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Rôle de XDSCR6 et de ses partenaires au cours du développement embryonnaire précoce de Xenopus laevis / XDSCR6 function during early embryonic development of Xenopus laevis

Loreti, Mafalda 26 September 2017 (has links)
La formation des trois feuillets embryonnaires primordiaux et leur régionalisation selon les axes embryonnaires sont des étapes cruciales au cours du développement précoce. Dans ce contexte, nous avons montré que XDSCR6, un inducteur du mésoderme et des axes embryonnaires qui présente des propriétés dorsalisantes, interagit physiquement et fonctionnellement avec le facteur de transcription XSTAT3. Au cours des étapes précoces du développement, XSTAT3 est active pendant la gastrulation et l'activation anormale de cette protéine dans la région dorsale induit la ventralisation des tissus embryonnaires. Par ailleurs, nous avons montré que XDSCR6 et XSTAT3 présentent des rôles antagonistes in vivo au cours de la mise en place des axes embryonnaires. Cet antagonisme peut être expliqué par le fait que XDSCR6 régule négativement l'activité transcriptionnelle de XSTAT3 en modulant sa méthylation sur les résidus lysine. L'ensemble de nos résultats a permis de déterminer l'importance cruciale de cette modification post-traductionnelle dans les propriétés ventralisantes de XSTAT3. Par ailleurs, nous avons montré que la méthyltransférase XEZH2 méthyle et active XSTAT3 in vivo. Des travaux antérieurs de l'équipe avaient montré que les propriétés dorsalisantes de XDSCR6 reposent sur sa capacité à inhiber l'activité épigénétique répressive de XEZH2 sur les gènes du mésoderme dorsal. Ainsi, nos travaux suggèrent que XDSCR6 est un modulateur transcriptionnel situé à l'interface entre certains régulateurs chromatiniens et des facteurs de transcription pendant la mise en place des axes embryonnaires. / One of the most challenging questions in developmental biology is to understand how a totipotent zygote differentiates into an organism containing all cell lineages. The formation of the three germ layers and the establishment of embryonic axis are fundamental events during early development. In this context, we demonstrated that XDSCR6, a mesoderm and embryonic axis inducer that exhibits dorsalizing properties, physically and functionally interacts with the transcriptional factor XSTAT3. During early development, XSTAT3 is active throughout gastrulation step and its abnormal activation in dorsal region leads to embryonic tissues ventralization. Furthermore, we showed that XDSCR6 and XSTAT3 have antagonistic roles in vivo during axis formation. This antagonism can be explained by the fact that XDSCR6 negatively regulates the transcriptional activity of XSTAT3 by interfering with its methylation on lysine residues. Moreover, this post-translational modification plays a crucial role in the ventralization abilities of XSTAT3. In a previous study, it has been shown that XDSCR6 negatively regulates the XEZH2 repressive epigenetic activity on dorsal mesoderm genes. Thus, we propose that XDSCR6 is a transcriptional modulator acting between epigenetic regulators and transcriptional factors during embryonic axis formation.
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Applications médicales et pharmaceutiques des cellules souches pluripotentes : vers un changement de paradigme ?

Denis, Jérôme Alexandre 27 October 2011 (has links) (PDF)
Les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) et maintenant de cellules souches induites à la pluripotence (hiPS) sont des cellules qui présentent deux caractéristiques uniques : elles sont d'une part capables de s'auto-renouveler de manière continue en culture ce qui permet de générer de grande quantité de cellules et d'autre part, elles présentent la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule de l'organisme lorsqu'elles sont soumises à un environnement permissif adéquat. Ces deux propriétés permettent d'envisager de nombreuses applications médicales comme la thérapie cellulaire mais aussi des applications dans le domaine de l'industrie pharmaceutique grâce au développement de modèles cellulaires innovants. Ce mémoire de thèse a pour objectif de présenter les caractéristiques biologiques principales de ces cellules et les enjeux médicaux et pharmaceutiques qu'elles représentent pour le futur, notamment pour le pharmacien.
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MODELISATION PATHOLOGIQUE DES MALADIES MONOGENIQUES PAR L'UTILISATION DES CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES HUMAINES. PREUVE DE CONCEPT APPLIQUEE A LA DYSTROPHIE MYOTONIQUE DE TYPE 1

Denis, Jérôme Alexandre 13 October 2010 (has links) (PDF)
Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.
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Compréhension des mécanismes moléculaires régulant la différenciation des cellules souches embryonnaires murines en cellules folliculaires thyroïdiennes.

Barbee, Cindy 30 November 2018 (has links) (PDF)
L’hypothyroïdie congénitale est un des troubles endocriniens les plus fréquents chez l’enfant, touchant un nouveau-né sur 2500.[1] Toutefois, même si quatre facteurs de transcription principaux, NKX2.1, PAX8, FOXE1 et HHEX, sont connus pour être impliqués et nécessaires au développement de la glande thyroïde, seuls 2% des patients atteints de dysgénésies thyroïdiennes sont reliés à une mutation au niveau d’un de ces quatre facteurs de transcription. Ceci suggère que d’autres facteurs, encore inconnus, pourraient jouer un rôle important durant l’organogenèse de la glande thyroïde.[1]Les mécanismes moléculaires contrôlant les différentes étapes du développement thyroïdien étant encore très peu connus, l’objectif de ce projet vise à décrypter le réseau génique contrôlant le développement thyroïdien. Pour se faire, la mise au point d’un protocole d’invalidation de gènes candidats impliqués dans le développement thyroïdien au sein de cellules souches embryonnaires murines à l’aide de la technologie des Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) a été mis au point. Ce nouveau protocole d’édition ciblée du génome de cellules souches embryonnaires permet la modélisation des différentes mutations identifiées au sein de patients atteints d’hypothyroïdisme congénital mais aussi la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le développement de la glande thyroïde lorsque ce protocole est couplé avec notre modèle in vitro de différenciation de cellules souches embryonnaires murines en cellules folliculaires thyroïdiennes. Grâce à l’utilisation combinée de ces deux protocoles, nous avons pu mettre en évidence la nécessité du gène Foxe1 pour la différenciation in vitro correcte des progéniteurs NKX2.1+ en cellules folliculaires thyroïdiennes. Toutefois, il a été démontré qu’une faible proportion de cellules sont toujours capables de générer des follicules thyroïdiens en l’absence du gène Foxe1. Enfin, la génération inattendue de structures pulmonaires tridimensionnelles parmi les cellules Foxe1 KO différenciées avec du 8-br-cAMP a été observée. Cette génération de structures pulmonaires ne semble pas être une conséquence directe de la diminution d’expression du gène Pax8 observée au sein de ces lignées Foxe1 KO mais pourrait refléter un potentiel rôle épigénétique du gène Foxe1 permettant ou non le recrutement de certaines protéines au sein de la chromatine. Le gène Foxe1 semble à la fois jouer un rôle de facteur « pioneer » et de « Gatekeeper » en orientant le destin cellulaire des progéniteurs NKX2.1+ vers une différenciation thyroïdienne à défaut d’une différenciation pulmonaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Implication de la protéine de biogenèse des ribosomes Rsl24d1 dans l'homéostasie de cellules souches embryonnaires murines / Role of the ribosome biogenesis protein Rsl24d1 in mouse embryonic stem cells

Bruelle, Marion 19 February 2018 (has links)
Le contrôle de l'expression des programmes géniques orchestrant le développement précoce et l'homéostasie des cellules souches fait l'objet de recherches intenses. En effet, les cellules souches embryonnaires (CSE) sont caractérisées par des propriétés comme leur clonogénicité (la capacité à proliférer dans le même état indifférencié) et leur pluripotence (la capacité à se différencier et à former les tissus embryonnaires et adultes). Au niveau moléculaire, l'identité des CSE est orchestrée par le contrôle de l'expression génique aux niveaux épigénétique, transcriptionnel, post- transcriptionnel et traductionnel en réponse à l'activation de voies de signalisation spécifiques. Dans ce contexte, des données récentes suggèrent un rôle de la machinerie traductionnelle les ribosomes et de la régulation de leur biogenèse, dans le maintien de l'homéostasie de cellules souches de différentes espèces. À partir de l'analyse de données transcriptomiques à haut débit (RNAseq), mon équipe d'accueil a ainsi identifié un ensemble de protéines associées aux ribosomes (PaR) significativement enrichies dans les cellules souches embryonnaires murines (CSEm) en comparaison à des lignées cellulaires murines différenciées et à des tissus. Parmi ces candidats, mes travaux de thèse ont consisté à la caractérisation d'une PaR particulièrement enrichie : Rsl24d1. Rsl24d1 est une protéine de biogenèse des ribosomes décrites exclusivement chez la levure. Son profil d'expression dans différentes lignées de CSEm suggère une fonction spécifique: enrichissement au niveau transcriptionnel et protéique dans les CSE à l'état de pluripotence naïf et diminution importante au cours de la différenciation. En effet, des approches de perte d'expression de Rsl24d1 m'ont permis d'établir l'importance de cette PaR dans l'homéostasie des CSEm. Rsl24d1 contribue au maintien de la prolifération cellulaire des CSE, de leur clonogénicité et plus modérément à leur pluripotence. Rsl24d1 semble être une protéine majoritairement nucléaire mais également associée aux sous- unités 60S libres des ribosomes cytoplasmiques. D'autre part, la perte d'expression de Rsl24d1 affecte spécifiquement la biogenèse des particules ribosomiques 60S. Ainsi, comme chez la levure, dans les CSEm, Rsl24d1 est un facteur navette orchestrant la maturation des particules ribosomiques pré-60S. Par ailleurs, Rsl24d1 semble permettre le maintien d'un taux de synthèse protéique élevé permettant notamment le renouvellement des protéines ayant une demi-vie courte parmi lesquels on recense des facteurs de transcription de la pluripotence comme Oct4 (Oct3/4), Nanog et Esrrb. Mes travaux de thèse ont donc permis d'identifier et de caractériser un facteur de biogenèse de la sous-unité 60S, Rsl24d1, impliqué dans l'homéostasie des CSEm / Embryonic stem cells (ESC) possess clonogenic and pluripotency abilities i.e. they are able to self-renew indefinitely in the same developpemental state and to differentiate in all the cell types composing embryonic and adult tissues. ESC homeostasis is coordinated by complex networks which are regulated at different levels of gene expression regulation, including epigenetic, transcriptional and post-transcriptional levels. Furthermore, emerging evidences point out that the translational machinery, ribosomes, are directly implicated in the control of adult and embryonic stem cell homeostasis in different model organisms. Along this line, we have identified Rsl24d1, a ribosomal associated protein (RaP), which is strongly expressed in naïve murine ESCs compared to their differentiated progenies. We demonstrated that Rsl24d1 actively contributes to ESC homeostasis and its expression is essential for ESC proliferation and clonogenic capacities. Finally, we have also demonstrated that Rsl24d1, like Rlp24 its yeast ortholog, is associated to pre-ribosomes in ESCs from the nucleus to the cytoplasm and is required for the biogenesis of the large ribosomal subunit
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Making cortex in a dish: an intrinsic mechanism of corticogenesis from embryonic stem cells

Gaspard, Nicolas 03 September 2009 (has links)
The cerebral cortex develops through the coordinated generation of dozens of neuronal <p>subtypes, but the mechanisms involved remain unclear. Here we show that mouse embryonic <p>stem cells, cultured without any morphogen but in the presence of a sonic hedgehog inhibitor, <p>recapitulate in vitro the major milestones of cortical development, leading to the sequential <p>generation of a diverse repertoire of neurons that display most salient features of genuine <p>cortical pyramidal neurons. When grafted into the cerebral cortex, these neurons develop <p>patterns of axonal projections corresponding to a wide range of cortical layers, but also to <p>highly specific cortical areas, in particular visual and limbic areas, thereby demonstrating that <p>the identity of a cortical area can be specified without any influence from the brain. The <p>discovery of intrinsic corticogenesis sheds new light on the mechanisms of neuronal <p>specification, and opens new avenues for the modelling and treatment of brain diseases. <p>In a further attempt to prove the validity of this model, we have initiated the study of the <p>mechanism of action of FoxG1, a forkhead box transcription factor involved in the control of <p>cell fate decision in the developing cortex. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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A genome-wide characterization of Mof or Tip60 containing complexes in mouse embryonic stem cells / L'analyse génomique des complexes contenant les acétyltransférases Mof ou Tip60 révèle des fonctions à la fois redondantes mais aussi spécifiques dans les cellules souches embryonnaire de souris

Ravens, Sarina 01 December 2014 (has links)
L’acétylation des histones est associée à une activation transcriptionnelle. Cette acétylation est mise en place par des histone acétyltransférases (HATs) qui sont le plus souvent les sous-unités catalytiques de complexes multiprotéiques. Mon travail concerne plus particulièrement deux complexes contenant l’acétyltransférase Mof, MSL et NSL, ainsi que le complexe HAT Tip60-p400 dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). Nos analyses de localistaion sur l’ensemble du génome par ChIP-seq indiquent que MSL, NSL et Tip60-p400 se lient aux gènes activement transcrits et agissent comme des co-activateurs transcriptionnels majeurs dans les mESCs. MSL, NSL et Tip60-p400 ont des rôles à la fois chevauchants mais aussi distincts dans la régulation transcriptionnelle dans les mESCs. Chaque complexe présent un profil distinct de liaison à la chromatine. NSL lie principalement des gènes de ménage. MSL et Tip60-p400 sont également présent les gènes impliqués dans le développement. MSL est directement impliqué dans l’augmentation de l’expression de ces gènes au cours de la différenciation des mESCs. / Histone acetylation is involved in transcriptional activation of genes and is carried out by histone acetyltransferases (HATs), which are part of molecular protein complexes. This study focuses on the genome-wide role of Mof-containing MSL and NSL complexes and the Tip60-p400 complex in mouse embryonic stem cells (mESCs). I have analysed these complexes by ChIP-seq, shRNA knockdown and biochemical approaches. The genome-wide binding studies show that NSL, MSL and Tip60-p400 have a global overlap at promoters, but also bind to specific gene sets. There distinct binding profiles propose distinct roles in transcriptional regulation. MSL is the main H4K16 acetylase in mESCs.NSL binds mainly to housekeeping genes, whereas MSL and Tip60 are also present at developmental genes. Importantly, these developmental genes are directly regulated by MSL during cellular differentiation.
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Etude in vitro et in vivo d'une cardiomyopathie secondaire à une laminopathie / In vitro and in vivo study of a cardiomyopathy secondary to a laminopathy

Jebeniani, Imen 27 January 2017 (has links)
La mutation LMNA H222P est responsable de dystrophie musculaire d’Emery Dreifuss autosomale dominante (DMED-AD). Les patients atteints de DMED-AD souffrent d’une dystrophie musculaire et de cardiomyopathie dilatée. Les mécanismes moléculaires impliqués dans cette pathologie sont encore peu connus. Dans mes travaux de thèse, je me suis servie de cellules souches pluripotentes murines ainsi que de souris portant la mutation LMNA H222P afin d’étudier une approche thérapeutique potentielle. L'échocardiographie des souris LMNA H222P in utero révèle une dilatation des cœurs embryonnaires dès E13.5, ce qui indique une origine développementale de la maladie. La différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes murines est altérée dès le stade mésoderme. Aussi, les niveaux d’expression de Mesp1, snail1 et twist, gènes impliqués dans la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) sont diminués dans les cellules mutées en comparaison avec les cellules sauvages en cours de différenciation. L'immunoprécipitation de la chromatine dans les cellules différenciées révèle une diminution spécifique de la marque d'histone H3K4me1 sur des régions régulatrices de Mesp1 et Twist. L'inhibition de LSD1, une déméthylase spécifique de H3K4me1 rétablit le taux de la marque H3K4me1 sur les régions génomiques étudiées dans les cellules mutées. De plus, la baisse de LSD1 améliore la contraction des cardiomyocytes différenciés obtenus à partir des cellules souches embryonnaires portant la mutation LMNA H222P. L'inhibiteur de LSD1, utilisé dans les essais cliniques en cancérologie, pourrait être une molécule thérapeutique potentielle pour le traitement des laminopathies à phénotype cardiaque. / The LMNA H222P missense mutation in autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy patients is responsible for a muscular dystrophy and dilated cardiomyopathy. The molecular mechanisms underlying the origin and development of the pathology are still unknown. Herein, we used mouse pluripotent stem cells as well as a mutant mouse, all harboring the LMNA H222P mutation, to investigate potential therapeutic approaches. Echocardiography of LMNA H222P mice in utero revealed dilatation of heart as early as E13.5, pointing to a developmental origin of the disease. Cardiac differentiation of mouse pluripotent stem cells was impaired as early as the mesodermal stage. Expression of Mesp1, a mesodermal cardiogenic gene as well as snail1 and twist, involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT) of epiblast cells, was decreased in mutated cells when compared to wild type in the course of differentiation. In turn, cardiomyocyte differentiation was impaired. Chromatin immunoprecipitation assays of the H3K4me1 epigenetic mark in differentiating cells revealed a specific decrease of this histone mark on regulatory regions of MesP1 and Twist. Downregulation or inhibition of LSD1, that specifically demethylates H3K4me1, rescued the epigenetic landscape in mutated cells. In turn downregulation of LSD1 rescued contraction in cardiomyocytes differentiated from LMNA H222P pluripotent stem cells. Our data point to LSD1 inhibitor, used in clinical trials in cancerology, as potential therapeutic molecule for laminopathies with a cardiac phenotype.
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Genome-wide analysis of ATP-dependent chromatin remodeling functions in embryonic stem cells / Analyse de la fonction des facteurs de remodelage de chromatine ATP-dépendants dans le contrôle de l’expression du génome des cellules souches embryonnaires

Bou Dargham, Daria 13 October 2015 (has links)
Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) constituent un excellent système modèle pour étudier les mécanismes épigénétiques contrôlant la transcription du génome mammifère. Un nombre important de membres de la famille des facteurs de remodelage de chromatine ATP-dépendants ont une fonction essentielle pour l’auto-renouvellement des cellules ES, ou au cours de la différentiation. On pense que ces facteurs exercent ces rôles essentiels en régulant l’accessibilité de la chromatine au niveau des éléments régulateurs de la transcription, en modulant la stabilité et le positionnement des nucléosome.Dans ce projet, nous avons conduit une étude génomique à grande échelle du rôle d’une dizaine des remodeleurs (Chd1, Chd2, Chd4, Chd6, Chd8, Chd9, Ep400, Brg1, Smarca3, Smarcad1, Smarca5, ATRX et Chd1l) dans les cellules ES. Une double stratégie expérimentale a été utilisée : Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine suivi par un séquençage à haute-débit (ChIP-seq) sur des cellules ES étiquetées pour les différents remodeleurs, pour étudier leur distribution sur le génome, et un approche transcriptomique sur des cellules déplétées de chaque remodeleur par traitement avec des vecteurs shRNA (knockdown). Nous avons établi les profils de liaison des remodeleurs sur des éléments régulateurs (promoteurs, enhancers et sites CTCF) sur le génome, et montré que ces facteurs occupent toutes les catégories d’éléments régulateurs du génome. La corrélation entre les données ChIP-seq et les données transcriptomiques nous a permis d’analyser le rôle des remodeleurs dans les réseaux de transcription essentiels des cellules ES. Nous avons notamment démontré l’importance particulière de certains remodeleurs comme Brg1, Chd4, Ep400 et Smarcad1 dans la régulation de la transcription chez les cellules ES. / The characteristics of embryonic stem cells (ES cells) make them one of the best models to study the epigenetic regulation exerted by different actors in order to control the transcription of the mammalian genome. Members of the Snf2 family of ATP-dependent chromatin remodeling factors were shown to be of specific importance for ES cell self-renewal and during differentiation. These factors are believed to play essential roles in modifying the chromatin landscape through their capacity to position nucleosomes and determine their occupancy throughout the genome, making the chromatin more or less accessible to DNA binding factors.In this project, a genome-wide analysis of the function of a number of ATP-dependent chromatin remodelers (Chd1, Chd2, Chd4, Chd6, Chd8, Chd9, Brg1, Ep400, ATRX, Smarca3, Smarca5, Smarcad1 and Alc1) in mouse embryonic stem (ES) cells was conducted. This was done using a double experimental strategy. First, a ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation followed by deep sequencing) strategy was done on ES cells tagged for each factor in the goal of revealing the genomic binding profiles of the remodeling factors. Second, loss-of-function studies followed by transcriptome analysis in ES cells were performed in order to understand the functional role of remodelers. Data from both studies were correlated to acquire a better understanding of the role of remodelers in the transcriptional network of ES cells. Specific binding profiles of remodelers on promoters, enhancers and CTCF binding sites were revealed by our study. Transcriptomic data analysis of the deregulated genes upon remodeler factor knockdown, revealed the essential role of Chd4, Ep400, Smarcad1 and Brg1 in the control of transcription of ES cell genes. Altogether, our data highlight how the distinct chromatin remodeling factors cooperate to control the ES cell state.
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Differentiable PKC activation on pacemaking activity of cardiomyocytes derived from mouse embryonic stem cells

Ghaffar, Merna 12 1900 (has links)
Les maladies cardiovasculaires sont souvent causées par des arythmies qui proviennent d'une obstruction du système de conduction cardiaque. L'intervenant clé de ce système est le nœud sinu-atrial (SA), qui est responsable de l’initiation de chaque battement cardiaque. L’activation électrique à intervalles réguliers, assurant que le rythme cardiaque est un rythme normal. Le dysfonctionnement du nœud SA entraînerait des instabilités électriques dans le cœur. Une maladie cardiaque acquise, comme la cardiopathie rhumatismale, ou un bloc de conduction ne sont que quelques-uns des nombreux cas qui nécessitent un stimulateur cardiaque électronique pour surveiller la fréquence cardiaque et générer une impulsion lorsqu'elle bat anormalement. Bien que le stimulateur cardiaque électrique soit considéré comme une thérapie fiable, il n'est pas sans limites. Ces limites comprennent les complications chirurgicales, l'infection au plomb ainsi que la durée de vie limitée de la batterie, qui doit être remplacée à intervalles de quelques années, ce qui alourdit le fardeau hospitalier. Plusieurs approches ont été adoptées pour développer une méthode thérapeutique plus adéquate. Une stratégie qui sera étudiée implique l'utilisation d'une greffe de cellules de stimulateur cardiaque, créant fondamentalement un stimulateur biologique. Les approches de thérapie cellulaire utilisent des cellules souches embryonnaires pour évoluer vers les lignées de cellules cardiaques, y compris les cellules stimulatrices cardiaques. Ces cellules de stimulation sont caractérisées par une dépolarisation spontanée qui crée les impulsions rythmiques dans le cœur et contrôle la fréquence cardiaque. Un élément important des cellules du stimulateur cardiaque qui donne lieu à la dépolarisation spontanée sont les canaux « hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated » qui sont activés pendant l’hyperpolarisation et conduisent le courant sous le nom de « funny current ». Ce courant augmente la perméabilité intérieure de la cellule aux courants de sodium et de potassium conduisant à la dépolarisation de la cellule. D'autre part, le taux de conduction est déterminé par la connexine 30.2 et la connexine 45, qui sont des protéines transmembranaires qui s’assemblent pour former des jonctions lacunaires. L'expression de HCN et l'expression de la connexine ont toutes deux étés liés au facteur T-box 3 (Tbx3) dans le développement des myocytes auriculaires. Une approche praticable pour moduler l'expression des gènes et par conséquent l'expression des protéines est l'utilisation du conditionnement chimique. Le Phorbol 12- myristate 13-acétate (PMA) est un activateur de Protéine Kinase C (PKC) lié à l'expression de Tbx3, et par conséquent à l'expression de HCN et de connexine, et entraînant une modification de l'activité spontanée. Les cellules souches embryonnaires de souris sont des cellules qui sont isolées de la masse cellulaire interne des embryons. Ces cellules ont la capacité de se différencier en tous les types de cellules somatiques. En combinant les facteurs de croissance, ces cellules peuvent se différencier en cardiomyocytes. Nous émettons l'hypothèse que le conditionnement chronique de cardiomyocytes de souris avec PMA entraîne une régulation à la hausse de l'expression de Tbx3 et par conséquent une régulation à la hausse de l'expression de HCN et de l'expression de connexine, favorisant ainsi le développement des cellules stimulatrices cardiaques dans la population des cardiomyocytes. Afin de vérifier notre hypothèse, nous avons acheté des cellules de la lignée cellulaire E14TG2A de souris. Ces cellules ont été cultivées dans des pétris et différenciées en cardiomyocytes à l'aide d'un protocole en trois étapes (voir la section Méthodes). Les cardiomyocytes sont ensuite exposés à la PMA à des concentrations variables (0.1 µM vs 1 µM) pendant 1h (exposition aiguë) ou 24 h (exposition chronique). Les résultats variaient d'un groupe expérimental à l'autre par rapport au groupe témoin. Dans toutes les conditions expérimentales, il semble y avoir une augmentation initiale de l'activité spontanée, mais elle s'inverse rapidement à la marque des 24 heures, où le rythme diminue. Différentes concentrations jouent un rôle dose-dépendant dans l'effet inhibiteur de longue durée sur la stimulation des cellules. / Cardiovascular diseases are often caused by arrhythmias that originate from an obstruction within the cardiac conduction system. The key player within that system is the sinoatrial (SA) node, which is responsible for initiation the electrical impulses at a regular interval, insuring the heartbeat at a normal pace. Dysfunction of the SA node would lead to electrical instabilities in the heart. An acquired heart disease, such as rheumatic heart disease, or a conduction block are just some of many cases that would require an electronic pacemaker to monitor the heart rate and generate an impulse when it beats abnormally. Although the electric pacemaker is considered as a reliable therapy, it is not without limitations. These limitations include surgery complication, lead infection as well as limited battery lifespan, which requires replacement every few years thus adding to the hospital burden. Several approaches have been taken to develop a more adequate therapeutic method. A strategy that will be investigated involves using a graft of pacemaker cells, fundamentally creating a biological pacemaker. Cell therapy approaches use embryonic stem cells to evolve into the cardiac cell lines, including pacemaker cells. These pacing cells are characterized by spontaneous depolarization that create the rhythmic impulses in the heart and control the heart rate. An important element of the pacemaker cells that give rise to the spontaneous depolarization are the hyperpolarization- activated and cyclic nucleotide-gated (HCN) channels that are activated during hyperpolarization and conduct the funny current by increasing the cell’s inward permeability to sodium-potassium currents. On the other hand, the conduction rate is determined by connexin 30.2 and connexin 45, which are transmembrane proteins that assemble to form gap junctions. Both HCN expression and connexin expression has been linked to T-box factor 3 (Tbx3) in the development of atrial myocytes. A practicable approach to modulate gene expression and consequently protein expression is using chemical conditioning. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) is a Protein Kinase C (PKC) activator that has linked to Tbx3 expression, and consequently HCN and connexin expression, and lead to a modification in spontaneous activity. Mouse embryonic stem cells (ESCs) are cells that are isolated from the inner cell mass of early embryos. These cells can differentiate into all somatic cell types. Given the proper combination of growth factors, these cells can differentiate into cardiomyocytes. We hypothesize that chronic conditioning of mice cardiomyocytes with PMA lead to an upregulation of Tbx3 expression and consequently an upregulation of HCN expression and connexin expression, therefore promoting the development of pacemaker cells within the cardiomyocyte population. In order to test our hypothesis, we purchased cells from the mouse E14TG2A cell line. These cells were cultured in glass bottom petri dishes and differentiated into cardiomyocytes using a three-step protocol (shown in Methods section). The cardiomyocytes are then exposed to PMA in varying concentration (0.1 µM vs 1 µM) for either 1h (acute exposure) or 24 h (chronic exposure). The results varied between the experimental groups compared to the control. In all experimental conditions there seems to be an initial increase in spontaneous activity, but this is quickly reversed at the 24 h mark, where pacing decreased. Different concentration plays a dose-dependent role in long-lasting inhibitory effect on the pacing of the cells

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