L’hypertension artérielle (HTA) est l’une des pathologies les plus fréquentes et les plus préoccupantes des pays occidentaux. Elle est souvent associée au surpoids, à des maladies rénales, cardiaques et aussi à un dysfonctionnement du système endocrinien. Les désordres vasculaires compliquant l’HTA induite par le traitement par l’érythropoïétine recombinante (r-HuEPO) chez les patients ayant une maladie rénale chronique ou en lien avec une perturbation du système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA), associent une augmentation de la rigidité artérielle, une dysfonction endothéliale, un déséquilibre endothéline-1/monoxyde d’azote (ET-1/NO) et un état inflammatoire. L'inflammation vasculaire contribue à la physiopathologie de l'HTA par l’augmentation du stress oxydatif et l'activation des cellules immunitaires. Plusieurs études ont suggéré que le système immunitaire est impliqué dans le développement des maladies cardiovasculaires. Cependant le rôle des lymphocytes T régulatrices (Treg) dans l'HTA ou d'autres formes de maladies cardio-vasculaires, reste encore largement inconnu. Bien que la majorité des études ont montré que l’HTA induite par l’r-HuEPO est associée à une dysfunction endothéliale et à un déséquilibre du rapport (ET-1/NO), les mécanismes exacts restent à être identifier.Plusieurs études ont montré que l’exercice physique d’endurance prévient l’HTA chez les patients ou les modèles animaux. L’objectif de la première partie du travail est d’étudier l’impact du shear stress et de l’exercice sur les désordres vasculaires et l’HTA induits par l’r-HuEPO, en présence d’un déséquilibre endothélial (ET-1/NO). Pour ce faire, trois environnements ont été utilisés (in vitro (cellules en culture), in vitro (artères mésentériques (AM)) et in vivo (souris transgéniques sur-exprimant l’ET-1 au niveau de l’endothélium). Nos résultats montrent que l'association L-NAME/r-HuEPO est responsable d'une vasoconstriction flux-dépendante et une augmentation accrue du shear stress correspondant (plus de 25 dyn/cm2). Le Bosentan, inhibiteur non sélectif des récepteurs de l’ET-1, empêche la vasoconstriction flux-dépendante engendrée par la combinaison L-NAME/rHu-EPO, sans pour autant corriger la vasodilatation; Le traitement des souris transgéniques eET-1 avec l’r-HuEPO augmente la pression artérielle systolique, la concentration plasmatique en ET-1, le stress oxydatif, l’infiltration des monocytes et des macrophages aortiques (MOMA-2), le taux des cytokines pro-inflammatoire INF-γ, TNF-α et IL-6 et exacerbe la dysfonction endothéliale. L’exercice physique prévient tous les effets délétères engendrés par l’administration de l’r-HuEPO. Il est à noter aussi que l’exercice augmente le taux du Foxp3 dans la rate et le cortex rénal. Quant à la deuxième partie, il s'agissait de tester l’effet du transfert adoptif des Treg sur l’HTA et les désordres vasculaires induits par l’administration d’angiotensine II ou d’aldostérone à des souris. Nos résultats montrent que le transfert adoptif des Treg prévient l’HTA induite par l’Ang II, l’altération de la vasodilatation endothélium-dépendante, prévient l’augmentation de la rigidité des AM, diminue le stress oxydatif et les taux plasmatiques des cytokines proinflammatoires (INF-γ, TNF-α et IL-6), ainsi que l’infiltration aortique et rénale des macrophages. Le transfert adoptif des Treg prévient partiellement l’augmentation de la pression artérielle systolique induite par l’Aldo, prévient l’altération de la vasodilatation endothelium dépendante et le remodelage hypertrophique des AM, diminue le stress oxydatif et l’infiltration des cellules immunitaires inflammatoires. Le transfert adoptif des cellules T effectrices (Teff) exacerbe la majorité des effets de l’Aldo. Nos résultats justifient, d’une part, l’importance de l’exercice comme outil préventif de l’HTA induite par l’r-HuEPO, et d’autre part, présentent les Treg comme élément essential dans la modulation de l’HTA et des désordres cardiovasculaires. / Hypertension (HTN) is one of the most frequent disease and is of greatest concern in Western countries.HTN is often associated with overweight, kidney, heart and endocrine system disease. Vasculardisorders, associated with HTN induced by erythropoietin (r-HuEPO) treatment in chronic kidneydisease or in case of disruption of the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS), associated increasein arterial stiffness, endothelial dysfunction, unbalanced endothelin-1/nitric oxide ratio (ET-1/NO) andinflammation. Vascular inflammation contributes to the pathophysiology of hypertension by increasingoxidative stress and activation of immune cells. Several studies have suggested that the immune systemis involved in the development of cardiovascular disease. However, the role of regulatory T cells (Treg)in HTN and other forms of cardiovascular diseases remains largely unknown. In addition, most of thestudies have shown that hypertension induced by r-HuEPO is related to endothelial dysfunction and theratio (ET-1/NO). The exact mechanisms remain to be identified. Several studies have shown thatphysical exercise prevents HTN in patients or animal models. The aim of the first part of this work is tostudy the impact of shear stress and exercise on HTN and vascular disorders induced by r-HuEPO, in thepresence of an endothelial imbalance (ET-1/NO). This was carried out in three settings: in vitro (culturecells), ex vivo (mesenteric arteries) and in vivo (transgenic mice overexpressing ET-1 in endothelialcells). Our results show that the association L-NAME/r-HuEPO is responsible for a significant decreasein intravascular diameter, in response to elevated intravascular flow resulting in a flow-dependentvasoconstriction and increased corresponding shear stress (more than 25 dyn/cm2). Bosentan (a nonselectiveantagonist of ET-1 receptors) inhibits flow-dependent vasoconstriction induced by thecombination L-NAME/rHu-EPO without correcting vasodilation. Treatment of ET-1 transgenic micewith r-HuEPO increases systolic blood pressure, ET-1 plasma concentration, oxidative stress, infiltrationof aortic monocytes and macrophages (MOMA-2), pro-inflammatory cytokines levels INF-γ, TNF-α andIL-6 and exacerbate endothelial dysfunction. Exercise prevents all the deleterious effects of r-HuEPO. Itis also noteworthy that exercise increases the number of Foxp3-positive cells in the spleen and renalcortex. Then, the second aim of our study was to test the effect of adoptive transfer of Treg cells on HTNand vascular disorders induced in mice treated with angiotensin II (Ang II) or aldosterone (Aldo). Ourresults show that adoptive transfer of Treg prevents Ang II induced hypertension, endothelialdysfunction, prevents stiffness of mesenteric arteries, decreases oxidative stress and plasma levels ofpro-inflammatory cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-6) and the aortic and renal infiltration ofmacrophages. Adoptive transfer of Treg prevents the increase in systolic blood pressure induced byAldo, prevents impaired endothelium-dependent vasodilatation and hypertrophic remodelling ofmesenteric arteries, decreases oxidative stress and infiltration of inflammatory immune cells. Theadoptive transfer of T effectors cells (Teff) exacerbates the majority of the Aldo effects. Our resultsjustify, on one hand, the importance of exercise as a preventive tool for hypertension induced by r-HuEPO, and on the other hand, highlight the role of Treg as an essential component in the modulation ofhypertension and cardiovascular disorders.

Rationnel : L’artérite à cellules géantes (ACG) est une vascularite primitive des gros vaisseaux dont le diagnostic repose sur la mise en évidence d’un infiltrat inflammatoire et de cellules géantes à la biopsie d’artère temporale (BAT). On note également un remodelage de la paroi vasculaire lié à une prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) pouvant aboutir à une occlusion artérielle. Objectif : Caractériser les auto-anticorps dirigés contre les cellules endothéliales (CE) et les CMLV au cours de l’ACG et préciser le rôle des CMLV dans le remodelage pariétal. Méthodes : La recherche d’auto-anticorps a reposé sur un immunoblot 2D couplé à la spectrométrie de masse. Les protéomes des CMLV d’artère ombilicale, d’artère pulmonaire et d’aorte humaines normales a été comparés par protéomique différentielle (2D-DIGE). Nous avons utilisé la 2D-DIGE et des puces d’expression pan-génomiques pour comparer les CMLV issues de BAT de patients suspects d’ACG (avec un diagnostic final d’ACG ou non), afin d’identifier les mécanismes contribuant à la prolifération des CMLV. Résultats : Chez 15 patients atteints d’ACG, nous avons notamment identifié la lamine, la vinculine et l’annexine A5 comme cible des auto-anticorps anti-CMLV. Les antigènes cibles identifiés sont liés à Grb2, une protéine adaptatrice impliquée dans la prolifération des CMLV. Nous avons mis en évidence des protéomes différents au sein des CMLV humaines normales selon leur origine vasculaire et avons principalement identifié des protéines du cytosquelette et du métabolisme énergétique.A partir des CMLV isolées des BAT et à l’aide d’Ingenuity®, nous avons identifié l’endothéline 1 (ET-1) et la paxilline comme des molécules impliquées dans le remodelage vasculaire. En immunohistochimie et par qPCR, nous avons confirmé l’expression de l’ET-1 et de ses récepteurs ETAR et ETBR au sein des artères temporales de patients atteints d’ACG. Enfin, nous avons inhibé la prolifération des CMLV avec du macitentan, un inhibiteur d’ETAR et en particulier avec son métabolite actif, mais pas avec d’autres inhibiteurs des récepteurs de l’ET-1. Conclusion : Nous avons identifié chez les patients atteints d’ACG des anticorps anti-CMLV dont le rôle pathogéne potentiel reste à définir. Les différences protéiques observées à partir des CMLV humaines normales pourraient correspondre à des phénotypes différents. A partir d’un matériel biologique unique, nous avons pu montrer que la prolifération excessive des CMLV au cours de l’ACG pouvait être inhibée par le macitentan ce qui permet d’envisager un usage thérapeutique de cette molécule. / Background : Giant cell arteritis (GCA) is a large vessel vasculitis and its diagnosis usually relies on the identification of an inflammatory infiltrate made of mononuclear cells and giant cells upon temporal artery biopsy. There is also a remodeling process in the arterial wall due to an excessive proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) which can sometimes lead to arterial occlusion. Purpose: Identify auto-antibodies targeting either endothelial cells (EC) and/or VSMC during GCA and better understand the role of VSMC in the remodeling process. Methods : Auto-antibodies were detected by a 2-dimensionnal immunoblot and their target antigens were identified by mass spectrometry. Proteoms of umbilical artery, pulmonary artery and aorta VSMC were compared by 2 dimension differential in gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to identify mechanisms involved in VSMC proliferation in GCA, we used both 2D-DIGE and pan genomic chips in order to compare VSMC isolated at the time of temporal artery biopsy (TAB) from patients with a final diagnosis of GCA or another diagnosis. Results : In 15 patients with GCA, we identified lamin, vinculin and Annexin A5 as target antigens of anti-VSMC antibodies. Target antigens were linked with Grb2, an adaptator protein involved in VSMC proliferation. Normal VSMC originating from different vascular beds have differ in protein contents with differential expression of cytoskeleton and energy metabolism proteins. We compared VSMC from TAB with Ingenuity software and identified endothelin-1 (ET-1) and paxillin as proteins involved in vessel remodeling. We confirmed by immunohistichemistry and qPCR that ET-1 and its receptor ETAR and ETBR were expressed in temporal arteries from patients with GCA. Last, we reduced VSMC proliferation with Macitentan, an ETAR and ETBR antagonist and significantly inhibited VSMC proliferation with its active metabolite whereas other ET-1 inhibitors had no effect. Conclusion : We identified anti-VSMC auto-antibodies in patients with GCA. Their pathogenic role remains to be determined. Normal VSMC from different vascular locations differ in protein conten which might reflect different phenotypes and different properties. The escessive proliferation of VSMC from patients with GCA was inhibited by Macitentan. This drug might constitute a future therapeutic option.

Les facteurs endothéliaux sont des hormones locales synthétisées et sécrétées par l'endothélium, qui interagissent dans un équilibre dynamique pour assurer le maintien de plusieurs phénomènes biologiques comme la régulation du tonus vasculaire et de la pression artérielle, de la structure de la paroi des vaisseaux et de la fonction d'organes vitaux tels que les reins. Cependant, dans certaines pathologies associées à une dysfonction endothéliale, cet équilibre serait bouleversé. En insuffisance rénale chronique, l'angiotensine II (Angll) et l'endothéline-1 (ET-1), des facteurs vasoconstricteurs, sont produits exagérément alors que le monoxyde d'azote (NO), le principal agent vasodilatateur, est déficient. Le rôle et les interactions des différents agents endothéliaux impliqués dans la pathogenèse de l'urémie et de ses complications sont encore mal définis. Dans un modèle d'insuffisance rénale chronique chez le rat, nous avons démontré une diminution de la densité des récepteurs ETB, comparativement aux récepteurs vasoconstricteurs ETA qui étaient inchangés. Cette diminution contribuerait à l'accumulation tissulaire d'ET-1 via une diminution de sa clairance locale, en plus de réduire l'effet vasodilatateur compensateur des récepteurs ETB, médié par la relâche du NO. Ces altérations favoriseraient ainsi l'hypertension et la progression des dommages rénaux. Nous avons aussi démontré que l'expression de l'ET-1 était augmentée de manière parallèle au TGF-pi dans les vaisseaux et les reins des rats urémiques. Le TGF-pi est un facteur de croissance associé à la fibrose et l'hypertrophie tissulaire dans plusieurs maladies cardiovasculaires et inflammatoires. Le traitement avec le losartan, un antagoniste du récepteur ATi, a significativement atténué l'hypertension artérielle et la protéinurie, en plus de réduire l'expression tissulaire de l'ET-l et du TGF-[31, suggérant l'implication de l'AnglI dans la régulation de ces deux facteurs. Nous avons ensuite comparé les effets du losartan au traitement avec le BMS-182874, un antagoniste spécifique aux récepteurs ETA, ainsi qu'avec la L-Arginine, le précurseur du NO. Le BMS-182874 et la L-Arginine ont diminué l'élévation de la pression artérielle, contrairement au losartan qui l'a complètement normalisé. Contrairement au losartan et à la L-Arginine qui ont atténué l'expression tissulaire de l'ET-l et du TGF-pi, le BMS-182874 n'a démontré aucun effet. Ainsi, l'ET-1 contribuerait à l'hypertension artérielle mais ne serait pas impliquée de façon majeure dans l'induction du TGF-pi en urémie. Par contre, l'AnglI serait un déterminant de l'induction de ces deux facteurs. Le NO serait également un agent clé dans la dysfonction endothéliale associée à l'urémie, en exerçant des effets pouvant moduler l'expression de l'ET-l et du TGF-Bl.

L’hypertension artérielle secondaire à la progression de l’insuffisance rénale chronique (IRC) est généralement associée à une dysfonction de l’endothélium vasculaire, caractérisée par une production exagérée de vasoconstricteurs tels l’endothéline-1 (ET-1) et l’angiotensine II (Ang II) et une réduction de la relâche de vasodilatateurs dont le monoxyde d’azote (NO). Cette dysfonction endothéliale peut entraîner la surproduction du transforming growth factor-Beta 1 (TGF-β1), une cytokine aux propriétés pro-fibrosantes et hypertrophiques. Nos travaux ont pour but d’élucider les interactions entre les facteurs dérivés de l’endothélium en IRC. Dans un premier temps, nous avons étudié l’implication de l’ET-1 chez le rat urémique avec masse rénale réduite, en utilisant un antagoniste des récepteurs ETA de l’ET-1, l’ABT-627. Une semaine après l’induction de l’insuffisance rénale par néphrectomie subtotale 5/6, des rats urémiques recevant l’ABT-627 sont comparés avec un groupe de rats urémiques ne recevant aucun traitement et des témoins, sur une période de 6 semaines. À la fin de l’étude, la pression artérielle systolique des animaux urémiques est augmentée comparativement à celle des animaux témoins. Les animaux urémiques présentent une augmentation de la créatinine sérique, de la protéinurie, de l’excrétion urinaire d’ET-1 et du TGF-β1 ainsi que de l’expression de l’ARNm du TGF-β1 dans le cortex rénal. De plus, ils montrent une augmentation de l’expression d’ET-1 et du TGF-β1 dans l’endothélium vasculaire de l’aorte thoracique. Par ailleurs, l’expression de l’ARNm du récepteur ETB de l’endothéline est réduite dans le cortex rénal des animaux urémiques. Les dommages histologiques rénaux comprennent de la glomérulosclérose, de la nécrose tubulaire et de la fibrose interstitielle associée à une production accrue d’alpha-actine de muscle lisse (α-SMA). Le traitement des animaux urémiques avec l’ABT-627 atténue l’élévation de la pression artérielle et les dommages histologiques rénaux, sans toutefois prévenir la détérioration progressive de la fonction rénale. Par ailleurs, l’ABT-627 ne contre pas la surproduction vasculaire et rénale d’ET-1 et du TGF-β1 ainsi que la réduction de l’expression rénale du récepteur ETB chez l’animal urémique. Ces résultats montrent que l’ET-1 est impliquée, du moins en partie, dans la pathogenèse de l’hypertension et des dommages rénaux chez le rat urémique. Cependant, le blocage des récepteurs ETA ne confère pas la protection cardiovasculaire et rénale escomptée, suggérant l’implication d’autres facteurs tels le TGF-β1 et l’Ang II dans ce modèle animal d’insuffisance rénale. Dans une seconde étude, nous avons évalué l’implication du TGF-β1 dans la pathogenèse de l’hypertension artérielle associée à l’insuffisance rénale, en utilisant le même modèle animal que précédemment. Pour ce faire, nous avons comparé les effets de la neutralisation du TGF-β1 avec l’anticorps 1D11 avec un antagoniste des récepteurs AT1 de l’Ang II chez l’animal urémique. Après 6 semaines de traitement, la pression artérielle systolique des animaux urémiques est augmentée comparativement à celle des animaux témoins. Les animaux urémiques présentent une augmentation significative de la créatinine sérique, de la protéinurie, de l’expression endothéliale d’ET-1 dans l’aorte thoracique et du TGF-β1 dans le cortex rénal, ainsi qu’une diminution de la créatinine urinaire et de la clairance de la créatinine. Ils montrent aussi des signes évidents d’hypertrophie cardiaque. Le traitement des animaux urémiques avec l’anticorps 1D11 diminue de façon significative la pression artérielle systolique, sans toutefois prévenir la détérioration de la fonction rénale et l’hypertrophie cardiaque, ni contrer la surexpression vasculaire d’ET-1 et rénale du TGF-β1. Par contre, le traitement des animaux urémiques avec le losartan normalise la pression artérielle systolique et la protéinurie, prévient l’hypertrophie cardiaque et limite la surexpression vasculaire et rénale d’ET-1 et du TGF-β1. Ainsi, la neutralisation du TGF-β1 atténue l’élévation de la pression artérielle systolique chez l’animal urémique, sans toutefois prévenir la détérioration de la fonction rénale ni la surexpression vasculaire et rénale d’ET-1 et du TGF-β1. À la lumière des résultats obtenus, il semble que le développement de l’hypertension artérielle associée à l’insuffisance rénale dans notre modèle expérimental soit attribuable plus particulièrement à l’action de l’Ang II. Les effets de l’Ang II seraient médiés en partie par l’ET-1 et le TGF-β1, qui agissent possiblement de façon indépendante. / Hypertension in chronic renal failure (CRF) is associated with endothelial dysfunction, which is characterized by exaggerated production of vasoconstrictors such as endothelin-1 (ET-1) and angiotensin II (Ang II) and a reduction in vasodilators such as nitric oxide (NO). Endothelial dysfunction could lead to TGF-β1 overproduction, a cytokine with pro-fibrotic and hypertrophic properties. Our studies aimed at elucidating the interactions between the endothelium-derived factors in CRF. In a first study, we investigated the role of ET-1 in the rat remnant kidney model of CRF, using the ETA receptor antagonist ABT-627. One week after renal mass reduction, uremic rats receiving ABT-627 were compared with untreated uremic rats and sham-operated rats, during 6 weeks. At the end of the study, systolic blood pressure was elevated in uremic rats as compared to sham-operated animals. Uremic animals showed increased serum creatinine, proteinuria, ET-1 and TGF-β1 urinary excretion and renal TGF-β1 mRNA expression. In addition, ET-1 and TGF-β1 expression was increased in the vascular endothelium of thoracic aorta of uremic animals. However, ETB mRNA expression was reduced in the renal cortex of uremic animals. The renal histological damages were comprised of glomerulosclerosis, tubular necrosis and interstitial fibrosis, which was associated with increased alpha-smooth muscle actin (α-SMA) expression. Treatment with ABT-627 attenuated the rise in systolic blood pressure and the renal damages, but did not prevent the progressive decline in renal function, the ET-1 and TGF-β1 overproduction nor the reduction in ETB receptor expression. Our results show that ET-1 is involved, at least in part, in the pathogenesis of hypertension and the renal injuries in uremic rats. However, ETA receptor blockade does not confer the anticipated cardiovascular and renal protection, suggesting the implication of other factors such as TGF-β1 and Ang II in this animal model of CRF. In a second study, we evaluated the involvement of TGF-β1 in the pathogenesis of hypertension associated with renal insufficiency, in the same animal model. We compared the effects of the TGF-β1 neutralizing antibody 1D11 and the Ang II AT1 receptor antagonist losartan. At the end of the study, systolic blood pressure was increased in uremic animals as compared to the controls. Uremic animals presented a significant increase in serum creatinin, proteinuria, expression of ET-1 in the vascular endothelium of thoracic aorta and renal cortex production of TGF-β1, as well as a reduction in creatinine clearance. They also showed obvious signs of cardiac hypertrophy. Treatment with the 1D11 antibody reduced the rise in systolic blood pressure without preventing the decline in renal function and cardiac hypertrophy nor the vascular ET-1 and renal TGF-β1 overexpression. In contrast, treatment with losartan normalized systolic blood pressure and proteinuria, prevented the cardiac hypertrophy and attenuated the vascular and renal ET-1 and TGF-β1 overexpression. Therefore, neutralization of TGF-β1 attenuates the rise in systolic blood pressure in uremic animal, without preventing the deterioration of renal function or the vascular and renal overexpression of ET-1 and TGF-β1. Based on these studies, the development of hypertension associated with the renal insufficiency in this experimental model is likely attributed to Ang II. The effects of Ang II may be mediated by ET-1 and TGF-β1, which appears to act in an independent manner.

Au cours des maladies cardiovasculaires (MCV), il peut se produire divers problèmes de santé, telle que l’insuffisance cardiaque ou encore l’HTA. Ces phénomènes se caractérisent, entre autres, par une augmentation de synthèse d’endotheline-1 (ET-1), un neuropeptide synthétisé par les cellules endothéliales ayant un effet vasoconstricteur sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Ainsi, la surexpression de ce vasopeptide, mène à terme, au maintien de l’HTA aggravée des sujets, précédée ou concomitante à l’athérosclérose ou à la resténose, cliniquement illustrées par une prolifération et une migration anormale des CMLV de la media vers l’intima des vaisseaux sanguins. Parallèlement, il a été observé que la protéine sirtuine-1 (Sirt-1), membre de la famille des protéines histones déacétylases (HDAC), présente des propriétés anti-athérosclérotiques par sa capacité d’atténuer la prolifération et la migration des CMLV. Des travaux récents ont aussi montré qu’au cours de l’HTA la protéine Sirt-1 est faiblement exprimée dans les CMLV. Son implication dans le développement des pathologies vasculaires semble apparente, mais des études demeurent nécessaires pour décrire son rôle exact dans la pathogenèse des MCV. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’observer la variation d’expression de Sirt-1 dans les CMLV, isolées de l’aorte ascendante de rat, en réponse à l’ET-1. On a remarqué qu’une heure de stimulation des CMLV avec l’ET-1 induit une diminution de l’expression de Sirt-1 via l’activation des récepteurs ETA. Ces résultats suggèrent que la capacité d’ET-1 à atténuer l’expression de Sirt-1 serait un éventuel mécanisme d’action avec des effets favorisant les MCV. / Cardiovascular diseases (CVD) are associated with several vascular dysfunctions such as heart failure and hypertension. These phenomena cause increased synthesis of endothelin-1 (ET-1), a neuropeptide, synthesized by endothelial cells which has vasoconstrictor action on vascular smooth muscle cells (VSMC). Overexpression of this vasopeptide leads eventually to hypertension (HTA). This usually happen after atherosclerosis or restenosis, leading to proliferation and migration of VSMC from media to intima. It was shown that during atherosclerosis, the protein sirtuin-1 (Sirt-1), a member of protein histone deacetylases (HDAC), has an anti-atherosclerotic effect due to its ability to diminish proliferation and migration of VSMC. It has also been observed that during hypertension, Sirt-1 was poorly expressed in VSMC. Its role in vascular pathophysiology remains sparsely studied, therefore it’s essential to explore it. In the present study we investigated the expression of Sirt-1 in VSMC isolated from the ascending aorta of rats, in response to ET-1 stimulation. We observed that Sirt-1 expression decreases after 1 hour of stimulation by ET-1 via ETA receptors. In summary, these results suggest that the ability of ET-1 to attenuate Sirt-1 expression in VSMC, may be a potential mechanism for promoting CVD.

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie. / Endothelin-1 has emerged as an extremely potent vasoactive peptide exhibiting potent mitogenic activity in vascular smooth muscle cells (VSMCs). A critical role of ET-1 in many cardiovascular diseases, such as atherosclerosis, hypertension, restenosis after angioplasty, heart failure and arrhythmia has been suggested. ET-1 exerts its effects through multiple signaling pathways which include Ca2+, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) including extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB)/Akt pathways. Several studies have also demonstrated that reactive oxygen species (ROS) may play an important role in mediating the signals of several growth factors and peptides hormones linked to these pathways. We have previously reported that ET-1 generates ROS which mediates ET-1-induced signaling. H2O2, an important ROS molecule, activates both MAPKs and PKB signaling in VSMCs. In addition, we have also suggested that Ca2+ and CaM are essential to trigger H2O2-induced ERK1/2, p38 and PKB phosphorylation in A-10 VSMCs. Ca2+/calmodulin (CaM)-dependent protein kinase II (CaMKII) is a multifunctional serine/threonine protein kinase which is believed to transduce the downstream effects of Ca2+/CaM, and has been shown to be involved in H2O2-induced signaling in endothelial cells. However, a role of CaMKII in mediating ET-1 and H2O2-induced ERK1/2, PKB, Pyk2 phosphorylation, as well as its effect on hypertrophic and proliferative responses of ET-1 in VSMCs remains unexplored. Interestingly, a role of CaMKII in several cardiovascular diseases has been reported and studies showing that pharmacological inhibition of CaMKII, by using KN-93, prevent arrhythmic activity improved vascular dysfunction in diabetes or in Ang II-induced hypertension. Nitric oxide (NO) is also an important reactive species and vasoactive molecule involved in the regulation of several hormone-mediated responses. NO has been suggested to modify growth-promoting signaling events and thus may serve as a vascular protective agent. Studies have shown that NO can attenuate EGF and Ang II-induced Ras/Raf/ERK1/2 as well as increase in PKB phosphorylation signaling pathways. There is also evidence for a potential cross-talk between ET-1 and NO, however not much information on the ability of NO to modify ET-1-induced signaling in VSMCs is available. Therefore, the work presented in this thesis has investigated the role of CaMKII system in ET-1 and H2O2-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation, as well as in cell growth and proliferation evoked by ET-1 in VSMCs. We also investigated the role of NO in ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation as well as protein synthesis. In the first part of our studies, by using three different approaches, i.e. use of pharmacological inhibitors, a CaMKII AIP (autoinhibitor peptide) and siRNA techniques, we have investigated the involvement of CaMKII in ET-1-induced ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. We have demonstrated that CaMKII mediates the effect of ET-1 on ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. By using pharmacological inhibitor alone such as, KN-93, earlier studies have reported that AngII and Ca2+ elevating agents, such as ionomycin, exert their effects on ERK1/2 phosphorylation via CaM-dependent pathways in VSMC. However, by using multiple approaches, our studies, have provided the first evidence to suggest an involvement of CaMKII in mediating the effect of ET-1 on ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. We have also reported for the first time, a crucial role of CaMKII in vascular pathophysiology related to ET-1 by regulating the growth and hypertrophic events by using the technique of [3H]leucine and [3H]thymidine incorporation. In the second part, in view of earlier studies showing that ROS mediates ET-1-induced signaling events in VSMC, we have also investigated if CaMKII is also implicated in H2O2-induced activation of ERK1/2 and PKB pathways. By using both pharmacological and molecular approaches, we show that similar to ET-1, CaMKII serves as a critical upstream component in triggering H2O2-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation in VSMC. Furthermore, since we have previously reported that IGF-1R transactivation is needed for H2O2-induced PKB activation, we have investigated the effect of CaMKII inhibition and knocking-down on IGF-1R phosphorylation evoked by H2O2. Taken together, these results demonstrate that CaMKII plays a critical upstream role in mediating the effect of H2O2 on ERK1/2, PKB and IGF-1R phosphorylation. In the third part of our studies, we have investigated the molecular mechanism by which NO exerts its anti-mitogenic and anti-hypertrophic effect on ET-1-induced signaling. By testing the effect of two different NO donors (SNAP and SNP) and L-NAME, an inhibitor of NO synthase, in ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation, we observed that NO has an inhibitory effect in ET-1-induced signaling in VSMC. In addition, 8-Br-cGMP, an analogue of cGMP, exerted similar effect to that of NO donors whereas, oxadiazole quinoxalin (ODQ), an inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC), reversed the inhibitory effect of NO. We conclude that NO, in a cGMP-dependent manner, attenuated ET-1-induced phosphorylation of ERK1/2, PKB and Pyk2 and also antagonized the hypertrophic effects of ET-1, since SNAP treatment decreased the protein synthesis induced by ET-1. In summary, the studies presented in this thesis demonstrate that both ET-1 and H2O2 induce ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation in VSMC and CaMKII activation is required for these events. We have also shown that CaMKII phosphorylation is upstream of H2O2-induced IGF-1R transactivation in VSMC. We have also provided evidence that NO attenuates ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation. Finally, we have established that CaMKII activation stimulates ET-1-evoked protein and DNA synthesis, yet NO attenuates protein synthesis induced by ET-1. Keywords : Endothelin; Hydrogen peroxide; CaMKII; Nitric oxide; Vascular; Protein Kinase B; Extracellular Signal-Regulated Kinase1/2; IGF-1R; Growth.

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie. / Endothelin-1 has emerged as an extremely potent vasoactive peptide exhibiting potent mitogenic activity in vascular smooth muscle cells (VSMCs). A critical role of ET-1 in many cardiovascular diseases, such as atherosclerosis, hypertension, restenosis after angioplasty, heart failure and arrhythmia has been suggested. ET-1 exerts its effects through multiple signaling pathways which include Ca2+, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) including extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB)/Akt pathways. Several studies have also demonstrated that reactive oxygen species (ROS) may play an important role in mediating the signals of several growth factors and peptides hormones linked to these pathways. We have previously reported that ET-1 generates ROS which mediates ET-1-induced signaling. H2O2, an important ROS molecule, activates both MAPKs and PKB signaling in VSMCs. In addition, we have also suggested that Ca2+ and CaM are essential to trigger H2O2-induced ERK1/2, p38 and PKB phosphorylation in A-10 VSMCs. Ca2+/calmodulin (CaM)-dependent protein kinase II (CaMKII) is a multifunctional serine/threonine protein kinase which is believed to transduce the downstream effects of Ca2+/CaM, and has been shown to be involved in H2O2-induced signaling in endothelial cells. However, a role of CaMKII in mediating ET-1 and H2O2-induced ERK1/2, PKB, Pyk2 phosphorylation, as well as its effect on hypertrophic and proliferative responses of ET-1 in VSMCs remains unexplored. Interestingly, a role of CaMKII in several cardiovascular diseases has been reported and studies showing that pharmacological inhibition of CaMKII, by using KN-93, prevent arrhythmic activity improved vascular dysfunction in diabetes or in Ang II-induced hypertension. Nitric oxide (NO) is also an important reactive species and vasoactive molecule involved in the regulation of several hormone-mediated responses. NO has been suggested to modify growth-promoting signaling events and thus may serve as a vascular protective agent. Studies have shown that NO can attenuate EGF and Ang II-induced Ras/Raf/ERK1/2 as well as increase in PKB phosphorylation signaling pathways. There is also evidence for a potential cross-talk between ET-1 and NO, however not much information on the ability of NO to modify ET-1-induced signaling in VSMCs is available. Therefore, the work presented in this thesis has investigated the role of CaMKII system in ET-1 and H2O2-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation, as well as in cell growth and proliferation evoked by ET-1 in VSMCs. We also investigated the role of NO in ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation as well as protein synthesis. In the first part of our studies, by using three different approaches, i.e. use of pharmacological inhibitors, a CaMKII AIP (autoinhibitor peptide) and siRNA techniques, we have investigated the involvement of CaMKII in ET-1-induced ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. We have demonstrated that CaMKII mediates the effect of ET-1 on ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. By using pharmacological inhibitor alone such as, KN-93, earlier studies have reported that AngII and Ca2+ elevating agents, such as ionomycin, exert their effects on ERK1/2 phosphorylation via CaM-dependent pathways in VSMC. However, by using multiple approaches, our studies, have provided the first evidence to suggest an involvement of CaMKII in mediating the effect of ET-1 on ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. We have also reported for the first time, a crucial role of CaMKII in vascular pathophysiology related to ET-1 by regulating the growth and hypertrophic events by using the technique of [3H]leucine and [3H]thymidine incorporation. In the second part, in view of earlier studies showing that ROS mediates ET-1-induced signaling events in VSMC, we have also investigated if CaMKII is also implicated in H2O2-induced activation of ERK1/2 and PKB pathways. By using both pharmacological and molecular approaches, we show that similar to ET-1, CaMKII serves as a critical upstream component in triggering H2O2-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation in VSMC. Furthermore, since we have previously reported that IGF-1R transactivation is needed for H2O2-induced PKB activation, we have investigated the effect of CaMKII inhibition and knocking-down on IGF-1R phosphorylation evoked by H2O2. Taken together, these results demonstrate that CaMKII plays a critical upstream role in mediating the effect of H2O2 on ERK1/2, PKB and IGF-1R phosphorylation. In the third part of our studies, we have investigated the molecular mechanism by which NO exerts its anti-mitogenic and anti-hypertrophic effect on ET-1-induced signaling. By testing the effect of two different NO donors (SNAP and SNP) and L-NAME, an inhibitor of NO synthase, in ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation, we observed that NO has an inhibitory effect in ET-1-induced signaling in VSMC. In addition, 8-Br-cGMP, an analogue of cGMP, exerted similar effect to that of NO donors whereas, oxadiazole quinoxalin (ODQ), an inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC), reversed the inhibitory effect of NO. We conclude that NO, in a cGMP-dependent manner, attenuated ET-1-induced phosphorylation of ERK1/2, PKB and Pyk2 and also antagonized the hypertrophic effects of ET-1, since SNAP treatment decreased the protein synthesis induced by ET-1. In summary, the studies presented in this thesis demonstrate that both ET-1 and H2O2 induce ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation in VSMC and CaMKII activation is required for these events. We have also shown that CaMKII phosphorylation is upstream of H2O2-induced IGF-1R transactivation in VSMC. We have also provided evidence that NO attenuates ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation. Finally, we have established that CaMKII activation stimulates ET-1-evoked protein and DNA synthesis, yet NO attenuates protein synthesis induced by ET-1. Keywords : Endothelin; Hydrogen peroxide; CaMKII; Nitric oxide; Vascular; Protein Kinase B; Extracellular Signal-Regulated Kinase1/2; IGF-1R; Growth.

Les récepteurs de type B de l'endothéline (ETB) sont présents sur l'enveloppe nucléaire des cardiomyocytes ventriculaires adultes (MVCAs). Il a été démontré que dans les MVCAs et les cellules endothéliales de rat, l’endocytose de l’endothéline marqué à la rhodamine colocalise avec le Lysotracker, un marqueur des lysosomes, mais n'est pas observée sur l’enveloppe nucléaire. Dans cette étude, nous avons caractérisé la localisation subcellulaire et la régulation de la biosynthèse de l’endothéline 1 dans les MVCAs et les fibroblastes cardiaques adultes de rat. Dans les deux types cellulaires les expériences d’immunocytofluorescence ont révélé une immunoréactivité de l’endothéline 1 correspondant à tous les stades de maturation du peptide, et détectable sur ou à proximité de la membrane nucléaire. L'enzyme de conversion d'endothéline 1(ECE1) est une métalloprotéase qui convertit la ̏ big˝ endothéline 1 en un peptide de 21 acides aminés biologiquement actif. L’immunoréactivité de l’ECE1 a été associée avec les tubules-T et les membranes nucléaires ou périnucléaires dans les MVCAs. Par contre, nous avons observé une immunoréactivité de l’ECE1 à la fois dans le noyau et le cytoplasme, mais pas sur la membrane plasmatique, dans les fibroblastes cardiaques à passage 3. L'ARNm de l’ET-1 a été détecté dans les deux types cellulaires. La régulation de la production de l'endothéline est principalement transcriptionnelle. L’application du facteur de croissance transformant ß1 (TGFß1) a augmenté l’ARNm de l’ET-1 dans les MVCAs et l'angiotensine II a stimulé l'augmentation de l’ARNm de l'ET-1 dans les fibroblastes. Dans les MVCAs, l'augmentation de l'ARNm ET-1 a été associée à une élévation du peptide intracellulaire ET-1 et du calcium nucléaire. Ces données suggèrent que l'endothéline endogène est disponible et serait capable d’activer le récepteur ETB nucléaire dans les MVCAs en réponse à des stimuli extracellulaires. / Type B endothelin receptors (ETB) are located in the nuclear envelope of adult ventricular cardiomyocytes (ACVMs). In both ACVMs and endothelial cells, endocytosed rhodamine endothelin colocalized with Lysotracker but was not observed at the nuclear membrane. In this study we have characterized the regulation and subcellular localization of endothelin biosynthesis in ACVMs and adult cardiac fibroblasts. In both cell types immunocytofluorescence experiments revealed endothelin-1 immunoreactivity, comprising all stages of peptide maturation, either on or near the nuclear membrane. Endothelin converting enzyme 1 (ECE1) is a metalloprotease that converts big endothelin to the biologically active 21-amino acid peptide. ECE1 immunoreactivity was associated with the T-tubules and nuclear or perinuclear membranes in ACVMs. In contrast, ECE1 immunoreactivity was observed both in the nucleus and the cytosol, but not at the plasma membrane, in passage 3 cardiac fibroblasts. Endothelin-1 mRNA was detected in both cell types. Regulation of endothelin production is primarily at the level of transcription. Application of TGFβ1 increased ET-1 mRNA in ACVMs whereas angiotensin II was effective in increasing ET-1 mRNA in fibroblasts. In AVCMs, the increase in ET-1 mRNA was associated with an increase of intracellular ET-1 peptide and nuclear calcium. These data suggest that endogenous endothelin is available and may activate nuclear ETB in ACVMs in response to extracellular stimuli.

Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension. / Oxidative stress is involved in the overexpression of kinin B1 receptor (B1R) in various models of diabetes and hypertension. Since angiotensin II (Ang II) and endothelin-1 (ET-1) are pro-oxidative peptides involved in cardiovascular diseases, their contribution in increasing the expression of B1R was examined in vascular smooth muscle cells (VSMC). QRT-PCR and Western blot analysis were used to measure the expression of B1R in VSMC derived from A10 cell line and the aorta of Sprague-Dawley rats. This study shows that Ang II increases the expression of B1R (mRNA and protein) in a concentration- and time-dependent manner (maximum 1 μM between 3-6 h). This increase involves AT1 receptor, PI3K and NF-κB, but not AT2 receptor and ERK1/2. Moreover, ETA receptor is involved in the effect of Ang II at 6-8 h but not at 1-4 h. However, ET-1 increases expression of B1R (maximum 2-4 h) via stimulation of ETA and ETB receptors. Ang II and ET-1-induced increase expression of B1R is blocked by antioxidants (N-acetyl-L-cysteine and diphenyleneiodonium). These results suggest that Ang II induces B1R in VSMC by AT1 receptor in the first phase and by releasing ET-1 (predominantly by ETA receptor) in the late phase, via oxidative stress and activation of PI3K and NF-κB. These results clarify the mechanism involved in the overexpression of B1R which has adverse effects in diabetes and hypertension.

L’échec thérapeutique des maladies cérébrales est lié, entre autres, à la présence de barrières entre le sang et le Système Nerveux Central (SNC), en particulier la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). La BHE est une structure neuro-vasculaire localisée au niveau des MicroVaisseaux Cérébraux (MVC) limitant l’entrée des molécules thérapeutiques dans le cerveau. Ce rôle barrière est dû à plusieurs facteurs, dont principalement, l’existence du côté luminal et/ou abluminal de la BHE de plusieurs transporteurs d’efflux, dont les transporteurs de type ABC (ATP Binding Casette) et SLC (SoLute Carrier) et qui sont à l’origine des phénomènes de résistance aux médicaments. Les études de recherche actuelles visent à identifier les voies de signalisation régulant l’activité de ces protéines d’efflux afin d’optimiser la pharmacothérapie cérébrale. Mais la majorité de ces études sont effectuées chez l’adulte. Très peu de données existent chez l’enfant.Cette étude a été réalisé dans la perspective de 1) Etudier l’ontogenèse des transporteurs ABC et SLC de la BHE au cours de la maturation cérébrale, 2) Elucider le rôle fonctionnel de quatre transporteurs d’efflux ((P-glycoproteine (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) dans le cerveau des enfants et 3) Elucider les mécanismes qui régulent leur expression fonctionnelle dans des conditions normales et pathologiques, notamment inflammatoires, parce que des modifications dans les composantes structurales et fonctionnelles de l'unité neurovasculaire ont été rapportées dans une longue liste de pathologies du SNC chez les enfants et les adultes. Nos résultats ont montré l’existence de différences fonctionnelles, en terme de passage de molécules, entre la BHE pédiatrique et celle adulte. De plus, cette étude a mis en évidence une régulation différentielle liée à l'âge des transporteurs d'efflux de médicaments de la barrière dans des conditions normales et inflammatoires.Ces résultats fournissent des preuves sur l’intérêt de prendre en compte les propriétés spécifiques de la BHE pédiatrique et la distinguer de la BHE adulte lors des définitions des stratégies thérapeutiques destinées à traiter les maladies cérébrales chez les enfants. / One major reason of CNS pharmacotherapy’s impediment is the existence of “barriers” between blood and CNS, especially the Blood-Brain Barrier (BBB), a neurovascular structure localized at the level of brain microvasculature. Main factors responsible for this barrier function are drug efflux transporters type ABC (ATP-Binding Cassette) and SLC (SoLute Carrier) expressed at BBB level and known to be at the origin of multi-drug resistance phenomenon. Recent researches aim at unraveling the signaling mechanisms regulating these transporters in order to modulate their activity and improve pharmacotherapy in brain diseases. For years, these transporters have been studied in adult organism. But, there is a wide spread belief that the BBB in embryo, fetus, new born and infant is “immature”, implying caution in giving drugs to infants. However, current knowledge on the functional status of the BBB in immature organism remains very limited.This study was performed in the aim of understanding: 1) The ontogenesis of ABC and SLC transporters during brain maturation, 2) the functional role of four BBB drug efflux transporters (P-glycoprotein (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) in children’s brain, and 3) the mechanisms that regulate their functional expression under normal and pathological conditions, mostly under inflammatory conditions, because indeed alterations in structural and functional components of the BBB have been reported in a long list of CNS pathologies in adults. Our results showed changing properties of the BBB during ontogenesis, as well as an age-related differential regulation of BBB drug efflux transporters under normal and inflammatory conditions.These findings highlight the importance of considering an age-related response of CNS to drugs and of taking into account the specific properties of juvenile BBB during definition of therapeutic strategies designed to treat childhood brain diseases, and this in the clinical perspective of developing new drugs with enhanced efficacy in children’s CNS.