Chez les végétaux supérieurs, l’embryogenèse est une phase clé du développement au cours de laquelle l’embryon établit les principales structures qui formeront la future plante et synthétise et accumule des réserves définissant le rendement et la qualité nutritionnelle des graines. Ainsi, la compréhension des évènements moléculaires et physiologiques menant à la formation de la graine représente un intérêt agronomique majeur. Toutefois, l'analyse des premiers stades de développement est souvent difficile parce que l'embryon est petit et intégré à l'intérieur du tissu maternel. Solanum chacoense qui présente des fleurs relativement grande facilitant l’isolation des ovules, a été utilisée pour l’étude de la biologie de la reproduction plus précisément la formation des gamètes femelles, la pollinisation, la fécondation et le développement des embryons. Afin d'analyser le programme transcriptionnel induit au cours de la structuration de ces étapes de la reproduction sexuée, nous avons mis à profit un projet de séquençage de 7741 ESTs (6700 unigènes) exprimés dans l’ovule à différents stades du développement embryonnaire. L’ADN de ces ESTs a été utilisé pour la fabrication de biopuces d’ADN. Dans un premier temps, ces biopuces ont été utilisé pour comparer des ADNc issus des ovules de chaque stade de développement embryonnaire (depuis le zygote jusqu’au embryon mature) versus un ovule non fécondé. Trois profils d’expression correspondant au stade précoce, intermédiaire et tardive ont été trouvés. Une analyse plus approfondie entre chaque point étudié (de 0 à 22 jours après pollinisation), a permis d'identifier des gènes spécifiques caractérisant des phases de transition spécifiques. Les annotations Fonctionnelles des gènes differentiellement exprimés nous ont permis d'identifier les principales fonctions cellulaires impliquées à chaque stade de développement, révélant que les embryons sont engagés dans des actifs processus de différenciation. Ces biopuces d’ADN ont été par la suite utilisé pour comparer différent types de pollinisation (compatible, incompatible, semi-compatible et inter-espèce) afin d’identifier les gènes répondants à plusieurs stimuli avant l'arrivé du tube pollinique aux ovules (activation à distance). Nous avons pu démontrer que le signal perçu par l’ovaire était différent et dépend de plusieurs facteurs, incluant le type de pollen et la distance parcourue par le pollen dans le style. Une autre analyse permettant la comparaison des différentes pollinisations et la blessure du style nous a permis d’identifier que les programmes génétiques de la pollinisation chevauchent en partie avec ceux du stress. Cela était confirmé en traitant les fleurs par une hormone de stress, méthyle jasmonate. Dans le dernier chapitre, nous avons utilisé ces biopuces pour étudier le changement transcriptionnel d’un mutant sur exprimant une protéine kinase FRK2 impliqué dans l’identité des ovules. Nous avons pu sélectionner plusieurs gènes candidat touchés par la surexpression de cette kinase pour mieux comprendre la voie se signalisation. Ces biopuces ont ainsi servi à déterminer la variation au niveau transcriptionnelle des gènes impliqués lors de différents stades de la reproduction sexuée chez les plantes et nous a permis de mieux comprendre ces étapes. / In higher plants, embryogenesis is a key phase of development during which the embryo establishes the main structures that will form the future plant, synthesizes, and accumulates the reserves that will define the yield and nutritional quality of the seeds. Thus, understanding the molecular and physiological events leading to the formation of the seed is of major agronomic interest. However, analysis of early stages of development is often difficult because the embryo is small and integrated within the maternal tissue. Solanum chacoense, whose relatively large flowers facilitate the isolation of ovules, was used to study the biology of reproduction, in particular the formation of female gametes, pollination, fertilization and embryo development. To analyze the transcriptional program induced during these stages of sexual reproduction, we produced amplicon-derived microarrays with 7741 ESTs isolated from ovules bearing embryos from different developmental stages. These chips were first used to compare cDNA of unfertilized ovule with ovule cells of each stage of embryonic development (from zygote to mature embryo). During embryogenesis, three major expression profiles corresponding to early, middle and late stages of embryo development were identified. Further analysis, of time points taken every 2 days from 0 to 22 days after pollination allowed the identification of a subset of stage-specific and transition-specific genes. Functional annotation of differentially expressed genes allowed us to identify the major cell processes implicated at each stage of development and revealed that embryos are engaged in active differentiation. The DNA microarrays were then used to compare different types of pollination (compatible, incompatible, semi-compatible and inter-species) to identify genes responding to various stimuli before the pollen tube reach the ovules (activation at distance). We found that the signal received by the ovary was different and depended on several factors including the pollen source and the distance traveled by the pollen in the style. Another analysis comparing different pollinations with wounding of the style showed that the genetic programs of pollination overlap with those of stress. This was confirmed by treating the flowers with a stress hormone, methyl jasmonate. lastly, we used the microarrays to study transcriptional changes in mutant ScFRK2. The over expression of FRK2 affect the ovule identity. We were able to select several candidate genes that may have a role in ovules identity signaling. These chips were used to determine the variation in transcription of genes involved at various stages of sexual reproduction in plants and has allowed us to better understand these steps at the transcriptional level.

Submitted by Natalie Mendes (nataliermendes@gmail.com) on 2015-08-04T01:30:32Z No. of bitstreams: 1 CRIS TESE FINAL.pdf: 3970188 bytes, checksum: 37240b01333f3a3c2c98ce2597450f53 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-04T01:30:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CRIS TESE FINAL.pdf: 3970188 bytes, checksum: 37240b01333f3a3c2c98ce2597450f53 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The life cycle of a seed plant involves subsequent stages of development including seed formation, germination and seedling establishment. Together these stages represent the critical phase of intersection between two generations and are characterized by deep cytological, morphological, metabolic and physiological changes. Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae) is popularly known as physic nut and produces seeds rich in oil with properties that allow its use in various industries, including the production of biodiesel. This study aimed to advance on the understanding of morphophysiological patterns and elucidate morphoanatomical adaptations involving embryogenesis, maturation, germination and seedling growth in J. curcas. Therefore, it was initially analysed and described the morphophysiological profile based on 13 stages of development and maturation associated to color of the fruit exocarp and seed coat, and description of the structures present at each stage (Chapter 1). Analysis of microtubular cytoskeleton configurations during embryogenesis showed cell cycle activity by the presence of cortical and mitotic microtubules during histodifferentiation and organogenesis, whilst it was possible to characterize a new organogenetic profile of embryogenesis revealed by the presence of a multimeristematic radicle and stomata in embryos of J. curcas seeds (Chapter 2). The multimeristematic embryos formed by a central apical meristem and four lateral meristems interconnected by a complex vascular system have revealed a new model of root formation during seed germination and seedling development, in which there is simultaneous protrusion of a larger main root and four smaller adventitious roots, all growing at the same time during the formation of the seedling root system (Chapter 3). The stomata occurred in the radicle-hypocotyl transition area, exhibited different sizes and ontogenic phases and short lifespan by degenerating during seedling development. This demonstrates it?s functioning as restricted to the simultaneous growth stage of the five roots during germination, apparently due to high demand in gas exchange and energy metabolism, and a likely evolution onto the lenticels present in the stem of this species (Chapter 4). / O ciclo de vida de uma planta com sementes envolve est?dios subsequentes de desenvolvimento, como a forma??o da semente, a germina??o e o estabelecimento da pl?ntula. Essas etapas juntas representam a fase cr?tica de interse??o entre duas gera??es e s?o caracterizadas por profundas mudan?as citol?gicas, morfol?gicas, metab?licas e fisiol?gicas. Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae) conhecida popularmente como pinh?o-manso, produz sementes ricas em ?leo com propriedades e aplica??es em diversos setores industriais, incluindo a produ??o de biodiesel. O presente estudo teve como objetivo caracterizar padr?es morfofisiol?gicos e elucidar adapta??es morfoanat?micas envolvendo a embriog?nese, matura??o, germina??o e o crescimento de pl?ntulas de J. curcas. Para tanto, foi inicialmente analisado e descrito o perfil morfofisiol?gico baseado em 13 est?dios de desenvolvimento e matura??o, associados ? colora??o do exocarpo do fruto e do tegumento das sementes e descri??o das estruturas presentes em cada est?dio (Cap?tulo 1). A an?lise das configura??es do citoesqueleto microtubular durante embriog?nese evidenciou atividade do ciclo celular por meio da presen?a de microt?bulos corticais e mit?ticos durante a histodiferencia??o e organog?nese. Foi poss?vel caracterizar um novo padr?o organogen?tico de embriog?nese revelado pela presen?a de rad?cula multimeristem?tica e de est?matos em embri?es de sementes de J. curcas (Cap?tulo 2). Os embri?es multimeristem?ticos, providos de um meristema apical central e quatro meristemas laterais, revelaram um novo modelo de forma??o de sistema radicular durante a germina??o de sementes e desenvolvimento de pl?ntulas, em que h? protrus?o simult?nea de uma raiz principal maior e quatro ra?zes advent?cias menores, todas crescendo ao mesmo tempo, durante a forma??o inicial do sistema radicular da pl?ntula (Cap?tulo 3). Os est?matos ocorrem na ?rea de transi??o hipoc?tilo-rad?cula e exibem diferentes tamanhos e fases ontog?nicas. Estas estruturas apresentaram um curto per?odo de vida, degenerando-se durante o desenvolvimento da pl?ntula, sugerindo seu funcionamento restrito ? etapa de crescimento simult?neo das cinco ra?zes durante a germina??o, aparentemente devido ? alta demanda em trocas gasosas e metabolismo energ?tico, e uma prov?vel evolu??o para as lenticelas presentes no caule desta esp?cie (Cap?tulo 4).

O. catharinensis e O. odorifera são árvores originárias da Mata Atlântica. Historicamente estas espécies foram intensamente exploradas e atualmente encontram-se vulneráveis de extinção. A embriogênese somática é uma ferramenta de grande potencial na reprodução de espécies de difícil propagação. No presente trabalho analisou-se o efeito dos meios de cultura MS e WPM e de diferentes de ANA e 2,4-D na indução da embriogênese somática nessas espécies. Em O. catharinensis a combinação WPM + 2,4-D mostrou-se mais efetiva na indução de calos. Resultados mais expressivos foram observados no tratamento WPM + 144µM 2,4-D. Os piores índices de indução foram obtidos no meio MS + 2,4-D. Em O. odorifera não foi utilizado o meio MS. Nesta espécie, mais importante do que o tipo do regulador de crescimento foi sua concentração. Maiores percentuais de calos foram observados em concentrações mais elevadas desses reguladores. WPM + ANA mostrou-se bastante efetivo em O. odorifera, ao contrário do que foi observado em O. catharinensis, onde os resultados foram pouco expressivos. / O. catharinensis and. O. odorifera are originary trees of the brazilian Rain Forest. Historically these species had been intensely explored and are currently considered vulnerable of extintion. Somatic embryogenesis is a tool of great potential in the reproduction of species of difficult propagation. In the present work was analyzed the effect of MS and WPM and different concentrations of ANA and 2,4-D in the iniciation of somatic embryogenesis in this species. In O. catharinensis WPM + 2,4-D revealed more effective in the induction of callus. More expressive results had been observed in the treatment WPM + 144µM 2,4-D. The worse rates of induction had been observed at the combination MS + 2,4-D. In O. odorifera the MS medium was not used. In this specie more important of what the type of the growth regulator was its concentration. Higher rates of callus had been observed at higher concentrations of these regulators. WPM + ANA revealed effective in O. odorifera, in contrast of what was observed in O. catharinensis, where the results had been little expressive.

La truite arc-en-ciel carnivore (Oncorhynchus mykiss) est considérée comme une espèce pauvre utilisatrice de glucides alimentaires. Des études récentes ont montré qu'une hypométhylation globale de l'ADN hépatique induite par un régime alimentaire riche en glucides et pauvre en protéines pourrait être impliquée dans l'établissement / le maintien du de ce phénotype chez la truite, mais le détail des mécanismes sous-jacents reste inconnu. La thèse vise à étudier les mécanismes épigénétiques sous-jacents à ce phénotype de faible utilisation des glucides alimentaire chez la truite et à examiner si le métabolisme du glucose et l’épigénome chez les juvéniles peuvent être programmés par un stimulus hypoxique précoce. Nous avons d’abord identifié tous les gènes paralogues liés aux voies de méthylation / déméthylation de l’ADN (dnmt, tet et tdg) dans le génome de la truite, clarifié leurs histoires évolutives et analysé leurs profils d’expression au cours de la gamétogenèse et de l’embryogenèse chez la truite. Nous avons ensuite étudiés plus en détail les processus et les mécanismes potentiellement à l’origine de l'hypométhylation de l'ADN hépatique global constatée chez la truite après un régime riche en glucides et pauvre en protéines. Les résultats ont montré pour la première fois qu'une diminution du taux deprotéines et une augmentation du taux de glucides dans l’aliment induisent de manière indépendante et en interaction une hypométhylation hépatique globale chez la truite, qui semble établie par le biais d'une voie de déméthylation active. Nous avons également constaté qu’une forte hyperglycémie induite par une injection de glucose induit une hypométhylation globale de l’ADN au niveau des sites CmCGG dans le foie de la truite. Les mécanismes détaillés de ces processus de déméthylation restent à élucider. Enfin, grâce à la stratégie de programmation métabolique, nous avons pour la première fois confirmé que l’utilisation d’un stimulus non nutritionnel au début de la vie, l’hypoxie, pouvait moduler de façon persistante la transcription des gènes liés au métabolisme du glucose chez la truite juvénile sans nuire aux performances de croissance. De plus, selon sa nature chronique ou aigue, l’hypoxie, a tendance à induire des effets de programmation opposés sur les gènes codants pour les transporteurs au glucose notamment dans le foie et le muscle de la truite juvénile. Dans son ensemble, la thèse met en avant notre compréhension du rôle du méthylome dans la contribution à la faible capacité d'utilisation des glucides alimentaires chez la truiteLa thèse met aussi en lumière le potentiel d'utilisation de l'hypoxie comme stimulus pour programmer le métabolisme du glucose, l'épigénome et l'utilisation des glucides alimentaires chez la truite arc-en-ciel. / The carnivorous rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is considered as a poor user of dietary carbohydrates. Recent studies showed that a high-carbohydrate/low protein diet inducing hepatic global DNA hypomethylation could be involved in the establishment/maintenance of the poor dietary carbohydrates utilisation phenotype in trout, but the detail mechanisms remain unclear. The present thesis aimed at investigating the epigenetic mechanisms underlying this poor dietary carbohydrate utilisation phenotype in trout, and exploring if the glucose metabolism and the epigenome in juveniles can be programmed through a hypoxic stimulus during early life. We first identified all the paralogous genes related to DNA methylation/demethylation pathways (dnmt, tet and tdg) in trout genome, clarified their molecular evolution histories and monitored their transcriptional expression patterns during gametogenesis and embryogenesis in trout. Besides, we investigate further the causes, processes and potential mechanisms about the hepatic global DNA hypomethylation in trout after feeding a high carbohydrate/low protein diet. Results for the first time demonstrated that a decrease in protein content and an increase in carbohydrate content in the diet can independently as well as interactively induce hepatic global hypomethylation in trout. This global loss of methylation is probably established through an active demethylation pathway. We also found that a strong hyperglycaemia induced by glucose injection induces global CmCGG hypomethylation in the liver of trout. The detailed mechanisms of these demethylation processes remain to be elucidated. Finally, through metabolic programming strategy, we confirmed for the first time that using a non-nutritional stimulus, hypoxia, during early life stage persistently modulates the transcription of glucose metabolism-related genes in juvenile trout without negative effects on growth performance. Moreover, acute and chronic hypoxia tended to induce opposite programming effects on glucose-transporter encoding genes in both liver and muscle of juvenile trout. Together, the present thesis brings forward our understandings about the roles of epigenetics in contributing to the low ability to use dietary carbohydrates in trout, and sheds light on the potential of using hypoxia as the stimulus in metabolic programming strategy to tailor the glucose metabolism, the epigenome and dietary carbohydrate utilisation in rainbow trout.

Notre travail qui sinscrit dans le cadre général de létude du développement embryonnaire de Phaseolus a pour objectif principal disoler et de caractériser des gènes différemment exprimés chez les embryons en voie davortement, et donc nécessaires au développment normal des embryons. Des embryons en cours de dégénérescence issus des hybridations interspécifiques et de la mutagenèse induite ont été analysés. Des ADNc différemment exprimés chez ces embryons ont été identifiés par les techniques de lHybridation Soustractive Suppressive (HSS) et de la dot blot. Les hybridations interspécifiques ont été réalisées entre lespèce P. vulgaris L. utilisée comme parent mâle et les espèces P. coccineus L. et P. polyanthus Greenm. utilisées comme parents femelles (formes sauvages et cultivées). La mutagenèse induite à lEthyl Méthyl Sulfonate (EMS) a été appliquée sur le génotype BAT93 de P. vulgaris, une variété améliorée du CIAT. Dans les croisements P. coccineus x P. vulgaris, 938 hybridations ont été effectuées et le taux de gousses avortées au-delà de 8 JAP est denviron 12%. Quatre gousses supposées hybrides ont été obtenues. Pour les croisements P. polyanthus x P. vulgaris, 733 hybridations ont été réalisées. Le taux de gousses avortées au-delà de 8 JAP est denviron 18% et une seule gousse supposée hybride a été produite. Les caractères hybrides dune plante de chacune des deux combinaisons interspécifiques ont été mis en évidence au moyen de caractères morphologiques des fleurs et des graines, mais aussi grâce à lutilisation dun marqueur moléculaire, le microsatellite BM160. La mise en évidence et la caractérisation des embryons en voie davortement ont été effectuées à partir de matériels issus des hybridations interspécifiques et de la mutagenèse à lEthyl Méthyl Sulfonate (EMS). Les observations, faites sur des embryons extraits et sur des coupes histologiques dovules, révèlent des malformations au niveau du suspenseur et des cotylédons et des retards de croissance. Les plantes issues de la mutagenèse et produisant des graines avortant avant la maturité ont été croisées avec des plantes normales. Lanalyse de la F2 effectuée sur 96 plantes révèle une proportion mendélienne 3:1 de plantes avec des graines normales et de plantes avec graines qui avortent. Ce résultat suggère un contrôle du caractère « avortement des graines » par une paire dallèles récessifs. La technique de lHSS a permis disoler des fragments dADNs complémentaires différemment exprimés dans les graines en voie davortement. Lanalyse des séquences de ces ADNs complémentaires montre quils codent pour plusieurs protéines intervenant dans les développements cellulaire et embryonnaire. Les principales protéines sont le cytochrome P450, la myo-inositol 1-phosphate synthase, la peroxydase cationique, le voltage-dependent anion channel et la sucrose synthase. A lexception du cytochrome P450, les niveaux dexpression des autres gènes sont plus faibles dans les graines en voie davortement issues de la mutagenèse par rapport aux graines normales. The main objective of this study was to isolate and to characterize cDNAs differentially expressed in Phaseolus degenerating embryos. Aborting embryos from interspecific hybridizations and induced mutation were analysed. cDNAs differentially expressed in these embryos were isolated using the Suppressive Subtractive Hybridization (SSH) and the dot blot techniques. The interspecific hybridizations were performed between P. vulgaris L. used as male parent and P. coccineus L. and P. polyanthus Greenm. used as female parents (wild and cultivated forms). The induced mutation was performed whith Ethyl Methyl Sulfonate (EMS) applied on the genotype BAT93 of P. vulgaris, a breeding line from CIAT. A total number of 938 crosses P. coccineus x P. vulgaris and 733 crosses P. polyanthus x P. vulgaris were carried out. In the crosses P. coccineus x P. vulgaris, the rate of pod abortion after 8 days after pollination (DAP) is 12%. Four putative hybrid pods were obtained. The rate of pod abortion after 8 DAP in the crosses P. polyanthus x P. vulgaris is 18% and one putative hybrid pod was produced. The hybrid nature of one plant from each interspecific combination was confirmed using morphological characters of flowers and seeds and molecular marker (microsatellite BM160). The isolation and the characterization of degenerating embryos were realised with materials from interspecific hybridizations and from chemical mutagenesis with EMS. The observations of these two materials revealed abnormalities mainly in suspensor and cotyledons; and the embryos failed to grow normally. Plants from mutagenesis which produce degenerating seeds were crossed with normal plants. Genetic analysis on 96 F2 plants revealed a 3:1 Mendel ratio of plants with normal seeds and plants with degenerating seeds. This result suggests the control of the seed abortion trait by a single recessive gene. The SSH technique was used to isolate cDNAs fragments differentially expressed in aborting seeds. Analysis of the cDNAs sequences revealed that these cDNAs encode for proteins involved in cellular and embryonic development. The main proteins are cytochrome P450, myo-inositol 1-phosphate synthase, cationic peroxidase, voltage-dependent anion channel and sucrose synthase. All the genes showed a reduction of their expression in developing seeds of the mutagenized plants, compared to those observed in wild-type plants.

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Chez les végétaux supérieurs, l’embryogenèse est une phase clé du développement au cours de laquelle l’embryon établit les principales structures qui formeront la future plante et synthétise et accumule des réserves définissant le rendement et la qualité nutritionnelle des graines. Ainsi, la compréhension des évènements moléculaires et physiologiques menant à la formation de la graine représente un intérêt agronomique majeur. Toutefois, l'analyse des premiers stades de développement est souvent difficile parce que l'embryon est petit et intégré à l'intérieur du tissu maternel. Solanum chacoense qui présente des fleurs relativement grande facilitant l’isolation des ovules, a été utilisée pour l’étude de la biologie de la reproduction plus précisément la formation des gamètes femelles, la pollinisation, la fécondation et le développement des embryons. Afin d'analyser le programme transcriptionnel induit au cours de la structuration de ces étapes de la reproduction sexuée, nous avons mis à profit un projet de séquençage de 7741 ESTs (6700 unigènes) exprimés dans l’ovule à différents stades du développement embryonnaire. L’ADN de ces ESTs a été utilisé pour la fabrication de biopuces d’ADN. Dans un premier temps, ces biopuces ont été utilisé pour comparer des ADNc issus des ovules de chaque stade de développement embryonnaire (depuis le zygote jusqu’au embryon mature) versus un ovule non fécondé. Trois profils d’expression correspondant au stade précoce, intermédiaire et tardive ont été trouvés. Une analyse plus approfondie entre chaque point étudié (de 0 à 22 jours après pollinisation), a permis d'identifier des gènes spécifiques caractérisant des phases de transition spécifiques. Les annotations Fonctionnelles des gènes differentiellement exprimés nous ont permis d'identifier les principales fonctions cellulaires impliquées à chaque stade de développement, révélant que les embryons sont engagés dans des actifs processus de différenciation. Ces biopuces d’ADN ont été par la suite utilisé pour comparer différent types de pollinisation (compatible, incompatible, semi-compatible et inter-espèce) afin d’identifier les gènes répondants à plusieurs stimuli avant l'arrivé du tube pollinique aux ovules (activation à distance). Nous avons pu démontrer que le signal perçu par l’ovaire était différent et dépend de plusieurs facteurs, incluant le type de pollen et la distance parcourue par le pollen dans le style. Une autre analyse permettant la comparaison des différentes pollinisations et la blessure du style nous a permis d’identifier que les programmes génétiques de la pollinisation chevauchent en partie avec ceux du stress. Cela était confirmé en traitant les fleurs par une hormone de stress, méthyle jasmonate. Dans le dernier chapitre, nous avons utilisé ces biopuces pour étudier le changement transcriptionnel d’un mutant sur exprimant une protéine kinase FRK2 impliqué dans l’identité des ovules. Nous avons pu sélectionner plusieurs gènes candidat touchés par la surexpression de cette kinase pour mieux comprendre la voie se signalisation. Ces biopuces ont ainsi servi à déterminer la variation au niveau transcriptionnelle des gènes impliqués lors de différents stades de la reproduction sexuée chez les plantes et nous a permis de mieux comprendre ces étapes. / In higher plants, embryogenesis is a key phase of development during which the embryo establishes the main structures that will form the future plant, synthesizes, and accumulates the reserves that will define the yield and nutritional quality of the seeds. Thus, understanding the molecular and physiological events leading to the formation of the seed is of major agronomic interest. However, analysis of early stages of development is often difficult because the embryo is small and integrated within the maternal tissue. Solanum chacoense, whose relatively large flowers facilitate the isolation of ovules, was used to study the biology of reproduction, in particular the formation of female gametes, pollination, fertilization and embryo development. To analyze the transcriptional program induced during these stages of sexual reproduction, we produced amplicon-derived microarrays with 7741 ESTs isolated from ovules bearing embryos from different developmental stages. These chips were first used to compare cDNA of unfertilized ovule with ovule cells of each stage of embryonic development (from zygote to mature embryo). During embryogenesis, three major expression profiles corresponding to early, middle and late stages of embryo development were identified. Further analysis, of time points taken every 2 days from 0 to 22 days after pollination allowed the identification of a subset of stage-specific and transition-specific genes. Functional annotation of differentially expressed genes allowed us to identify the major cell processes implicated at each stage of development and revealed that embryos are engaged in active differentiation. The DNA microarrays were then used to compare different types of pollination (compatible, incompatible, semi-compatible and inter-species) to identify genes responding to various stimuli before the pollen tube reach the ovules (activation at distance). We found that the signal received by the ovary was different and depended on several factors including the pollen source and the distance traveled by the pollen in the style. Another analysis comparing different pollinations with wounding of the style showed that the genetic programs of pollination overlap with those of stress. This was confirmed by treating the flowers with a stress hormone, methyl jasmonate. lastly, we used the microarrays to study transcriptional changes in mutant ScFRK2. The over expression of FRK2 affect the ovule identity. We were able to select several candidate genes that may have a role in ovules identity signaling. These chips were used to determine the variation in transcription of genes involved at various stages of sexual reproduction in plants and has allowed us to better understand these steps at the transcriptional level.

Infertility affects 15 % of couples, which corresponds to 60 - 80 million worldwide. The microenvironments in which the oocyte, embryo and fetus mature are vital to the establishment and development of a healthy pregnancy. Different biological systems, such as angiogenesis, the immune system and apoptosis need to be adequately regulated for pregnancy to occur and progress normally. The overall aim of this thesis was to investigate the impact of Histidine-rich glycoprotein (HRG) and Src homology 2 domain-containing adapter protein B (SHB) on human female fertility. HRG is a plasma protein that regulates angiogenesis, the immune system, coagulation/fibrinolysis and apoptosis, by building complexes with various ligands. The impact of HRG on fertility is studied here for the first time. HRG is present in follicular fluid, the Fallopian tube, endometrium, myometrium and placenta. HRG distribution within embryo nuclei depends on developmental stage. Blastocysts express and secrete HRG. The HRG C633T single nucleotide polymorphism (SNP) appears to affect the chance of pregnancy and, correspondingly, parameters associated with pregnancy in IVF. Additionally, this HRG genotype may increase the risk in IVF of only developing embryos unfit for transfer. SHB is an adaptor protein involved in intracellular signaling complexes that regulate angiogenesis, the immune system and cell proliferation/apoptosis. Shb knockout mice have altered oocyte/follicle maturation and impaired embryogenesis. The impact of three SHB polymorphisms (rs2025439, rs13298451 and rs7873102) on human fertility is studied for the first time. The SNP prevalences did not differ between infertile and fertile women. BMI, gonadotropin dosages, the percentage of immature oocytes, the number of fertilized oocytes, the percentage of good-quality embryos and the day of embryo transfer seems to be affected by SHB genotype. In conclusion, HRG and SHB appear to influence female fertility. They are potential biomarkers that might be used for predicting pregnancy chance in infertile women. Knowledge of these genotypes may improve patient counseling and individualization of treatment.

The process of embryogenesis is governed by the expressions of groups of genes which are acting in a coordinate way. Uncovering how the expressions of these genes control the development of a multicellular organism is fundamental for developmental biology. Gene expression atlases could capture quantitative spatio-temporal information of all genes expressed in a developing embryo. In other words, they could reveal the underlying genetic activity during the embryogenetic processes by providing information about, apart from how much and which, where and when the genes are expressed at cellular level and the interactions between them. The extraction of relative gene expression data and their simultaneous study in animal models, such as zebrafish, would be greatly facilitated by the existence of such atlases. This Master Thesis focuses on the early zebrafish embryogenesis and its goal is to design and implement an image processing framework that will provide the means to gather the expression patterns of different genes from different embryos at a given developmental stage into a common template. The framework should work with image-based data from different embryos, each fluorescently stained to label nuclear DNA and the expression patterns of a reference gene and another gene of interest. The volumetric data from each fluorescent label are contained in different channels. Therefore the crux of the framework lies in its ability to combine appropriately the information from the different channels and deal with a three-dimensional image registration problem. The implemented framework works with datasets of two embryos, one that serves as a template and depicts a whole embryo and another that has to be aligned with the first and depicts part of the other embryo. It is composed of different steps, responsible for preprocessing the channels, coarsely positioning the partial embryo view in the three dimensional template’s space and determining the geometrical transformation that finally aligns it with the template using as reference the gene expression pattern common to all labelled embryos. The resulting transformation is used to map the second expression patterns, thus producing their spatial expression atlas. The algorithm developed is based on the Insight Segmentation and Registration Toolkit. The framework was evaluated with data from six embryos at the same developmental stage and four different registration methods were compared in terms of performance. Visual inspection of the results identified the combination of the correlation coefficient, as a similarity measure function between two images, with the gradient descent optimization algorithm as the most appropriate method for this specific application. The final results obtained showed that the framework achieves its goal of integrating several gene expression patterns into a common template. This framework is ready to be used in order to construct a gene expression atlas integrating a large number of gene expression data of the zebrafish embryogenesis. In the near future, this atlas should be validated with known genetic interactions and used to unravel new ones, so that gene regulatory network models can become a reality. / Η διαδικαςία ανάπτυξης των εμβρύων καθορίζεται από τις συγχρονισμένες εκφράσεις ορισμένων γονιδίων. Το πώς αυτές ελέγχουν την δημιουργία ενός πολυκύτταρου οργανισμού από ένα κύτταρο αποτελεί αντικείμενο μελέτης της Αναπτυξιακής Βιολογίας. Ένας χάρτης γονιδιακής έκφρασης θα μπορούσε να συνδυάζει χρονικές, χωρικές και ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με την έκφραση των γονιδίων που ενορχηστρώνουν την διαδικασία ανάπτυξης ενός εμβρύου. Σε έναν τέτοιον χάρτη η γενετική δραστηριότητα θα αναλυόταν σε συνιστώσες που αφορούν το ποια, πότε, πού και πόσο εκφράζονται τα γονίδια σε κυτταρικό επίπεδο. Η ύπαρξη τέτοιων χαρτών για οργανισμούς, όπως το ζεβρόψαρο, που πρωταγωνιστεί σε μελέτες που αφορούν σπονδυλωτά, θα διευκολύνει την ταυτόχρονη μελέτη των εκφράσεων και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων. Η παρούσα διπλωματική εστιάζεται στον σχεδιασμό και στην υλοποίηση μιας διαδικασίας επεξεργασίας εικόνας που θα είναι ικανή να συγκεντρώσει τις γονιδιακές εκφράσεις ενός συγκεκριμένου σταδίου ανάπτυξης του ζεβρόψαρου σε έναν τρισδιάστατο άτλαντα. Τα δεδομένα που πρέπει να επεξεργαστεί είναι τρισδιάστατες απεικονίσεις διαφορετικών εμβρύων, κάθε ένα από τα οποία έχει σημανθεί με φθορίζουσες ουσίες με στόχους το DNA των πυρήνων και τις εκφράσεις δύο γονιδίων, εκ των οποίων η μία είναι κοινή για όλα τα έμβρυα. Η πληροφορία που αποκαλύπτει κάθε ουσία βρίσκεται σε διαφορετικό κανάλι της κάθε εικόνας. Συνεπώς η διαδικασία θα πρέπει να συνδυάζει κατάλληλα τις πληροφορίες των διαφορετικών καναλιών και να ευθυγραμμίζει τρισδιάστατες εικόνες. Η υλοποιημένη διαδικασία δέχεται σειρές δεδομένων από δύο έμβρυα. Η μία απεικονίζει πλήρως ένα έμβρυο, το οποίο αποτελεί το έμβρυο αναφοράς και η άλλη μέρος του άλλου εμβρύου, το οποίο κα πρέπει να ευθυγραμμιστεί με το πρώτο. Η διαδικασία αποτελείται από διάφορα βήματα, τα οποία προεπεξεργάζονται τα δεδομένα, μετασχηματίζουν την εικόνα του μερικώς απεικονιζόμενου εμβρύου ώστε να αποκτήσει μια κατάλληλη αρχική θέση στον χώρο που ορίζεται από την εικόνα του ολόκληρου εμβρύου και τέλος ευθυγραμμίζουν την πρώτη εικόνα στην δεύτερη χρησιμοποιώντας ως αναφορά τη γονιδιακή έκφραση που είναι κοινή για όλα τα σημασμένα έμβρυα. Οι παράμετροι που προκύπτουν από την ευθυγράμμιση χρησιμοποιούνται για την αντιστοίχιση των άλλων σημασμένων γονιδιακών εκφράσεων, δημιουργώντας έτσι ένα τρισδιάστατο χάρτη εκφράσεων. Η υλοποίηση βασίστηκε στο Insight Segmentation and Registration Toolkit. Η διαδικασία δοκιμάστηκε με δεδομένα από έξι έμβρυα του ίδιου σταδίου ανάπτυξης και συγκρίθηκαν οι επιδόσεις τεσσάρων μεθόδων αντιστοίχισης. Οπτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων ανέδειξε τον συνδυασμό της συνάρτησης του συντελεστή συσχέτισης με τον αλγόριθμο βελτιστοποίησης gradient descent ως την πιο κατάλληλη μέθοδο για την συγκεκριμένη εφαρμογή. Τα τελικά αποτελέσματα απέδειξαν ότι η διαδικασία επιτυγχάνει τον στόχο της. Η διαδικασία που υλοποιήθηκε στην παρούσα διπλωματική είναι έτοιμη προς χρήση για την δημιουργία ενός χάρτη γονιδιακής έκφρασης του ζεβρόψαρου. Αντικείμενο μελλοντικής μελέτης αποτελεί η επικύρωση του χάρτη με ήδη γνωστές γονιδιακές αλληλεπιδράσεις και κατόπιν η χρήση του για την εύρεση νέων.

Nous développons une nouvelle approche éléments finis pour des équations aux dérivées partielles elliptiques de type élasticité linéaire ou Stokes sur une surface fermée de R3. La surface considérée est décrite par le zéro d'une fonction de niveau assez régulière. Le problème se ramène à la minimisation d'une fonctionnelle énergie pour le champ de vitesse sous contraintes. Les contraintes sont de deux types : (i) la vitesse est tangentielle à la surface, (ii) la surface est inextensible. Cette deuxième contrainte équivaut à l'incompressibilité surfacique du champ de vitesse. Nous abordons ce problème de deux façons : la pénalisation et l'introduction de deux multiplicateurs de Lagrange. Cette dernière méthode a l'avantage de traiter le cas de la limite incompressible d'un écoulement en surface dont nous présentons pour la première fois l'analyse théorique et numérique. Nous montrons des estimations d'erreurs sur la solution discrète et les tests numériques confirment l'optimalité des ces estimations. Pour cela, nous proposons plusieurs approches pour le calcul numérique de la normale et la courbure de la surface. L'implémentation utilise la librairie libre d'éléments finis Rheolef. Nous présentons aussi des résultats de simulations numériques pour une application en biologie : la morphogenèse de l'embryon de la drosophile, durant laquelle des déformations tangentielles d'une monocouche de cellules avec une faible variation d'aire. Ce phénomène est connu sous le nom de l'extension de la bande germinale. / We develop a novel finite element approach for linear elasticity or Stokes-type PDEs set on a closed surface of $mathbb{R}^3$. The surface we consider is described as the zero of a sufficiently smooth level-set function. The problem can be written as the minimisation of an energy function over a constrained velocity field. Constraints areof two different types: (i) the velocity field is tangential to the surface, (ii) the surface is inextensible. This second constraint is equivalent to surface incompressibility of the velocity field. We address thisproblem in two different ways: a penalty method and a mixed method involving two Lagrange multipliers. This latter method allows us to solve the limiting case of incompressible surface flow, for which we present a novel theoretical and numerical analysis. Error estimates for the discrete solution are given andnumerical tests shows the optimality of the estimates. For this purpose, several approaches for the numerical computation of the normal and curvature of the surface are proposed. The implementation relies on the Rheolef open-source finite element library. We present numerical simulations for a biological application: the morphogenesis of Drosophila embryos, duringwhich tangential flows of a cell monolayer take place with a low surface-area variation. This phenomenon is known as germ-band extension.