Der Erfolg neuer Strategien in der Regenerativen Medizin und im Tissue Engineering hängt maßgeblich von einem gut entwickeltem vaskulären Netzwerk ab, welches die auf den Implantaten wachsenden Zellen und Gewebe versorgen. Oberflächeneigenschaften der Implantate sowie die Präsentation verschiedener Liganden für extrazelluläre Matrixproteine spielen bei der Besiedlung der Implantate, als auch bei der Bildung versorgender Blutgefäße durch die Endothelzellen eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit konnte durch Variation der Anbindungsstärke (kovalent oder physisorptiv) des extrazellulären Matrixproteins Fibronektins an die MSA-Copolymere der Einfluss des Aufbaus der extrazellulären Matrix auf das Differenzierungsverhalten der Endothelzellen gezeigt werden. Auch die initiale Konzentration von Adhäsionsproteinen an der Substratoberfläche zeigte sich bedeutend für das Verhalten der Zellen. Optimal für eine gute Adhäsion, native Entwicklung und Kapillarbildung der Endothelzellen war die stabile (kovalente) Anbindung weniger Adhäsionsproteine (hier Fibronektin) an die Substratoberfläche, so dass die Zellen problemlos adhärieren konnten. Erfolgte die weiter Proteinadsorption an die Oberflächen in einem nativen Zustand (hier auf den hydrophilen Oberflächen) so waren die Endothelzellen in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu reorganisieren und ein dem in vivo Zustand ähnlicher Aufbau der extrazellulären Matrix konnte realisiert werden. Dies ermöglichte den Zellen wiederum ein natürliches Verhalten. Die Ausbildung einer moderaten Anzahl von Adhäsionsstellen der Zellen, sowie der in vivo ähnliche Aufbau der Adhäsionspunkte ermöglichte den Zellen einen eher lockeren Kontakt zum Substrat. Daher waren sie sehr flexibel in ihrer Morphologieanpassung. Unter diesen Bedingungen war es möglich, dass die Endothelzellen bei Stimulierung der Angiogenese kapillarähnliche Strukturen ausbildeten. Die Verwendung dreidimensionaler Zellkulturträger zeigte eine Unterstützung der Kapillarbildung der Endothelzellen in Abhängigkeit unter den beschrieben Bedingungen. / The success of tissue engineering strategies using artificial scaffolds crucially depends on a controlled formation of well-developed vascular networks in growing tissues. The presentation of extracellular matrix ligands on scaffolds is often envisioned as an appropriate strategy to support capillary formation. We show that the control of primary coupling mode — covalent versus physisorbed — as well as of secondary interactions of cell-secreted extracellular matrix proteins have a strong impact on endothelial cell development. A set of maleic anhydride copolymer thin films was used as planar model substrates. They exhibit a switchable mode of primary matrix coupling combined with a gradation of secondary matrix–substrate interactions due to a variation of surface hydrophobicity and polarity. We found that the cells adhere in a more native state at a low amount of covalent primary coupled fibronectin ligands in conjunction with weak interactions of secondarily adsorbed adhesion ligands on hydrophilic surfaces. These substrates allow for a formation of capillary-like networks of endothelial cells. High ligand densities and strong secondary hydrophobic interactions inhibit a pronounced capillary formation. The composition and structure of the formed extracellular matrix correlates well with the specific integrin expression pattern. From these results it is concluded that the formation of blood capillaries in artificial scaffolds can be triggered by controlling primary and secondary coupling of cell adhesion ligands to implant materials. 2

No description available.

No description available.

We isolated and expanded stem cells from dental pulp from extracted third molars using an innovative culture method consisting of low serum-containing medium supplemented with epidermal growth factor and platelet-derived growth factor BB. We evaluated the differentiation potential of these cells when they were growing either adherently or as micromass/spheroid cultures in various media. Undifferentiated and differentiated cells were analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and immunoblotting. The flow cytometry results showed that the dental pulp stem cells (DPSCs) were positive for mesenchymal stromal cell markers, but negative for hematopoietic markers. Immunocytochemical and/or immunoblotting analyses revealed the expression of numerous stem cell markers, including nanog, Sox2, nestin, Musashi-1 and nucleostemin, whereas they were negative for markers associated with differentiated neural, vascular and hepatic cells. Surprisingly, the cells were only slightly positive for α-smooth muscle actin, and a heterogeneous expression of CD146 was observed. When cultured in osteogenic media, they expressed osteonectin, osteopontin and procollagen I, and in micromass cultures, they produced collagen I. DPSCs cultured in TGF-β1/3-supplemented media produced extracellular matrix typical of cartilaginous tissue. The addition of vascular endothelial growth factor to serum-free media resulted in the expression of endothelial markers. Interestingly, when cultured in neurogenic media, DPSCs exhibited de novo or upregulated markers of undifferentiated and differentiated neural cells. Collectively, our data show that DPSCs are self-renewing and able to express markers of bone, cartilage, vascular and neural tissues, suggesting their multipotential capacity. Their easy accessibility makes these cells a suitable source of somatic stem cells for tissue engineering. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Hintergrund: Endothelzellen spielen sowohl in Homöostase als auch in Stresssituationen eine wesentliche Rolle bei der Regulation und der Erhaltung der hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Viele Zytokine und Wachstumsfaktoren werden für die natürliche HSC-Aktivität benötigt und von den Endothelzellen exprimiert. Neben der Unterstützung der hämatopoetischen Stammzellaktivität stellen Endothelzellen ein Gefäßversorgungsnetzwerk zur Verfügung, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Fragestellung: In der hier vorgestellten Arbeit habe ich die Hypothese verfolgt, dass eine Veränderung der Sauerstoffsensorik in Endothelzellen eine Modifizierung der Aktivität hämatopoetischer Stammzellen ermöglicht. Material und Methoden: Trotz des Wissens um die Bedeutung von Sauerstoff für die Endothelzellen fehlt uns das Verständnis dafür, wie die Sauerstoffsensorik der Endothelzellen die lokalen Knochenmark-Nischenzellen und die HSCs reguliert. Um einen Einblick in diesen Mechanismus zu erhalten, haben wir ein Mausmodell mit einem endothelzellenspezifischen Knockout des zentralen Sauerstoffsensors PHD2 entwickelt. Mit diesem in vivo-Ansatz habe ich versucht, den Einfluss von Veränderungen der Hypoxie-Signalwegproteine in Endothelzellen auf HSCs und ihre Nische zu untersuchen. Ergebnisse: Ich konnte in der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Morphologie der sinusförmigen Endothelzellen des Knochenmarks nach Verlust von PHD2 verändert ist. Außerdem konnte ich eine ausgeprägte Gefäßvasodilatation, begleitet von reduzierten hypoxischen Bereichen im angrenzenden Knochenmark beobachten. Zudem stellte ich fest, dass die Inaktivierung von PHD2 in Endothelzellen zu einem Rückgang des Knochenvolumens und zu einer Verminderung der an das Endothel angrenzenden Perizyten führt. Auffallend ist, dass sich gravierende Unterschiede in den hämatopoetischen Zellen der Peripherie zeigten, insbesondere war ein deutlicher Anstieg der zirkulierenden Leukozyten bei den KO-Mäusen zu erkennen. Dieser Phänotyp ist mit einer Vermehrung der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in Knochenmark und Milz verbunden. Darüber hinaus konnte ich zeigen dass die B-Zelldifferenzierung in der Milz vollständig zum Erliegen kommt, was zu einem signifikanten Rückgang der B-Zellen in der Marginalzone führt. Um die Funktionalität von Endothelzellen mit deletiertem PHD2 zu beurteilen, habe ich die Mäuse mit einer nicht-tödlichen Dosis ionisierender Strahlung behandelt. Die Analyse der endothelialen Zellregeneration im KO-Knochenmark zeigte eine Verminderung der Gefäßneubildung ohne Einfluss auf das gesamte Gefäßlumen im Vergleich zu unbehandelten Wurfgeschwistern. Außerdem stellte ich fest, dass sich in den ersten 3 Wochen nach der Bestrahlung bei Mäusen mit fehlendem PHD2 auf der Endothelzellenoberfläche das RBC-Kompartiments schneller regeneriert. Ich konnte ausschließen, dass dieser Effekt auf eine erhöhte Produktion von RBCs zurückzuführen ist, was zu der Hypothese führte, dass eine Verminderung des endothelialen PHD2 entweder zu einem längerfristigen Überleben der RBCs oder zu einer beeinträchtigten RBC-Clearance führt. Zusätzlich habe ich einen Anstieg in der Anzahl der quieszenten hämatopoetischen Vorläuferzellen bei Mäusen mit endothelialer PHD2-Deletion beobachtet, was darauf hindeutet, dass das endotheliale PHD2 Downstream-Signaling den Zellzyklus von hämatopoetischen Vorläuferzellen bei myeloablativen Stress beeinflusst. Abschließend konnte ich zeigen, dass ein Großteil der beobachteten Phänotypen bei KO-Mäusen durch den nachgeschalteten Transkriptionsfaktor HIF-2α vermittelt wird. Die Verwendung meiner selbstgenerierten Doppel-Knockout-Mauslinie, bei der erstmalig gleichzeitig PHD2 und HIF-2 in den Endothelzellen deletiert sind, führte zu eine vollständige Umkehrung des hämatopoetischen Phänotyps der bei den PHD2-Knockout-Mäusen im Steady-State beobachtet wurde. Zusätzlich wird der zuvor beobachtete signifikante Anstieg der Lymphozyten und der Rückgang der Erythrozyten- und Thrombozytenzahl in den Doppel-Knockout-Mäusen genetisch wiederhergestellt. Gleichzeitig reduziert sich die Entwicklung der marginalen B-Zellen im stationären Zustand wieder auf das Wildtyp-Niveau. Des Weiteren habe ich nach der Bestrahlung von Mäusen mit ionisierender Strahlung keine signifikanten Unterschiede zwischen WT und KO in ihrer hämatopoetischen Zellregeneration mehr feststellen können. Schlussfolgerungen: Zusammengenommen konnte ich in meiner Dissertation neue Eigenschaften von Hypoxie-Pathway-Proteinen in Endothelzellen mit Einfluss auf hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen sowie auf verschiedene Kompartimente ihrer Nische demonstrieren; sowohl im stationären Zustand als auch nach Belastung durch Bestrahlung. Abschließend unterstreicht meine Arbeit die entscheidende Bedeutung der Sauerstoffsensorik im Knochenmark und gibt neue Einblicke in das Zusammenspiel zwischen dem Knochenmark-Endothel und dem hämatopoetischen System.:1 Introduction 1.1 Oxygen is necessary for survival of multicellular organisms 1.2 Oxygen sensing is necessary for induction of rapid cellular response 1.3 Endothelial and hematopoietic tissues together deliver oxygen 1.4 Hematopoietic stem cells give rise to blood cells 1.5 Regulation of HSCs is dependent on cells of the hematopoietic niche 1.6 Types of HSC regulation 1.7 Cancer therapy affects all highly proliferating cells 1.8 Irradiation stress disrupts hematopoietic stem cell niche signaling 1.9 Hypoxia induced signaling during recovery after irradiation 2 Aims of the thesis Aim 1: Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche. 3 Materials and methods 3.1 Mice. 3.2 Histology, immunohistochemistry and immunofluorescence staining 3.2.1 Tissue processing prior to staining: 3.2.2 Staining: 3.3 Endothelial cell sorting 3.4 Mature hematopoietic cell isolation 3.5 Expression analysis 3.6 Hypoxyprobe 3.7 Quantitative image analysis 3.8 Bone structure analysis 3.9 Blood analysis 3.10 FACS analysis 3.11 Cell cycle analysis 3.12 RBC transfusion 3.13 Statistics. 4 Results 4.1 Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche 4.1.1 Validation of the Flk1:cre line endothelial cell targeting 4.1.2 Characterization of the endothelial cell morphology and vessel function upon PHD2 inactivation 4.1.3 Loss of endothelial PHD2 leads to a decrease in bone marrow niche 4.1.4 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to alterations of hematopoietic cells in the periphery 4.1.5 Significant increase of white blood cells in the periphery upon loss of endothelial PHD2 4.1.6 Loss of endothelial PHD2 does not impact the hematopoietic stem cells in the bone marrow. 4.1.7 Loss of PHD2 leads to increase in hematopoietic stem cells in the spleen 4.1.8 Loss of endothelial PHD2 impacts lineage-committed progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.9 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to an increase in frequency and activity of myeloid progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.10 Loss of endothelial PHD2 impacts lymphocyte progenitors in secondary lymphatic organs but not in the bone marrow 4.2 Defining the impact of radiation exposure on the recovery of PHD2-deficient endothelial cells and its hematopoietic compartment. 4.2.1 Characterization of the non-lethal ionizing radiation damage to bone marrow endothelial and hematopoietic recovery 4.2.2 Loss of PHD2 from endothelium impacts endothelial recovery after myeloablative assault 4.2.3 Loss of PHD2 in endothelial cells and its subsequent effect on hematopoietic recovery following ionizing radiation exposure 4.2.4 Mechanism of increased RBC numbers is not due to an increase in hematopoietic stem cell frequency or activity in bone marrow or the spleen, 2 weeks after irradiation 4.3 Characterization of the influence of the transcription factor HIF-2α in mice lacking EC PHD2 4.3.1 The molecular signal transduction upon PHD2 inactivation is mediated by the HIF-2 transcription factor. 4.3.2 Loss of PHD2 and HIF-2α from endothelial cells partially rescues alterations in bone marrow endothelial cell morphology 4.3.3 Simultaneous loss of PHD2 and HIF-2α in endothelial cells completely reverses the hematopoietic phenotype observed in KO mice. 4.3.4 HIF-2α transcription factor induce signaling on endothelial cells that leads to marginal zone B cell impairment 4.3.5 Loss of PHD2 and subsequent stabilization of the HIF-2αtranscription factor is responsible for the increased recovery of RBCs following ionizing radiation 5 Discussion 6 References 7 List of abbreviations 8 Abstract 9 Zussamenfassung 10 Acknowledgements 11 Deklarations / Background: Endothelial cells have an essential role in hematopoietic stem cell (HSC) regulation and maintenance during homeostasis and stress. Many cytokines and growth factors are required for normal HSC activity and are expressed by the endothelial cells. Along the support of hematopoietic stem cell activity, endothelial cells provide vessel delivery network to ensure proper oxygen delivery. Despite the importance of oxygen on endothelial cells, we lack the understanding of how oxygen sensing in endothelial cells regulates the local bone marrow niche cells and HSCs. Hypothesis: I have hypothesized that by modulating oxygen sensor in endothelial cells I will be able to modify the activity of hematopoietic stem cells Material and methods: To gain insight into this system, we developed a mouse model with an endothelial cell-specific knockout of the central oxygen sensor PHD2. Using this in vivo approach I sought to determine the impact of changes in hypoxia pathway proteins in endothelial cells on HSCs and their niche. Results: First, I revealed that the morphology of bone marrow sinusoidal endothelial cells is altered upon loss of PHD2. I observed prominent vessel vasodilation accompanied by reduced hypoxic areas in their adjacent marrow. Moreover, I determined that inactivation of PHD2 in endothelial cells led to a decrease in bone volume and pericytes adjacent to endothelium. Remarkably, I observed profound differences in the hematopoietic cells of the periphery. Specifically, I observed a profound increase in circulating leukocytes of KO mice. This phenotype was related to an increase in hematopoietic stem and progenitor cells in bone marrow and spleen. Moreover, I found a complete impairment of B cell differentiation in the spleen, which consequently led to a profound decrease in marginal zone B cells. To assess the functionality of endothelial cells lacking PHD2, I subjected the mice to a non-lethal dose of ionizing radiation. Analysis of endothelial cell recovery in KO bone marrow revealed a decrease in the formation of new vessels without an impact on the overall vascular lumen compared to WT littermates. Similarly, I found an enhanced recovery of the RBC compartment during the first 3 weeks after irradiation in mice lacking PHD2 on endothelial cells. I excluded the possibility that this effect was due to an increased RBC production, which led to hypothesis that inhibition of endothelial PHD2 results in prolonged RBC survival or impaired RBC clearance. Additionally, I observed an increase in quiescent hematopoietic progenitors cells in mice lacking PHD2 in endothelial cells that implies that endothelial PHD2 downstream signaling impact cycling of hematopoietic progenitors upon myeloablative stress. Finally, I demonstrated that a majority of the observed phenotypes in KO mice are mediated by the downstream HIF-2α transcription factor. Using my unique self-made double knockout mouse line simultaneously lacking PHD2 and HIF-2 in their endothelial cells, I was able to reveal a reversal of the hematopoietic phenotypes observed in the single PHD2 knockout mice during steady state. Additionally, the previously observed significant increase in lymphocyte and decrease in erythrocyte and thrombocyte numbers was genetically rescued in double knockout mice. Similarly, marginal zone B cell development returned to wild-type levels during steady state. Moreover, after subjecting mice to ionizing radiation I did not observe any significant differences between WT and KO in their hematopoietic cell recovery. Conclusions: Taken together, during my thesis I was able to demonstrate novel properties of hypoxia pathway proteins in endothelial cells having an impact on hematopoietic stem and progenitor cells as well as different compartments of their niche; both during steady state and radiation stress. In conclusion, my work underscores the critical importance of oxygen sensor signaling in the bone/bone marrow and provides new insight into the interplay between the bone marrow endothelium and the hematopoietic system.:1 Introduction 1.1 Oxygen is necessary for survival of multicellular organisms 1.2 Oxygen sensing is necessary for induction of rapid cellular response 1.3 Endothelial and hematopoietic tissues together deliver oxygen 1.4 Hematopoietic stem cells give rise to blood cells 1.5 Regulation of HSCs is dependent on cells of the hematopoietic niche 1.6 Types of HSC regulation 1.7 Cancer therapy affects all highly proliferating cells 1.8 Irradiation stress disrupts hematopoietic stem cell niche signaling 1.9 Hypoxia induced signaling during recovery after irradiation 2 Aims of the thesis Aim 1: Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche. 3 Materials and methods 3.1 Mice. 3.2 Histology, immunohistochemistry and immunofluorescence staining 3.2.1 Tissue processing prior to staining: 3.2.2 Staining: 3.3 Endothelial cell sorting 3.4 Mature hematopoietic cell isolation 3.5 Expression analysis 3.6 Hypoxyprobe 3.7 Quantitative image analysis 3.8 Bone structure analysis 3.9 Blood analysis 3.10 FACS analysis 3.11 Cell cycle analysis 3.12 RBC transfusion 3.13 Statistics. 4 Results 4.1 Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche 4.1.1 Validation of the Flk1:cre line endothelial cell targeting 4.1.2 Characterization of the endothelial cell morphology and vessel function upon PHD2 inactivation 4.1.3 Loss of endothelial PHD2 leads to a decrease in bone marrow niche 4.1.4 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to alterations of hematopoietic cells in the periphery 4.1.5 Significant increase of white blood cells in the periphery upon loss of endothelial PHD2 4.1.6 Loss of endothelial PHD2 does not impact the hematopoietic stem cells in the bone marrow. 4.1.7 Loss of PHD2 leads to increase in hematopoietic stem cells in the spleen 4.1.8 Loss of endothelial PHD2 impacts lineage-committed progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.9 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to an increase in frequency and activity of myeloid progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.10 Loss of endothelial PHD2 impacts lymphocyte progenitors in secondary lymphatic organs but not in the bone marrow 4.2 Defining the impact of radiation exposure on the recovery of PHD2-deficient endothelial cells and its hematopoietic compartment. 4.2.1 Characterization of the non-lethal ionizing radiation damage to bone marrow endothelial and hematopoietic recovery 4.2.2 Loss of PHD2 from endothelium impacts endothelial recovery after myeloablative assault 4.2.3 Loss of PHD2 in endothelial cells and its subsequent effect on hematopoietic recovery following ionizing radiation exposure 4.2.4 Mechanism of increased RBC numbers is not due to an increase in hematopoietic stem cell frequency or activity in bone marrow or the spleen, 2 weeks after irradiation 4.3 Characterization of the influence of the transcription factor HIF-2α in mice lacking EC PHD2 4.3.1 The molecular signal transduction upon PHD2 inactivation is mediated by the HIF-2 transcription factor. 4.3.2 Loss of PHD2 and HIF-2α from endothelial cells partially rescues alterations in bone marrow endothelial cell morphology 4.3.3 Simultaneous loss of PHD2 and HIF-2α in endothelial cells completely reverses the hematopoietic phenotype observed in KO mice. 4.3.4 HIF-2α transcription factor induce signaling on endothelial cells that leads to marginal zone B cell impairment 4.3.5 Loss of PHD2 and subsequent stabilization of the HIF-2αtranscription factor is responsible for the increased recovery of RBCs following ionizing radiation 5 Discussion 6 References 7 List of abbreviations 8 Abstract 9 Zussamenfassung 10 Acknowledgements 11 Deklarations

We isolated and expanded stem cells from dental pulp from extracted third molars using an innovative culture method consisting of low serum-containing medium supplemented with epidermal growth factor and platelet-derived growth factor BB. We evaluated the differentiation potential of these cells when they were growing either adherently or as micromass/spheroid cultures in various media. Undifferentiated and differentiated cells were analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and immunoblotting. The flow cytometry results showed that the dental pulp stem cells (DPSCs) were positive for mesenchymal stromal cell markers, but negative for hematopoietic markers. Immunocytochemical and/or immunoblotting analyses revealed the expression of numerous stem cell markers, including nanog, Sox2, nestin, Musashi-1 and nucleostemin, whereas they were negative for markers associated with differentiated neural, vascular and hepatic cells. Surprisingly, the cells were only slightly positive for α-smooth muscle actin, and a heterogeneous expression of CD146 was observed. When cultured in osteogenic media, they expressed osteonectin, osteopontin and procollagen I, and in micromass cultures, they produced collagen I. DPSCs cultured in TGF-β1/3-supplemented media produced extracellular matrix typical of cartilaginous tissue. The addition of vascular endothelial growth factor to serum-free media resulted in the expression of endothelial markers. Interestingly, when cultured in neurogenic media, DPSCs exhibited de novo or upregulated markers of undifferentiated and differentiated neural cells. Collectively, our data show that DPSCs are self-renewing and able to express markers of bone, cartilage, vascular and neural tissues, suggesting their multipotential capacity. Their easy accessibility makes these cells a suitable source of somatic stem cells for tissue engineering. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Arterien und Venen sind aufgrund ihrer Funktion im Körper morphologisch, funktionell und genetisch unterschiedlich. Schon die großen Blutgefässe auskleidende Endothelzellen zeigen eine arteriovenöse Determinierung. Ausgehend von einer Mikroarray-Analyse der mRNA-Expression arterieller und venöser Endothelzellen der Nabelschnur wurde im Rahmen dieser Arbeit auf Moleküle des Notch-Signalwegs, Dll-4, Notch-4, Hey-1 und Hey-2 fokussiert, die präferenziell bis exklusiv arteriell exprimiert werden. Weitere Gene mit einem arteriellen Expressionsmuster, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert wurden, sind Angiopoietin-2 und CD44s. Trotz der genetisch definierten Unterschiede ließ der Vergleich physiologisch relevanter Funktionen, wie Proliferation oder die Interaktion mit monozytären Zellen keinen vom endothelialen Zelltyp abhängigen Unterschied erkennen. Die im Matrigel ausgebildeten kapillar-ähnlichen Strukturen sind durch homogene, eng beieinander liegende Netzwerke charakterisiert. Studien über den Einfluss von Wachstumsfaktoren und Schubspannung auf die arteriovenöse Expression von Angiopoietin-2 deuten auf eine schubspannungsvermittelte Regulation der Gefäßstabilität und Differenzierung hin. Die in der Zellkultur durchgeführten Manipulationen, wie der Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren oder die Applikation unterschiedlicher Schubspannungen, erreichten in Bezug auf die Expression der untersuchten Markergene keine tiefer greifende Redifferenzierung des jeweiligen endothelialen Phänotyps. Der evolutionär hoch konservierte Notch-Signalweg ist präferenziell arteriell exprimiert, wobei Hey-2 ausschließlich arteriell exprimiert wird. In adulten Endothelzellen erfolgt die Hey-2-Regulation jedoch Notch-unabhängig. Die arteriovenöse Genexpression von Molekülen des Notch-Signalwegs ist unabhängig von der Schubspannung. Unter hypoxischen Bedingungen verringerte sich die Expression von Dll-4, Hey-1 / 2 dramatisch, ohne das jedoch physiologische Beeinträchtigungen zu beobachten waren. Die Expression des venösen COUP-TF II wird in arteriellen Endothelzellen nicht durch den Notch-Signalweg reguliert. Die Auswertung der Daten in der vorgelegten Arbeit lässt vermuten, dass die einmal festgelegte genetische Determinierung adulter Endothelzellen fixiert und äußeren Einflüssen gegenüber stabil und unumkehrbar ist. Dennoch ist eine gewisse Anpassungsfähigkeit der Endothelzellen an bestimmte Situationen möglich, die zwar die Ausprägung von Merkmalen des jeweilig anderen Phänotyps beinhaltet, jedoch nicht eine vollständige Redifferenzierung.

Der Erfolg neuer Strategien in der Regenerativen Medizin und im Tissue Engineering hängt maßgeblich von einem gut entwickeltem vaskulären Netzwerk ab, welches die auf den Implantaten wachsenden Zellen und Gewebe versorgen. Oberflächeneigenschaften der Implantate sowie die Präsentation verschiedener Liganden für extrazelluläre Matrixproteine spielen bei der Besiedlung der Implantate, als auch bei der Bildung versorgender Blutgefäße durch die Endothelzellen eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit konnte durch Variation der Anbindungsstärke (kovalent oder physisorptiv) des extrazellulären Matrixproteins Fibronektins an die MSA-Copolymere der Einfluss des Aufbaus der extrazellulären Matrix auf das Differenzierungsverhalten der Endothelzellen gezeigt werden. Auch die initiale Konzentration von Adhäsionsproteinen an der Substratoberfläche zeigte sich bedeutend für das Verhalten der Zellen. Optimal für eine gute Adhäsion, native Entwicklung und Kapillarbildung der Endothelzellen war die stabile (kovalente) Anbindung weniger Adhäsionsproteine (hier Fibronektin) an die Substratoberfläche, so dass die Zellen problemlos adhärieren konnten. Erfolgte die weiter Proteinadsorption an die Oberflächen in einem nativen Zustand (hier auf den hydrophilen Oberflächen) so waren die Endothelzellen in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu reorganisieren und ein dem in vivo Zustand ähnlicher Aufbau der extrazellulären Matrix konnte realisiert werden. Dies ermöglichte den Zellen wiederum ein natürliches Verhalten. Die Ausbildung einer moderaten Anzahl von Adhäsionsstellen der Zellen, sowie der in vivo ähnliche Aufbau der Adhäsionspunkte ermöglichte den Zellen einen eher lockeren Kontakt zum Substrat. Daher waren sie sehr flexibel in ihrer Morphologieanpassung. Unter diesen Bedingungen war es möglich, dass die Endothelzellen bei Stimulierung der Angiogenese kapillarähnliche Strukturen ausbildeten. Die Verwendung dreidimensionaler Zellkulturträger zeigte eine Unterstützung der Kapillarbildung der Endothelzellen in Abhängigkeit unter den beschrieben Bedingungen. / The success of tissue engineering strategies using artificial scaffolds crucially depends on a controlled formation of well-developed vascular networks in growing tissues. The presentation of extracellular matrix ligands on scaffolds is often envisioned as an appropriate strategy to support capillary formation. We show that the control of primary coupling mode — covalent versus physisorbed — as well as of secondary interactions of cell-secreted extracellular matrix proteins have a strong impact on endothelial cell development. A set of maleic anhydride copolymer thin films was used as planar model substrates. They exhibit a switchable mode of primary matrix coupling combined with a gradation of secondary matrix–substrate interactions due to a variation of surface hydrophobicity and polarity. We found that the cells adhere in a more native state at a low amount of covalent primary coupled fibronectin ligands in conjunction with weak interactions of secondarily adsorbed adhesion ligands on hydrophilic surfaces. These substrates allow for a formation of capillary-like networks of endothelial cells. High ligand densities and strong secondary hydrophobic interactions inhibit a pronounced capillary formation. The composition and structure of the formed extracellular matrix correlates well with the specific integrin expression pattern. From these results it is concluded that the formation of blood capillaries in artificial scaffolds can be triggered by controlling primary and secondary coupling of cell adhesion ligands to implant materials. 2

Im 1997 wurden der Orphan GPR30 aus HUVECs kloniert, die FSS ausgesetzt waren. In dieser Studie konnte gezeigt werden dass die Expression von GPR30 durch die FSS-Behandlung im Vergleich zu unbehandelten HUVEC-Zellen deutlich induziert wurde. Daraufhin wurde in einer Studie von Isensse et al. die zelluläre und gewebsspezifische Expression von GPR30 in GPR30-LacZ Reportergen-Mäusen untersucht. Es konnte eine Expression von GPR30 vorwiegend in den Endothelzellen der kleinen Arterien verschiedenster Gewebetypen nachgewiesen werden. GPR30 war postuliert dass E2 direkt binden kann und dadurch rasche nicht-genomische Signale vermittelt. Im Gegensatz dazu haben verschiedene andere Veröffentlichungen gezeigt dass E2 nicht spezifisch an GPR30 bindet. Trotz der Kontroverse ob es sich bei GPR30 um einen Östrogenrezeptor oder nicht ist bislang nichts über seine Interaktion zu anderen Proteinen und deren Wechselwirkung bekannt. Deswegen war ein Ziel dieser Arbeit, Interaktionspartner von menschlichen GPR30 zu identifizieren und folglich ein humanes vaskuläres in vitro Modell zu etabliren, um die potentiellen Interaktionen von GPR30 sowie die downstream-Effekte der Wechselwirkung zwischen GPR30 und den neuen Interaktionspartner des vaskulären Modells auf Transkriptebene zu evaluieren. Ein Screening einer humanen kardiovaskulären cDNA-Bibliothek mit Hilfe des Y2H-Systems führte zur Identifizierung mehrerer Interaktionspartner für GPR30 darunter PATJ und FUNDC2. Durch anschließende CoIP konnte die Interaktion von GPR30 mit PATJ validiert werden. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit die Wirkung von FSS auf die Expression von GPR30 in HUVECs bestätigt und ebenfalls in weiteren anderen Endothelzellen gezeigt werden. Abschließend wurde die Rolle von GPR30 und PATJ bei der Reaktion auf FSS auf transkriptioneller Ebene in HMEC-1-Zellen genomweit untersucht. Interessanterweise war eine Gruppe von Genen aufgrund von FSS in Zellen die GPR30 überexprimierten dereguliert als alleine durch FSS. / In 1997, the orphan G protein-coupled receptor 30, GPR30, was cloned using HUVECs exposed to FSS. It was shown that the level of GPR30 expression was up-regulated in response to FSS. Subsequently, in a study performed in the laboratory where the work for this thesis was carried out, the cellular and tissue distribution of GPR30 were investigated in GPR30-LacZ reporter mice and the expression was found predominantly in the endothelial cells of small arteries in several tissue types. GPR30, was also claimed to bind 17-β-estradiol (E2) directly and to mediate rapid non-genomic signalling. In contrast, various reports have indicated that E2 fails to bind GPR30 in a specific manner. Despite the controversy on whether GPR30 is an estrogen receptor or not, nothing is known at present about its relation and interaction with other proteins. Therefore, the aim of the work described in this thesis was to identify human GPR30 protein interaction partners and to establish a human vascular in vitro model in order to evaluate the potential role of GPR30 and the downstream effects of the interaction between GPR30 and new interaction partners in a vascular model at transcript level. The screening of a human heart cDNA library using the yeast two-hybrid assay led to the identification of several interaction partners for GPR30, among them PATJ and FUNDC2. These interactions were verified by CoIP experiments and the interaction of GPR30 with PATJ could be confirmed. The effect of FSS on the expression of GPR30 was confirmed in HUVECs and was detected in other endothelial cell types. In HUAECs, HAoECs and HMEC-1 cells GPR30 was also found up-regulated upon FSS, suggesting that GPR30 may indeed play a key role in vascular physiology. Finally, the role of GPR30 and PATJ in the FSS response was investigated at the genome-wide transcript level in HMEC-1 cells. Interestingly, a different panel of genes was deregulated owing to FSS in cells over-expressing GPR30 compared to FSS alone.

In atherosklerotischen Gefäßabschnitten kommt es durch Migration von Endothelzellen zur Neovaskularisation atherosklerotischer Plaques. Die Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1, die sowohl von luminalen, als auch von neovaskulären Endothelzellen exprimiert werden, vermitteln die Adhäsion von Leukozyten, die so durch die Endothel-Barriere hindurch an den Entzündungsort migrieren können. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) sind ligand-aktivierte Kernrezeptoren, die als Transkriptionsfaktoren hauptsächlich an der Genregulation im Fett- und Glukosestoffwechsel beteiligt sind und zudem Wirkungen im kardiovaskulären System haben. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte der PPAR-alpha-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat und der PPAR-gamma-Liganden Troglitazon und Ciglitazon auf die Migration von Endothelzellen sowie die Beeinflussung der dabei involvierten Komponenten der Signaltransduktion und die Wirkung der PPAR-Liganden auf die Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 untersucht. PPAR-alpha- und PPAR-gamma-Liganden hemmten signifikant und konzentrationsabhängig die VEGF-induzierte Endothelzellmigration. Der Migrationsprozess wird sowohl durch die MAP-Kinase, als auch durch die Serin/Threonin-Kinase Akt vermittelt und ist durch pharmakologische Inhibitoren dieser Enzyme hemmbar. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, das die PPAR-Liganden den Migrationsprozess durch eine Inhibition der Phosphorylierung von Akt hemmen, während die Phosphorylierung der MAP-Kinase durch die PPAR-Liganden unbeeinflusst blieb. Die PPAR-alpha-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat hemmten signifikant zeit- und konzentrationsabhängig die TNF-alpha-stimulierte Expression von VCAM-1. Fenofibrat hemmte außerdem die Expression von E-Selectin und ICAM-1. Die PPAR-gamma-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hatten keine Wirkung auf die Expression der Adhäsionsmoleküle. / In atherosclerotic blood vessels migration of endothelial cells leads to neovascularisation of atherosclerotic Plaques. The adhesion molecules E-Selectin, VCAM-1 and ICAM-1, being expressed by luminal endothelial cells as well as by neovascular endothelial cells, mediate leucocyte-adhesion and transmigration through the endothelial-barrier to the atherosclerotic lesion. Peroxisome Proliferator-Acticated Receptors (PPARs) are ligand-activated nuclear receptors, which regulate gene expression in lipid and glucose metabolism and also exert several vascular effects. It was the aim of this study to examine the effect of the PPAR-alpha-ligands WY-14,643 and fenofibrate and the PPAR-gamma-ligands troglitazone and ciglitazone on endothelial migration and the involved signal transduction components and to examine the effect on the expression of the endothelial adhesion molecules E-Selectin, VCAM-1 and ICAM-1. PPAR-alpha- and PPAR-gamma-ligands significantly inhibited VEGF-induced endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. This migratory process is MAP-Kinase- and Akt-dependent and can be blocked by pharmacologic inhibitors of these enzymes. This study is the first to show that PPAR-ligands inhibit endothelial cell migration by targeting Akt whereas MAP-Kinase phosphorylation was not affected by the PPAR-ligands. PPAR-alpha-ligands WY-14,643 and fenofibrate significantly inhibited TNF-alpha-induced expression of VCAM-1 in a time- and concentration-dependent manner. Furthermore, fenofibrate also inhibited the expression of E-Selectin and ICAM-1. PPAR-gamma-ligands troglitazone and coglitazone did not affect the expression of any of these adhesion molecules.