Made available in DSpace on 2015-03-16T14:27:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 33.pdf: 500377 bytes, checksum: bc016b7b61ad66b4f4a8b88148fedd5d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A busca por novas metodologias visando a substituição de métodos in vivo por métodos in vitro, vem ao longo dos anos se tornando um grande desafio cada vez maior entre pesquisadores e cientistas, em particular na área de controle de qualidade de produtos sujeitos à Vigilância Sanitária. No que se refere ao controle de qualidade de soros antiofídicos, o único ensaio preconizado pelas Farmacopéias oficiais para a detecção de contaminantes pirogênicos é o teste de pirogênio realizado em coelhos. Em nosso trabalho, dentre os diversos soros antiofídicos produzidos no Brasil, propusemos a validação da determinação de endotoxina no soro antibotrópico pelo método Quantitativo Cromogênico em Limulus (QCL-cinético). O ensaio de endotoxina bacteriana (LAL) pelo método QCL-cinético é específico para detecção de endotoxina de bactérias Gram negativas. A escolha do soro antibotrópico se deveu ao fato de ser a serpente do gênero Bothrops a maior causadora de acidentes ofídicos em nosso país e consequentemente o soro com maior freqüência de análises no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) para controle de sua qualidade. A validação do ensaio envolveu a determinação de parâmetros de desempenho exigidos pela ANVISA, FDA e USP. O coeficiente de correlação (r) da curva-padrão de endotoxina (E. coli 055: B5 Endotoxin), de 0.005 EU/mL a 50 EU/mL, em todos os experimentos, ficou entre -0,998 e -1,000; a recuperação da endotoxina adicionada à amostra (0,5 EU/mL) na diluição de trabalho (1:10) em todos os experimentos obedeceu ao critério de recuperação, ou seja, entre 50 a 200%. O coeficiente de variação (C.V. < 15%) no parâmetro de precisão nas 6 determinações foi de 12,6%; 5,6%; 9,6%; 13,8%; 9,9% e 11,4%. A exatidão (80 a 120%) nas 6 determinações apresentou os seguintes resultados: 103,1%; 103,1%, 110,5%; 114,3%; 103,7% e 90,7%. A concentração Limite de Endotoxina (CLE) para o soro antibotrópico a partir da validação passa a ser ≤ 2,9 EU/mL. / A busca por novas metodologias visando a substituição de métodos in vivo por métodos in vitro, vem ao longo dos anos se tornando um grande desafio cada vez maior entre pesquisadores e cientistas, em particular na área de controle de qualidade de produtos sujeitos à Vigilância Sanitária. No que se refere ao controle de qualidade de soros antiofídicos, o único ensaio preconizado pelas Farmacopéias oficiais para a detecção de contaminantes pirogênicos é o teste de pirogênio realizado em coelhos. Em nosso trabalho, dentre os diversos soros antiofídicos produzidos no Brasil, propusemos a validação da determinação de endotoxina no soro antibotrópico pelo método Quantitativo Cromogênico em Limulus (QCL-cinético). O ensaio de endotoxina bacteriana (LAL) pelo método QCL-cinético é específico para detecção de endotoxina de bactérias Gram negativas. A escolha do soro antibotrópico se deveu ao fato de ser a serpente do gênero Bothrops a maior causadora de acidentes ofídicos em nosso país e consequentemente o soro com maior freqüência de análises no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) para controle de sua qualidade. A validação do ensaio envolveu a determinação de parâmetros de desempenho exigidos pela ANVISA, FDA e USP. O coeficiente de correlação (r) da curva-padrão de endotoxina (E. coli 055: B5 Endotoxin), de 0.005 EU/mL a 50 EU/mL, em todos os experimentos, ficou entre -0,998 e -1,000; a recuperação da endotoxina adicionada à amostra (0,5 EU/mL) na diluição de trabalho (1:10) em todos os experimentos obedeceu ao critério de recuperação, ou seja, entre 50 a 200%. O coeficiente de variação (C.V. <15%) no parâmetro de precisão nas 6 determinações foi de 12,6%; 5,6%; 9,6%; 13,8%; 9,9% e 11,4%. A exatidão (80 a 120%) nas 6 determinações apresentou os seguintes resultados: 103,1%; 103,1%, 110,5%; 114,3%; 103,7% e 90,7%. A concentração Limite de Endotoxina (CLE) para o soro antibotrópico a partir da validação passa a ser ≤ 2,9 EU/mL. A metodologia foi considerada validada intralaboratorialmente após o cumprimento dos parâmetros de desempenho.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva entomotóxica usada no controle de insetos-praga e vetores de doenças há mais de 60 anos. Desde a introdução das plantas cultivadas expressando genes de Bt, ficou demonstrado que cultivares-Bt constituem uma importante ferramenta no aumento da produtividade e diminuição no uso de pesticidas químicos. O sucesso do Bt advém da produção das δ-endotoxinas (Cry). Estas toxinas compartilham um mecanismo de ação semelhante, com pelo menos, alguns aspectos em comum. A atividade das Cry é baseada nas clivagens N e C-terminais, ligação a receptores (i.e. caderinas) e mudanças conformacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos estruturais das δ-endotoxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 e Cry1Ia12 usando ferramentas de modelagem molecular por homologia, dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Oito toxinas Cry e duas caderinas (CAD) foram modeladas. Quatro toxinas (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa e Cry8Ea1) foram usadas para construir 8 sistemas que foram submetidos a simulações de DM de 50 ns utilizando o pacote GROMACS e o campo de força GROMOS96 43a1. As Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 e suas 3 variantes foram comparadas a fim de estabelecer as relações entre as diferenças estruturais e as mudanças na toxicidade. As caderinas, Cry1Ab e Cry1Ac foram usadas nos cálculos de docking molecular. Os resíduos das Cry1A com RMSF alto são os mesmos identificados experimentalmente como sítios de reconhecimento/ligação aos receptores ou desempenham um papel na dinâmica de interação. Os dados mostraram que as flexibilidades global e local das Cry estudadas aumentaram nos sistemas sem a α-1 e isto pode estar relacionado com o mecanismo de ação. Este efeito se propaga por toda a superfície a não apenas na porção N-terminal, sugerindo o início de um processo de transição conformacional. Na Cry1Ac, a ausência da α-1 promove alterações estruturais na alça 2 (ligação a receptores GPI). Algumas mutações das Cry8Ka e Cry1Ia12 estão próximas dos sítios de ligação e podem estar contribuindo para as alterações nas toxicidades. Os mapas de interfaces resultantes dos dockings moleculares corresponderam aos dados experimentais. Neste trabalho foi possível observar novos aspectos do mecanismo de ação das toxinas Cry e suas interações com caderinas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive entomotoxic bacterium widely used to control crop pests and disease vectors. Since the introduction of transgenic plants expressing Bt genes, it has been demonstrated that Bt-crops constitute an important tool in the increase of productivity and in the decrease of the use of chemical pesticides. Its success comes from the production of the δ-endotoxins (Cry). These toxins share a molecular mechanism of similar action or, at least, some common aspects. Activity of Cry proteins is due to N- or C-terminal cleavages, binding to at least one membrane receptor (e.g. cadherins) and conformational changes. The aim of this work was to study structural aspects of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 and Cry1Ia12 δ-endotoxins, using homology modeling, molecular dynamics (MD) and molecular docking. Eight Cry toxins and two cadherins (CAD) were modeled. Four toxins (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa and Cry8Ea1) were used to construct eight systems (whole Cry toxins and α-1 removed proteins (Δα1)). Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 and their three variants were compared to analyze the contributions of each mutation. The cadherins and Cry1Ab and Cry1Ac were used on docking calculations. The Cry1A residues with high flexibility are the same identified as recognition/binding sites (apex of domain II and domain-II/IIIinterface) or to play a role on its dynamic. The data show that the global and local flexibilities of Cry toxins studied was increased by helix α-1withdrawal (Δα1) and it is closely related with the mode of action. This effect propagates on the surface and not only on the N-termini suggesting a complex process of conformational transition. Regarding Cry1Ac, the absence of helix α-1 triggers structural changes on loop2, which is related to binding GPI-receptors. Some Cry8Ka5 and Cry1Ia12 mutations are in the neighborhood of receptor-binding sites and this fact may imply alterations on binding affinity. It was possible to obtain a map of Cry/CAD interface by docking studies. Therefore, this work was able to obtain molecular level insights into the Cry activation mechanism and its interaction with CAD.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva entomotóxica usada no controle de insetos-praga e vetores de doenças há mais de 60 anos. Desde a introdução das plantas cultivadas expressando genes de Bt, ficou demonstrado que cultivares-Bt constituem uma importante ferramenta no aumento da produtividade e diminuição no uso de pesticidas químicos. O sucesso do Bt advém da produção das δ-endotoxinas (Cry). Estas toxinas compartilham um mecanismo de ação semelhante, com pelo menos, alguns aspectos em comum. A atividade das Cry é baseada nas clivagens N e C-terminais, ligação a receptores (i.e. caderinas) e mudanças conformacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos estruturais das δ-endotoxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 e Cry1Ia12 usando ferramentas de modelagem molecular por homologia, dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Oito toxinas Cry e duas caderinas (CAD) foram modeladas. Quatro toxinas (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa e Cry8Ea1) foram usadas para construir 8 sistemas que foram submetidos a simulações de DM de 50 ns utilizando o pacote GROMACS e o campo de força GROMOS96 43a1. As Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 e suas 3 variantes foram comparadas a fim de estabelecer as relações entre as diferenças estruturais e as mudanças na toxicidade. As caderinas, Cry1Ab e Cry1Ac foram usadas nos cálculos de docking molecular. Os resíduos das Cry1A com RMSF alto são os mesmos identificados experimentalmente como sítios de reconhecimento/ligação aos receptores ou desempenham um papel na dinâmica de interação. Os dados mostraram que as flexibilidades global e local das Cry estudadas aumentaram nos sistemas sem a α-1 e isto pode estar relacionado com o mecanismo de ação. Este efeito se propaga por toda a superfície a não apenas na porção N-terminal, sugerindo o início de um processo de transição conformacional. Na Cry1Ac, a ausência da α-1 promove alterações estruturais na alça 2 (ligação a receptores GPI). Algumas mutações das Cry8Ka e Cry1Ia12 estão próximas dos sítios de ligação e podem estar contribuindo para as alterações nas toxicidades. Os mapas de interfaces resultantes dos dockings moleculares corresponderam aos dados experimentais. Neste trabalho foi possível observar novos aspectos do mecanismo de ação das toxinas Cry e suas interações com caderinas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive entomotoxic bacterium widely used to control crop pests and disease vectors. Since the introduction of transgenic plants expressing Bt genes, it has been demonstrated that Bt-crops constitute an important tool in the increase of productivity and in the decrease of the use of chemical pesticides. Its success comes from the production of the δ-endotoxins (Cry). These toxins share a molecular mechanism of similar action or, at least, some common aspects. Activity of Cry proteins is due to N- or C-terminal cleavages, binding to at least one membrane receptor (e.g. cadherins) and conformational changes. The aim of this work was to study structural aspects of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 and Cry1Ia12 δ-endotoxins, using homology modeling, molecular dynamics (MD) and molecular docking. Eight Cry toxins and two cadherins (CAD) were modeled. Four toxins (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa and Cry8Ea1) were used to construct eight systems (whole Cry toxins and α-1 removed proteins (Δα1)). Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 and their three variants were compared to analyze the contributions of each mutation. The cadherins and Cry1Ab and Cry1Ac were used on docking calculations. The Cry1A residues with high flexibility are the same identified as recognition/binding sites (apex of domain II and domain-II/IIIinterface) or to play a role on its dynamic. The data show that the global and local flexibilities of Cry toxins studied was increased by helix α-1withdrawal (Δα1) and it is closely related with the mode of action. This effect propagates on the surface and not only on the N-termini suggesting a complex process of conformational transition. Regarding Cry1Ac, the absence of helix α-1 triggers structural changes on loop2, which is related to binding GPI-receptors. Some Cry8Ka5 and Cry1Ia12 mutations are in the neighborhood of receptor-binding sites and this fact may imply alterations on binding affinity. It was possible to obtain a map of Cry/CAD interface by docking studies. Therefore, this work was able to obtain molecular level insights into the Cry activation mechanism and its interaction with CAD.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva entomotóxica usada no controle de insetos-praga e vetores de doenças há mais de 60 anos. Desde a introdução das plantas cultivadas expressando genes de Bt, ficou demonstrado que cultivares-Bt constituem uma importante ferramenta no aumento da produtividade e diminuição no uso de pesticidas químicos. O sucesso do Bt advém da produção das δ-endotoxinas (Cry). Estas toxinas compartilham um mecanismo de ação semelhante, com pelo menos, alguns aspectos em comum. A atividade das Cry é baseada nas clivagens N e C-terminais, ligação a receptores (i.e. caderinas) e mudanças conformacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos estruturais das δ-endotoxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 e Cry1Ia12 usando ferramentas de modelagem molecular por homologia, dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Oito toxinas Cry e duas caderinas (CAD) foram modeladas. Quatro toxinas (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa e Cry8Ea1) foram usadas para construir 8 sistemas que foram submetidos a simulações de DM de 50 ns utilizando o pacote GROMACS e o campo de força GROMOS96 43a1. As Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 e suas 3 variantes foram comparadas a fim de estabelecer as relações entre as diferenças estruturais e as mudanças na toxicidade. As caderinas, Cry1Ab e Cry1Ac foram usadas nos cálculos de docking molecular. Os resíduos das Cry1A com RMSF alto são os mesmos identificados experimentalmente como sítios de reconhecimento/ligação aos receptores ou desempenham um papel na dinâmica de interação. Os dados mostraram que as flexibilidades global e local das Cry estudadas aumentaram nos sistemas sem a α-1 e isto pode estar relacionado com o mecanismo de ação. Este efeito se propaga por toda a superfície a não apenas na porção N-terminal, sugerindo o início de um processo de transição conformacional. Na Cry1Ac, a ausência da α-1 promove alterações estruturais na alça 2 (ligação a receptores GPI). Algumas mutações das Cry8Ka e Cry1Ia12 estão próximas dos sítios de ligação e podem estar contribuindo para as alterações nas toxicidades. Os mapas de interfaces resultantes dos dockings moleculares corresponderam aos dados experimentais. Neste trabalho foi possível observar novos aspectos do mecanismo de ação das toxinas Cry e suas interações com caderinas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive entomotoxic bacterium widely used to control crop pests and disease vectors. Since the introduction of transgenic plants expressing Bt genes, it has been demonstrated that Bt-crops constitute an important tool in the increase of productivity and in the decrease of the use of chemical pesticides. Its success comes from the production of the δ-endotoxins (Cry). These toxins share a molecular mechanism of similar action or, at least, some common aspects. Activity of Cry proteins is due to N- or C-terminal cleavages, binding to at least one membrane receptor (e.g. cadherins) and conformational changes. The aim of this work was to study structural aspects of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 and Cry1Ia12 δ-endotoxins, using homology modeling, molecular dynamics (MD) and molecular docking. Eight Cry toxins and two cadherins (CAD) were modeled. Four toxins (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa and Cry8Ea1) were used to construct eight systems (whole Cry toxins and α-1 removed proteins (Δα1)). Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 and their three variants were compared to analyze the contributions of each mutation. The cadherins and Cry1Ab and Cry1Ac were used on docking calculations. The Cry1A residues with high flexibility are the same identified as recognition/binding sites (apex of domain II and domain-II/IIIinterface) or to play a role on its dynamic. The data show that the global and local flexibilities of Cry toxins studied was increased by helix α-1withdrawal (Δα1) and it is closely related with the mode of action. This effect propagates on the surface and not only on the N-termini suggesting a complex process of conformational transition. Regarding Cry1Ac, the absence of helix α-1 triggers structural changes on loop2, which is related to binding GPI-receptors. Some Cry8Ka5 and Cry1Ia12 mutations are in the neighborhood of receptor-binding sites and this fact may imply alterations on binding affinity. It was possible to obtain a map of Cry/CAD interface by docking studies. Therefore, this work was able to obtain molecular level insights into the Cry activation mechanism and its interaction with CAD.

Unidad de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / En el presente trabajo se realizaron análisis para la Validación de las metodologías analíticas: Análisis de determinación Endotoxinas Bacterianas y Análisis de test esterilidad, utilizadas en el laboratorio de Microbiología, Departamento de Operaciones Analíticas del laboratorio farmacéutico Synthon Chile. Estos análisis fueron dirigidos a tres productos farmacéuticos estériles. Para el Análisis de Determinación Endotoxinas Bacterianas se realizó una evaluación de potenciación o inhibición que ejerce el producto sobre el reactivo LAL, con el que se validó la técnica de coagulación GEL-CLOT. Mientras que en el Análisis de Test de Esterilidad, se realizó la técnica de filtración por membrana en la que se buscó neutralizar la actividad bacteriostática y/o fungistática del fármaco. Para esto se inocularon las muestras con cepas estandarizadas de la colección American Type Culture Collection (ATCC) con una carga de microorganismos ≤ 100 unidades formadoras de colonias (ufc), indicadas por la Farmacopea Europea. Los resultados obtenidos de este proceso de validación fueron dispares para los distintos fármacos utilizados. Ondansetron fue el que presentó los mejores resultados, logrando ser validados ambos métodos de análisis (esterilidad y endotoxinas). Mientras que en los otros dos fármacos no alcanzó a finalizar la validación, esto debido a resultados no satisfactorios y falta de muestras respectivas para el reanálisis

Unidad de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas

Orientador: Rogério de Castilho Jacinto / Coorientador: Frederico Canato Martinho / Banca: Eloi Dezan Junior / Banca: Giselle Prisiclla Cruz Abi Rached / Resumo: O objetivo deste estudo clínico foi avaliar a eficácia de dois sistemas rotatórios: HyFlex CM e ProTaper Next na remoção de bactérias cultiváveis e endotoxinas de canais radiculares infectados. Vinte e quatro canais radiculares de molares e pré-molares com necrose pulpar e lesão periapical foram selecionados e divididos aleatoriamente em 2 grupos: HyFlex CM (n = 12); e ProTaper Next (n = 12). As amostras foram coletadas antes e após o preparo biomecânico e inoculadas em frascos específicos. A irrigação foi realizada com hipoclorito de sódio a 2,5%. Um teste turbidimétrico LAL (Pyrogent 5000 - Lonza, Walkersville, MD, EUA) foi utilizado para quantificar endotoxinas. Cultura microbiológica foi utilizada para determinar a contagem de unidades formadoras de colônias bacterianas (UFC/mL). Os dados coletados foram analisados estatisticamente usando SigmaPlot 12.0 para Windows (Systat Software Inc., San Jose, CA). Foi realizado o teste estatístico de Two-Way ANOVA e o nível de significância foi de 5%. Nas coletas antes do preparo biomecânico, bactérias cultiváveis e endotoxinas foram evidenciadas em 100% das amostras. A análise de cultura revelou que não houve uma diferença estatisticamente significativa na redução bacteriana entre os dois sistemas de instrumentação. As endotoxinas estavam presentes em 100% dos canais após a instrumentação e não houve diferença estatística entre os dois sistemas na redução de endotoxinas. Assim, concluímos que ambos os sistemas de instrumentação for... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this clinical study was to compare the effectiveness of two rotary systems: HyFlex CM and ProTaper Next on the removal of cultivable bacteria and endotoxins from primarily infected root canals. Twenty-four root canals of molars and premolars with pulp necrosis were selected and randomly divided into 2 groups: HyFlex CM (n = 12); and ProTaper Next (n = 12). Samples were collected before and after the biomechanical preparation and inoculated in specific flasks. Irrigation was performed using 2.5% sodium hypochlorite. A kinetic turbidimetric lysate assay of limulus amoebocytes was used to quantify endotoxins. Microbiological culture was used to determine the count of bacterial colony forming units (CFU/mL). Data collected were statistically analyzed using SigmaPlot 12.0 for Windows (Systat Software Inc, San Jose, CA). The Two-Way ANOVA statistical test was performed and the level of significance was 5%. In the samples before the biomechanical preparation, cultivable bacteria and endotoxins were evidenced in 100% of the cases. The culture analysis revealed that there was no statistically significant difference in the bacterial reduction between the two instrumentation systems. Endotoxins were present in 100% of the canals after instrumentation, and there was no statistical difference between the two systems in endotoxin reduction. Thus, it was concluded that both instrumentation systems were effective in reducing root canal bacteria and endotoxins with primary endodont... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Los pirógenos son sustancias bacterianas que pueden resistir los métodos convencionales de esterilización presentándose en grandes cantidades después de la muerte y lisis de celular, su administración en productos parenterales contaminados provoca fiebre al hombre y/o animales, siendo los más importantes las endotoxinas de las bacterias Gram negativas. La prueba LAL (Limulus amebocyte lysate) se emplea para cuantificar las endotoxinas mediante una reacción de coagulación y formación de un gel. Esta prueba debe ser validada en cada producto para demostrar la factibilidad de aplicarla con resultados confiables. En el presente trabajo se validó la Prueba de endotoxinas bacterianas por el método de Gel Clot en tres lotes del producto final Clindamicina 600mg / 4mL inyectable, para lo cual se trabajó con equipos calificados, reactivos vigentes y de potencia certificada, material apirógeno. Se encontró que en los tres lotes del producto no se presentaron interferencias (magnificación ni inhibición) lo cual demostró la aplicabilidad del método a esta formulación. El desarrollo del presente trabajo permitió demostrar que es válido el uso de este método para determinar el cumplimiento del límite de las endotoxinas bacterianas y liberar nuestro producto cumpliendo los requerimientos reglamentarios. / Pyrogens are bacterial substances which can resist the conventional sterilization methods and are found in great quantities after death and cellular lysis. They induce fever when administered to humans and animals in contaminated parenteral articles. The most important pyrogen is the endotoxin of the Gram negative bacteria. LAL test (Limulus amebocyte lysate) is used to quantify endotoxins based on a coagulation reaction with endotoxin giving a gel. LAL test must be validated to demonstrate the feasibility to apply this test with certain results. In this monograph I got the Validation of LAL Test by Gel Clot technique on three batches of Clindamycin 600mg / 4mL phosphate injection, for the development of this work, calificated equipment, reagents validated, apyrogen materials were used. There was found a good response of the test. In the three batches, I found that the product doesn’t interfere (neither magnify nor inhibit), so it was demonstrated that we can apply this test to this formulation. The development of this work demonstrated that this method can be used to ensure that the product meet the bacterial endotoxin limit.

Los pirógenos son sustancias bacterianas que pueden resistir los métodos convencionales de esterilización presentándose en grandes cantidades después de la muerte y lisis de celular, su administración en productos parenterales contaminados provoca fiebre al hombre y/o animales, siendo los más importantes las endotoxinas de las bacterias Gram negativas. La prueba LAL (Limulus amebocyte lysate) se emplea para cuantificar las endotoxinas mediante una reacción de coagulación y formación de un gel. Esta prueba debe ser validada en cada producto para demostrar la factibilidad de aplicarla con resultados confiables. En el presente trabajo se validó la Prueba de endotoxinas bacterianas por el método de Gel Clot en tres lotes del producto final Clindamicina 600mg / 4mL inyectable, para lo cual se trabajó con equipos calificados, reactivos vigentes y de potencia certificada, material apirógeno. Se encontró que en los tres lotes del producto no se presentaron interferencias (magnificación ni inhibición) lo cual demostró la aplicabilidad del método a esta formulación. El desarrollo del presente trabajo permitió demostrar que es válido el uso de este método para determinar el cumplimiento del límite de las endotoxinas bacterianas y liberar nuestro producto cumpliendo los requerimientos reglamentarios. / Pyrogens are bacterial substances which can resist the conventional sterilization methods and are found in great quantities after death and cellular lysis. They induce fever when administered to humans and animals in contaminated parenteral articles. The most important pyrogen is the endotoxin of the Gram negative bacteria. LAL test (Limulus amebocyte lysate) is used to quantify endotoxins based on a coagulation reaction with endotoxin giving a gel. LAL test must be validated to demonstrate the feasibility to apply this test with certain results. In this monograph I got the Validation of LAL Test by Gel Clot technique on three batches of Clindamycin 600mg / 4mL phosphate injection, for the development of this work, calificated equipment, reagents validated, apyrogen materials were used. There was found a good response of the test. In the three batches, I found that the product doesn’t interfere (neither magnify nor inhibit), so it was demonstrated that we can apply this test to this formulation. The development of this work demonstrated that this method can be used to ensure that the product meet the bacterial endotoxin limit. / Tesis

O objetivo do presente trabalho foi quantificar, in vitro e in vivo, a endotoxina bacteriana (LPS) aderida a ligaduras ortodônticas elastoméricas estéticas de poliuretano e de silicone, empregando o teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Para o estudo in vitro foram utilizadas quatro tipos de ligaduras elastoméricas estéticas: Sani-Ties (poliuretano) e Sili-Ties (silicone), da GAC, e Mini Single Case Ligature Stick (poliuretano) e Synergy&reg; Low-friction ligatures (silicone), da Rock Mountain, sendo 5 contaminadas com solução de endotoxina (controle positivo) e 5 não-contaminadas (controle negativo). Réplicas feitas de fio de amarrilho torcido e de aço inox fundido, de mesmo tamanho e formato das ligaduras elastoméricas, contaminadas ou não com endotoxina, foram usadas como controle. A quantificação de endotoxina foi realizada por meio do teste LAL (Kit QCL-1000&trade;), sendo os resultados expressos em unidades de endotoxina (UE/mL). No estudo in vivo, 20 pacientes de ambos os gêneros, com faixa etária entre 15 e 30 anos, que iniciaram tratamento com aparelho ortodôntico fixo na Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo receberam, randomicamente, em quadrantes alternados, os mesmos quatro tipos de ligaduras elastoméricas utilizadas no estudo in vitro, sendo uma ligadura de cada marca inserida nos caninos superiores e inferiores (13, 23, 33 e 43), aleatoriamente. Vinte e um dias após, as ligaduras foram removidas e processadas para quantificação da endotoxina bacteriana, utilizando também o Kit QCL-1000&trade;. Todos os dados obtidos foram submetidos à análise estatística apropriada de acordo com a distribuição dos dados, por meio dos testes de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn (estudo in vitro) e ANOVA de medidas repetidas e pós-teste de Tukey (estudo in vivo). Todas as análises foram efetuadas por meio do programa Graph Pad Prism 4.0, com nível de significância de 5%. De acordo com os resultados obtidos, observou-se que a endotoxina bacteriana aderiu-se a todos os materiais testados. No estudo in vitro, o grupo GAC silicone foi o que apresentou menor mediana de contaminação (1,15 UE/mL), com relação aos outros grupos (p<0,0001), os quais não apresentaram diferença estatisticamente significante quando comparados entre si (p>0,05). No estudo in vivo, de maneira semelhante ao observado no estudo in vitro, o grupo GAC silicone foi o que apresentou menor média de contaminação (0,577±0,017 UE/mL), com diferença estatisticamente significante (p<0,001) em comparação aos demais grupos. Pôde-se concluir, que a endotoxina bacteriana apresentou afinidade pelas ligaduras elastoméricas estéticas à base de silicone e poliuretano testadas. As ligaduras de silicone da marca GAC foram as que apresentaram menor quantidade de endotoxina aderida às suas superfícies / The objective of this study was to quantify, in vitro and in vivo, bacterial endotoxin (LPS) attached to esthetic elastomeric orthodontic ligatures made of polyurethane and silicone using the Limulus Amebocyte Lysate test (LAL). For the in vitro study, were used four types of aesthetic elastomeric ligatures: Sani-Ties (polyurethane) and Sili-Ties (silicone) - GAC, and Mini Single Case Ligature Stick (polyurethane) and Synergy&reg; Low-friction ligatures (silicone) - Rock Mountain; 5 of each were contaminated with endotoxin solution (positive control) and 5 non-contaminated (negative control). Replicas made of twisted wire ligatures and of cast stainless steel, of the same size and shape than the elastomeric ligatures, contaminated or not with endotoxin, were used as control. Endotoxin quantification was performed using the LAL test (QCL-1000&trade; kit), the results being expressed in EU/mL. In the in vivo study, 20 patients of both genders, with ages ranging from 15 to 30 years old, who started treatment with a fixed orthodontic appliance at the School of Dentistry of Ribeirão Preto - University of São Paulo, received randomly the same four types of elastomeric ligatures used in the in vitro study, being a ligature of each brand inserted in the upper and lower canines (UR3, UL3, LR3, LL3), randomly. Twenty-one days later, ligatures were removed and processed for quantification of bacterial endotoxin, using the same test as the in vitro study. All data were submitted to appropriate statistical analysis according to the data distribution, using KruskalWallis tests and Dunn post-test (in vitro study) and ANOVA of repeated measurements and Tukey\'s post-test (in vivo study). All analyzes were performed using the Graph Pad Prism 4.0 program, with a significance level of 5%. According to the results obtained, it was observed that the bacterial endotoxin attached to all materials tested. In the in vitro study, the GAC silicone group had the lowest median contamination (1.15 EU/mL), in relation to the other groups (p<0.0001), which did not present a statistically significant difference when compared to each other (p>0.05). In the in vivo study, similar to that observed in the in vitro study, the GAC silicone group had the lowest mean contamination (0.577 ± 0.017 EU/mL), with a statistically significant difference (p< 0.001) compared to the others groups. It could be concluded that bacterial endotoxin exhibited affinity for the tested silicone and polyurethane aesthetic elastomeric ligatures. The silicone ligatures of GAC brand were the ones that presented less amount of endotoxin attached to their surfaces