A engenharia de tecidos é uma área de pesquisa que busca alternativas para a regeneração de tecidos danificados. Uma subárea dessa nova ciência faz uso das células-tronco, capazes de participar do processo de regeneração tecidual. As células são cultivadas em suportes porosos chamados de biomateriais ou scaffolds. As células-tronco mesenquimais de polpa de dente são células multipotentes e fáceis de serem obtidas. A policaprolactona, polímero atóxico, tem sido vastamente utilizada na fabricação de scaffolds devido as suas propriedades mecânicas, adequadas para a regeneração de alguns tecidos. A cultura dinâmica em biorreatores vem sendo utilizada pela sua capacidade de mimetizar as condições do ambiente natural das células-tronco no organismo humano. O objetivo do presente trabalho foi definir um protocolo de cultivo de células-tronco mesenquimais da polpa de dente em scaffolds de policaprolactona em multicamada, utilizando biorreatores de perfusão. Os biorreatores foram projetados com base em informações presentes na literatura. Os scaffolds de policaprolactona foram produzidos por electrospinning e apresentaram um diâmetro de 15 mm, aproximadamente 300 μm de espessura e diâmetro médio das fibras de 0,98 ± 0,24 μm. O cultivo estático, para fins de comparação, foi realizado em triplicata. Para o cultivo dinâmico, analisaram-se 3 diferentes vazões: 0,1 mL.min-1, 0,08 mL.min-1 e 0,05 mL.min-1. Nos dias 1, 3 e 7 de cultivo celular as análises de viabilidade celular foram realizadas pelo ensaio de WST-8, a citotoxicidade pela dosagem de LDH e de adesão celular pela histologia.. As células cultivadas nos scaffolds do topo da estrutura em camadas apresentaram maior viabilidade celular para as vazões de 0,1 e 0,08 mL.min-1 entre os dias 1 e 7 do cultivo celular. O cultivo dinâmico realizado na vazão de 0,05 mL.min-1 obteve um número baixo de células viáveis em todos os dias de análise. No cultivo estático, a viabilidade celular aumentou do primeiro ao sétimo dia de cultivo, mas permaneceu abaixo da maior vazão testada. As análises de histologia confirmaram a presença de células nas superfícies dos scaffolds. Os níveis maiores de citotoxicidade foram encontrados para o cultivo dinâmico, principalmente para a vazão de 0,1 mL.min-1, bem como foi observada maior viabilidade celular para essa vazão. Ainda é necessário repetir ambos os cultivos para confirmar os resultados e validar o protocolo definido para os experimentos. No entanto, no cultivo dinâmico, a vazão de 0,1 mL.min-1 proporcionou resultados promissores para o sistema de perfusão utilizado, podendo comprovar as vantagens do cultivo dinâmico de células-tronco para a medicina regenerativa. / Tissue engineering is an area of research which seeks for alternatives for the regeneration of damaged tissue. A sub-area of this new science uses stem cells, which are able to participate in the process of tissue regeneration. The cells are cultivated in porous supports called biomaterials or scaffolds. The mesenchymal stem cells from teeth pulp are multipotent cells and are easily obtained. Polycaprolactone, an atoxic polymer, has been extensively used in the production of scaffolds, due to its mechanical properties which are suitable for the regeneration of certain types of tissue. The dynamic cultivation using bioreactors is currently used because of its capacity to immitate the conditions of the natural environment of stem cells in the human organism. The aim of the present study has been to define a protocol for the cultivation of mensechymal stem cells from teeth pulp in multi-layered polycaprolactone scaffolds in perfusion bioreactors. The bioreactors were designed based on current information available in the literature. The polycaprolactone scaffolds were produced by electrospinning and had a diameter of 15 mm, with approximately 300 μm thickness and an average fiber diameter of 0.98 ± 0.24 μm. The static cultivation for use as a comparison was carried out in triplicate. Three different flow rates were analyzed for cellular cultivation: 0.1 mL.min-1, 0.08 mL.min-1 and 0.05 mL.min-1. The cellular viability analyses were carried out by WST-8 assay, cytotoxicity through an LDH dosage and cellular adhesion by histology on days 1, 3 and 7 of the cellular cultivation. The cultivated cells on the scaffolds, which were above the structure in layers, presented greater cellular viability when the flow rates 0.1 and 0.08 mL.min-1 were used, between days 1 and 7 of the cellular cultivation. When the flow rate of 0.05 mL.min-1 was used in the dynamic cultivation, the lowest number of viable cells in all the days of the analyses was observed. In the static cultivation, cellular viability increased between the first and seventh day of cultivation but remained lower than the dynamic cultivation with the higher flow rate tested. The histological analyses confirmed the presence of cells on the surface of the scaffolds. Both the greatest levels of cytotoxicity and cellular viability were observed in the dynamic cultivation, mainly with the flow rate of 0.1 mL.min-1. It is necessary to repeat both the cultivations to confirm the results and to test the efficiency of the protocol defined by the experiments. However, in the dynamic cultivation, the flow rate of 0.1 mL.min-1 presented promising results for the perfusion system of this study, showing the advantages of the dynamic cultivation of stem cells for regenerative medicine.

Os cimentos de fosfato de cálcio (CFCs) formam uma pasta viscosa após a mistura de uma fase sólida (sal de fosfato de cálcio) com uma fase líquida (água ou uma solução aquosa). Esta pasta endurece, dando lugar a um precipitado que contenha um ou mais fosfatos de cálcio, que graças à sua formação à temperatura corporal evita uma resposta imunológica negativa do organismo. Embora uma das caraterísticas mais importantes dos cimentos de -TCP seja sua reabsorbilidade pelo organismo, a taxa de reabsorção In Vivo pode ser lenta devido à ausência de macroporos abertos. No presente trabalho foram obtidas estruturas macroporosas com presença de interconexões a partir da mistura de cimento de -TCP com uma fase líquida espumada. A fase líquida foi constituída de diferentes concentrações de hidrogenofosfato de sódio e um surfactante (Lutensol ON 110 ou Lauril Sulfato de Sódio), sendo espumada por agitação manual num sistema composto por 2 seringas conectadas por uma válvula de PVC. Após, foi acrescentado o pó de cimento, o qual foi misturado com a espuma no mesmo sistema. Verificou-se que as soluções com Lutensol apresentaram maior espumabilidade (218 – 400%) que as soluções com Lauril (63 – 209%). A difração de raios X evidenciou a transformação de -TCP em Hidroxiapatita deficiente em cálcio em todas as amostras após a imersão em solução de Ringer. As amostras preparadas com Lutensol apresentaram macroporos abertos com diâmetros maiores a 100m. Além disso foi observado que a macroestrutura final e o tamanho dos macroporos dos cimentos espumados varia em função das concentrações de fosfato e surfactante, além da proporção L/P. Por outro lado, a resistência a compressão das amostras macroporosas diminuiu com o aumento da porosidade total. Finalmente, foi observada a formação de uma camada continua de apatita sobre a superfície dos cimentos após imersão em SBF durante 21 dias. Este estudo sugere que as amostras de cimento de fosfato de cálcio espumadas com Lutensol possuem potencial para uso como arcabouços (scaffolds) para crescimento de tecidos. / Calcium phosphate cements (CPCs) form a viscous paste after mixing a solid phase (a calcium phosphate salt) with a liquid phase (water or an aqueous solution). This paste hardens, forming a precipitate with one or more calcium phosphates, which thanks to their formation at body temperature prevent a negative immune response. Even though one of the most important characteristics of -TCP cements is their resorbability in the body, their In Vivo resorption rate is low due to the lack of open macropores. In the present work, macroporous interconnected structures were obtained by mixing the -TCP cement with a foamed liquid phase. The liquid phase was composed of different concentrations of sodium hydrogenphosphate and a surfactant (Lutensol ON 110 or Sodium Lauril Sulfate), and it was foamed by manual agitation in a system of two syringes connected by a PVC valve. The cement powder was then added to the system and mixed with the foam likewise. Solutions with Lutensol showed better foamability (218 - 400%) than solutions with Lauril (63 - 209%). X-ray diffraction showed the transformation of -TCP into Calcium Deficient Hydroxyapatite in every sample after immersion in Ringer’s solution. Samples prepared with Lutensol showed open macropores with diameters greater than 100m. It was found that final macrostructure and size of macropores in the foamed cements vary according to phosphate and surfactant concentrations, as well as to the L/P ratio. It was also found that compressive strength of the macroporous samples decreased with the increase of the total porosity. Finally, a continuous apatite layer was observed on the surface of the cements after immersion in SBF for 21 days. This study suggests that the calcium phosphate cement samples foamed with Lutensol have potential to be applied as scaffolds for bone tissue regeneration.

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-19Bitstream added on 2015-01-26T13:30:41Z : No. of bitstreams: 1 000793457.pdf: 4940625 bytes, checksum: 33d37f3e9d163f7bc90f3beb34d29c57 (MD5) / Introdução: A Engenharia de Tecidos consiste na regeneração de órgãos e tecidos, obtidos através da coleta de partes de órgãos ou tecidos do indivíduo, que, dissociados em células, são cultivadas sobre suportes biológicos ou sintéticos (scaffolds), tendo como principal premissa o reestabelecimento e recuperação da funcionalidade do tecido lesado ou perdido. Esta tecnologia, portanto, abre novos caminhos para gerar transplantes funcionais e vitais. Dentro da Engenharia Biomédica e de Biomateriais, o Laboratório de Engenharia Celular do Hemocentro de Botucatu possui, desde 2001, pesquisas na área de produção de curativos biológicos, que são aqueles que interagem de forma ativa nas diversas fases do processo cicatricial, nos vários tipos de feridas. Diante da realidade de que o tratamento das feridas crônicas englobam altos custos econômicos, sociais e humanos, comprometendo a vida dos indivíduos acometidos e da necessidade de se otimizar e minimizar o impacto negativo do descarte de hemocomponentes excedentes da prática transfusional, o desafio é buscar alternativas de scaffolds para Terapia Celular. Objetivos: Avaliar o desempenho de diferentes arcabouços biológicos como a cola de fibrina, gel de plaquetas e membrana de quitosana dopada com fatores de crescimento extraídos de plaquetas, para cultura de células. Material e Métodos: Foi coletado um fragmento de pele e um de gordura de cinco pacientes diferentes. Estes tecidos foram submetidos a protocolos de dissociação mecânica, enzimática e por explante, seguido de isolamento, semeadura e expansão das células obtidas: células-tronco mesenquimais, fibroblastos e queratinócitos. As células foram cultivadas até ao menos a quarta passagem, caracterizadas e separadas em dois grupos: testes pré-scaffold e pós-scaffold, que consistiu nas análises de imunofenotipagem, imunocitoquímica, dosagem de citocinas inflamatórias no sobrenadante de cultura, teste do ... / Introduction: Tissue engineering comprises in organ and proper tissue regeneration achieved by collecting small tissue fragments that are dissociated into cells and then cultivated into biological or synthetics scaffolds. The main characteristic of these constructs is their capacity to behave as their biological matrix counterparts, providing mechanical support and the required micro environment to the cells. This technology paves the way for the creation of functional and vital tissues for transplants. Within Biomedical Engineering and Biomaterials, the Cell Engineering Laboratory of the Botucatu Blood Transfusion Center has been investigating these topics since 2001, starting with the production of biological dressings. Biological dressings interact actively with the several phases of chronic wounds, which involves high economic, social and psychological costs, often condemning the patients quality of life. Considering this reality, the contribution of tissue engineering is to develop alternatives on cell therapy using scaffold technology. Aims: To assess the performance of different biological scaffolds such as fibrin glue, platelet gel and chitosan membrane for cell culture. Material and Methods: Five fragments of adipose tissue and skin were collected, dissociate with mechanical, enzymatic and explant techniques, and the resulting cells were seeded on tissue culture flasks, amplified and characterized using multiparameter techniques. Following characterization, these cells were cultivated into three different scaffolds made of fibrin glue, platelet gel and chitosan - which was performed in two distinct ways, on its natural form and incorporated with platelet-derived growth factors to analyze this interaction. Discussion and Results: cell cultures were amplified and cultivated making a good cell bank. However, keratinocytes were difficult to grow and the rest of experiments were unfeasible to drawn up. Immunocytochemistry analysis ...

A Engenharia de Tecidos tem como objetivo desenvolver alternativas para o tratamento de doenças degenerativas e regeneração de tecidos lesionados. O princípio básico da Engenharia de Tecidos é promover o crescimento de células sobre um substrato. Esse substrato deve reproduzir a matriz extracelular, influenciando a diferenciação e as funções celulares. Para isso, neste trabalho, nanopartículas poliméricas de poli(3-hidroxibutirato-co- 3-hidroxivalerato) (PHBHV), com diferentes diâmetros hidrodinâmicos, foram sintetizadas pelo método de emulsão-evaporação do solvente. A concentração do surfactante, a velocidade de agitação durante a emulsificação e o tempo de agitação foram variados a fim de se analisar a influência desses parâmetros no diâmetro hidrodinâmico, índice de polidispersidade e estabilidade coloidal das emulsões. Os parâmetros que mais influenciaram no diâmetro hidrodinâmico e no índice de dispersidade foram a concentração de surfactante e a amplitude de sonicação da emulsão, respectivamente. Após a obtenção das dispersões com estabilidade coloidal, realizou-se a modificação química da superfície dessas partículas utilizando os aminosilanos, 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e 3- aminopropiltrietoxisilano (APTES). Essa modificação química na superfície das nanopartículas teve como objetivo a mimetização da matriz extracelular, permitindo a adesão e proliferação das células. As partículas modificadas foram caracterizadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia de força atômica (AFM), calorimetria exploratória diferencial (DSC), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H). Os resultados de FTIR mostraram o aparecimento de pico referente ao grupo amino, que foi indicativo da modificação química da superfície das nanopartículas. Os resultados de RMN 1H mostraram o sinal dos grupos CH3 do silano APTMS no espectro das nanopartículas modificadas por APTMS, e nas partículas modificadas por APTES, foi possível identificar o sinal referente aos grupos CH2 do APTES. A partir desses resultados comprovou-se a modificação química da superfície das nanopartículas pelos aminosilanos. / Tissue engineering aims to develop alternatives to treat damaged tissues by promoting tissue regeneration. The basic principle of Tissue Engineering is to promote the growth of cells on a substrate. This substrate must reproduce the extracellular matrix, influencing particular cell functions and differentiation fate. For this purpose, at the present work, polymeric nanoparticles of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBHV) with different hydrodynamic diameters were synthesized by emulsion-solvent evaporation technique. The concentration of the surfactant, stirring speed during emulsification and stirring time were varied in order to analyze the influence of these parameters on hydrodynamic diameter, polydispersity and colloidal stability. The parameters that most influenced the hydrodynamic diameter and polydispersity index were the variation in the surfactant concentration and the variation of emulsion sonication amplitude, respectively. After that, the nanoparticles had their surface modified by 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and 3- aminopropyltriethoxysilane (APTES). The aim of this chemical modification was to mimic the extracellular matrix, allowing the adhesion and proliferation of cells. The modified particles were characterized by dynamic light scattering (DLS), atomic force microscopy (AFM), differential scanning calorimetry (DSC), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). The FTIR results showed a peak of the amino group, which was an indicative of the nanoparticles surface chemical modification. 1H NMR results showed the signal of the CH3 groups of the APTMS silane in the spectrum of the APTMS-modified nanoparticles and in the APTES-modified particles it was possible to identify signal relating to the CH2 groups of the APTES. From these results, it was verified the nanoparticles surface chemical modification by the aminosilanes.

A engenharia de tecidos é uma área de pesquisa que busca alternativas para a regeneração de tecidos danificados. Uma subárea dessa nova ciência faz uso das células-tronco, capazes de participar do processo de regeneração tecidual. As células são cultivadas em suportes porosos chamados de biomateriais ou scaffolds. As células-tronco mesenquimais de polpa de dente são células multipotentes e fáceis de serem obtidas. A policaprolactona, polímero atóxico, tem sido vastamente utilizada na fabricação de scaffolds devido as suas propriedades mecânicas, adequadas para a regeneração de alguns tecidos. A cultura dinâmica em biorreatores vem sendo utilizada pela sua capacidade de mimetizar as condições do ambiente natural das células-tronco no organismo humano. O objetivo do presente trabalho foi definir um protocolo de cultivo de células-tronco mesenquimais da polpa de dente em scaffolds de policaprolactona em multicamada, utilizando biorreatores de perfusão. Os biorreatores foram projetados com base em informações presentes na literatura. Os scaffolds de policaprolactona foram produzidos por electrospinning e apresentaram um diâmetro de 15 mm, aproximadamente 300 μm de espessura e diâmetro médio das fibras de 0,98 ± 0,24 μm. O cultivo estático, para fins de comparação, foi realizado em triplicata. Para o cultivo dinâmico, analisaram-se 3 diferentes vazões: 0,1 mL.min-1, 0,08 mL.min-1 e 0,05 mL.min-1. Nos dias 1, 3 e 7 de cultivo celular as análises de viabilidade celular foram realizadas pelo ensaio de WST-8, a citotoxicidade pela dosagem de LDH e de adesão celular pela histologia.. As células cultivadas nos scaffolds do topo da estrutura em camadas apresentaram maior viabilidade celular para as vazões de 0,1 e 0,08 mL.min-1 entre os dias 1 e 7 do cultivo celular. O cultivo dinâmico realizado na vazão de 0,05 mL.min-1 obteve um número baixo de células viáveis em todos os dias de análise. No cultivo estático, a viabilidade celular aumentou do primeiro ao sétimo dia de cultivo, mas permaneceu abaixo da maior vazão testada. As análises de histologia confirmaram a presença de células nas superfícies dos scaffolds. Os níveis maiores de citotoxicidade foram encontrados para o cultivo dinâmico, principalmente para a vazão de 0,1 mL.min-1, bem como foi observada maior viabilidade celular para essa vazão. Ainda é necessário repetir ambos os cultivos para confirmar os resultados e validar o protocolo definido para os experimentos. No entanto, no cultivo dinâmico, a vazão de 0,1 mL.min-1 proporcionou resultados promissores para o sistema de perfusão utilizado, podendo comprovar as vantagens do cultivo dinâmico de células-tronco para a medicina regenerativa. / Tissue engineering is an area of research which seeks for alternatives for the regeneration of damaged tissue. A sub-area of this new science uses stem cells, which are able to participate in the process of tissue regeneration. The cells are cultivated in porous supports called biomaterials or scaffolds. The mesenchymal stem cells from teeth pulp are multipotent cells and are easily obtained. Polycaprolactone, an atoxic polymer, has been extensively used in the production of scaffolds, due to its mechanical properties which are suitable for the regeneration of certain types of tissue. The dynamic cultivation using bioreactors is currently used because of its capacity to immitate the conditions of the natural environment of stem cells in the human organism. The aim of the present study has been to define a protocol for the cultivation of mensechymal stem cells from teeth pulp in multi-layered polycaprolactone scaffolds in perfusion bioreactors. The bioreactors were designed based on current information available in the literature. The polycaprolactone scaffolds were produced by electrospinning and had a diameter of 15 mm, with approximately 300 μm thickness and an average fiber diameter of 0.98 ± 0.24 μm. The static cultivation for use as a comparison was carried out in triplicate. Three different flow rates were analyzed for cellular cultivation: 0.1 mL.min-1, 0.08 mL.min-1 and 0.05 mL.min-1. The cellular viability analyses were carried out by WST-8 assay, cytotoxicity through an LDH dosage and cellular adhesion by histology on days 1, 3 and 7 of the cellular cultivation. The cultivated cells on the scaffolds, which were above the structure in layers, presented greater cellular viability when the flow rates 0.1 and 0.08 mL.min-1 were used, between days 1 and 7 of the cellular cultivation. When the flow rate of 0.05 mL.min-1 was used in the dynamic cultivation, the lowest number of viable cells in all the days of the analyses was observed. In the static cultivation, cellular viability increased between the first and seventh day of cultivation but remained lower than the dynamic cultivation with the higher flow rate tested. The histological analyses confirmed the presence of cells on the surface of the scaffolds. Both the greatest levels of cytotoxicity and cellular viability were observed in the dynamic cultivation, mainly with the flow rate of 0.1 mL.min-1. It is necessary to repeat both the cultivations to confirm the results and to test the efficiency of the protocol defined by the experiments. However, in the dynamic cultivation, the flow rate of 0.1 mL.min-1 presented promising results for the perfusion system of this study, showing the advantages of the dynamic cultivation of stem cells for regenerative medicine.

Com o aumento da expectativa de vida e o envelhecimento da população, a medicina regenerativa vem ocupando um importante espaço visando manter a qualidade de vida da população. A engenharia de tecidos, apoiada nos avanços da biotecnologia e da nanotecnologia, vem se configurando como alternativa mais versátil e menos custosa ao reparo e transplante de tecidos e órgãos. Os arcabouços para engenharia tecidual constituídos de nanofibras têm o potencial para mimetizar a arquitetura nanométrica dos tecidos humanos, especialmente devido à grande área superficial e elevada porosidade. Para a fabricação de arcabouços de nanofibras, a técnica mais utilizada é a de eletrofiação, devido à sua alta versatilidade, e os materiais mais estudados são os polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, que são os mais desejados para fins biomédicos. A esterilização é uma etapa crítica no processo de fabricação de produto médico implantável e pode ter impacto no desempenho dos arcabouços poliméricos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da esterilização por gás ozônio em arcabouços de nanofibras poliméricas eletrofiadas para engenharia de tecidos. A esterilização por ozônio foi eficaz na inativação do indicador biológico G. stearothermophilus, caracterizando eficácia na letalidade microbiana; igualmente, não se detectou crescimento microbiano no teste de esterilidade. Os arcabouços de nanofibras de poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) tiveram suas propriedades físico-químicas, mecânicas e biológicas preservadas, mantendo o mesmo desempenho como suporte para o crescimento de fibroblastos NIH3T3 após a esterilização. Já os arcabouços de poli-caprolactona, tiveram suas propriedades alteradas e apresentaram um melhor desempenho na proliferação celular de fibroblastos L929 após a esterilização. Assim, o gás ozônio se mostrou como um método alternativo para a esterilização de nanofibras poliméricas para engenharia tecidual. / Since world population is ageing, regenerative medicine has become a growing area in the medical field in order to maintain the life quality of population. With the advance of biotechnology and nanotechnology, tissue engineering has emerged as a more versatile and less costly alternative to tissue repair and transplantation. Nanofibers have the potential to mimic the human tissue architecture at the nanometer scale, especially due to their large surface area and high porosity. Electrospinning is the most applied technique to fabricate nanofibers scaffolds mainly because of its powerful and high versatility. Many polymers can be used on the fabrication of nanofibers scaffolds; however, the biodegradable and biocompatible polymers are the most desired ones for biomedical purposes. Sterilization is a critical step in the fabrication process and might impact the performance of polymeric scaffolds. Therefore, the aim of this study was to evaluate the impact of sterilization by ozone gas on polymeric electrospun nanofibers scaffolds for tissue engineering. Ozone gas sterilization was efficient in killing the G. stearothermophilus spores, a common biological indicator used for validation of sterilization processes. The sterilization method preserved the physico-chemical, mechanical, and biological properties of poly(lactic-co-glycolic) acid nanofibers, keeping the performance of NIH3T3 proliferation on the scaffolds. On the other hand, the same sterilization method altered some properties of poly-caprolactone electrospun scaffolds, what improved L929 fibroblasts proliferation on the scaffolds after sterilization. Therefore, ozone gas was found to be a benign sterilization method for polymeric electrospun scaffolds for tissue engineering.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-17T13:56:21Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2138386 bytes, checksum: 3aebcacc72eafc8089742b514c82fa88 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-17T13:56:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2138386 bytes, checksum: 3aebcacc72eafc8089742b514c82fa88 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As lesões ou perdas de tecido ósseo são condições que afetam diretamente a qualidade de vida dos seres humanos e animais. Os processos de reparação podem não ocorrer de maneira eficiente quando existirem condições clínicas desfavoráveis. Alguns compósitos, polímeros e proteínas são utilizados na formação de matrizes por promover maior eficiência nesse processo reparador. Entretanto, os biomateriais utilizados hoje no tratamento dessas afecções ainda apresentam algumas propriedades que devem ser adequadas ao uso do mesmo. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial reparador do compósito constituído de hidroxiapatita (HAP) e fibroína da seda (FS) na presença de ácido hialurônico (AH) em diferentes concentrações, utilizado para o tratamento de defeitos ósseos experimentais realizados na ulna de coelhos. Primeiramente, foram realizadas análises de difração de raios-X e microscopia eletrônica de varredura com o objetivo de caracterizar a topografia de superfície, porosidade e grau de cristalinidade de cada compósito. Posteriormente, foram realizados testesin vivode biocompatibilidade e biodegradabilidade do compósito. Para tal, foram utilizados três coelhos que receberam, cada um, quatro implantes no subcutâneo de um mesmo compósito. O coelho numero 1 recebeu quatro implantes referentes ao compósito 1 (HAP+FS). O coelho numero 2 recebeu quatro implantes referentes ao compósito 2 (HAP+FS+1%AH). E por fim, o coelho número 3 recebeu quatro implantes referentes ao compósito 3 (HAP+FS+3%AH). Uma amostra de cada animal foi coletada em cada um dos dias 15, 30, 60 e 90 dias, após a cirurgia e processadas para avaliação histológica.Por fim, avaliou-se também a capacidade de osteocondução e osseointegração através da implantação dos compósitos 1, 2 e 3 em um defeito previamente criado no olecrano dos animais. As cirurgias de implantação no olecranoforam realizadas após divisão dos grupos experimentais, contendo 10 animais cada, em grupo tratado e controle, sendo o grupo controle não recebendo nenhum tipo de tratamento.As avaliações clínicas foram realizadas durante os sete dias e depois aos 30 dias de pós-operatório. Radiografias dos membros operados foram realizadas no pós-operatório imediato, após sete e 30 dias de tratamento.Atomografia microcomputadorizada e as análises histológicasforam realizadas coletando-se as amostras aos sete e 30 dias de implantação do compósito no tecido ósseoe a microscopia eletrônica de varredura somente após 30 dias de implantação. Os resultados das análises de difração de raios-X revelaram três compósitos de alta cristalinidade, e as imagens de microscopia eletrônica de varredura demonstraram que o compósito HAP+FS+3%AH possuía uma topografia mais complexa e porosa, em relação aos outros dois compósitos HAP+FS e HAP+FS+1% AH, demonstrando ser uma superfície ideal para a adesão e proliferação celular. Ao teste de biocompatibilidade, os três compósitos apresentaram integração com o tecido, com proliferação tecidual, fragmentação do compósito e, ao final da avaliação, observou-se a formação de um tecido fibroso organizado ao redor do biomaterial. As avaliações clínicas demonstraram um compósito biocompatível e tolerado pelos animais, e as radiografias dos grupos tratados demonstraram diminuição da radiopacidade óssea, tornando-se semelhante ao osso adjacente aos 30 dias de pós-operatório. A tomografia microcomputadorizada demonstrou, através de imagens tridimensionais, uma perda maior na regularidade da borda do defeito no grupo tratado com HAP+FS+3%AH em comparação com os outros grupos, sugestivo de crescimento de tecido ósseo e demonstrando ser o melhor compósito para o tratamento do ponto de vista dessa análise. A histopatologia e a microscopia eletrônica de varredura revelaram uma interação compósito e tecido, com a formação de tecido ósseo ao redor do implante e a análise histomorfométrica revelou quantidade maior de trabéculas ósseas jovens no grupo tratado com HAP+FS+3%HA, demonstrando ser o melhor tratamento utilizado neste estudo para os defeitos criados nos olecranos de coelhos. / The lesions or bone loss are conditions that directly affect the quality of life of humans and animals. The repair process may not occur efficiently when there are unfavorable conditions. Some composites, polymers, and proteins are used to form matrices to promote higher efficiency in this repairing process. However, the biomaterials used today in the treatment of these diseases still have some properties so that these biomaterials could suitable for use. The objective of this work was to evaluate the reparative potential of the composite consisting of hydroxyapatite (HAP) and fibroin silk (FS) in the presence of hyaluronic acid (HA) in different concentrations used for the treatment of experimental bone defects made in the rabbits ulna. First, diffraction of X-rays and scanning electron microscopy analyzes were performed in order to characterize the surface topography, porosity and degree of crystallinity of each composite. Later, in vivo biocompatibility and biodegradability of the composite tests were performed. To this end, three rabbits were used who received each four implants into the subcutaneous tissue of the same composite. The number one rabbit received four implants for the composite 1 (HAP + FS). The number 2 rabbit received four implants for the composite 2 (HAP + FS + 1% AH). Finally, the rabbit number 3 received four implants for the composite 3 (HAP + FS + 3% AH). A sample of each animal was collected in each of days 15, 30, 60 and 90 days after surgery and processed for histological evaluation. Finally, we assessed whether her ability to osteoconductive and osseointegration through the deployment of composite 1, 2 and 3 in a defect previously created in the olecranon animals. The implementation of the olecranon surgeries were performed after division of experimental groups of 10 animals each, in treated and control group, and the control group not receiving any kind of treatment. Clinical evaluations were performed 7 days and then at 30 days postoperatively. X-rays of operated limbs were performed in the immediate postoperative period, after 7 and 30 days of treatment. The microcomputadorizada tomography and histological analyzes were performed by collecting samples at seven and 30 days of composite implantation into bone tissue and scanning electron microscopy only after 30 days of implantation. The results of the analysis of diffraction X-rays revealed three composite of high crystallinity, and scanning electron microscopy pictures show that the composite HAP + FS + 3% HA had a more complex porous topography another two composites HAP + FS e HAP+FS+ 1% AH, proving to be an ideal surface for cell adhesion and proliferation. When biocompatibility test, the three composites showed integration with the tissue with tissue proliferation, composite fragmentation and at the end of the evaluation was observed the formation of an organized fibrous tissue around the biomaterial. Clinical evaluations demonstrated a biocompatible composite tolerated by the animals, and radiographs of the treated groups showed decreased bone radiopacity, making it similar to the adjacent bone at 30 days postoperatively. The microcomputadorizada tomography demonstrated by means of three-dimensional images, a greater loss in the defect edge regulariy in the group treated with HAP + FS + 3% HA in comparison with other groups, suggestive of bone growth and demonstrated to be the best composite to treating point of view this analysis. Histopathology and scanning electron microscopy revealed a compositeand tissue interaction with the formation of bone tissue around the implant and histomorphometric analysis revealed a greater number of young trabecular bone in the group treated with PAH + FS + 3% HA, proving to be the best treatment used in this study for defects created in rabbits ulna.

Células-tronco humanas derivadas da polpa dental (hDPSCs) e células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo (AhSCs) são células multipotentes capazes de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo, e promissoras fontes de células para a engenharia de tecido ósseo, dada a sua facilidade de expansão, isolamento e diferenciação. É de grande interesse compreender qual é o melhor tipo celular para diferenciação osteogênica, assim, o objetivo deste estudo foi comparar o potencial de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo entre hDPSCs e hASCs. Foram isoladas e estabelecidas seis populações de células-tronco de hDPSCs (entre 7-12 anos) e seis da hASC (de indivíduos com idade entre 30-49 anos). Após a indução in vitro, a diferenciação osteogênica foi comprovado através das colorações de fosfatase alcalina (9 dias) e vermelho de alizarina (14 e 21 dias). A quantificação da mineralização da matriz após 21 dias de diferenciação osteogênica revelou 2,24 mais ossificação das hDPSCs em relação às hASCs. Para realizar o experimento in vivo, foram triados seis biomateriais para verificar qual melhor biomaterial para o nosso modelo, defeito crítico em calvária de Ratos Wistar não imunossuprimidos, com três amostras de hDPSCs. Após 45 dias, CellCeram(TM) exibiu a melhor neoformação óssea in vivo, e foi selecionado para comparar os potenciais osteogênicos in vivo entre hDPSCs e hASCs. Células (10e6) foram associadas a discos de 4,5 mm CellCeram(TM), grupo controle foi realizado através do transplante do biomaterial livre de células. Neoformação óssea foi mensurada 45 dias após a cirurgia através da coloração histológica de hematoxilina / eosina. A formação óssea total foi quantificada através da análise de imagens de todas as ilhas de ossificação. A associação entre hDPSCs e CellCeram(TM) promoveu 7,24 vezes mais neoformação óssea quando comparado com a associação entre esse mesmo material e hASCs (p <0,0001). A utilização de células-tronco adultas para regeneração óssea é uma ótima abordagem para uso terapêutico, e calcular ou predizer o potencial osteogênico das células utilizadas é extremamente importante e necessário para futura aplicação em novas estratégias de bioengenharia de tecido ósseo / Human dental pulp stem cells (hDPSCs) and human adipose-derived stem cells (AhSCs) are multipotent cells capable of undergoing osteogenesis in vitro and in vivo, and promising cell-source populations for bone tissue engineering given their easiness of isolation, expansion and differentiation. It is of great interest to understand which is the best cell type for osteogenic differentiation, thus the aim of this study is to compare the in vitro and the in vivo osteogenic differentiation potentials between DPSCs and ASCs. We isolated six stem cell populations from DPSCs (aged 7-12 years) and six from ASCs (from subjects aged 30-49 years) and cell culture was established. After in vitro induction the populations were able to undergo osteogenic differentiation, as evidenced by alkaline phosphatase (9 days) and alizarin red S (14 and 21 days) stainings. Quantification of matrix mineralization after 21 days of osteogenic differentiation revealed an enhancement of 2.24-fold increase between hDPSCs and hASCs differentiation. To perform the in vivo experiment, we promoted a screening of six scaffolds to find out which would be best scaffold to our model, a calvarial critical-sized defect in Wistar non-immunosuppressed rats, with three different culture samples of hDPSCs. After 45 days, CellCeram(TM) displayed the best in vivo bone neoformation, and was used to compare the in vivo osteogenic potentials between hDPSCs and hASCs. Cells (10e6) were associated to 4.5 mm CellCeram(TM) discs, and control groups were performed transplanting the biomaterial free of cells. Bone healing was measured through histological hematoxylin/eosin staining 45 days after surgery. Newly formed bone was also evaluated by total bone island surface quantification through image analysis. The association between hDPSCs and CellCeram(TM) induced a mean of 7.24 times more bone formation when compared to the association between this same material and hASCs (p<0.0001). The use of adult stem cells for bone regeneration is a robust therapeutic option, and calculate or predicts the osteogenic potential of the cell used are extremely important and necessary to future application, and translation to new strategies in bone tissue engineering

Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção do periodonto. Alloderm® (MDA) é um substituto alógeno muito utilizado e estudado em periodontia. O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, se a MDA é uma matriz tridimensional adequada, através de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais e células neoplásicas; e, ainda, se os subprodutos da MDA influenciam o comportamento celular. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais de cão (FGC) e fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de, respectivamente, três indivíduos e três cães saudáveis. As células FGC, FGH e B16F10 de melanoma murino foram cultivadas sobre a MDA por até 14 dias. Os seguintes parâmetros foram avaliados: presença, morfologia e distribuição de FGC, FGH e B16F10 por fluorescência direta; viabilidade de FGC e FGH por MTT; e o efeito do meio de cultura condicionado (MC) em MDA por 24 h na viabilidade celular de FGC por MTT. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn para comparações múltiplas (nível de significância: 5%). Resultados: A epifluorescência revelou que, em 12 h, FGH e FGC estavam aderidos à superfície da MDA em baixa densidade celular, exibindo morfologia poligonal com núcleos esféricos, enquanto que, aos 7 e 14 dias, essas células apresentavam com formato alongado, núcleos ovalados e citoesqueleto de actina com fibras de estresse. Aos 7 e 14 dias, FGC apresentavam-se distribuídos de forma desigual sobre a MDA, formando uma camada celular descontínua, sem aumento no número de células entre os períodos; FGH formaram uma monocamada celular na superfície da MDA, estando presentes em maior número após 14 dias de cultivo (p<0,05); e B16F10 exibiram um aumento no número de células de 12 h para 7 dias (p<0,05), apresentando-se dispostas em aglomerados celulares, principalmente na superfície da MDA, com a formação de camada contínua aos 14 dias. Notou-se maior número de células nas amostras cultivadas com B16F10, seguido por FGH e FGC aos 7 dias (p<0,05). Aos 14 dias, FGH e B16F10 estavam presentes em maior número, com diferença estatística significante em relação aos FGC (p<0,05). Foi observada maior porcentagem de células na superfície (p<0,05) do que no interior da MDA e essa proporção manteve-se estável durante os períodos avaliados para todos os tipos celulares. O ensaio de MTT indicou maior viabilidade celular nas amostras cultivadas com FGH comparado a FGC (p=0,024), aos 7 e 14 dias. Notou-se um decréscimo na viabilidade celular em culturas cultivadas em MC, com diferença estatística entre os grupos em 48 e 72 horas (p<0,05). Conclusão: Podemos concluir que fibroblastos gengivais e mesmo células altamente proliferativas, como B16F10, povoam apenas superficialmente a MDA e que FGC são afetados negativamente pelos subprodutos da MDA, reduzindo sua viabilidade. / Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Alloderm® (Alloderm® - ADM) is the most used and studied allogeneic substitute. The aim of this investigation was to verify if ADM is a suitable threedimensional matrix, through its in vitro response to gingival fibroblasts and cancerous cells lineage and, also, if ADM end products affect cellular behavior. Methods: Canine gingival fibroblasts (CGF) and human gingival fibroblasts (HGF) cultures were established by the explant technique of gingival connective tissues of three dogs and three healthy patients, respectively. CGF, HGF and B16F10 cells of murine melanoma were seeded on ADM and grown for up to 14 days. The following parameters were assessed: presence, morphology and distribution of CGF, HGF e B16F10 by direct fluorescence; CGF and HGF viability by MTT; and the effect of culture medium conditioned (CM) in the MDA for 24 h on CGF viability by MTT. Quantitative data were submitted to Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, followed by Dunn\'s method. Results: Epifluorescence revealed that CGF and HGF were adherent and exhibited a polygonal morphology at 12 h while at 7 and 14 days they were spread, exhibiting an elongated shape and the actin cytoskeleton assembled into stress fibers. CGF were unevenly distributed on ADM surface, showing no increase in cell number over the experimental periods; HGF formed a monolayer on the ADM surface, in a higher number at 14 days (p<0,05); B16F10 exhibited na increase in cell number in 7 days (p<0,05), and were mainly arranged in cell aggregates on the ADM, forming a continuous layer at 14 days. A higher percentage of cells on the ADM surface (p <0.05) compared to inside the matrix was observed for all cell types in all periods. MTT values indicated higher cell viability in samples cultured with HGF compared to CGF (p=0.024). A significantly lower cell viability for CGF grown in CM compared to cells grown in non conditioned medium at 48 and 72 h (p <0.05) was noticed. Conclusion: Gingival fibroblasts and even highly proliferative cells as B16F10 can be only superficially located on ADM and CGF are negatively affected by ADM end products, reducing its viability.

Introdução: Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção. Mucograft® (MCS-3D) é um substituto xenógeno novo que vem sendo utilizado na periodontia em técnicas de recobrimento radicular e aumento de tecido queratinizado. O objetivo do presente estudo foi avaliar morfológica e imunohistoquimicamente, se a MCS-3D é uma matriz tridimensional adequada, por meio de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de três indivíduos. Os FGH foram cultivados sobre colágeno bovino bidimensional (ColB-2D), colágeno bovino tridimensional (ColB-3D) e matriz colágena suína tridimensional (MCS-3D) por até 10 dias. Em 3, 7 e 10 dias, os seguintes parâmetros foram avaliados: número, morfologia e distribuição de FGH por fluorescência direta; viabilidade celular por MTT; proliferação celular e expressão de proteínas citoesqueléticas: actina e tubulina e proteínas da matriz extracelular não colágena: fibronectina imunofluorescência indireta. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos de Friedman para comparação intra e intergrupos para as variáveis da análise de expressão das proteínas: fibronectina, actina e tubulina. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparações intra e intergrupos, seguido do teste de Tukey para as variáveis das análises de viabidlidade, proliferação e número total de células. Resultados: A epifluorescência revelou que em 3 dias os FGH apresentavam-se aderidos em todos os grupos experimentais. FGH cultivados sobre ColB-2D exibiram forma menos alongada, ampla e achatada com maior quantidade de projeções e numerosas fibras de estresse em 3, 7 e 10 dias. Por outro lado, os FGH cultivados sobre ColB-3D e MCS-3D demonstraram, em todos os períodos experimentais, fenótipo fusiforme, alongado ou cilíndrico com menor quantidade de projeções do que observado no substrato 2D, com algumas das células cultivadas sobre MCS-3D demonstrando aspecto estrelado. O ensaio de MTT revelou viabilidade celular significantemente superior no ColB-2D e MCS-3D do que no ColB-3D (p<0,001), em todos os períodos experimentais. Em 3 dias, foi observado maior número de FGH cultivados sobre ColB-2D seguido por MCS-3D e ColB-3D respectivamente, havendo diferença estatística entre ColB-2D e MCS-3D (p<0,001) e entre ColB-2D e ColB-3D (p<0,001). No sétimo dia houve redução no número de células no ColB-2D e aumento na MCS-3D e ColB-3D, em que o número de células foi significantemente superior no ColB-2d com relação a MCS-3D (p=0,002). Ao final do período experimental, foi observado aumento no número de células em todos os grupos experimentais, sendo o número de células, mais uma vez, significantemente superior no ColB-2D do que na MCS-3D (p=0,002). Maior porcentagem de FGH no ciclo celular pode ser observado em ColB-2D seguido por ColB-3D e MCS-3D, respectivamente, em todos os períodos experimentais. Na MCS-3D praticamente não houve marcação por Ki-67 e o ColB-2D apresentou redução significativa de FGH ciclando entre o período de 3 e 10 dias (p=0,036). A expressão de proteínas não colágenas e citoesqueléticas foi similar em ambas as matrizes experimentais durante todo o estudo. Conclusão: Podemos concluir que a MCS-3D constitui uma matriz adequada para o cultivo de fibroblastos gengivais humanos, uma vez que, no interior da matriz, importantes propriedades foram verificadas, dentre as quais, morfologia, proliferação, e expressão de proteínas, semelhantes a uma matriz colágena tridimensional já consagrada na literatura. / Introduction: Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Mucograft® (PCM-3D) is a new xenogeneic substitute that has been used in periodontics in techniques such as root coverage and increasing keratinized tissue. The aim of this investigation was to verify if PCM-3D is a suitable three-dimensional matrix though its in vitro response to the culture of HGF. Methods: Human gingival fibroblasts (HGF) culture was established by the explant technique of gingival connective tissues of three healthy patients. HGF were seeded on bidimensional bovine collagen matrix (BCol-2D), three-dimensional bovine collagen matrix (BCol- 3D) and three-dimensional porcine collagen matrix (PCM-3D). HGF were grown for up to 10 days. At 3, 7 and 10 days the following parameters were assessed: HGF number, morphology and distribution by direct fluorescence; cell viability by MTT; cell proliferation and expression of proteins of the extracellular matrix non-collagenous fibronectina and cytoeskeletic - proteins actin and tubulin by indirect immunofluorescence. Quantitative data were submitted to Friedman and Kruskal- Wallis test, and the last one was followed by Tukeys test. Results: Epifluorescence revealed that at 3 days HGF grown on BCol-2D were broader, more flattened and had more cell protrusions and stress fibers in all experimental times. On the other hand, HGF seeded on BCol-3D and PCM-3D displayed a spindle-shaped, elongated, or cylindrical phenotype with fewer protrusions as well as less total cell spread area than on the 2D matrix, with some cells on PCM-3D showing stellate appearance. MTT assay showed cell viability higher in cultures grown on BCol-2D and PCM-3D than in BCol-3D (p<0,001). At 3days a greater number of cells in BCol-2D samples followed by PCM-3D and BCol-3D, respectively, was observed with statistical difference between BCol-2D and PCM-3D and between (p<0,001). At 7 days, there was a decrease in cell number grown on BCol-2D and an increase in BCol-3D and PCM-3D, where the number of cells were significantly higher in BCol-2D in relation to PCM-3D (p=0.002). At the end of the experimental period, there was an increase in total cell number in all of the experimental groups, and it was again significantly greater in BCol-2D than in PCM (p=0.005). Between 3 and 10 days, there was an increase in total cell number in ColB-3D (p<0.001), which showed higher counts within 10 days. Higher percentage of HGF in the cell cycle could be seen in BCol-2D followed by BCol-3D and PCM-3D, respectively, in all of the experimental groups. In PCM-3D there was almost no expression of Ki-67. BCol-2D showed a decrease in HGF cycling between 3 and 10 days (p=0,036). The expression of non-collagenous and cytoskeletal proteins were similar in both matrices during all the period of the study. Conclusion: PCM-3D is suitable for HGF culture, since, within the matrix, important properties were found, among them, morphology, proliferation andprotein expression, similar to those observed in a 3D collagen matrix well established in the literature.