O uso desenfreado dos recursos naturais durante as últimas décadas têm impactado drasticamente o meio ambiente, direcionando a humanidade a investir no desenvolvimento de tecnologias para produção sustentável e ecológica de novas fontes de energia renovável e de produtos verdes. Nesse âmbito, o uso de resíduos derivados da biomassa vegetal tem sido apresentado como uma promissora alternativa à substituição de combustíveis, componentes químicos e polímeros de origem fóssil. Esse material é barato, abundante e não compete direta ou indiretamente com a segurança alimentar. Hoje, mais de 200 compostos químicos e biopolímeros de valor agregado podem ser obtidos a partir do processamento de material lignocelulósico. Todavia, essa tecnologia ainda não é plenamente desenvolvida, afetando sua competitividade econômica, sendo que o maior custo atribui-se à despolimerização enzimática dos polissacarídeos que formam a parede celular vegetal (PCV). Essa etapa requer preparados enzimáticos compostos por diversas enzimas, que agem sinergicamente sobre a complexa estrutura da PCV. Dentre essas enzimas, as pectinases e xilanases desempenham um importante papel na desconstrução dos polímeros pécticos e da hemicelulose. O presente trabalho objetivou o estudo funcional e estrutural de diferentes classes de pectinases e xilanases com potencial biotecnológico, no intuito de contribuir para o desenvolvimento pleno da despolimerização enzimática da PCV. Dentro dessa perspectiva, foram estudadas: uma pectina metilesterase (Sl-PME) e uma endo-poligalacturonase (Sl-EndoPG) do inseto Sphenophorus levis; uma exo-poligalacturonase (Bl-ExoPG) de Bacillus licheniformis; uma xilanase GH10 (MT-Xyn10) e duas GH11 (MT-Xyn11a e MT-Xyn11b) identificadas no metatranscriptoma de um consórcio microbiótico derivado de compostagem de bagaço de cana-de-açúcar. A estrutura cristalográfica da Sl-PME evidenciou alta semelhança com outra PME de inseto. Também foi concluído que as PMEs de inseto são mais similares às bacterianas, quando comparadas às fúngicas e vegetais, principalmente em relação ao sulco catalítico. Além disso, PMEs de inseto, exclusivamente, apresentam uma permutação circular, possívelmente realcionada a um evento de transferência horizontal. A Bl-ExoPG apresentou-se monomérica em solução, com atividade ótima em pH neutro a 60°C, sendo estável em uma ampla faixa de pH (5-10) e com considerável termoestabilidade em elevadas temperaturas. Essa enzima, também, apresentou especificidade por pectina não-metilada, liberando unicamente monômeros de ácido galacturônico. As três xilanases estudadas apresentaram-se monoméricas em solução, com maior atividade entre 30 e 45°C e pHs de 6 a 9, retendo atividade acima de 50% nos pHs 5 e 10. Além disso, todas elas apresentam especificidade por xilano, sendo que a MT-Xyn10 apresentou, também, alta atividade sobre arabinoxilano. A MT-Xyn10 apresentou um conjunto de propriedades enzimáticas bastante atrativas às aplicações industriais, uma vez que é altamente estável em uma ampla faixa de pH (4-10), termoestável em temperaturas de até 50°C e sua ação catalítica produz diversos xilo-oligossacarídeos de alto valor agregado. A análise da estrutura cristalográfica da MT-Xyn11a revela três particularidades estruturais, compartilhadas com a MT-Xyn11b, mas não descritas para outras GH11. Dentre essas particularidades, um loop parece limitar o acesso do substrato ao sítio catalítico, contribuindo diretamente para a baixa afinidade ao substrato apresentada por essas duas enzimas. / Decades of unbridled use of natural resources have drastically affected the global environment, driving humanity to invest in the development of novel technologies for production of sustainable and ecofriendly renewable energy sources and green products. In this context, plant biomass residues have been presented as a promising alternative to fuels, chemicals and polymers derived from fossil reserves. This feedstock is abundant, cheap and does not compete directly or indirectly with food security. Today, more than 200 value-added chemicals and biopolymers can be generated by processing lignocellulosic material. However, this technology is not fully developed yet; its major costs stem from the enzymatic depolymerization of the polysaccharides that constitute the plant cell wall (PCW). This step requires enzymatic cocktails composed of several enzymes that synergistically deconstruct the complex PCW. Among these enzymes, pectinases and xylanases play an important role in the depolymerization of pectic polymers and hemicellulose. The present work is a functional and structural study of different classes of pectinase and xylanases with biotechnological potential. It intends to contribute to the full development of PCW enzymatic depolymerization. With this perspective, we studied a pectin methylesterase (Sl-PME) and an endo-polygalacturonase (Sl-EndoPG) from the insect Sphenophorus levis; an exo-polygalacturonase (Bl-ExoPG) from Bacillus licheniformis; a GH10 xylanase (MT-Xyn10); and two GH11 xylanases (MT-Xyn11a and MT-Xyn11b) from the metatranscriptome of sugarcane bagasse compost-derived microbial consortia. The Sl-PME crystallographic structure showed high similarity with other insect PME. It was also concluded that insect PMEs are more similar to bacterial PMEs than fungi or plant PMEs, especially in relation to the catalytic groove. Moreover, insect PMEs exclusively presented a circular permutation that is possibly related to an event of horizontal gene transfer. Bl-ExoPG is monomeric in solution, with optimal activity on neutral pH and 60°C, being stable in a wide pH range (5-10) and with considerable thermostability at high temperatures. This enzyme, also presented specificity for non-methylated pectin substrates, releasing only monomers of galacturonic acid as catalytic product. All three xylanases studied here are monomeric in solution, with optimal activity between 30°C and 45°C and between pHs 6 and 9, retaining more than 50% of original activity in the pHs 5 and 10. Besides, they all showed specificity for xylan, and MT-Xyn10 also showed high activity on arabinoxylan. MT-Xyn10 revealed a set of enzymatic properties attractive for industrial applications, such as high stability in a wide pH range (4-10), thermostability up to 50°C and released products that are high value-added xilo-oligosaccharides. The MT-Xyn11a crystallographic structure revealed three structural particularities shared with MT-Xyn11b, but not previously described in other GH11. Among these particularities, a loop seems to limit the substrate access to the catalytic site, contributing to the low enzyme affinity presented by both MT-Xyn11a and MT-Xyn11b.

Inúmeros trabalhos da literatura científica mostram que a remoção parcial de lignina é útil para facilitar o processo de sacarificação enzimática de materiais lignocelulósicos. No entanto, a maioria dos processos de deslignificação aplica condições severas de reação e apresenta custos elevados de processo. Uma alternativa aos processos mais severos de deslignificação envolve a aplicação de sistemas biomiméticos. Estes sistemas demandam condições amenas de reação, compatíveis com a etapa de hidrólise enzimática, porém geralmente são mais lentos e menos eficientes do que os pré-tratamentos químicos e quimiotermomecânicos convencionais. Ponderando estes fatos, o objetivo desta tese foi estudar a aplicação de sistemas oxidativos e biomiméticos na deslignificação de materiais lignocelulósicos prévios a uma etapa de hidrólise enzimática da fração polissacarídica. A estratégia de trabalho consistiu em pré-tratar bagaço de cana (foram empregados 3 cultivares diferentes de cana no presente estudo) com um processo quimiotermomecânico (CTM) em condições amenas de reação (5,0% de Na2SO3 e 2,5% de NaOH) seguido de um tratamento biomimético oxidativo. Esta abordagem visou gerar um material parcialmente deslignificado que pudesse ter a recalcitrância significativamente diminuída pela aplicação de um processo biomimético. Um segundo pré-tratamento foi aplicado em condições mais severas de reação (10% de Na2SO3 e 5,0% de NaOH) e visou gerar um material de referência, com baixa recalcitrância. Os sistemas biomiméticos empregados tiveram origem nos processos naturais de biodegradação de madeira por fungos de decomposição branca e parda e envolveram a ação de: a) Manganês peroxidase, Lacase, ferro e Oxigênio; b) reação de Fenton mediada por quelantes. Estes sistemas foram suplementados ou não com ácidos graxos insaturados, visando gerar radicais organoperoxila no caso dos sistemas suplementados. As reações de Fenton mediadas por quelantes apresentaram emissão de quimiluminescência, o que permitiu otimizar o sistema reacional com base na máxima quimiluminescência obtida. A remoção de lignina obtida com o pré-tratamento CTM variou de acordo com a carga de sulfito alcalino empregada, sendo que para as severidades baixa e alta, a remoção de lignina atingiu 26% e 54%, respectivamente. Os sistemas biomiméticos aplicados no bagaço de cana, após pré-tratamento com sulfito alcalino na condição branda, produziram graus de deslignificação variáveis, sendo que as principais remoções de lignina foram obtidas com o tratamento de Fenton mediado por quelantes e com Oxigênio, atingindo remoções acumuladas de lignina de 44% e 62%, respectivamente. Em todos os casos avaliados, a remoção adicional de lignina promoveu maiores eficiências de conversão enzimática das frações polissacarídicas residuais. A maior conversão de celulose e hemicelulose (acima de 80%) foi obtida com o tratamento Fenton mediado por quelantes aplicado sobre um cultivar de cana de açúcar que apresentava elevado teor de ácidos hidroxicinâmicos, sugerindo uma ação eficiente destes sistemas para a remoção destes ácidos hidroxicinâmicos. / The current scientific literature shows that lignin removal can facilitates subsequent processes of enzymatic saccharification of lignocellulosic materials. However, most of the delignification processes use severe reaction conditions and present high process costs. One alternative for the severe delignification processes includes the use of biomimetic systems. These systems can be applied under mild reaction conditions, which are compatible with the enzymatic hydrolysis step. Nevertheless, biomimetic systems usually present low reaction rates and are less efficient than the more severe chemical and chemithermomechancial processes. Weighing these facts, the main subject of the current PhD thesis was to study oxidative-biomimetic systems suitable for delignification of lignocellulosic materials as a previous step to the enzymatic hydrolysis of the polysaccharide fraction. The experimental approach involved the pretreatment of sugar cane bagasse (three different sugar cane cultivars were evaluated) by a chemithermomechanical (CTM) process under mild reaction conditions (5% of Na2SO3 and 2.5% NaOH), followed by an oxidative-biomimetic system. This approach aimed to prepare a partially delignified material suitable to be treated by the subsequent biomimetic systems, providing significant changes in the material recalcitrance. A second pretreatment under more severe reaction conditions (10% Na2SO3 and 5% NaOH) was performed to prepare a reference material with low recalcitrance. The biomimetic systems used in the current work were based on natural wood decay processes involving white- and brown-rot fungi, and include the actions of: a) Manganese peroxidase, Laccase, Iron íons and Oxygen; b) Chelator Mediated Fenton reactions (CMF). This reaction systems used (or not) the presence of unsaturated fatty acids to induce formation of organoperoxyl radicals. The CMF reactions presented chemiluminescence, which enabled the reaction optimization with basis on maximal chemiluminescence. The lignin removal during the CTM pretreatment varied according to the alkaline-sulfite load used in the reaction. The delignification increased with increased alkaline-sulfite loads reaching 26% and 54% for the less severe and more severe reaction conditions, respectively. Biomimetic systems applied over the mild-pretreated sugar cane bagasse produced varied delignification levels, reaching maximal values for cumulative lignin removal of 44% and 62% for the CMF and Oxigen, respectively. In all cases, the supplementary removal of lignin resulted in more efficient enzymatic hydrolysis of the polysaccharide fraction. The highest cellulose and hemicellulose conversions (over 80%) was obtained with the CMF system applied on a sugar cane cultivar that contained high hydroxycinnamic acids contents, suggesting an efficient action of CMF systems for hydroxycinnamic acids removal.

Mono e diacilgliceróis são produtos empregados na indústria alimentícia, farmacêutica, cosmética e química como emulsificantes e melhoradores de viscosidade de produtos alimentícios, cosméticos e farmacêuticos. No entanto, a forma mais usual de obtê-los é por síntese química, o que acaba rendendo produtos finais caros e com atributos de qualidade, rendimento e de aplicabilidade tecnológica inferiores aos esperados. A busca por formas de obtenção mais racionais, eficientes e com melhor padrão de qualidade destes produtos foi o objetivo principal do trabalho, por meio de hidrólise parcial enzimática, que necessita de condições de reação mais brandas. Foram avaliadas a hidrólise enzimática descontína, empregando como substrato a trioleína técnica, e a hidrólise enzimática descontínua-alimentada, usando como substrato o óleo de girassol médio oléico. Foi utilizada, em ambos processsos, a lipase imobilizada sn-1,3 específica Lipozyme RM IM (de Rhizomucor miehei). A caracterização dos padrões e dos substrados, bem como o acompanhamento da formação dos produtos da hidrólise enzimática foram feitos por determinação da porcentagem de hidrólise, cromatografia em camada delgada (TLC), dos perfis das curvas de fusão e cristalização por calorimetria diferencial de varredura (DSC), cromatografia gasosa (CG) e cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (HPSEC). Os parâmetros de hidrólise descontínua foram o tempo de reação, a temperatura e a concentração inicial de substrato. Os parâmetros de hidrólise descontínua-alimentada foram tempo de enchimento e intervalo de alimentação de substrato. Para as respostas analíticas de porcentagem de hidrólise e de composição de frações lipídicas foi aplicado um modelo de regressão múltipla com base em metodologia de superfície de resposta. Os resultados experimentais observados nas reações de hidrólise enzimática descontínua de trioleína técnica mostraram de 24,7 a 34,2% de mono e diacilgliceróis (para 5% de óleo na emulsão) e de 21,4 a 33,6% de mono e diacilgliceróis (para 20% de óleo na emulsão). Os resultados experimentais observados nas reações de hidrólise enzimática descontínua-alimentada de óleo de girassol médio oléico (para 15% de óleo na emulsão), mostraram de 7,9 a 31,8% de mono e diacilgliceróis. Os modelos de superfície de resposta foram considerados significativos e preditivos. As hidrólises obtidas no formato descontínuo e descontínuo-alimentado permitiram efetivamente a obtenção de frações de mono/ diacilgliceróis com vários graus de eficiência de conversão e com corretas identificação e quantificação das frações de lipídios procuradas. As correlações feitas entre porcentagem de hidrólise e entalpias de cristalização e fusão, corroboradas com os resultados qualitativos e/ou quantitativos diretos obtidos na cromatografia de camada delgada (TLC) e de HPSEC, demonstraram que estes atributos podem positivamente indicar a ocorrência efetiva de reação de hidrólise, além de auferir uma escala de desempenho de reação alinhada com o previsto na literatura, à medida que são aumentadas a temperatura, o tempo de hidrólise e a porcentagem inicial de substrato oleoso, sob regime descontínuo, e que puderam ser melhoradas, de forma inovadora, sob parâmetros de tempo total de alimentação e de intervalo de alimentação, sob regime descontínuo-alimentado. A hidrólise parcial enzimática de triacilgliceróis utilizando lipase imobilizada sn-1,3 específica pode ser considerada uma alternativa às vias químicas para a produção de misturas de mono e diacilgliceróis para utilização como aditivos químicos. / Mono and diacylglycerols are products used in the food, pharmaceutical, cosmetic and chemical industries as emulsifiers and viscosity improvers for food products, cosmetics and pharmaceuticals. However, the most usual forms of obtaining them are by chemical synthesis, which ends up yielding expensive final products with attributes of quality, yield and technological applicability lower than expected. The search for more rational, efficient and better quality standards of these products was the aim of the work, through partial enzymatic hydrolysis, which requires milder reaction conditions. Discontinuous enzymatic hydrolysis was evaluated using technical triolein as substrate and discontinuous-fed enzymatic hydrolysis using as the substrate the mid oleic sunflower oil. In both processes, immobilized lipase sn-1,3 specific Lipozyme RM IM (from Rhizomucor miehei) was used. The characterization of the patterns and substrates, as well as the monitoring of the formation of the products from the enzymatic hydrolysis were made by determining the percentage of hydrolysis, thin layer chromatography (TLC), profiles of the melting and crystallization curves by differential scanning calorimetry ( DSC), gas chromatography (GC) and high performance size exclusion chromatography (HPSEC). The parameters of discontinuous hydrolysis were the reaction time, the temperature and the initial substrate concentration. The parameters of discontinuous-fed hydrolysis were filling time and substrate feed interval. For the analytical responses of hydrolysis percentage and composition of lipid fractions a multiple regression model was applied based on response surface methodology. The experimental results observed in the reactions of discontinuous enzymatic hydrolysis of technical triolein indicated amounts of mono- and diacylglycerols from 24.7 to 34.2% (for 5% of oil in the emulsion) and from 21.4 to 33.6% for mono and diacylglycerols with 20% oil in the emulsion. The experimental results observed in the reactions of discontinuous-fed enzymatic hydrolysis of mid oleic sunflower oil (for 15% oil in the emulsion), showed from 7.9 to 31.8% of mono and diacylglycerols. Response surface models were considered significant and viii predictive. The hydrolysis obtained in the discontinuous and discontinuous-fed form allowed to obtain fractions of mono / diacylglycerols with various degrees of conversion efficiency and with correct identification and quantification of the lipid fractions sought. The correlations between the percentage of hydrolysis and enthalpies of crystallization and fusion, corroborated with the qualitative and / or quantitative direct results obtained in thin layer chromatography (TLC) and HPSEC, showed that these attributes can positively indicate the effective occurrence of reaction of Hydrolysis, in addition to achieving a reaction performance scale in line with the literature, as the temperature rate, the hydrolysis time and the initial percentage of oily substrate are increased under a discontinuous regime and can be improved, in a innovative form, under parameters of total filling time and feeding interval, under a fed-batch regime. The partial enzymatic hydrolysis of triacylglycerols using specific sn-1,3-specific immobilized lipase may be considered an alternative to the chemical pathways for the production of mono- and diacylglycerol blends for use as chemical additives.

A DOW é uma empresa que busca continuamente por alternativas para agregar maior valor aos seus produtos através da avaliação das tendências apresentadas pela indústria química. Dentro desta dinâmica, identificou-se uma grande necessidade do mercado de fluidos de corte por inibidores de corrosão mais eficientes e adequados às novas questões regulatórias. Desta avaliação surgiu o tema deste Mestrado Profissional, no qual se estudou a síntese e aplicação de alcanolamidas em fluidos de corte como inibidores de corrosão. Optou-se pela síntese enzimática na ausência de solventes orgânicos por se tratar de uma nova tecnologia à DOW e estar alinhada aos preceitos de sustentabilidades promovidos pela empresa. A escolha pela avaliação das alcanolamidas surgiu de um estudo realizado pela companhia sobre novas tecnologias utilizadas neste segmento e a possibilidade de aplicação destes compostos em outros mercados de atuação da empresa. Foram sintetizadas quatro alcanolamidas, RMEA, RMIPA, RDIPA e RAEPD, obtidas respectivamente da reação entre o ácido ricinoléico e os aminoálcoois: 2-hidroxietilamina, 1-amino-2-propanol, bis-(2-hidroxipropil)amina e 2-amino-2-etil-1,3-propanodiol. O catalisador Novozym 435 (lipase) foi utilizado em todas as sínteses, e estas realizadas de acordo com um planejamento fatorial completo 23. Os produtos sintetizados foram caracterizados por RMN 13C, 1H e dept 135, Espectroscopia no Infravermelho e Espectroscopia de Massas. O rendimento das reações foi mensurado através da técnica de HPLC. Com base nos resultados obtidos foi possível, através do planejamento fatorial, determinar as condições reacionais nas quais o rendimento é maximizado (T = 80 °C; Catalisador = 15 mol/g de ácido ricinoléico; rotação = 600 rpm). A única desvantagem deste processo de síntese foi o custo inerente ao catalisador utilizado. Após o término do planejamento fatorial foram formulados oito fluidos de corte semissintéticos com as alcanolamidas sintetizadas e dois fluidos com o inibidor convencionalmente utilizado. Após verificar a estabilidade térmica destes fluidos, a eficiência à inibição da corrosão foi mensurada através da técnica de manchamento em ferro fundido. Os fluidos contendo as alcanolamidas apresentaram melhor desempenho à inibição da corrosão, porém, não foi possível mensurar quantitativamente as diferenças observadas através desta técnica. Com isso, os compostos foram submetidos a ensaios de perda de massa e polarização potenciodinâmica em ácido clorídrico, além de microscopia atômica para avaliar o efeito dos inibidores na superfície metálica. Através destes estudos foi possível comprovar que os produtos RDIPA e RAEPD possuem maior eficiência à inibição da corrosão. O mecanismo de inibição destes compostos, determinado através de isotermas de Langmuir, ocorre por fisissorção. Após a comprovação das propriedades anticorrosivas dos compostos sintetizados, foram analisadas as seguintes propriedades dos fluidos produzidos: viscosidade, formação de espuma, ângulo de contato, desgaste Reichert, alcalinidade e contaminação microbiológica. Observou-se um aumento da viscosidade e formação de espuma do fluido concentrado. Entretanto, comprovou-se que não há impacto significativo destas propriedades durante a aplicação destes fluidos. As alcanolamidas impactaram positivamente no aumento da lubricidade e reserva alcalina dos fluidos, além de diminuir a taxa de corrosão e a susceptibilidade dos fluidos à contaminação microbiológica, e facilitar o tratamento do resíduo gerado no processo de usinagem devido a maior biodegradabilidade das alcanolamidas. / DOW is a company that continuously searches for alternatives to add greater value to their products through the assessment of trends presented by the chemical industry. Within this dynamic it was identified a great need for more efficient and suitable (to new regulatory issues) corrosion inhibitors applied in metalworking fluids. This Master Thesis came up from this evaluation, where it was studied the synthesis and application of alkanolamides in metalworking fluids as corrosion inhibitors. The enzymatic synthesis in the absence of organic solvents was the chosen production process of alkanolamides because it\'s a new technology to DOW and it\'s aligned with sustainable precepts promoted by the company. The choice for the evaluation of alkanolamides emerged from a study conducted by the company on new technologies applied in metalworking fluids and the possibility of application of these compounds in other markets. It was synthesized four alkanolamides, RMEA, RMIPA, RDIPA and RAEPD, respectively obtained from the reaction between ricinoleic acid and following amino alcohols: 2-hydroxyethylamine, 1-amino-2-propanol, bis(2-hydroxypropyl)amine and 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol. The Novozym 435 catalyst (lipase) was used for all syntheses, and these were carried out according to a full factorial design for three factors. The synthesized products were characterized by NMR 13C, 1H and dept 135, Infrared and Mass Spectroscopy. The yield of the reactions was measured by HPLC technique. Based on the results it was possible, through the factorial design, determine the reaction conditions in which the yield is maximized (T = 80 ° C; Catalyst = 15 mol / g of ricinoleic acid; Speed = 600 rpm). The only disadvantage found of this synthesis process was the cost of the catalyst used. After the factorial design eight semi-synthetic metalworking fluids were formulated with the synthesized alkanolamides and two with the corrosion inhibitor conventionally used. After checking the thermal stability of these fluids, the corrosion inhibition efficiency was measured by staining technique of cast iron. Fluids containing alkanolamides performed better corrosion inhibition, however, was not possible to measure quantitatively the differences observed using this technique. Thus, the compounds were subjected to weight loss and potentiodynamic polarization tests in hydrochloric acid, besides the atomic microscopy to evaluate the effect of the inhibitors on the metal surface. Through these studies it was possible to demonstrate that RDIPA and RAEPD products were more efficient at inhibiting corrosion. The mechanism of inhibition of these compounds, as determined by Langmuir isotherms, is by physisorption. After checking the anticorrosive properties of the synthesized compounds, the following properties were analyzed from the formulated fluids: viscosity, foaming, contact angle, Reichert friction, alkalinity and microbiological contamination. It was observed an increase in viscosity and foaming on the concentrated fluids. However, it was found that there is no significant impact of these properties during the application of these fluids. Alkanolamides enabled an increase in lubricity and alkalinity of the formulated fluids. Additionally they reduced the corrosion rate and the susceptibility of fluids to microbiological contamination, and would make easier the treatment of the waste generated in cutting process due to their higher biodegradability.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karine_Zachow.pdf: 505370 bytes, checksum: d13cb696c6352796268e8e885343e6aa (MD5) Previous issue date: 2011-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Tomato (Lycopersicon esculentum Mill) is subject to chilling injury during cold storage. The application of calcium and plant growth regulators in post-harvest may help to reduce a number of physiological disorders on fruits. In this work were verified the influence of the application in post-harvest of the five treatments: control, without heat shock; only heat shock; heat shock + Ca 2 %; heat shock + GA3 100 mg L-1; and heat shock + Ca 2 % + GA3 100 mg L-1, associated with hydrothermal treatment (45 °C) for 12 min of immersion in the response of tomato to the "chilling" and check the physical and chemical composition, the bioactive compounds and enzyme activity of the fruit. The fruits were stored at 5 °C and relative humidity of 80 % for a period of ten days. The evaluations were made ten days after removal of the fruits of the cooling conditions. The design was completely randomized with five treatments and five repetitions, each repetition being characterized by a fruit. Was applied to the ANOVA results, and when the parameter was significant, the averages were compared by Tukey test, at 5 % probability. The use of heat shock treatment was effective in reducing pathogens in tomato fruits after cold storage. Treatment with heat shock + Ca 2 % + GA3 100 mg L-1 was the best among the rest, because it provided a higher concentration of ascorbic acid, as well as β-carotene and total phenols in the fruits treated and caused a reduction in the incidence of pathogens. The use of GA3 showed better results compared to Ca, when combined with heat shock, the fruits response to the effects of cold storage, requiring further investigation in this direction / O tomate (Lycopersicon esculentum Mill) está sujeito a danos causados pelo frio ( chilling ) durante o armazenamento refrigerado. A aplicação, em pós-colheita, de cálcio e reguladores vegetais, bem como do uso de tratamento hidrotérmico, pode contribuir para reduzir vários tipos de desordens fisiológicas nos frutos. Neste trabalho, verificou-se a influência da aplicação, pós-colheita, de cinco tratamentos, sendo eles: controle, sem choque térmico; apenas choque térmico; choque térmico + Ca 2 %; choque térmico + GA3 100 mg L-1; e choque térmico + Ca 2 % + GA3 100 mg L-1, associada ao tratamento hidrotérmico (45 ºC) por 12 min de imersão, na resposta do tomate ao chilling , verificando a composição físico-química, os compostos bioativos e atividade enzimática dos frutos. Os frutos foram armazenados a 5 ºC e umidade relativa de 80 % por um período de dez dias. As avaliações foram efetuadas dez dias após a retirada dos frutos das condições de refrigeração. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e cinco repetições, sendo cada repetição caracterizada por um fruto. Aos resultados aplicou-se ANOVA, e quando o parâmetro foi significativo, suas médias foram comparadas pelo Teste de Tukey, ao nível de 5 % de probabilidade. O uso do tratamento com choque térmico foi eficiente na redução de patógenos nos frutos de tomate após o armazenamento com frio. O tratamento com choque térmico + Ca 2 % + GA3 100 mg L-1 foi o melhor entre os demais, pois proporcionou maior concentração de ácido ascórbico, bem como de β-caroteno e fenóis totais nos frutos tratados e proporcionou redução da incidência de patógenos. O uso do GA3 apresentou melhores resultados comparado ao Ca, quando combinados ao choque térmico, na resposta dos frutos aos efeitos do frio durante a armazenagem, necessitando de maiores investigações neste sentido

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sidiane_Coltro.pdf: 604676 bytes, checksum: eccb769c94921f8082441892d38b80d7 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The strawberry is a fruit that is highly perishable and are very susceptible to physical damage and fungal attack. The use of fungicides has been the primary method for reducing post-harvest diseases. Accordingly, alternative methods free of chemicals must be used in post-harvest to maintain the quality and prolong the life reduce the incidence of fungi. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of heat treatment and post-harvest salicylic acid in the response of strawberry-related activities of the enzymes polyphenol oxidase and peroxidase, the contents of total phenols, anthocyanins and ascorbic acid and the incidence of pathogens during storage of fruits. This study was divided into two experiments. In the first experiment, Dover strawberries were treated thermally in an oven at 45°C for 3 hours and stored at 5°C for 1, 7 and 14 days and analyzed. After these periods, the fruit were removed and transferred to the cooling environment at 20°C for 2 days to be analyzed again. We used a completely randomized in factorial scheme (2x6), with 12 treatments and four replicates of 10 berries per tray. In the second experiment, strawberries Dover were heat treated in an oven with forced air at 45°C for 3 hours and after immersed in a solution of salicylic acid 2.0 mM L-1 for 5 minutes; then they were stored under refrigeration (5°C) and after 1,7 and 14 days and transferred to a room at 20°C for 2 days and the be analyzed. The design was completely randomized in factorial scheme (4x3), with 12 treatments and four replications. Were evaluated the activity of polyphenoloxidase, peroxidase, phenylalanine ammonia-lyase, the incidence of fungi, total phenols, anthocyanins, ascorbic acid, pH, titratable acidity, soluble solid and weight loss. It was found that the metabolism postharvest Dover cv. strawberry has been modified by application of heat treatment, because the results showed that the activity of polyphenoloxidase, peroxidase and phenylalanine ammonia-lyase and ascorbic acid, total phenols and anthocyanins, and the incidence of fungi were lower in heat-treated strawberries. The heat treatment resulted in higher acidity, higher soluble solids and lower mass loss. The heat treatment is not provided, according to the incidence of fungi and weight loss, increased shelf life of strawberries, being limited to seven days of storage. However, the addition of salicylic acid to heat treatment was less effective than other treatments for most variables, indicating that it is disadvantageous. However, heat shock alone was more effective in reducing the activity of peroxidase, polyphenoloxidase showed lower activity compared to the control at 7 +2 days and did not differ from other treatments at 14 +2 days, was effective in maintaining high levels phenolic compounds, anthocyanins and ascorbic acid up to 7 +2 days / O morango é um fruto que apresenta alta perecibilidade e, são bastante suscetíveis a danos físicos e ataque de fungos. O uso de fungicidas químicos tem sido o principal método para reduzir as doenças pós-colheita. Nesse sentido, métodos alternativos livres de produtos químicos devem ser utilizados em pós-colheita para manter a qualidade, prolongar a vida útil e diminuir a incidência de fungos. Assim, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do tratamento térmico pós-colheita e do ácido salicílico na resposta do morango relacionada à atividade das enzimas polifenoloxidase e peroxidase, aos conteúdos de fenóis totais, antocianinas e ácido ascórbico e à incidência de patógenos durante o armazenamento dos frutos. Este estudo foi dividido em dois experimentos. No primeiro experimento, morangos cultivar Dover, foram tratados termicamente em estufa a 45°C por 3 horas e armazenados a 5 ºC por 1, 7 e 14 dias e analisados. Após esses períodos, os frutos foram retirados da refrigeração e transferidos para ambiente a 20 ºC por 2 dias para serem analisados novamente. Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial (2x6), com 12 tratamentos e quatro repetições com 10 morangos por bandeja. No segundo experimento, morangos cultivar Dover foram tratados termicamente em estufa com circulação forçada de ar com 45°C por 3 horas e depois imergidos em solução de ácido salicílico 2,0 mMol L-1 por 5 minutos, depois foram armazenados sob refrigeração (5°C) e após 1, 7 e 14 dias foram transferidos para ambiente a 20 ºC por 2 dias para então serem analisados. O delineamento foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial (4x3), com 12 tratamentos e quatro repetições. Foram avaliados a atividade de polifenoloxidase, peroxidase, fenilalanina amônia-liase, incidência de fungos, fenóis totais, antocianinas, ácido ascórbico, pH, acidez titulável, sólidos solúveis e perda de massa. Foi constatado que, o metabolismo pós-colheita de morangos cv. Dover foi modificado pela aplicação de tratamento térmico, pois os resultados mostraram que a atividade de polifenoloxidase, peroxidase e fenilalanina amônia-liase e os teores de ácido ascórbico, fenóis totais e antocianinas e a incidência de fungos foram inferiores em morangos tratados termicamente. O tratamento térmico resultou em maior acidez titulável, maior teor de sólidos solúveis e menor perda de massa. O tratamento térmico não proporcionou, segundo a incidência de fungos e a perda de massa, aumento da vida útil dos morangos, ficando limitado aos sete dias de armazenamento refrigerado. Entretanto, a adição de ácido salicílico ao tratamento térmico, se mostrou menos efetivo que os demais tratamentos para a maioria das variáveis analisadas, indicando ser desvantajoso. Porém, o choque térmico isolado mostrou-se mais efetivo em reduzir a atividade de peroxidase, apresentou atividade inferior de polifenoloxidase comparado ao controle aos 7+2 dias e não diferiu dos demais tratamentos aos 14+2 dias, se mostrou efetivo em manter níveis elevados de compostos fenólicos, antocianinas e ácido ascórbico até 7+2 dias

A melatonina é uma indolamina produzida e secretada pela glândula pineal. O objetivo do presente estudo foi verificar em ratos Wistar o efeito da pinealectomia na expressão gênica e atividade das enzimas antioxidantes no córtex pré-frontal, fígado e sóleo utilizando para este fim animais controles, pinealectomizados e pinealectomizados repostos com melatonina. Os animais foram sacrificados 60 dias após a cirurgia em 4 pontos distribuídos ao longo do dia. A expressão gênica da glutationa peroxidase (GPx), catalase (Cat) e SOD 1 e 2 foram avaliadas por qPCR e a atividade enzimática da GPx e da Cat por espectrofotometria. Foi detectada uma redução na expressão do RNAm da GPx no sóleo de animais pinealectomizados no ZT18 e uma atividade aumentada da mesma enzima no animal pinealectomizado no ZT6. No córtex pré-frontal foi detectado um aumento de atividade da GPx em animais pinealectomizados no ZT24. Conclui-se que a ausência de melatonina altera o padrão de expressão da GPx no sóleo e provoca um aumento na atividade da mesma enzima no córtex pré-frontal e no sóleo. / Melatonin is an indolamine synthesized and secreted by the pineal gland during the night. The purpose of this study was to investigate the effect of pinealectomy on gene expression and activity of antioxidant enzymes in the prefrontal cortex, liver and soleus muscle using for this purpose control, pinealectomized and melatonin-treated pinealectomized rats. The animals were sacrificed 60 days after surgery. Glutathione peroxidase (GPx), catalase (Cat) and SOD 1 and 2 gene expression was evaluated by qPCR and GPx and Cat enzyme activity was assessed by spectrophotometry. A reduction of GPx mRNA expression was found in the soleus muscle of pinealectomized animals at ZT18 and an increased activity of the same enzyme at ZT6 was observed in this group compared to control. The prefrontal cortex presented an increased activity of GPx in the pinealectomized animals at ZT24. We conclude that the absence of melatonin alters the expression pattern of GPx in the soleus muscle and causes an increase in the activity of the same enzyme in the prefrontal cortex and soleus.

A necessidade de economias sustentáveis tem aumentado o interesse no desenvolvimento de plataformas microbianas para novos processos, tanto para a produção de biocombustíveis quanto para a síntese de compostos que demandam alta capacidade energética e processamento químico em sua produção. O isolamento de microrganismos, capazes de degradação materiais lignocelulósicos, resistentes a diferentes inibidores e com rendimento elevado na biossíntese de moléculas específicas faz-se necessário para atender tais propósitos. Neste trabalho, microrganismos cultiváveis isolados do trato digestivo de larvas dos insetos pragas de cana-de-açúcar, besouro da raiz, Migdolus fryanus, bicudo da cana, Sphenophorus levis, broca-gigante da cana, Telchin licus licus e de broca-da-cana, Diatraea saccharalis, foram caracterizados quanto a atividade enzimática em fontes de carbono e identificados por técnicas moleculares. Larvas no terceiro ínstar de M. fryanus e S. levis e quinto ínstar de T. licus licus e D. saccharalis foram coletadas em plantios de cana-de-açúcar no interior de São Paulo. Um total de 341 microrganismos cultiváveis foram avaliados quanto a capacidade de degradação de substratos lignocelulósicos, como única fonte de carbono em meio sólido usando o índice de atividade enzimática (I.E.). Os isolados foram identificados por sequênciamento das regiões do 16S rRNA para bactérias, ITS rDNA para fungos e 26S rDNA para leveduras. Bactérias com atividade enzimática foram relacionadas aos gêneros do filo Firmicutes Bacillus, Enterobacter Serratia e Citrobacter. Os isolados relacionados à B. amyloliquefaciens destacaram-se na degradação da celulose. Entre fungos filamentosos, leveduras e leveduriformes, a atividade enzimática foi destacada para a degradação da hemicelulose. Fungos filamentosos e leveduras pertencem ao filo Ascomycota e os leveduriformes ao filo Chlorophyta. Fungos que apresentaram hidrólise de xilano foram relacionados aos gêneros Pyrenophora, Aspergillus e Penicillium. As leveduras relacionam-se a nove gêneros, majoitariamente aos gêneros Meryerozyma e Candida. Leveduras com capacidade hidrolítica destacada foram relacionadas à Meyerozyma guilliermondii, Cryptococcus laurentti, Candida pseudointermedia, C. parapsilosis, C. solani e Aureobasidium pullulans. Entre as leveduras, 40 isolados apresentam sequências que diferem em mais de 1% das sequências referência, podendo-se inferir a respeito de possíveis novas espécies. No ensaio cinético, realizado para a triagem de leveduras com capacidade de bioconversão da D-xilose em xilitol e etanol, o maior rendimento em xilitol foi demonstrado pelo microrganismo relacionado à Prototheca zopfi var. hydrocarbonea. A capacidade desse organismo de produzir xilitol não havia sido descrita. Os resultados obtidos nesse trabalho, revelaram que o trato digestivo das pragas de cana-de-açúcar como uma fonte de microrganismos que apresentam capacidade de degradação enzimática para celulose e xilano cujo potencial para utilização na biotecnologia industrial ainda precisa ser revelado / The pursuit for sustainable economies has increased the interest in development of microbial-based platforms for new processes, both for biofuel production and for the synthesis of compounds, which demands high energetic capacity and chemical processing in its production. The isolation of microorganisms capable of degradation of lignocellosic materials, resistant to different inhibitors and highly efficient in the biosynthesis of specific molecules is necessary to achieve such purposes. In this research, cultivable microorganisms isolated from the larval gut of sugarcane pests: sugarcane borer root Migdolus fryanus, sugarcane weevil Sphenophorous levis, giant sugarcane borer Telchin licus licus and sugarcane borer Diathrea saccharalis, were characterized according to their extracellular enzymatic activity in carbon sources and molecularly identified. Third-instar larvae of Migdolus fryanus and S. levis and fifth-instar larvae of T. licus licus and D. saccharalis were collected in sugarcane fields in São Paulo, Brazil. A total number of 341 strains were evaluated for their capacity of degradation of lignocelulitic substrates, as single carbon sources in solid medium. The enzymatic activities of the strains were estimated by Enzymatic Activity Index (EAI); further, the strains were molecularly identified by sequencing of the 16S rRNA region for bacterias; ITS rDNA region for filamentous fungi and 26S rDNA region for yeasts. Bacteria strains which presented enzymatic activity were related to Firmiculites genera Bacillus, Enterobacter, Serratia and Citrobacter. Strains related to B. amyloliquefaciens have demonstrated higher levels of cellulosic degradation. Among filamentous fungi, yeasts and yeast-like organisms higher activity was showed to degradation of hemicelluloses. Filamentous fungi and yeasts belong to phylum Ascomycota, and the yeast-like organisms to phylum Chlorophyta. Six filamentous fungi which presented higher hidrolisys of xylan were related to Pyrenophora, Aspergillus and Penicillium genera. Yeasts were related mostly to the Meryerozyma and Candida genera. Yeasts with higher hydrolysis cababilities were reated to Meyerozyma guilliermondii, Cryptococcus laurentti, Candida pseudointermedia, C. parapsilosis, C. solani e Aureobasidium pullulans. Among the yeasts, 40 strains showed sequences that differ by more than 1% from reference sequences, which allows infering about possible new species. In the kinetic assay carried out for screening for yeasts capable of bioconverting D-xylose into xylitol and ethanol, higher yields of xylitol were obtained for the yeast-like organism related to Prototheca zopfi var. hydrocarbonea. This microorganism\'s ability to produce xylitol had not been reported yet. The results obtained in this work have demonstrated the gut of sugarcane pests as source of microorganisms capable of enzymatic degradation of cellulose and xylan, whose potential for use in the industrial biotechnology has yet to be revealed.

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Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Adilson Bosetto 2015 PDF.pdf: 2419034 bytes, checksum: 3fdc9e711199e04fe0746f89b07c4bea (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / The application of enzymes in industrial processes, in its broad sense, has shown the market evolution for innovative alternatives for preserving the environment. Brazil has a great potential to develop some technologies, which allow the use of such materials as substratum for products with higher added value, due to the large amount of lignocellulose as waste that comes from agriculture. Therefore, the analysis of genes expression related to microbial degradation of plant cell wall has caught the researchers attention, mainly because it is associated to the possibility of controlled large-scale synthesis of enzymes applied in biofuel production. In this context, the Gram-negative bacterium C. crescentus is found as a promising microorganism for biotechnological exploitation due to its ability on degrading xylan, the major component of plant hemicellulose. There are several genes in the bacterial genome that codify to Xylanases and β-Xylosidases. In order to purify and biochemically characterize the β-Xylosidase III protein of C. crescentus, xynB3 gene (CCNA_00856) that contains 1,623 nucleotides and encodes a protein with conserved domains of β-Xylosidase with 540 amino acid residues has been studied. Therefore, xynB3 gene was isolated from genomic DNA of C. crescentus NA1000 by Polymerase Chain Reaction (PCR) using specific primers. The single amplification product was cloned into pJet1.2Blunt vector in non-cohesive sites and reintroduced in vector of pTrcHisA expression within the reading frame to produce a histidine tag at the amino-terminus area of fusion protein. The obtained construction was denominated pTrcHis-xynB3 and the confirmation of its gene identification was figured out by the DNA sequence after insertion into the TOP10 E. coli strain and subsequent experimental tests of expression in different temperature of growth, IPTG concentrations and induction times. The recombinant protein was overexpressed into inclusion bodies, thus, in a non-soluble form. Different induction and purification protocols were used to obtain the β-xylosidase III pure of C. crescentus, in native or non-native form. However, assays of enzymatic activity with different substrates neither demonstrated β-xylosidase activity nor detectable levels of the protein. These results suggest that the enzyme was not active during the assays, due its expression in inclusion bodies. This suggests that this protein may have a toxic effect on E. coli when expressed at high levels. Thus, this trial contributes to additional data about the xylanolytic complex concerning the aquatic bacterium C. crescentus. / A utilização de enzimas em processos industriais, no seu sentido mais amplo, demonstra a evolução do mercado em relação a alternativas inovadoras de preservação do meio ambiente. Devido à grande quantidade de material lignocelulósico residuário, proveniente da agricultura, o Brasil é um país com elevado potencial para o desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a utilização desses materiais como substrato para produtos de maior valor agregado. Dessa forma, o estudo da expressão de genes microbianos relacionados com a degradação da parede celular vegetal tem despertado a atenção de pesquisadores, principalmente pelo fato de estar relacionado com a possibilidade de síntese controlada e em larga escala de enzimas utilizadas na produção de biocombustíveis. Neste contexto, a bactéria gram-negativa Caulobacter crescentus encontra-se como um microrganismo promissor para a exploração biotecnológica em função da capacidade que tem de degradar o xilano, principal componente hemicelulósico das plantas. Essa bactéria contém em seu genoma vários genes que codificam para xilanases e β-xilosidases. Dentre eles o gene xynB3 (CCNA_00856), que apresenta 1623 nucleotídeos e codifica uma proteína contendo domínios conservados de β-xilosidase, com 540 resíduos de aminoácidos, denominada neste trabalho como β-xilosidase III de C. crescentus. Com o objetivo de possibilitar em estudos futuros a caracterização bioquímica dessa proteína, foi estudado o gene xynB3. Para isso, xynB3 foi isolado a partir do DNA genômico de C. crescentus NA1000 por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos específicos. O único produto de amplificação foi clonado no vetor pJet1.2blunt em sítios não coesivos e reintroduzido no vetor de expressão pTrcHisA dentro do quadro de leitura para a produção de uma cauda de histidinas na região amino-terminal da proteína de fusão. A construção obtida foi denominada pTricHis-xynB3 e após confirmação da identidade da mesma por sequenciamento de DNA foi inserida na cepa TOP10 de Escherichia coli e submetida a ensaios experimentais de expressão com diferentes temperaturas de crescimento, concentrações de IPTG e tempos de indução. A proteína recombinante foi super-expressa em corpos de inclusão, portanto, em uma forma não solúvel. Diferentes protocolos de indução e purificação foram empregados para obtenção da β-xilosidase III de C. crescentus pura, em forma nativa ou não nativa. Entretanto, nos ensaios de atividade enzimática, com diferentes substratos, foram obtidos níveis de atividade de β-xilosidase não detectáveis pelas ferramentas utilizadas. Esses resultados sugerem que a enzima não se mostrou ativa durante os ensaios, em função da formação de corpos de inclusão. Isso leva a crer que essa proteína pode apresentar efeito tóxico para E. coli quando expressa em níveis elevados. Assim, este trabalho contribui com dados adicionais a cerca do complexo xilanolítico da bactéria aquática C. crescentus.