Low-density lipoprotein (LDL) apheresis is effective and safe for patients with diabetes, proteinuria, and dyslipidemia. Diabetes mellitus is accompanied by ocular microvascular complications like retinal neovascularization or diabetic macular edema. These are leading causes of blindness and can be mediated by abnormal vessel growth and increased vascular permeability due to elevated levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) in diabetic patients. In this study, we established methods to study the expression of different VEGF isoforms in human retinal and endothelial cells. The VEGF-A165a isoform is much higher expressed in retinal cells, compared to endothelial cells. Stimulation with glyoxal as a model of oxidative stress under diabetic conditions lead to a pronounced induction of VEGF-A165a in human retinal and endothelial cells. These data suggest that diabetes and oxidative stress induce VEGF-A isoforms which could be relevant in regulating the ingrowths of novel blood vessels into the retina in diabetic patients.

Im 1997 wurden der Orphan GPR30 aus HUVECs kloniert, die FSS ausgesetzt waren. In dieser Studie konnte gezeigt werden dass die Expression von GPR30 durch die FSS-Behandlung im Vergleich zu unbehandelten HUVEC-Zellen deutlich induziert wurde. Daraufhin wurde in einer Studie von Isensse et al. die zelluläre und gewebsspezifische Expression von GPR30 in GPR30-LacZ Reportergen-Mäusen untersucht. Es konnte eine Expression von GPR30 vorwiegend in den Endothelzellen der kleinen Arterien verschiedenster Gewebetypen nachgewiesen werden. GPR30 war postuliert dass E2 direkt binden kann und dadurch rasche nicht-genomische Signale vermittelt. Im Gegensatz dazu haben verschiedene andere Veröffentlichungen gezeigt dass E2 nicht spezifisch an GPR30 bindet. Trotz der Kontroverse ob es sich bei GPR30 um einen Östrogenrezeptor oder nicht ist bislang nichts über seine Interaktion zu anderen Proteinen und deren Wechselwirkung bekannt. Deswegen war ein Ziel dieser Arbeit, Interaktionspartner von menschlichen GPR30 zu identifizieren und folglich ein humanes vaskuläres in vitro Modell zu etabliren, um die potentiellen Interaktionen von GPR30 sowie die downstream-Effekte der Wechselwirkung zwischen GPR30 und den neuen Interaktionspartner des vaskulären Modells auf Transkriptebene zu evaluieren. Ein Screening einer humanen kardiovaskulären cDNA-Bibliothek mit Hilfe des Y2H-Systems führte zur Identifizierung mehrerer Interaktionspartner für GPR30 darunter PATJ und FUNDC2. Durch anschließende CoIP konnte die Interaktion von GPR30 mit PATJ validiert werden. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit die Wirkung von FSS auf die Expression von GPR30 in HUVECs bestätigt und ebenfalls in weiteren anderen Endothelzellen gezeigt werden. Abschließend wurde die Rolle von GPR30 und PATJ bei der Reaktion auf FSS auf transkriptioneller Ebene in HMEC-1-Zellen genomweit untersucht. Interessanterweise war eine Gruppe von Genen aufgrund von FSS in Zellen die GPR30 überexprimierten dereguliert als alleine durch FSS. / In 1997, the orphan G protein-coupled receptor 30, GPR30, was cloned using HUVECs exposed to FSS. It was shown that the level of GPR30 expression was up-regulated in response to FSS. Subsequently, in a study performed in the laboratory where the work for this thesis was carried out, the cellular and tissue distribution of GPR30 were investigated in GPR30-LacZ reporter mice and the expression was found predominantly in the endothelial cells of small arteries in several tissue types. GPR30, was also claimed to bind 17-β-estradiol (E2) directly and to mediate rapid non-genomic signalling. In contrast, various reports have indicated that E2 fails to bind GPR30 in a specific manner. Despite the controversy on whether GPR30 is an estrogen receptor or not, nothing is known at present about its relation and interaction with other proteins. Therefore, the aim of the work described in this thesis was to identify human GPR30 protein interaction partners and to establish a human vascular in vitro model in order to evaluate the potential role of GPR30 and the downstream effects of the interaction between GPR30 and new interaction partners in a vascular model at transcript level. The screening of a human heart cDNA library using the yeast two-hybrid assay led to the identification of several interaction partners for GPR30, among them PATJ and FUNDC2. These interactions were verified by CoIP experiments and the interaction of GPR30 with PATJ could be confirmed. The effect of FSS on the expression of GPR30 was confirmed in HUVECs and was detected in other endothelial cell types. In HUAECs, HAoECs and HMEC-1 cells GPR30 was also found up-regulated upon FSS, suggesting that GPR30 may indeed play a key role in vascular physiology. Finally, the role of GPR30 and PATJ in the FSS response was investigated at the genome-wide transcript level in HMEC-1 cells. Interestingly, a different panel of genes was deregulated owing to FSS in cells over-expressing GPR30 compared to FSS alone.

In atherosklerotischen Gefäßabschnitten kommt es durch Migration von Endothelzellen zur Neovaskularisation atherosklerotischer Plaques. Die Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1, die sowohl von luminalen, als auch von neovaskulären Endothelzellen exprimiert werden, vermitteln die Adhäsion von Leukozyten, die so durch die Endothel-Barriere hindurch an den Entzündungsort migrieren können. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) sind ligand-aktivierte Kernrezeptoren, die als Transkriptionsfaktoren hauptsächlich an der Genregulation im Fett- und Glukosestoffwechsel beteiligt sind und zudem Wirkungen im kardiovaskulären System haben. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte der PPAR-alpha-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat und der PPAR-gamma-Liganden Troglitazon und Ciglitazon auf die Migration von Endothelzellen sowie die Beeinflussung der dabei involvierten Komponenten der Signaltransduktion und die Wirkung der PPAR-Liganden auf die Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 untersucht. PPAR-alpha- und PPAR-gamma-Liganden hemmten signifikant und konzentrationsabhängig die VEGF-induzierte Endothelzellmigration. Der Migrationsprozess wird sowohl durch die MAP-Kinase, als auch durch die Serin/Threonin-Kinase Akt vermittelt und ist durch pharmakologische Inhibitoren dieser Enzyme hemmbar. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, das die PPAR-Liganden den Migrationsprozess durch eine Inhibition der Phosphorylierung von Akt hemmen, während die Phosphorylierung der MAP-Kinase durch die PPAR-Liganden unbeeinflusst blieb. Die PPAR-alpha-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat hemmten signifikant zeit- und konzentrationsabhängig die TNF-alpha-stimulierte Expression von VCAM-1. Fenofibrat hemmte außerdem die Expression von E-Selectin und ICAM-1. Die PPAR-gamma-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hatten keine Wirkung auf die Expression der Adhäsionsmoleküle. / In atherosclerotic blood vessels migration of endothelial cells leads to neovascularisation of atherosclerotic Plaques. The adhesion molecules E-Selectin, VCAM-1 and ICAM-1, being expressed by luminal endothelial cells as well as by neovascular endothelial cells, mediate leucocyte-adhesion and transmigration through the endothelial-barrier to the atherosclerotic lesion. Peroxisome Proliferator-Acticated Receptors (PPARs) are ligand-activated nuclear receptors, which regulate gene expression in lipid and glucose metabolism and also exert several vascular effects. It was the aim of this study to examine the effect of the PPAR-alpha-ligands WY-14,643 and fenofibrate and the PPAR-gamma-ligands troglitazone and ciglitazone on endothelial migration and the involved signal transduction components and to examine the effect on the expression of the endothelial adhesion molecules E-Selectin, VCAM-1 and ICAM-1. PPAR-alpha- and PPAR-gamma-ligands significantly inhibited VEGF-induced endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. This migratory process is MAP-Kinase- and Akt-dependent and can be blocked by pharmacologic inhibitors of these enzymes. This study is the first to show that PPAR-ligands inhibit endothelial cell migration by targeting Akt whereas MAP-Kinase phosphorylation was not affected by the PPAR-ligands. PPAR-alpha-ligands WY-14,643 and fenofibrate significantly inhibited TNF-alpha-induced expression of VCAM-1 in a time- and concentration-dependent manner. Furthermore, fenofibrate also inhibited the expression of E-Selectin and ICAM-1. PPAR-gamma-ligands troglitazone and coglitazone did not affect the expression of any of these adhesion molecules.

Einleitung: Die Wundheilung kornealer Endothelzellen erfolgt hauptsächlich durch Migration benachbarter Zellen. Die Endothelzellen sind in vivo ständig in Kontakt mit Kammerwasser (KW). TGF-ß2 und Ascorbin- säure (AS) sind in hoher Konzentration im KW enthalten. Der Einfluß von humanem KW, TGF-ß2 und AS auf Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen (BCEC) in Kultur wurde untersucht. Methoden: Proliferation: BCEC der 1.Passage wurden zu 1,5x104 Zellen/Well ausgesät. Mit frischem Medium und Zusatz von humanem KW (10% und 100%), TGF-ß2 (0,1; 1 und 10 ng/ml) und AS (50, 100 und 200 µg/ml) wurden die Kulturen für 72 oder 96 h inkubiert und anschließend gezählt. Migration: Konfluente Zellkulturen der 1.Passage wurden verwendet. Mit einem modifizierten Trepan (Durchmesser 5,5 mm) wurde eine zentrale, zirkuläre "Wunde" gesetzt. Die Kulturen wurden mit frischem Medium, das humanes KW, TGF-ß2 und AS in den o. g. Konzentrationen enthielt, für 72 oder 96 h inkubiert. Zur Auswertung wurden die in den Wundbereich migrierten Zellen an 5 verschiedenen Stellen, ausgehend vom Wundrand, gezählt. Ergebnisse: Die Proliferation der BCEC wurde durch humanes KW (unverdünntes KW: nahezu 100%; 10%iges KW: 30%) und Ascorbinsäure (ca. 90% bei AS 200 µg/ml) gehemmt. TGF-ß2 stimulierte die Proliferation bis zu einem 3fachen Wert der Kontrollen. Die Migration wurde durch humanes KW (unverdünntes KW: nahezu 100%; 10%iges KW: 30%) und TGF-ß2 (ca. 50% bei allen Konzentrationen) gehemmt. AS hatte einen stimulierenden Einfluß (20-50%) auf die Migration. Schlußfolgerung: Noch ist unklar, welche Substanzen im KW für den proliferationshemmenden Einfluß auf korneale Endothelzellen verantwortlich sind. Sowohl AS als auch TGF-ß2 zeigten einen gegensätzlichen Effekt auf Proliferation und Migration kultivierter BCEC. Die Bedeutung dieser Beobachtungen für die Wundheilung humaner kornealer Endothelzellen in vivo ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. / Purpose: Corneal endothelial cells are non-proliferating, wound healing primarily occurs by migration of adjacent cells. Endothelial cells in vivo are constantly exposed to aqueous humor (AH). Elevated concentrations of TGF-ß2 and ascorbic acid (AA) are present in aqueous humor. The influence of human AH, TGF- ß2 and AA on proliferation and migration of bovine corneal endothelial cells in vitro was investigated. Methods: Proliferation assays: BCEC at first passage were seeded at 1.5x104 cells/well. Fresh medium containing human AH (10% and 100%), TGF-ß2 (0,1;1 and 10 ng/ml) and AA (50, 100 and 200 µg/ml) was added to the cells. 72 or 96 hours later the cells were counted. Migration assays: BCEC at first passage were grown to confluency. A central, circular "wound" was made with an especially designed trephine (diameter 5.5 mm). The cultures were incubated with fresh medium containing human AH, TGF-ß2 and AA in the same concentrations for 72 or 96 hours. The cells were then counted in five randomly chosen sections from the wound edge. Results: Proliferation of BCE cells was inhibited by human AH (pure AH: nearly 100%, 10% AH: 30%) and AA (about 90% at 200 µg/ml). TGF-ß2 stimulated the proliferation up to 3 fold compared to the controls. Migration was inhibited by human AH (pure AH: nearly 100%, 10% AH: 30%) and TGF-ß2 (about 50% at all concentrations). AA had a stimulatory effect (20-50%) on migration. Conclusion: Presently, it remains unknown which substances in AH are responsible for the inhibiting effect on corneal endothelial proliferation. Both TGF-ß2 and AA showed to have a differential effect on proliferation and migration of cultured BCE cells. The significance of these observations for wound healing of human corneal endothelial cells in vivo has to be investigated.

F-Aktin spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung der endothelialen Barrierefunktion. In dieser Arbeit verwendeten wir Colchicin, Vinca-Alkaloide (Vinblastin, Vincristin) und Paclitaxel um Mikrotubulussysteme (MT) auszulenken und den Effekt auf die Permeabilität zu untersuchen. Endothelzellen wurden auf Polycarbonatfiltermembranen gepflanzt und einem kontinuierlichen hydrostatischen Druck von 10 cm H2O ausgesetzt. Die Exposition von Endothelzell-Monolayern gegenüber Colchicin und Vinca-Alkaloiden führte innerhalb von 60 100 Minuten zeit- und dosisabhängig zu einem fünf zehnfachen Anstieg der hydraulischen Konduktivität. Dagegen war nach MT-Stabilisation durch Paclitaxel keine Permeabilitätszunahme festzustellen. Doppelimmunfluoreszenz-Mikroskopie zeigte, dass die MT-Depolymerisation durch Colchicin und Vinca Alkaloide zu F-Aktin-Umverteilung, Stressfaserbildung und Zellretraktionen mit ausgeprägter parazellulärer Lücken-Bildung führt. Diese Phänomene wurden durch Kombinationen von Vinblastin und Paclitaxel deutlich abgeschwächt. Die fluorometrische Messung des intrazellulären F-Aktins nach MT-Depolymerisation durch Vinblastin resultierte in einer signifikanten Zunahme der Aktinfilamente. Auf der anderen Seite resultierte F-Aktin Abbau durch Cytochalasin D und Clostridium difficile (TcdB-10463) morphologisch nicht in einer Veränderung von MT-Strukturen. Dabei zeigten in Interzellularbrücken gelegene MT-Filamente Kolokalisation mit F-Aktin Fragmenten. Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass MT-Systeme an der Regulation der endothelialen Barriere beteiligt sind. Darüber hinaus verdeutlichen die Resultate eine enge Bindung von MT- und Aktin-Filamenten innerhalb endothelzellulärer Adhäsionskontakte. / The endothelian cytosceleton plays an important role in the regulation of endothelial permeability via cellular actin filaments. We tested the effect of agents known to perturb cellular microtubules on the permeability of endothelial cell monolayers. The agents chosen were colchicine, the vinca alkaloids vinblastine and vincristine and paclitaxel. Cell monolayers were prepared on polycarbonate filter membranes and exposed to a continuous hydrostatic pressure of 10 cm H2O. Colchicine and the vinca alkaloids caused a five to tenfold increase in the hydraulic conductivity of the monolayers within 60 100 min. The effect was dose and time dependent. The microtubule stabilizer paclitaxel caused no increase in permeability. Double-immunofluorescence microscopy showed that microtubule depolymerisation was associated with certain morphological features such as inter-endothelial gaps, cell retraction, f-actin reorganisation and some stressfibre appearance. These phenomena were significantly reduced when vinblastine and paclitaxel were combined. Measurement of intracellular f-actin following microtubule inhibition with vinblastine showed a significant increase in endothelial actin filaments. No changes in microtubule structures were seen when actin filaments were perturbed with cytochalasin D and Clostridium difficile (TcdB-10463). However, in this case the intercellular bridges showed that microtubules were co-localised with fragments of actin filaments from neighbouring cells. Our data demonstrate that microtubules are important for the regulation of endothelial permeability. Moreover, our results support evidens of binding between microtubules and actin filaments within endothelial cell adhesion contacts.

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rollgeschwindigkeiten von Leukozyten auf humanen kardialen mikrovaskulären Endothelzellen (HCMEC) und humanen umbilikalen venösen Endothelzellen (HUVEC). Die Endothelzellen wurden aus explantierten humanen Herzen sowie aus menschlichen Nabelschnüren unmittelbar postpartal gewonnen. Unter definierten Bedingungen wurden die in einer Flusskammer gemessenen Geschwindigkeiten von L-Selektin exprimierenden Nalm6-IF4 Zellen auf unstimulierten Endothelzellen mit denen auf stimulierten Endothelzellen verglichen. Die langsamere Geschwindigkeit der Leukozyten auf stimulierten Endothelzellen weist darauf hin, dass L-Selektin Liganden auf humanen kardialen mikrovaskulären Endothelzellen erst nach Stimulation exprimiert werden. Die beobachtete Geschwindigkeitsreduktion der Leukozyten ist jedoch von dem in der Literatur beschriebenen Selektin vermittelten Rollen zu unterscheiden. In den Versuchen mit Tunicamycin wurde gezeigt, dass N-glykosidisch gebundene Zucker kritische Bestandteile der Liganden für ihre Interaktion mit L-Selektin sind. Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch der Einfluss E-Selektin vermittelter Interaktionen auf die Geschwindigkeit der HL60 Zellen untersucht. Neben dem typischen Rollen wurde hier ebenfalls eine Selektin abhängige Geschwindigkeitsreduktion gesehen. / The aim of the present study was to investigate selectin mediated rolling velocities of leucocytes on human cardiac microvascular endothelial cells (HCMEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). HCMEC were gained from explanted human hearts and HUVEC from umbilical cords immediately postpartum. Flow velocities of L-Selectin expressing Nalm6-IF4 cells on quiesent endothelial cells were compared to those on stimulated endothelial cells. Stimulation of endothelial cells with TNF led to significantly slower velocities of Nalm6-IF4 cells indicating that HCMEC express L-Selectin ligands only after stimulation. The observed reduction of flow velocities differs from rolling of leucocytes described in the literature. Experiments with tunicamycin showed that N-glycosylated carbohydtrate moieties are needed for proper function of L-Selectin ligands. E-Selectin mediated interactions between HL60 cells and endothelial cells were studied under the same conditions. Besides the typical rolling, a selectin mediated reduction of flow velocity was observed.

Der Erfolg neuer Strategien in der Regenerativen Medizin und im Tissue Engineering hängt maßgeblich von einem gut entwickeltem vaskulären Netzwerk ab, welches die auf den Implantaten wachsenden Zellen und Gewebe versorgen. Oberflächeneigenschaften der Implantate sowie die Präsentation verschiedener Liganden für extrazelluläre Matrixproteine spielen bei der Besiedlung der Implantate, als auch bei der Bildung versorgender Blutgefäße durch die Endothelzellen eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit konnte durch Variation der Anbindungsstärke (kovalent oder physisorptiv) des extrazellulären Matrixproteins Fibronektins an die MSA-Copolymere der Einfluss des Aufbaus der extrazellulären Matrix auf das Differenzierungsverhalten der Endothelzellen gezeigt werden. Auch die initiale Konzentration von Adhäsionsproteinen an der Substratoberfläche zeigte sich bedeutend für das Verhalten der Zellen. Optimal für eine gute Adhäsion, native Entwicklung und Kapillarbildung der Endothelzellen war die stabile (kovalente) Anbindung weniger Adhäsionsproteine (hier Fibronektin) an die Substratoberfläche, so dass die Zellen problemlos adhärieren konnten. Erfolgte die weiter Proteinadsorption an die Oberflächen in einem nativen Zustand (hier auf den hydrophilen Oberflächen) so waren die Endothelzellen in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu reorganisieren und ein dem in vivo Zustand ähnlicher Aufbau der extrazellulären Matrix konnte realisiert werden. Dies ermöglichte den Zellen wiederum ein natürliches Verhalten. Die Ausbildung einer moderaten Anzahl von Adhäsionsstellen der Zellen, sowie der in vivo ähnliche Aufbau der Adhäsionspunkte ermöglichte den Zellen einen eher lockeren Kontakt zum Substrat. Daher waren sie sehr flexibel in ihrer Morphologieanpassung. Unter diesen Bedingungen war es möglich, dass die Endothelzellen bei Stimulierung der Angiogenese kapillarähnliche Strukturen ausbildeten. Die Verwendung dreidimensionaler Zellkulturträger zeigte eine Unterstützung der Kapillarbildung der Endothelzellen in Abhängigkeit unter den beschrieben Bedingungen. / The success of tissue engineering strategies using artificial scaffolds crucially depends on a controlled formation of well-developed vascular networks in growing tissues. The presentation of extracellular matrix ligands on scaffolds is often envisioned as an appropriate strategy to support capillary formation. We show that the control of primary coupling mode — covalent versus physisorbed — as well as of secondary interactions of cell-secreted extracellular matrix proteins have a strong impact on endothelial cell development. A set of maleic anhydride copolymer thin films was used as planar model substrates. They exhibit a switchable mode of primary matrix coupling combined with a gradation of secondary matrix–substrate interactions due to a variation of surface hydrophobicity and polarity. We found that the cells adhere in a more native state at a low amount of covalent primary coupled fibronectin ligands in conjunction with weak interactions of secondarily adsorbed adhesion ligands on hydrophilic surfaces. These substrates allow for a formation of capillary-like networks of endothelial cells. High ligand densities and strong secondary hydrophobic interactions inhibit a pronounced capillary formation. The composition and structure of the formed extracellular matrix correlates well with the specific integrin expression pattern. From these results it is concluded that the formation of blood capillaries in artificial scaffolds can be triggered by controlling primary and secondary coupling of cell adhesion ligands to implant materials. 2

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We isolated and expanded stem cells from dental pulp from extracted third molars using an innovative culture method consisting of low serum-containing medium supplemented with epidermal growth factor and platelet-derived growth factor BB. We evaluated the differentiation potential of these cells when they were growing either adherently or as micromass/spheroid cultures in various media. Undifferentiated and differentiated cells were analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and immunoblotting. The flow cytometry results showed that the dental pulp stem cells (DPSCs) were positive for mesenchymal stromal cell markers, but negative for hematopoietic markers. Immunocytochemical and/or immunoblotting analyses revealed the expression of numerous stem cell markers, including nanog, Sox2, nestin, Musashi-1 and nucleostemin, whereas they were negative for markers associated with differentiated neural, vascular and hepatic cells. Surprisingly, the cells were only slightly positive for α-smooth muscle actin, and a heterogeneous expression of CD146 was observed. When cultured in osteogenic media, they expressed osteonectin, osteopontin and procollagen I, and in micromass cultures, they produced collagen I. DPSCs cultured in TGF-β1/3-supplemented media produced extracellular matrix typical of cartilaginous tissue. The addition of vascular endothelial growth factor to serum-free media resulted in the expression of endothelial markers. Interestingly, when cultured in neurogenic media, DPSCs exhibited de novo or upregulated markers of undifferentiated and differentiated neural cells. Collectively, our data show that DPSCs are self-renewing and able to express markers of bone, cartilage, vascular and neural tissues, suggesting their multipotential capacity. Their easy accessibility makes these cells a suitable source of somatic stem cells for tissue engineering. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.