de saliva e das bandas eletroforéticas dos géis SDS-PAGE que demonstraram diferenças. A análise quantitativa relativa mostrou as diferenças entre os grupos nas bandas de alto, médio e baixo pesos moleculares, bem como das proteínas nelas presentes. Este estudo concluiu que existem diferenças na composição proteômica da saliva de adolescentes acometidos por cárie quando comparados a jovens sem lesões ativas, principalmente quando se considerou lesões de cárie iniciais. / This study aimed to compare the salivary protein content of adolescents presenting active caries lesions with caries-free persons. Twelve adolescents with average age of 15.2 (standard deviation=1.6) years old were divided into three groups according to the caries occurrence: Group CA - participants with at least four active cavitated caries lesions (n = 4), classified as scores 5 and/or 6 according to the International Caries Detection and Assessment System (ICDAS); Group MB - adolescents (n = 4) in which subjects showed at least four cavitated active lesions (ICDAS 5 and 6), group MB (n=4) with at least four active initial caries lesions (scores 1 and/or 2 of ICDAS); and group CO - with subjects with no active caries lesions (n = 4). Proteins from stimulated saliva (20 ?g) were submitted to sodium-dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in three independent experiments. Densitometric values from fifteen bands of different molecular weights were measured and analyzed with analysis of variance (p<0.05). Mass spectrometry was used to identify and characterize the proteome from electrophoretic bands. Relative quantification consisted in submit to SDS-PAGE salivary protein samples paired by total protein concentration from groups MB and CO. Electrophoretic bands were densitometrically analyzed, and their protein content were quantified with mass spectrometry. Results from SDS-PAGE revealed that four bands of high and low molecular weight from group MB were statistically higher when compared to group CO. Samples from group CA did not show differences when compared to group CO. Mass spectrometry showed the protein content from SDS-PAGE electrophoretic bands. Relative quantitative analysis showed differences among groups in bands of high, middle and low molecular weights, as well in their proteins. This study concludes that there are differences in the proteomic composition of saliva from adolescents with active caries lesions when compared to persons with no active caries lesions, mainly considering initial active caries lesions.

A tuberculose é a segunda maior causa de mortes por doença infecciosa no mundo depois do HIV. A pirazinamida, um dos fármacos utilizados no tratamento atual, é um pró-fármaco do ácido pirazinóico que tem ação relevante contra Mycobacterium tuberculosis latentes, possui alta atividade bactericida sendo capaz de eliminar micobactérias intracelulares como nos macrófagos, por exemplo. A observação de que micobactérias resistentes à pirazinamida ainda são suscetíveis aos ésteres do ácido pirazinóico direcionou as pesquisas no desenvolvimento de derivados ésteres como pró-fármaco, com a vantagem de que as esterases presentes nas micobactérias possibilitam a ativação do pró-fármaco. O éster do ácido pirazinóico, pirazinoato de etila, apresenta como vantagem a fácil obtenção por apenas uma etapa de reação. A estruturação de fármacos em nanopartículas poliméricas traz como vantagens a melhora na estabilidade e alta capacidade de carreamento do fármaco. A nanoestruturação de ativos cria a necessidade de métodos capazes de quantificar os componentes presentes. Neste contexto, a eletroforese capilar apresenta-se como uma técnica analítica de baixo custo e tem como vantagem a diminuição do tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver a nanoestruturação do éster pirazinoato de etila e quantificar o mesmo nas nanopartículas pela técnica de eletroforese capilar. O éster do ácido pirazinóico foi caracterizado por ponto de fusão, calorimetria exploratória diferencial, análise elementar, espectroscopia no infravermelho e ressonância magnética nuclear. As nanopartículas obtidas pelo método de nanoprecipitação foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz, potencial Zeta, pH, calorimetria exploratória diferencial e microscopia eletrônica de varredura. Um método por eletroforese capilar foi desenvolvido e validado de acordo com os guias ANVISA e ICH. O método apresentou boa linearidade (R2>0,99), precisão (DPR< 3%) e exatidão (recuperação de 99% ±0,2). O método desenvolvido foi usado para quantificar o éster contido nas nanopartículas e a eficiência da encapsulação do fármaco foi determinada. / Tuberculosis the second leading cause of deaths from infectious diseases after HIV. Pyrazinamide, one of the drugs available in therapy of tuberculosis, is a prodrug from pirazinoic acid wich is active against latent bacilli, besides the high bacterial activity since it is capable to eliminate within macrophages. Since bacteria which is not susceptible to pyrazinamide is still susceptible to pyrazinoic acid esters, has directed research on developing pirazinoic acid esters derivative as prodrug, with the advantage this is activated for mycobacterial esterases. Pyrazinoic acid ester, ethyl pyrazinoate, it has the advantage to be done in only one reaction step and simply obtaining. Structured drugs in polymeric nanoparticles presenting advantages such as stability improvement and high drug carrying capacity. The drugs nanostructuring makes necessary methods to this quantifying. In this context, capillary electrophoresis represents an analytical technique low cost and the advantage of the shorter analysis. The aim of this work was the nanostructuring of ethyl pyrazinoate ester and quantify this in nanoparticles by capillary electrophoresis. The pyrazinoic ester was characterized by melting point, differential scanning calorimetry, elemental analysis, infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance. Nanoparticles were prepared by nanoprecipitation method and were characterized by dynamic light scattering, zeta potential, pH, differential scanning calorimetry and scanning electron microscopies. A capillary electrophoresis method was developed and validated in accordance with the requirements of ANVISA and ICH guidelines. The method showed good linearity (R2>0,99), precision (RSD < 3%) and accuracy (recovery 99% ±0,2). The method was used to quantify the ester loaded in nanoparticles and the entrapment efficiency was determined.