A matriz extracelular (MEC) dos tecidos uterinos é altamente remodelada na gestação de camundongos. Os objetivos deste estudo foram avaliar a influência dos hormônios ovarianos estrógeno (E2) e progesterona (P4) sobre a estrutura dos tecidos uterinos de camundongo e a deposição dos proteoglicanos decorim, biglicam, fibromodulim, lumicam, perlecam e versicam nestes tecidos. Para isto, utilizamos um modelo de castração e reposição hormonal, e o ciclo estral como parâmetro fisiológico. Verificamos que, como na gestação, durante o ciclo estral ocorre intensa remodelação na estrutura e na MEC dos tecidos uterinos. Verificamos ainda que a resposta aos hormônios ovarianos é: compartimento-específica; hormônio-específica e molécula-específica. Notável foi a modulação do versicam pelos hormônios ovarianos. P4 induz a deposição de versicam no estroma, enquanto o miométrio responde apenas a E2. A modulação dos proteoglicanos pelos hormônios ovarianos mostra a relevância destas moléculas para a composição de um ambiente uterino propício para o desenvolvimento do embrião. / The extracellular matrix (ECM) of the mouse uterine tissues is highly remodeled during pregnancy. The aim of this study was to demonstrate the influence of estrogen (E2) and progesterone (P4) on the uterine structure and on the deposition of the proteoglycans decorin, biglycan, fibromodulin, lumican, perlecan and versican in these tissues. For that purpose, we used a model of castration e hormone replacement as main strategy, and the estrous cycle as physiological parameter. We verified that, as in pregnancy, during the estrous cycle an intense remodeling occurs on the structure and the ECM of the uterine tissues. We also showed that the response to the ovarian hormones is: compartment-; hormone- and molecule- specific. Noteworthy was the modulation of versican by the hormones: P4 induces the deposition of versican in the stroma, whereas the myometrium responds only to E2. The modulation of proteoglycans by the ovarian hormones indicates the relevance of these molecules for the composition of a proper microenvironment for embryo development.

As Distrofias Musculares Progressivas (DMPs) constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Dentre as diferentes abordagens terapêuticas propostas para esse grupo de doenças, a terapia celular com células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido um foco importante de pesquisas. Muitos tipos de CTMs já foram descritas com o intuito de reconhecer qual o tipo ideal a ser usado em uma possível terapia celular para DMPs. Neste trabalho comparamos o potencial terapêutico de células-tronco de diferentes fontes obtidas de um mesmo doador. Escolhemos as células de pericito (CP) como ferramenta de estudo, uma vez que elas estão presentes em todos os tecidos irrigados por vasculatura. Isolamos pericitos de 4 tecidos da mesma doadora (endométrio, trompa, tecido adiposo e músculo). Em seguida, injetamos 1 milhão dessas células intraperitonialmente em camundongos Utrntm1KedDmdmdx/J (duplo knockout para o gene da distrofina e utrofina) semanalmente, por 8 semanas, e avaliamos a clínica e a sobrevida desses animais. Observamos que nas condições experimentais desse estudo, o potencial miogênico dessas células é insuficiente para ser utilizado como terapia regenerativa. Entretanto, apesar dos testes padronizados não detectarem nenhuma melhora clínica aparente, os animais tratado com pericitos de gordura mostraram uma curva de sobrevivência significativamente maior do que os controles não tratados. Como não houve diferenciação miogênica, esses resultados sugerem que os efeitos benéficos ocorreram através de liberação de fatores tróficos e imunoreguladores (efeito parácrino). É digno de nota que apesar das células serem todas derivadas de pericito e de uma mesma doadora o aumento de sobrevida só foi observado com células do tecido adiposo. Esses resultados indicam que o potencial terapêutico de CP difere de acordo com sua origem e que essa diferença não depende do genoma do doador. Esses resultados constituem um passo inicial, porém, valioso na compreensão do potencial de utilização dessas células em terapias / Progressive Muscular Disorders (PMDs) are a group of heterogeneous genetic diseases characterized by an irreversible degeneration of the muscle tissue due to mutation or absence of a protein. Among the many different available therapeutic approaches to treat PMDs, cell therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the most studied ones. There are many types of MCSs described to date and the need to identify the best one suited to treat PMDs has yet to be addressed. In this thesis, we compared the therapeutic potential of different types of stem cells derived from the same donor. First, we chose pericytes as a tool of comparison, as this cell is unequivocally present in all vascularized tissues. We isolated pericytes of 4 different tissues from the same donor (endometrium, fallopian tubes, adipose tissue and muscle). We injected 1 million of these cells intraperitonially in Utrntm1KedDmdmdx/J mice (knockout for the dystrophin and utrophin gene) weekly for 8 weeks evaluating the clinical features and survival curve of these mice. We observed that, in the experimental conditions of this study, the myogenic potential of these cells is insufficient to be harnessed as therapy for regenerative purposes. However, despite the fact that the standardized tests did not detect any apparent clinical improvement, mice treated with pericytes derived from adipose tissue had a survival curve greater than control treated mice. As we could not observe any myogenic differentiation or cell engraftment, this results suggests that the beneficial effect observed could be due to the releasing of trophic and immune modulator factors (paracrine effect). It is noteworthy that despite all cells being derived from the same donor, the increase in life expectancy was only observed in pericytes derived from the adipose tissue. These results indicate that the therapeutic potential of pericytes differs according to their tissue of origin and the difference is not due to genetic differences. This is still preliminary data but it is valuable in understanding the therapeutic potential of these cells

O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células Tγ&#948 para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células Tγ&#948, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células Tγ&#948 foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células Tγ&#948 para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina. / The maternal immune system plays an important role on the establishment and maintenance of pregnancy until the onset of parturition in mammals. Our hypothesis is that there is a recruitment of γ&#948T-cell to the endometrium during pregnancy. These cells express a particular cytokine profile that is important to the establishment and maintenance of maternal toleranceto fetal antigens in cattle. Experiment I - To study the population dynamics of immune cells in the peripheral blood of NLNP, 1st and 3rd trimester of pregnancy, PBMCs were separated by Ficoll density gradient and the abundance of CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ and WC1+ was analyzed by single-color flow cytometry. There was no statistical difference of the abundance of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ among groups of cows. Experiment II To analyze the gene expression profile of 1st trimester, LNP and NLNP. PBMCs were isolated by Ficoll density gradient and γ&#948T-cells (WC1+) were enriched by magnetic cell sorting. Both PBMC and WC1+ cells gene expression was analyzed for IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 and TNFA by qRT-PCR. Gene expression analysis showed increased expression of the IL1B, IL6 and TGFB2 in PBMC in NLNP compared with 1st trimester of pregnancy and LNP cows, while other genes analyzed showed no significant difference. Experiment III fragments of endometrium were collected from cows at the early (33 to 35 days of pregnancy), mid (143 to 182 days of pregnancy) and late pregnancy (228 to 247 days of pregnancy). Endometrial immune cells were quantified (CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+, and WC1+) by single-color immunofluorescence. There was an increase CD25+ and CD62L+ cells in the endometrium in early pregnancy. In the mid of pregnancy, there was an increase of WC1+ and CD14+ cells. At the end of pregnancy, there was an increase of CD14+, CD25+, CD18+ and CD62L+. In conclusion, our data suggest that the maternal immune system is modulated according to the stage of pregnancy in the cow. In early pregnancy, there is an increased number of endometrial CD25+ cells that may reflect the activation of local immune response and recruitment of putative T-reg cells to the endometrium for an active establishment of maternal tolerance to fetal antigens. While, in mid pregnancy there is a massive recruitment of γ&#948T-cells and CD14+ to the pregnant endometrium perhaps to maintain an tolerogenic microenvironment and to promote tissue remodeling for proper fetal development and growth. Finally, in late pregnancy, there is a recruitment of effector immune cells such as CD62L+, CD18 and CD14+ cells associated with an increased expression of proinflammatory cytokines (i.e. IFNG, IL-6) to play a role on induction of parturition and uterine involution in the cow

A leptina é um hormônio peptídico multifuncional, produzido principalmente pelo tecido adiposo, possuindo receptores (Ob-Rs) nos órgãos reprodutivos, hipotálamo e hipófise. Os glicocorticóides, como o cortisol, também influenciam diretamente a produção de leptina. A importância desses dois hormônios na atividade reprodutiva tem sido descrita por diversos autores, que observaramo envolvimento de ambos, na melhoria dos índices reprodutivos, seja por sua influência direta no eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal, na maturação dos oócitos ou na preparação uterina para receber o concepto. No entanto, quando em excesso na circulação, podem influênciar negativamente o sistema reprodutivo. Marcadores como a leptina e seu receptor funcional de cadeia longa, estão sendo estudados no endométrio de espécies como humanos, bovinos e suínos, apresentando resultados que correlacionam a diminuição destes, com a infertilidade ou perda embrionária, porém até o momento não foi possível encontrar estudos que abordassem esse tema em equinos. Neste estudo foram avaliados: 1) a presença de leptina (Ob) e seu receptor (Ob-Rb) no endométrio de éguas, observando a influência da obesidade e do ciclo estral nesses marcadores e 2) em uma condição de manejo adverso e estressante, a influência do cortisol intrafolicular, nos níveis de leptina no fluido folicular (FF) e nos marcadores de Ob e Ob-Rb no endométrio durante as fases do ciclo estral. Os resultados demonstraram que existe a presença da leptina e seu receptor (Ob-Rb) no endométrio de equinos, com imunomarcação no epitélio luminal e glandular em todas as fases do ciclo estral avaliadas, apresentando, no entanto, uma marcação imunológica mais intensa nos Ob-Rb (142.68±4.97, P< 0,0001) no epitélio glandular durante o diestro em éguas de escore corporal moderado. Não foi possível observar a influência do aumento do cortisol intrafolicular (FF) nas variáveis avaliadas, pois o cortisol se manteve dentro dos valores fisiológicos para a espécie, no entanto pode-se verificar uma correlação positiva entre os níveis intrafoliculares de cortisol e leptina, estando o cortisol aumentado 8 (30.1±0.07ng/ml, P< 0,05) nos folículos mais próximos a ovulação. Pode-se perceber também, que a marcação imunológica do receptor de leptina no epitélio glandular foi mais intensa (144.52±3.17, P< 0,0001) nos animais que apresentavam folículos até 22 mm, estando a imunomarcação de ambos Ob e Ob-Rb correlacionado de forma negativa (r: -0.7836; P < 0.0001, r:- 0.7343; P < 0.0001), com os níveis de cortisol no FF. / Leptin is a multifunctional peptidic hormone, mainly produced by adipose tissue, having receptors (Ob-Rs) in the reproductive organs, hypothalamus and pituitary. Glucocorticoids, such as cortisol, also directly influence leptin production. The importance of these two hormones in reproductive activity has been described by several authors, who observed the involvement of both, in the improvement of reproductive indices, either by their direct influence on the hypothalamic-pituitary-gonadal axis, oocyte maturation or the uterine preparation to receive the concept. However, when in excess in circulation, they can negatively influence the reproductive system. Markers such as leptin and its long-chain functional receptor are being studied in the endometrium of species such as humans, cattle and pigs, presenting results that correlate the decrease of these with infertility or embryonic loss, but to date it has not been possible to find studies to address this issue in horses. In this study we evaluated: 1) the presence of leptin (Ob) and its receptor (Ob-Rb) in the endometrium of mares, observing the influence of obesity and estrous cycle on these markers and 2) in an adverse and stressful management condition, the influence of intrafollicular cortisol, leptin levels in the follicular fluid (FF), and the Ob and Ob-Rb markers in the endometrium during the estrous cycle phases. The results showed that leptin and its receptor (Ob-Rb) are present in the equine endometrium, with immunostaining in the luminal and glandular epithelium in all stages of the estrous cycle evaluated, however, showing a more intense immunological labeling in Ob -Rb (142.68 ± 4.97, P <0.0001) in the glandular epithelium during the diestrous in mares of moderate body score. It was not possible to observe the influence of intrafollicular cortisol (FF) on the variables evaluated, because cortisol remained within the physiological values for the species, however a positive correlation can be observed between intrafollicular cortisol and leptin levels, being the 10 cortisol increased (30.1 ± 0.07ng/ml, P <0.05) in the follicles closest to ovulation. It can also be noticed that the immunological labeling of the leptin receptor in the glandular epithelium was more intense (144.52 ± 3.17, P <0.0001) in the animals that presented follicles up to 22 mm, and the immunostaining of both Ob and Ob-Rb correlated negatively (r: -0.7836; P <0.0001, r: - 0.7343; P <0.0001), with cortisol levels in FF.

A endometriose é uma doença ginecológica benigna, de etiologia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de estroma e tecido glandular tipo endométrio fora da cavidade uterina. Afeta de 10 a 15% da população feminina, que apresentam sintomatologia variada, incluindo dor pélvica e infertilidade. Para elucidar mecanismos potenciais que estejam envolvidos com a fisiopatologia complexa desta doença, analisamos o perfil de expressão gênico diferencial pela metodologia de hibridação subtrativa em tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais e endometrioma ovariano) de 17 mulheres com endometriose, no início da fase proliferativa do ciclo menstrual. Foram identificados 291 genes desregulados nas lesões endometrióticas, considerados como genes candidatos. Para a validação dos dados, utilizamos a metodologia de PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC, indicados como superexpressos; e MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP como menos expressos nas lesões. Diferenças significativas de expressão nas lesões peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. Sugerimos que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP seja responsável pela perda da homeostase celular nas lesões endometrióticas, contribuindo para a implantação e sobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Este trabalho disponibilizou ao banco de dados da literatura, 291 genes com expressão gênica diferencial em lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas como candidatos a investigações futuras. / Endometriosis is a benign gynecological disease, which presents a multifactorial and complex etiology, characterized by the presence of stromal and glandular endometrium tissue outside the uterine cavity. Ten to 15% of the female population is affected by the disease with a wideranging symptomatology including pelvic pain and infertility. To clarify the potential mechanisms involved in the complex physiopathology of this disease, we analyzed the differential gene expression profile by subtractive hybridization in eutopic and ectopic tissue (peritoneal lesions and ovarian endometriomas) from 17 women with endometriosis, in the early proliferative phase of the menstrual cycle. We identified 291 genes deregulated in the endometriotic lesions, considered as candidate genes. For data validation, Real Time PCR was applied for genes CTGF and SPARC, indicated as overexpressed; and for genes MYC, MMP3, IGFBP1 and PAEP, indicated as downregulated in the lesions. Significant differences in the peritoneal lesions expression were obtained for genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP and in the ovarian endometriomas for genes MMP3 and PAEP. We suggest that the deregulation of genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI and PAEP is responsible for loss of cellular homeostasis in the endometriotic lesions, contributing for the implantation and maintenance of the ectopic tissue in the extra-uterine environment. This study provided 291 genes with differential gene expression, in peritoneal and ovarian lesions, to the literature database as candidates for future investigations.

OBJETIVO: Avaliar a receptividade endometrial de pacientes submetidas à embolização do mioma uterino, analisando a expressão gênica de LIF, IL-11, IL-6, claudina-4, HoxA-10, HoxA-11, receptor de estrogênio e receptor de progesterona antes e após este procedimento. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Foram colhidas biópsias aspirativas de endométrio de 30 pacientes previamente à embolização do mioma uterino e repetida a coleta 3 a 4 meses após este procedimento. A média etária do grupo estudado foi de 36,2 anos. O volume uterino médio pré-embolização foi de 662,1 cc e o pós-embolização foi de 338,2 cc, medidos através de ressonância nuclear magnética. INTERVENÇÃO: As amostras de endométrio foram analisadas pela técnica de RT-PCR para os genes LIF, IL-11, IL-6, claudina-4, HoxA-10, HoxA-11, receptor de estrogênio e receptor de progesterona. RESULTADOS: Dentre os genes estudados, LIF (p=0,005), IL-11 (p=0,001) e HoxA-11 (p=0,021) apresentaram redução estatisticamente significante da expressão no endométrio após a embolização. Os demais genes não apresentaram alteração da expressão estatisticamente significante. CONCLUSÃO: Houve alteração da expressão de genes relacionados à receptividade endometrial, no endométrio de pacientes tratadas pela técnica da embolização do mioma uterino / OBJECTIVE: Assessing endometrial receptivity in patients undergoing uterine fibroid embolization by analyzing the gene expression of LIF, IL-11, IL-6, claudin-4, Hoxa-10, Hoxa-11, estrogen receptor and progesterone receptor before and after this procedure. METHODS: Endometrial aspiration biopsies were collected from 30 patients prior to embolization of uterine myoma, and the collections were repeated 3 to 4 months after this procedure. The average age of the study group was 36.2 years old. The mean uterine volume pre-embolization was 662. 1 cc and post-embolization was 338.2cc as measured by Magnectic Resonance Imaging (MRI). INTERVENTION: Endometrial samples were analyzed by RT-PCR for genes LIF, IL-11, IL-6, claudin-4, Hoxa-10, Hoxa-11, estrogen receptor and progesterone receptor. RESULTS: Among the studied genes, LIF (p=0.005), IL-11 (p=0.001) and Hoxa-11 (p=0.021) showed statistically significant reduction of expression in the endometrium after embolization. The remaining genes showed no statistically significant change in expression. CONCLUSION: There was altered expression of genes related to endometrial receptivity in the endometrium of patients treated by the technique of embolization of uterine myoma

OBJETIVO: Avaliar a receptividade endometrial de pacientes submetidas à embolização do mioma uterino, analisando a expressão gênica de LIF, IL-11, IL-6, claudina-4, HoxA-10, HoxA-11, receptor de estrogênio e receptor de progesterona antes e após este procedimento. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Foram colhidas biópsias aspirativas de endométrio de 30 pacientes previamente à embolização do mioma uterino e repetida a coleta 3 a 4 meses após este procedimento. A média etária do grupo estudado foi de 36,2 anos. O volume uterino médio pré-embolização foi de 662,1 cc e o pós-embolização foi de 338,2 cc, medidos através de ressonância nuclear magnética. INTERVENÇÃO: As amostras de endométrio foram analisadas pela técnica de RT-PCR para os genes LIF, IL-11, IL-6, claudina-4, HoxA-10, HoxA-11, receptor de estrogênio e receptor de progesterona. RESULTADOS: Dentre os genes estudados, LIF (p=0,005), IL-11 (p=0,001) e HoxA-11 (p=0,021) apresentaram redução estatisticamente significante da expressão no endométrio após a embolização. Os demais genes não apresentaram alteração da expressão estatisticamente significante. CONCLUSÃO: Houve alteração da expressão de genes relacionados à receptividade endometrial, no endométrio de pacientes tratadas pela técnica da embolização do mioma uterino / OBJECTIVE: Assessing endometrial receptivity in patients undergoing uterine fibroid embolization by analyzing the gene expression of LIF, IL-11, IL-6, claudin-4, Hoxa-10, Hoxa-11, estrogen receptor and progesterone receptor before and after this procedure. METHODS: Endometrial aspiration biopsies were collected from 30 patients prior to embolization of uterine myoma, and the collections were repeated 3 to 4 months after this procedure. The average age of the study group was 36.2 years old. The mean uterine volume pre-embolization was 662. 1 cc and post-embolization was 338.2cc as measured by Magnectic Resonance Imaging (MRI). INTERVENTION: Endometrial samples were analyzed by RT-PCR for genes LIF, IL-11, IL-6, claudin-4, Hoxa-10, Hoxa-11, estrogen receptor and progesterone receptor. RESULTS: Among the studied genes, LIF (p=0.005), IL-11 (p=0.001) and Hoxa-11 (p=0.021) showed statistically significant reduction of expression in the endometrium after embolization. The remaining genes showed no statistically significant change in expression. CONCLUSION: There was altered expression of genes related to endometrial receptivity in the endometrium of patients treated by the technique of embolization of uterine myoma

O câncer de endométrio tem incidência crescente, principalmente nos países desenvolvidos, devido ao estilo de vida moderno, aumento de casos de obesidade e diabetes, e diversos outros fatores que, em conjunto, estão tornando esta neoplasia na mais comum no trato reprodutor feminino. Ele é bastante influenciado pelo estado hormonal e por fatores reprodutivos das pacientes. Assim, é mais frequente no período pós-menopausa, quando pode ocorrer um desequilíbrio na sinalização do estrogênio. A diabetes e a obesidade são causadas, principalmente, pelo excesso de triglicerídeos e glicose circulantes, e pela resistência à insulina. A hiperglicemia leva à produção excessiva de insulina e do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1), sendo que estes hormônios são considerados antiapoptóticos e promotores da proliferação celular. Sabe-se que eles agem por vias semelhantes e que, provavelmente, o mecanismo responsável pela proliferação provocada por eles está associado à via PI3K/Akt/mTOR. Desta forma, avaliamos a expressão gênica de 92 genes na rota de sinalização do IGF1R em câncer de endométrio (n=3) e endométrio normal (n=2), através da técnica de qRT-PCR (ensaio TaqMan® Array Human IGF1R Signaling). Dentro destes genes, alguns estão envolvidos diretamente com a via PI3K/Akt/MAPK, outros estão implicados em processos como proliferação, diferenciação, tumorigênese, apoptose, resposta imune, síntese proteica, entre outros. Avaliamos, também, os níveis proteicos do receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF1R), IGF1 e receptor da insulina (IR) pela técnica de imunohistoquímica, além da funcionalidade geral dos 4 genes mais diferencialmente expressos no câncer de endométrio Observamos que, dos 92 genes, 26 foram expressos somente no grupo câncer - CACNA1H, CRK, EIF2B5, ELK1, FRAP1 (MTOR), GYS1, HRAS, IGF2, IKBKB, IKBKE, ITPR3, KRAS, NFAT5, NFATC1, NFKB1, NFKBIB, NFKBIE, PIK3CA, PIK3CB, PLCB1, PLCB2, PLCG2, PRKCZ, RELB, SHC1 e YWHAZ; 46 tiveram expressão aumentada no grupo câncer de endométrio - AKT1, AKT2, ARAF, ATF4, BAD, BRAF, CACNA1C, CALM1, CALM2, CALM3, CREB1, EIF4E, FOXO3, GSK3B, IGF1, IGF1R, IKBKG, IRS1, MAP2K1, MAP2K2, MAPK3, MEF2C, MEF2D, NFATC2, NFATC3. NFKB2, NFKBIA, NRAS, PDPK1, PIK3CD, PIK3R1, PIK3R2, PLCG1, PPP3CA, PPP3R1, PRKCI, RAF1, RAPGEF1, RELA, RPS6, RPS6KB1, SOS1, YWHAB, YWHAE, YWHAH e YWHAQ, um não apresentou expressão em nenhum dos grupos (SLC2A4) e não foi possível analisar os restantes 20 genes, pois não foram expressos em todas as amostras. Quanto à expressão das proteínas IGF1R, IGF1 e IR, todas se mostraram mais expressas no câncer de endométrio e que se encontram localizadas principalmente no citoplasma das células. Assim, este trabalho mostra que a sinalização do IGF1R pode ter participação importante na aquisição do fenótipo maligno das células endometriais, e que o aumento das moléculas efetoras desta via no câncer de endométrio provavelmente está relacionado ao seu papel mitogênico. / Endometrial cancer has a growing incidence, especially in developed countries, because of the modern lifestyle, increased cases of obesity and diabetes, and several other factors that together make this disease the most common in the female reproductive tract. Endometrial cancer is strongly influenced by the hormonal state and by the reproductive factors of the patients. Thus, it is attributed to the postmenopausal period, when estrogen signaling can be unbalanced, and consequently lead to malignant proliferative patterns. Diabetes and obesity are caused mainly by the excess of circulating triglycerides and glucose, and by insulin resistance. Hyperglycemia leads to excessive production of insulin and IGF1.These hormones are considered to have antiapoptotic effects and to promote cell proliferation. It is known that they are very similar pathways, and the mechanism responsible for this proliferation is associated with the PI3K/Akt/mTOR pathway. Thus, we evaluated the expression of 92 genes in IGF1R signaling pathway in endometrial cancer (n = 3) and normal endometrium (n = 2), using qRT-PCR (TaqMan® Array Human IGF1R Signaling test). Within these genes, some are in the PI3K/Akt/MAPK pathways, others are involved in proliferation, differentiation, tumorigenesis, apoptosis, immune response, protein synthesis, among others We also evaluated the protein levels of IGF1R, IGF1 and IR by immunohistochemistry, as well as the general functionality of the 4 most differentially expressed genes in endometrial cancer. We found that 26 genes were expressed only in endometrial cancer - CACNA1H, CRK, EIF2B5, ELK1, FRAP1 (mTOR), GYS1, HRAS, IGF2, IKBKB, IKBKE, ITPR3, KRAS, NFAT5, NFATc1, NFKB1, NFKBIB, NFKBIE, PIK3CA, PIK3CB, PLCB1, PLCB2, PLCG2, PRKCZ, RELB, SHC1 and YWHAZ; 46 had increased expression in endometrial cancer, when compared to control group - AKT1, AKT2, ARAF, ATF4, BAD, BRAF, CACNA1C, CALM1, CALM2, CALM3, CREB1, eIF4E, FOXO3, GSK3B, IGF1, IGF1R IKBKG, IRS1, MAP2K1, MAP2K2, MAPK3 , MEF2C, MEF2D, NFATC2, NFATC3. NFKB2, NFKBIA, PIK3R1, PIK3R2, PLCG1, PPP3CA, PPP3R1, PRKCI, RAF1, RAPGEF1, RELA, RPS6, RPS6KB1, SOS1, YWHAB, YWHAE, YWHAH and YWHAQ, one showed no expression in neither groups (SLC2A4) and the other 20 were not expressed in all samples, so we decided not to analyze them. As for the expression of IGF1R, IGF1 and IR proteins, all them showed increased expression in endometrial cancer and were localized in the citoplasm. Thus, this work shows that IGF1R signaling may play an important role in the acquisition of a malignant phenotype by endometrial cells, and that the increase of these effectors in endometrial cancer is related to its mitogenic effects.

Endometriumkrebs ist eine der häufigsten gynäkologischen Malignomen weltweit und wird in einen Typ I eingeteilt, welcher östrogenabhängig ist, und in eine Typ-II-Östrogen-unabhängige Form. Typ I ist der häufigste Fall und kommt in etwa für 75% bis 85% aller diagnostizierten Fälle in Frage. Erhöhte Östrogenspiegel haben gezeigt, das Risiko von Gebärmutterkrebsentwicklung zu erhöhen, genauso wie Östrogen die Proliferation von Endometriumzellen stimuliert und die Apoptose hemmt. Die Insulinresistenz scheint eine zentrale Rolle in der endometrialen Karzinogenese zu spielen und darüber hinaus werden Erkrankungen mit Insulinresistenz, wie zum Beispiel das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) und Adipositas, sowie Typ II-Diabetes mellitus (DM) als signifikantes Risiko angesehen, Faktoren für die Entwicklung und Progression von Typ-I-Endometrium-Krebs zu sein. Zusätzlich können PCOS-Patienten durch eine Fettleibigkeit in einem normoglykämischen Status eine unabhängige Insulin-Resistenz haben. In diesem Fall scheint die Hyperinsulinämie der fördernde Faktor zu sein, nicht nur für die Entwicklung als auch für die Tumorprogression.Aber auch erhöhte Blutzuckerspiegel tragen zum Wachstum und die Karzinogenese in Endometriumkarzinom bei und dienen als wichtige Verbindung zwischen dem beobachteten erhöhten Krebsrisiko bei Patienten mit Typ-II-DM. Die Behandlung mit einem Anti-Diabetikum, welches den Insulinspiegel senken kann, könnte einen allgemeinen Ansatz bieten gegen die Entwicklung von Krebs und zur Verringerung der Metastasierung. Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung einer 0,1 mM Metformin-Dosis auf das proliferative und metastatische Potential von Endometriumkrebszellen bewerten zu können, sowie die Analyse der Auswirkungen von kurz- und langfristigen Behandlungen auf intrazelluläre Signalwege der Endometriumkrebszellen.(Fortsetzung) (Fortsetzung)Ebenso soll der Zusammenhang der Entwicklung und der Progression von Krebszellen untersucht werden, wenn sie einer Umgebung mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen und hohen Insulinspiegeln ausgesetzt werden. Darüber hinaus ist eine endometriale dreidimensionale (3D) Cokultur zu standardisieren, für eine viabele Kultur bei 20 Tagen Kultivierung. Das proliferative Potential wurde unter Verwendung des CellTitle-Glo-Tests durchgeführt, und das metastatische Potential wurde unter Verwendung von Transwell-Migration und Invasion untersucht. Die mRNAExpression von MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 und JAG1 Gene wurden durch real-time PCR gemessen. Die kumulative Populationsverdopplungsrate wurde durch das Replikationsverhalten einer Endometriumkrebszelllinie durchgehend von 20 Tagen nach einer Behandlungsdauer bestimmt. In allen Assays wurden die Zellen durch Medien mit normaler (5,5 mM) oder hoher (17 mM) Glucosekonzentration, sowie in verschiedenen Gruppen behandelt: Kontrolle, Insulin, Metformin und Insulin+Metformin. Das 3D-Kokulturmodell wurde unter Verwendung von endometrialen Primärzellen und einer Endometriumkrebszelllinie hergestellt, wobei die Modellkonstruktion durch Matrigel® als extrazelluläre Matrix verwendet wurde. In dieser Studie hemmte die 0,1 mM Metformin-Dosis die Insulinwirkung stark und verringerte die Fähigkeit der endometrialen Krebszelllinie, in einer hohen und normalen Glukoseumgebung zu migrieren und einzudringen.(Fortsetzung) (Fortsetzung) Auf das proliferative Potential wurde dieser Effekt nicht beobachtet, allerdings reagierte die relative Zellproliferation empfindlich auf Metformin im Bereich zwischen 1 und 5 mM, unabhängig von der vorliegenden Glucosekonzentration. In den intrazellulären molekularen Mechanismen wurde beobachtet, dass die hohe Glukosekonzentration eine optimale Umgebung für endometriale Krebszellen schafft, um einen aggressiveren Genotyp und eine Resistenz gegenüber Metformin während einer Langzeitbehandlung zu zeigen. Darüber hinaus blieb das endometriale 3DKokulturmodell über 20 Kulturtage lebensfähig. Daher zeigte sich, trotz der Endometriumkrebszellen, eine Resistenz gegenüber dem Metformin-Effekt, wenn sie einer hohen Glucoseumgebung ausgesetzt waren. Die 0,1 mM Metformin-Dosis war in der Lage, die Insulinwirkung zu hemmen und das metastatische Potential der Zellen zu verringern, was darauf hindeutet, dass Metformin klinisch in Verbindung mit Insulin wirkt, sowie die indirekten und direkten Effekte als potentieller Wirkstoff in der Krebstherapie eingesetzt werden könnten. / O câncer de endométrio é uma das neoplasias ginecológicas com maior incidência, classificado como tipo I, estrógeno dependente, e tipo II, estrógeno nãodependente. O tipo I é a forma mais comum, ocorrendo em torno de 75 – 85 % dos casos de câncer de endométrio. Altos níveis de estrogênio têm sido relacionados ao aumento do risco de desenvolvimento do câncer de endométrio, pois estimula a proliferação celular e inibe a apoptose. A resistência à insulina parece desempenhar um papel central nesta neoplasia, e as doenças associadas à resistência à insulina como obesidade, Diabetes Mellitus (DM) tipo II e Síndrome dos Ovários Policísticos (PCOS) também são consideradas fatores de risco significantes para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio tipo I. Adicionalmente, pacientes com PCOS podem apresentar um quadro de resistência à insulina independente de obesidade, permanecendo em um estado glicêmico normal. Neste caso, a hiperinsulinemia isolada seria um fator tanto para a promoção, como também para a progressão do câncer. Entretanto, o aumento de níveis séricos de glicose, a hiperglicemia, também é considerada um fator independente para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio sendo um elo crítico entre o aumento do risco do desenvolvimento de câncer observado em pacientes com DM tipo II Dessa forma, tratamento utilizando agentes insulino-sensibilizantes, que atuam diminuindo a resistência à insulina e consequentemente reduzindo seus níveis pode ser uma estratégia interessante para prevenir o câncer e reduzir a disseminação metastática. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o efeito da dose de 0,1 mM de metformina sobre o potencial proliferativo e metastático das células de câncer de endométrio, assim como, avaliar o efeito do tratamento a curto e a longo prazo sobre vias de sinalização intracelular relacionadas ao desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio quando exposta a um ambiente com diferentes concentrações de glicose e níveis elevados de insulina. Por fim, a padronização de um modelo tridimensional (3D) de cocultura de células de endométrio que permanecesse viável ao longo de 20 dias de cultivo. O potencial proliferativo foi determinado pelo método luminescente CellTitle Glo, e o potencial metastático pelo o ensaio transwell de migração e invasão. Análises de expressão do mRNA dos genes MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 e JAG1 foram realizadas a partir da técnica de PCR em tempo real. O índice de duplicação populacional cumulativo das células determinou o comportamento de replicação da linhagem de câncer de endométrio ao longo do período de tratamento de 20 dias. Em todas os ensaios as células foram cultivadas em meio contendo concentrações normais (5,5 mM) ou altas (17 mM) de glicose, e divididas nos diferentes grupos de tratamento: controle, insulina, metformina e metformina associado a insulina. A padronização do modelo 3D de cocultura de células de endométrio foi realizado utilizando células primárias e células de linhagem de câncer de endométrio, a Matrigel® foi a matriz extracelular temporária utilizada para a construção do modelo. Neste estudo, a concentração de 0,1 mM de metformina inibiu a ação da insulina, diminuindo a habilidade de migração e invasão das células de câncer de endométrio independente da concentração de glicose presente no meio. Entretanto, este efeito não foi observado sobre o potencial proliferativo, sendo observada uma redução da proliferação das células de câncer de endométrio ao serem utilizadas concentrações maiores de metformina. Em relação aos mecanismos moleculares intracelulares, foi observado que na presença de altas concentrações de glicose as células de câncer de endométrio adquirem um genótipo mais agressivo e apresentam resistência ao efeito da metformina na dose de 0,1 mM durante o tratamento agudo. Além disso, foi possível a padronização de um modelo 3D de cocultura de células de câncer de endométrio que permanecesse viável ao longo dos 20 dias de cultivo. Contudo, apesar das células de câncer de endométrio apresentarem resistência ao efeito da metformina na presença de altas concentrações de glicose, a dose de 0,1 mM foi capaz de inibir o efeito da insulina e diminuir o potencial metastático dessas células, sugerindo que a metformina ao atuar clinicamente em combinação com seus efeitos indiretos e diretos pode ser um potencial agente adjuvante na terapia contra o câncer. / Endometrial cancer is one of the most common gynecological malignancies worldwide and is classified into a type I, which is estrogen-dependent, and a type II estrogen-independent form. The type I is the most common, accounting to 75%-85% of all cases of endometrial cancer. Elevated estrogen levels have been shown to increase the risk of endometrial cancer development, as estrogen stimulates endometrial cell proliferation and inhibits apoptosis. The insulin resistance seems to play a central role in endometrial carcinogenesis, furthermore, diseases associate with insulin resistance, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS), and obesity, as well as type II diabetes mellitus (DM) are considered as significant risk factors for the development and progression of type I endometrial cancer. Additionally, PCOS patients may have an insulin resistance independent of obesity remaining in a normoglycemic status. At this case, the hypeinsulinemia seems to be the promoter factor not only for the development but also for the cancer progression. However, also increased blood glucose levels are contributing to the growth and carcinogenesis in endometrial cancer and are acting as a critical link between the observed increased cancer risk in patients with type II DM. Therefore, the treatment with insulin-sensitizing agents that act through reducing insulin levels, could offer a general approach to prevent the development of cancer and reduce metastasis The aim of this study was to evaluate the effect of 0.1 mM metformin dose on the proliferative and metastatic potential of endometrial cancer cells, as well as, analyze the effects of short and long-term treatment on intracellular signaling pathways related to endometrial cancer development and progression when exposed to an environment with different glucose concentrations and high insulin levels. Additionally, the endometrial three-dimensional (3D) coculture standardization to remain viable over 20 culture days. The proliferative potential was performed by using CellTitle Glo assay, and the metastatic potential was performed by using transwell migration and invasion assay. The mRNA expression of MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 and JAG1 genes were measured by real time PCR. The cumulative population doubling rate was evaluated to determine the replication behavior of an endometrial cancer cell line throughout 20 days of treatment period. In all assays the cells were cultured in medium containing normal (5.5 mM) or high (17 mM) glucose concentration, and treated in different groups: control, insulin,metformin or combined treatment The 3D coculture model was established by using endometrial primary cells and an endometrium cancer cell line, to the model construction Matrigel® was used as an extracellular matrix. In this study, the 0.1 mM metformin dose potently inhibited the insulin action, decreasing the ability of the endometrial cancer cell line to migrate and invade in a high and normal glucose environment. On the proliferative potential this effect was not observed, however, relative cell proliferation sensitivity to metformin was observed in the range between 1 and 5 mM regardless of the present glucose concentration. In the intracellular molecular mechanisms, it was observed that the high glucose concentration creates an optimal environment for endometrial cancer cells to exhibit a more aggressive genotype and resistance to metformin during a long-term treatment. Moreover, the endometrial 3D coculture model remained viable throughout 20 culture days. Therefore, despite of endometrial cancer cells show resistance to the metformin effect when exposed to high glucose environment, the 0.1 mM metformin dose was able to inhibit the insulin action and decrease the metastatic potential of the cells, suggesting that metformin is acting clinically in combination with indirectly and direct effects could emerge as a potential agent in cancer therapy.

Rápidas adaptações endometriais ocorrem com a chegada do embrião no útero para criar um ambiente uterino receptivo, que é essencial para o desenvolvimento do concepto. As descrições dos eventos endometriais que ocorrem antes da chegada do embrião ao útero, são escassas. O objetivo deste experimento foi demonstrar mudanças na arquitetura e na estrutura do endométrio que ocorrem no dia 5 pós-ovulação em éguas cíclicas e inseminadas. Amostras de biopsia endometrial foram recolhidas em torno do dia 5 pós-ovulação em um grupo de 10 éguas reprodutivamente sadias, uma de cada corno, durante dois ciclos. No primeiro como ‘Cíclicas’ (n = 10) e no seguinte estas mesmas foram inseminadas para formar o grupo ‘Inseminadas’ (n = 10). As éguas inseminadas foram subdivididas em dois subgrupos: aquelas em que as amostras foram recolhidas antes do dia 5.5 e aquelas em que as amostras o foram depois do dia 5.5. As biopsias endometriais foram analisadas por microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. A densidade, o diâmetro, o epitélio, o lúmen e a secreção glandular, foram submetidos à análise histomorfométrica. As células brancas foram avaliadas em uma contagem diferencial. As células ciliadas, poligonais com microvilosidades, e a presença de células planas ou ingurgitadas no epitélio, na microscopia eletrónica de varredura, foram analisados por uma contagem individual de cada um dos tipos celulares. Houve um aumento no diâmetro glandular, uma diminuição significativa nas células ciliadas e um aumento significativo na população de linfócitos nas éguas inseminadas, quando comparadas com as égua cíclicas. Na análise dos subgrupos de éguas inseminadas, não houve diferenças nas variáveis. Estes resultados levam a concluir que mudanças significativas ocorrem no endométrio no dia 5 pós ovulação, na égua inseminada. / Rapid endometrial adaptations occur as the embryo enters the uterus to create a receptive uterine environment, which is essential for the conceptus' development. Descriptions of endometrial events before the embryo reaches the uterus, are scant The aim of this experiment was to demonstrate architectural and structural changes in the endometrium on day 5 after ovulation in cyclic and inseminated mares. Endometrial biopsy samples were taken during day 5 post-ovulation from a group of 10 reproductively healthy mares, one from each uterine horn, during two cycles. The first one they were considered as ‘cyclic’ (n = 10), and in the following one, the same mares were inseminated to constitute the ‘inseminated’ group (n = 10). Inseminated mares were subdivided into two subgroups: those sampled before day 5.5 and those sampled after day 5.5. Biopsy samples were analyzed through optic microscopy and scanning electron microscopy. Glandular density, diameter, epithelial height, lumen, and secretion were analyzed through histomorphometry. White blood cells were evaluated through a differential cell count. Ciliated cells, micro-ciliated polygonal cells, and flat or protruded cells over the epithelium, on scanning electron microscopy, were analyzed through an individual cell type count. Inseminated mares presented an increase in glandular diameter, significant decrease in ciliated cell population, and a significant increase in lymphocyte population, compared to cyclic mares. No differences in any of the variables were detected between subgroups from inseminated mares. The results here presented lead to the conclusion that significant endometrial changes occur on day 5 post-ovulation in inseminated mares.