Submitted by Suelen Cristina Nunes Alves (suelen_cris88@yahoo.com.br) on 2018-05-30T16:50:57Z No. of bitstreams: 1 SuelenCristinaNunesAlvesTeseRevisada.pdf: 2888189 bytes, checksum: 543ba9a57a76662fdd1500ad5ee48e03 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-05T18:24:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alves_scn_dr_jabo.pdf: 2888189 bytes, checksum: 543ba9a57a76662fdd1500ad5ee48e03 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-05T18:24:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alves_scn_dr_jabo.pdf: 2888189 bytes, checksum: 543ba9a57a76662fdd1500ad5ee48e03 (MD5) Previous issue date: 2018-04-04 / O níquel (Ni) é um metal de ocorrência natural em rochas magmáticas. Pode ser adicionado ao solo por ações antrópicas, como a agricultura, disposição de resíduos industriais e deposições atmosféricas. Este elemento satisfaz critérios de essencialidade para as plantas, mas é considerado tóxico em altas concentrações. A hipótese deste trabalho é: doses variadas de Ni na forma de Ni(NO3)2 e Ni2O3 contribuem para maior absorção de Ni por plantas de sorgo e causam efeitos nas atividade biológicas e enzimáticas do solo. A degradação de plantas de sorgo contaminadas em solo que não foi adicionado Ni(NO3)2 e Ni2O3 não causam efeitos na atividade biológica e enzimática. O experimento foi instalado em casa de vegetação localizada no departamento de Tecnologia da FCAV/UNESP – Jaboticabal. O solo utilizado foi o Latossolo Vermelho distrófico (LVd). O experimento foi conduzido em duas etapas. A primeira etapa diz respeito ao desenvolvimento de plantas de sorgo em solo contaminado por Ni(NO3)2 e Ni2O3. O delineamento experimental foi o fatorial 2 x 3 +1. Nessa etapa foram testadas 2 fontes de Ni [Ni(NO3)2 e Ni2O3] em 3 doses, com 3 repetições, mais um tratamento controle com adubação mineral sem níquel. As doses de Ni foram 35, 70 e 140 mg kg-1 solo. Nesta etapa foram realizadas análises de Ni pseudototal e extraível, Ni nas folhas diagnose, planta inteira e grãos, assim como, quantificação do carbono na biomassa microbiana, respiração basal do solo, hidrólise do diacetato de fluoresceína e cálculo de quociente metabólico, além da produtividade da cultura. A contaminação do solo com Ni(NO3)2 e Ni2O3 influencia as atividades biológica e enzimática, pois provocou estresse na comunidade microbiana. O Ni(NO3)2 ocasionou maior absorção de Ni na planta e a absorção dos elementos Cu, Zn, Mn e Mg também foi influenciada pelo Ni no solo. A produtividade foi menor no tratamento com plantas contaminadas. A segunda etapa foi desenvolvida em delineamento experimental inteiramente casualizado, em que foi avaliada a liberação de Ni pela biodegradação das plantas de sorgo, e sua influência do Ni nas atividades biológica e enzimática do solo no decorrer do tempo, com 4 tratamentos e 5 repetições. Foram adotados os tratamentos, todos com o mesmo solo: controle absoluto sem plantas (CABS), controle com plantas não contaminadas com Ni (CONT), plantas contaminadas com Ni(NO3)2 (NN) e Ni2O3 (OX). Foram realizadas amostragens aos 0, 15, 30, 60 e 120 dias após a instalação do experimento, para verificar as mudanças no decorrer do tempo. Foram analisados o níquel extraível, o carbono na biomassa microbiana e a hidrólise do diacetato de fluoresceína. / Nickel (Ni) is a naturally occurring metal in magmatic rocks. Can be added to the soil by anthropogenic actions, such as agriculture, industrial waste disposal and atmospheric deposition. This element satisfies criteria for essentiality to the plants, but is considered toxic at high concentrations. The hypothesis of this paper is: varied doses of Ni in the form of Ni(NO3)2 and Ni2O3 contribute to greater absorption of Ni for sorghum plants and cause effects on biological and enzyme activity of soil. The degradation of sorghum plants contaminated in soil that has not been added Ni(NO3)2 and Ni2O3 do not cause effects on biological and enzyme activity. The experiment was installed in greenhouse located in the Department of technology of UNESP/FCAV-Jaboticabal. The soil used was Red Latosol distrófic (LVd). The experiment was conducted in two stages. The first stage concerns the development of sorghum plants in contaminated soil by Ni(NO3)2 and Ni2O3. The experimental design was factorial 2 x 3 +1. In this step 2 Ni sources were tested [Ni(NO3)2 and Ni2O3] into 3 doses, with 3 replications, more control treatment with mineral fertilization without nickel. The doses of Ni were 35, 70 and 140 mg kg-1 soil. Analyses were performed at pseudototal and extractable Ni, Ni on diagnosis, entire plant and grain, as well as quantification of microbial biomass carbon, soil basal respiration, hydrolysis of fluorescein diacetate and calculation of Metabolic Quotient, in addition to the productivity of the crop. Soil contamination with Ni(NO3)2 and Ni2O3 influences the biological and enzymatic activities, because it caused stress on microbial community. The Ni(NO3)2 caused increased absorption of Ni in the plant and the absorption of the elements Cu, Zn, Mn and Mg was also influenced by Ni in soil. Productivity was lower in the treatment with contaminated plants. The second step was developed in completely randomized experimental design, in which it was evaluated the release of Ni by the biodegradation of sorghum plants, and your influence of biological and enzymatic activities Ni of the soil over time, with 4 treatments and 5 repetitions. The treatments were adopted, all with the same soil: absolute control without plants (CABS), with control plants contaminated with Ni (CONT), contaminated plants with Ni(NO3)2 (NN) and Ni2O3 (OX). Samplings were carried out at 0, 15, 30, 60 and 120 days after installation of the experiment, to check the changes over time. We analyzed the extractable nickel, carbon in microbial biomass and fluorescein diacetate hydrolysis.

RABELO, Marcela Cristina. Termoestabilidade de enzimas dos sucos de graviola e caju. 2012. 55 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-06T13:36:23Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_mcrabelo.pdf: 879949 bytes, checksum: 07273017644edc43fb0362c7a1ec8c7e (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-21T19:23:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_mcrabelo.pdf: 879949 bytes, checksum: 07273017644edc43fb0362c7a1ec8c7e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T19:23:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_mcrabelo.pdf: 879949 bytes, checksum: 07273017644edc43fb0362c7a1ec8c7e (MD5) Previous issue date: 2012 / The industrialization of fruit into juices aims to maintain its sensorial and nutritional characteristics as similar as possible to in natura produce, besides ensuring the microbiological safety. However, processing and storage of fruit juice triggers a range of complex biochemical reactions that may lead to losses of desirable or development of unpleasant flavors. Enzymes such as peroxidases and pectinases may compromise the quality and shelf-life of juices and therefore should be inactivated. This work´s objective was to evaluate the thermostability of enzymes from cashew apple and soursop juices. Juices were prepared as ripe soursop pulp was homogenized with a domestic blender and diluted in water distilled (1:1) meanwhile, ripe cashew apples were expeller-pressed. The juices were submitted to different thermal treatments (55, 65, 75, 85 and 95 °C) for different periods of times (1, 3, 5, 10, 15, 20 and 30 min) and then, evaluated for activity of enzymes: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate (APX) and guaiacol (G-POD) peroxidases, pectinamethylesterase (PME) and polygalacturonase (PG). For the cashew juice, SOD activity was highly resistant to thermal treatments as the exposure to 95 °C initially decreased its activity followed by a recovery and maintenance of 74% of residual activity, after 30 min. APX residual activity initially declined under all temperatures tested, but then increased, especially at 55 °C. PME from cashew juice was thermoresistant as the 55 °C treatment increased its activity 10-fold and the greater temperatures did not differ from control. PG and PME presented similar thermostability patterns as the lower tested temperatures stimulated their activities and the higher temperatures did not alter them. For the soursop juice, the 85 and 95 °C treatments totally inactivated SOD, after 3 min. The G-POD was inactivated after 1 min, at 65 °C. The PME was thermolabile and treatment at 95 °C caused the greatest reduction in activity, 39%, after 30 min. Treatments at 95 and 85 °C led to the greatest inactivation of PG to 26 and 18%, respectively, after 30min. The enzymes from cashew apple juice were more resistant to heating than those from soursop juice, indicating that characteristics particular to each fruit species and the different preparation methods influenced their thermostability. As a conclusion, the treatment at 75 °C for 30 min was considered optimum for cashew juice enzyme inactivation, whereas 55 °C for 30 min was efficient for the soursop juice in reducing significant amounts of the residual activity of enzymes that would lead to quality loss without compromising the activity of desirable enzymes. / A industrialização de produtos alimentícios visa à obtenção de produtos com características sensoriais e nutricionais próximas ao produto in natura e que sejam seguros sob o ponto de vista microbiológico. Nas operações de processamento e durante o armazenamento de suco de frutas ocorrem transformações que podem resultar em perdas ou aparecimento de sabor e aroma desagradáveis devido a várias reações bioquímicas complexas entre seus constituintes. Enzimas, como as peroxidases e as pectinases podem comprometer a qualidade e tempo de vida útil dos sucos, devendo, portanto, ser inativadas durante as etapas do processamento. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento térmico sobre a atividade de enzimas nos sucos de caju e graviola. Polpas de graviola madura foram homogeneizadas em aparelho liquidificador doméstico e diluídas em água destilada na proporção de 1:1, para a obtenção do suco. Já o suco de caju foi preparado a partir da prensagem de pedúnculos maduros. Os sucos foram tratados com diferentes temperaturas (55, 65, 75, 85 e 95 °C) por diferentes tempos (1, 3, 5, 10, 15, 20 e 30 minutos) e então avaliados quanto à atividade das enzimas dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidases do ascorbato (APX) e guaiacol (G-POD), pectinametilesterase (PME) e poligalacturonase (PG). Para o suco de caju, observou-se que a SOD apresenta uma elevada resistência a altas temperaturas, de modo que a exposição a 95 °C resultou em decréscimo em sua atividade residual no primeiro minuto e depois, em uma recuperação e manutenção da atividade até os 30 min, quando houve então um declínio para 74%. A atividade residual da APX sofreu um declínio no primeiro minuto de todos os tratamentos aplicados, seguido de um aumento principalmente a 55 °C. A PME de suco de caju mostrou-se termorresistente como pode ser observado pelo tratamento a 55 °C que aumentou sua atividade em até 10 vezes e os demais tratamentos não provocaram grandes alterações na atividade da PME em relação ao controle. Os resultados encontrados para a PG se assemelham aos encontrados para a PME, quando as temperaturas mais baixas estimularam a atividade e de modo geral, o aquecimento nas condições empregadas não reduziu sua atividade. Para o suco de graviola, o tratamento a 85 e 95 °C resultou em total inativação da SOD, após 3 min. A G-POD foi inativada em a partir de 1 min a 65 °C. A PME do suco de graviola se apresentou susceptível ao aquecimento e o tratamento a 95 °C apresentou a maior redução em sua atividade caindo para 39%, após 30 min. As temperaturas de 85 e 95 °C resultaram na maior inativação da PG que apresentou atividade residual de 26 e 18% após 30 min, respectivamente. De um modo geral, as enzimas provenientes do suco de caju mostraram-se mais termorresistentes do que aquelas provenientes do suco de graviola, o que indica que a origem e as características da solução onde tais enzimas estão inseridas influenciam em sua termoestabilidade. Como conclusão para o suco de caju, o tratamento a 75 °C por 30 min foi considerado o melhor, enquanto que para o suco de graviola, o tratamento a 55 °C por 30 min mostrou-se já eficiente em reduzir a atividade residual de enzimas que levariam a uma depreciação do suco sem comprometer a atividade de enzimas desejáveis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-21T10:29:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 533850 bytes, checksum: d669e4c3ba80d7e72b17ab931cfde38e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-21T10:29:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 533850 bytes, checksum: d669e4c3ba80d7e72b17ab931cfde38e (MD5) Previous issue date: 2016-05-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Foram utilizados 720 frangos de corte machos sexados da linhagem Cobb® em dois experimentos para avaliar níveis de selênio de fonte orgânica (SeO) em rações para frangos de corte, no período de 1 a 46 dias de idade, mantidos em ambiente de terrmoneutralidade e de alta temperatura. Em cada experimento 360 aves foram distribuídas em delineamento experimental inteiramente casualizado com cinco tratamentos (uma ração controle com 0,30 ppm de selênio de fonte inorgânica (SeI) na forma de selenito de sódio e quatro rações com SeO), oito repetições e nove aves por unidade experimental. Os níveis de SeO nas rações experimentais foram: 0,19; 0,30; 0,41 e 0,52 ppm. Aos 21 dias de idade, três aves de cada gaiola, com peso mais distante da média da gaiola (±10%), foram retiradas permanecendo 240 aves em cada experimento. No experimento 1 os pintos com 1 dia de idade e peso inicial de 44 ± 0,11g, foram alojados em câmaras climáticas com temperatura de 31,9 ± 1,09oC e umidade relativa de 65 ± 3,8%, que resultaram em um ITGU calculado de 82 ± 1,4, caracterizando ambiente de termoneutralidade. Não se observou efeito dos níveis de SeO e das fontes de selênio no consumo de ração (CR), ganho de peso (GP) e conversão alimentar (CA) dos frangos de corte de 1 aos 21 e 1 aos 46 dias de idade. Da mesma forma, os níveis de SeO não influenciaram os rendimentos de carcaça, peito, coxa e sobrecoxa das aves aos 46 dias de idade. Os níveis de SeO da ração não influenciaram as atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px), enquanto a suplementação com SeI proporcionou maiores valores nas atividades destas enzimas. Os níveis de SeO da ração, influenciaram de forma quadrática a concentração de glutationa reduzida (GSH) no plasma das aves que diminuiu até o nível estimado de 0,31 ppm. Constatou-se aumento na concentração plasmática da GSH com a suplementação de SeO. Os níveis de SeO não influenciaram os valores de malonaldeído (MDA) no plasma das aves. Por outro lado, a concentração de MDA plasmático aumentou quando se utilizou SeI em relação à fonte orgânica. Não se observou variação nos valores dos hormônios tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) em razão do aumento dos níveis de SeO e da fonte utilizada nas rações dos frangos de corte aos 46 dias de idade. No experimento 2, os pintos com 1 dia de idade e peso inicial de 42 ± 0,12g, foram alojados em câmaras climáticas com temperatura de 34,3 ± 0,63oC e umidade relativa de 65 ± 5,1%, que resultaram em um ITGU calculado de 85 ± 1,0, caracterizando ambiente de alta temperatura. Não foi observado efeito dos níveis de SeO, quanto das fontes de selênio em nenhum dos parâmetros de desempenho, no período de 1 aos 21 dias de idade. No entanto, no período de 1 a 46 dias, enquanto o GP e a CA não foram influenciados pelos níveis de SeO, o CR das aves aumentou de forma quadrática até o nível estimado de 0,35 ppm. O CR no período total, também variou com a fonte de selênio, que foi menor nas aves suplementadas com SeO nas concentrações de 0,19 e 0,52 ppm em relação às que receberam suplementação com SeI. Não se verificou efeito dos níveis de SeO e das fontes de selênio da ração nos rendimentos de carcaça, peito, coxa e sobrecoxa das aves. Com relação aos marcadores oxidativos, constatou- se aumento linear nas atividades das enzimas da SOD e da GSH-Px em razão dos níveis de SeO da ração. Não houve efeito da fonte de suplementação na atividade da enzima SOD. Em contrapartida maior atividade da enzima GSH-Px foi observada no plasma das aves suplementadas com 0,52 ppm de SeO, em relação a fonte inorgânica. Os níveis de SeO influenciaram de forma linear decrescente a atividade da enzima catalase, enquanto a mesma não variou em função da fonte de suplementação. A concentração da molécula glutationa reduzida GSH no plasma dos frangos não foi influenciada pelos níveis e nem pela fonte de selênio utilizada. Os níveis de SeO diminuíram linearmente a concentração do hormônio T3 no soro das aves, enquanto a fonte orgânica proporcionou menores valores de T3 sérico em relação à inorgânica. Conclui-se que o nível 0,19 ppm de selênio de fonte orgânica suplementado na ração, atende a exigência dos frangos de corte e não compromete os constituintes do sistema antioxidantes das aves em ambiente de termoneutralidade e de estresse por calor. / We used 720 sexed male broilers of Cobb® lineage in two experiments to evaluate organic selenium levels (SeO) in diets for broilers, from 1 to 46 days of age kept in terrmoneutralidade environment and high temperature. In each experiment 360 birds were distributed in a completely randomized design with five treatments (one control diet with 0,30 ppm inorganic selenium (SeI) in the form of sodium selenite and four diets with SeO), eight replicates and nine birds per experimental unit. The levels of SeO the experimental diets were: 0,19; 0,30; 0,41 and 0,52 ppm. At 21 days of age three birds, with the longest average weight of the cage (± 10%) were removed from each cage. After this 240 birds remaining in each experiment. In experiment 1 the chickens at 1 day of age and initial weight of 44 ± 0,11g, were housed in climatic chambers with temperature of 31,9 ± 1,09oC and relative humidity of 65 ± 3,8%, which resulted in one BGHI calculated 82 ± 1,4, featuring the thermal neutral environment. There was no effect of SeO levels and sources of selenium (Se) in feed intake (FI), weight gain (WG) and feed conversion (FC) of broilers from 1 to 21 and 1 to 46 days age. Similarly, SeO levels did not influence the carcass yield, breast, thigh and drumstick birds at 46 days of age. The SeO levels in the diet did not affect the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px), while supplementation with SeI provided higher values in the activities of these enzymes. SeO levels of feed, had a quadratic effect the concentration of reduced glutathione (GSH) in plasma of birds rose up to the level of ppm. It found an increase in plasma concentrations of GSH supplementation with SeO. The SeO levels did not influence the values malondialdehyde (MDA) in plasma of birds. On the other hand, the plasma MDA concentration increased when using SeI in relation to the organic source. There was no variation in the amounts of hormones thyroxine (T4) and triiodothyronine (T3) due to the increase of SeO levels and the font used in the feed of broilers at 46 days of age. In experiment 2, chickens at 1 day of age and initial weight of 42 ± 0,12 g, were housed in climatic chambers with temperature of 34,3 ± 0,63oC and relative humidity of 65 ± 5,1%, which resulted BGHI calculated in a 85 ± 1,0, characterizing the high temperature environment. There was no effect of SeO levels and sources of Se in any of the performance parameters evaluated from 1 to 21 days. However, in the period 1- 46 days, while the WG and FC were not influenced by levels of SeO, the FI birds increased quadratically up to the level of ppm. The CR total period also varied with the source of Se, which was lower in birds supplemented with SeO at concentrations of 0,19 and 0,52 ppm in relation to that received supplementation SeI. There was no effect of SeO levels and dietary sources of Se in the carcass, breast, thigh and drumstick of birds. Regarding the oxidative markers, there was a linear increase in the activities of SOD and GSH-Px because of SeO levels in the diet. There was no effect of supplementation source in the SOD enzyme activity. In contrast higher activity of GSH-Px enzyme was observed in plasma of birds supplemented with 0,52ppm SeO, for inorganic source. The levels of SeO influenced decreasing linearly the activity of catalase, while it did not change depending on the supplemental source. The concentration of reduced glutathione GSH molecule in the plasma of chickens was not influenced by the levels nor the selenium source used. The SeO levels linearly decreased the concentration of T3 in serum of birds, while the organic source provided lower serum T3 values relative to the inorganic. It is concluded that the level of 0,19 ppm organic selenium supplemented in the diet, meets the demand of broilers and does not compromise the constituents of the antioxidant system of birds in thermoneutral environment and heat stress.

Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-02-09T12:08:56Z No. of bitstreams: 1 Mestrado_Jorge_Possas.pdf: 2405516 bytes, checksum: 670ec740bf14634ac4f95c8209ae9eb6 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-02-09T12:09:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Mestrado_Jorge_Possas.pdf: 2405516 bytes, checksum: 670ec740bf14634ac4f95c8209ae9eb6 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-02-09T12:09:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Mestrado_Jorge_Possas.pdf: 2405516 bytes, checksum: 670ec740bf14634ac4f95c8209ae9eb6 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-09T12:09:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mestrado_Jorge_Possas.pdf: 2405516 bytes, checksum: 670ec740bf14634ac4f95c8209ae9eb6 (MD5) Previous issue date: 2014 / Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A abordagem do conceito do Erro Total é ferramenta para efetuar validações que apresenta desempenho superior à abordagem clássica, que avalia os componentes de veracidade e precisão isoladamente, e é capaz de identificar deficiências na Exatidão de um modelo de cálculos de resultados de um imunoensaio. O uso do conceito do Erro Total em validação de métodos analíticos é abordagem que incorpora a expressão da soma da veracidade e da precisão. Esse método utiliza ainda os Perfis de Exatidão baseados em intervalos de tolerância (ou intervalos de predição) para decidir se um modelo de calibração dará resultados de qualidade e prevê o controle do risco de aceitar uma metodologia imprópria. Com a finalidade de avaliar o uso dessas ferramentas para: a) decidir qual o modelo de cálculo de curva de calibração de maior exatidão; b) documentar a validação de imunoensaios, foram aplicados o Conceito do Erro Total, os perfis de Exatidão e os Índices de Exatidão no estudo de validação em uso de um ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) para determinar o teor de ovoalbumina em vacinas, fortificando-se as vacinas com três concentrações de ovoalbumina em relação à concentração existente na vacina (5,0μg/0,5mL) na faixa 25 a 300%, testadas em relação à vacina pura. O Estudo de validação em uso demonstrou que, quando utilizado ométodo de cálculo de curva logística de 5 parâmetros, os resultados mostraram-se mais exatos em relação aos outros dois modelos testados. O ensaio apresenta exatidão, precisão, linearidade e veracidade em conformidade ao intervalo de concentrações estudado, e mostrou ser um ensaio confiável para avaliar o teor de ovalbumina. / The Total Error approach is a validation tool that shows superior performance, when compared to the classical analysis, which assesses the trueness and precision components separately, and it is qualified to identify the deficiencies in the accuracy of an immunoassay. The use of the Total Error approachfor validating of analytical methods incorporates the expression of the sum of trueness and precision. This analysis also uses the Accuracy Profiles based on tolerance intervals (or prediction intervals) to determine whether a calibration modelwill provide quality results and to predict the control of risk in accepting an inadequate methodology. In order to evaluate the use of the Total Error, the Accuracy Profiles and the Accuracy Index approaches for validating immunoassays, these tools were used in the in use study of validation of an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for determining the ovalbumin contents in vaccines. It covered the range of 25-300% of a concentration existent on the vaccine (5.0 ug/mL) in relation to the pure vaccine. The in use study validation showed that, by using the five parameters logistic curve for calculating results, this assay demonstrates complying accuracy, precision, linearity and accuracy in the concentration range of 1.25-300μg/0,5mL; and it is a reliable methodology to assess the ovalbumin contents.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:26:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 14.pdf: 930696 bytes, checksum: 4334fa07716ed0ea4227a0d296d9310c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A asparaginase de origem bacteriana é o principal medicamento para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda, um câncer que afeta principalmente as crianças. Apesar de efetivo, o medicamento causa sérias reações imunológicas por ser produzido por um procarioto. Atualmente, o medicamento existente no mercado brasileiro é importado, o que acarreta dependência tecnológica, alto custo na obtenção do medicamento e dificuldade de abastecimento. As asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene ASP3 apresenta, por suas características, potencial para uso como medicamento antileucêmico. Em trabalhos anteriores, este gene foi clonado e expresso em altos níveis na levedura Pichia pastoris. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas e bioquímicas da asparaginase periplásmica recombinante produzida por P. pastoris, tendo sido avaliados as melhores condições de estocagem da enzima após ressuspensão, o efeito de alguns íons e de alguns compostos na atividade asparaginásica, a afinidade da asparaginase pelos substratos D e L-asparagina e L-glutamina e os seus parâmetros cinéticos. Observou-se que a ressuspensão da asparaginase de levedura em água destilada e mantida a 4 °C reteve em torno de 98% da atividade original após 96 horas, na presença de sorbitol 0,1 M, mostrando ser esta a melhor condição de estocagem. Os valores do Km e da Vmáx foram determinados, obtendo-se 2,461 ± 0,170mM e 0,090 ± 0,0017mM min-1, respectivamente. A asparaginase de P.pastoris recombinante apresentou maior afinidade pela D-asparagina, de forma semelhante à asparaginase nativa de S. cerevisiae; e baixa atividade glutaminásica, o que favorece a sua utilização como medicamento pelo menor risco de efeitos tóxicos. O EDTA não apresentou efeito negativo sobre a asparaginase de levedura, indicando não ser a mesma uma metaloenzima. A influência negativa de agentes redutores sobre a atividade enzimática indica a presença de pontes de enxofre na estrutura proteica. Os resultados obtidos são de extrema importância para a continuidade dos estudos da utilização da asparaginase de Pichia pastoris recombinante como agente antileucêmico. / Bacterial asparaginase is the main medicament for the treatment of acute lymphoblastic leukemia, a cancer that primarily affects children. Although effective, the medicine causes serious immunological reactions due to its prokaryotic origin. Currently, the existing drug in the Brazilian market is imported, which carries a technological dependence, high cost and supply difficulties. The asparaginase II of Saccharomyces cerevisiae encoded by the ASP3 gene, given its characteristics, has potential to be used as an antileukemic drug. In previous work, this gene was cloned and expressed at high levels in the yeast Pichia pastoris. The present work aimed to characterize the physicochemical and biochemical properties of the recombinant periplasmic asparaginase produced by P. pastoris, having been assessed the best enzyme storage conditions after resuspension, the effect of some ions and some compounds in asparaginasic activity, asparaginase affinity for yhe substrates D- and L-asparagine and Lglutamine and its kinetic parameters. It was observed that the yeast asparaginase resuspension in distilled water and kept at 4 °C retained about 98% of the original activity after 96 hours in the presence of 0.1 M sorbitol, showing this to be the best storage condition. The values of Km and Vmax were determined to be 2,461 ± 0,170mM e 0,090 ± 0,0017mM min-1, respectively. The recombinant asparaginase showed higher affinity for D-asparagine, similarly to the native S. cerevisiae asparaginase; and low glutaminasic activity, which favors its use as a medicine due to the lower risk of toxic effects. EDTA showed no negative effect on the yeast asparaginase, indicating that it is not a metalloenzyme. The negative influence of reducing agents on the enzymatic activity indicates the presence of sulfur bridges in the protein structure. These results are extremely important for the further studies on the use of the recombinant Pichia pastoris asparaginase as antileukemic agent.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the viability of using diets composed of ingredients of plant and animal origin in the feeding of post-larvae jundiá (Rhamdia quelen) and its influence on the development of animals. Experiments were carried out where it is tested in the first (E1) the total replacement (30%) and partial (15%) of the liver poultry for fish meal (FJ) and / or protein soy concentrate (CPS) on the standard diet containing 30% liver poultry. In the second (E2) substitution levels (5; 10; 15; 20 and 25%) of the liver by FJ and third (E3) of the liver levels for CPS replacement (15, 20, 25 and 30%) supplemented with taurine (CPST). Performance parameters were analyzed (weight, total length, condition factor, specific growth rate, daily weight gain, survival and product weight versus survival), muscle development (fiber diameter, number of fibers / mm² and total number of fibers ) and enzymatic activity (trypsin, chymotrypsin, lipase, amylase and maltase). The best performance of jundiá post-larvae was from 15FJ diets (E1 and E2) and 15CPST (E3). In the muscle development is found larger diameter and total number of fibers with the above mentioned diets. The development of the digestive system was not affected by the diets provided to post-larvae in this study. The enzymes assessed were already present and active at the first feeding. The enzyme activity varied during all experimental periods, with reduced activity of trypsin and chymotrypsin for diets with higher percentages of CPST over those with a lower percentage. According to the results we conclude that the combination of the sources of animal and plant improved the diet, helping improve the development of post-larvae of jundiá. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da utilização de dietas compostas por ingredientes de origem animal e vegetal na alimentação de pós-larvas de jundiás (Rhamdia quelen) e sua influência no desenvolvimento dos animais. Foram realizados três experimentos onde testou-se no primeiro (E1) a substituição total (30%) e parcial (15%) do fígado de aves por farinha de peixe (FJ) e/ou concentrado proteico de soja (CPS) na dieta padrão contendo 30% de fígado de aves. No segundo (E2) níveis de substituição (5; 10; 15; 20 e 25%) do fígado por FJ e no terceiro (E3) níveis de substituição do fígado por CPS (15; 20; 25 e 30%) suplementado com taurina (CPST). Foram analisados parâmetros de desempenho (peso, comprimento total, fator de condição, taxa de crescimento específico, ganho em peso diário, sobrevivência e produto peso versus sobrevivência), desenvolvimento muscular (diâmetro da fibra, número de fibras/mm² e número total de fibras) e atividade enzimática (tripsina, quimotripsina, lipase, amilase e maltase). O melhor desempenho das pós-larvas de jundiá foi a partir das dietas 15FJ (E1 e E2) e 15CPST (E3). No desenvolvimento muscular encontrou-se maiores diâmetros e número total de fibras com as dietas citadas acima. O desenvolvimento do sistema digestório não foi prejudicado pelas dietas fornecidas às pós-larvas neste estudo. As enzimas analisadas já estavam presentes e ativas no momento da primeira alimentação. A atividade das enzimas oscilou durante todos os períodos experimentais, apresentando redução da atividade da tripsina e quimotripsina para as dietas com maiores percentuais de CPST em relação aquelas com menor percentual. De acordo com os resultados concluimos que a combinação das fontes de origem animal e vegetal aprimorou a dieta, contribuindo para melhorar o desenvolvimento das pós-larvas de jundiá.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work aimed to study the enzymatic hydrolysis of malt bagasse, using mechanical agitation, ultrasonic probe and supercritical CO2. Enzymatic hydrolysis was performed on granular starch. For this, was used a commercial amylolytic complex suitable for this type of hydrolysis, STARGENTM 002. For each technology were studied different variables. The first planning was carried out for the hydrolysis assisted by mechanical agitation and the variables studied were temperature (°C), enzyme concentration (%, m/m) and substrate concentration in the medium (m/m). TRS concentrations were found up to 75.5 g per kg of substrate and all variables had a significant effect on the response. This concentration of TRS was defined as mass yield of the process and this yield was corroborated by a kinetic, developed under the same conditions, with slight increase in temperature (70°C). From this initial planning, the temperature variables (70°C), enzyme concentration (8.2%) and substrate concentration (170 g.L-1) were fixed to carry out the hydrolysis assisted by direct and indirect ultrasound. The variables were investigated in the second planning were amplitude (%) and pulse factor (-) for 2 hours of reaction. With the application of direct sonication, it was possible to achieve 100% efficiency in the starch conversion process. The TRS for the best essay (5) was 370.86 g.kg-1. For indirect sonication TRS concentration at the best condition (run 6) was 162.96 g / kg of substrate. A kinetic assay for the best condition under direct sonication was carried out for 3 hours, confirming that the ultrasound increases the reaction rate resulting in better yields in less time compared to the other techniques. For reactions with supercritical CO2 was studied the influence of the moisture content, temperature and pressure, where the best result among all the reactions was using at pressure 175 bar, 40 °C for temperature and moisture content of 80%, resulting in 104.28 g of TRS per kg of dry pulp. Ultrasound showed better results than other technologies investigated in this study. / Este trabalho teve como objetivo estudar a hidrólise enzimática do bagaço de malte, utilizando agitação mecânica, sonda de ultrassom e CO2 supercrítico. A hidrólise enzimática foi realizada sobre o amido granular. Para tanto, foi utilizado um complexo amilolítico comercial próprio para este tipo de hidrólise, STARGENTM 002. Para cada tecnologia foram estudadas diferentes variáveis. O primeiro planejamento foi realizado para a hidrólise assistida por agitação mecânica e as variáveis estudadas foram temperatura (ºC), concentração de enzima (%, m/m) e concentração de substrato no meio (m/m). Foram encontradas concentrações de ART de até 75,5 g por kg de substrato e todas as variáveis apresentaram efeito significativo sobre a resposta. Essa concentração de ART, foi definida como rendimento mássico do processo e este valor foi corroborado com uma cinética, desenvolvida nas mesmas condições do melhor ensaio, com leve aumento apenas na temperatura (70ºC), e indicou valor concernente ao anterior além de provar que o tempo de 4 horas de hidrólise foi suficiente. A partir deste primeiro planejamento, as variáveis temperatura (70°C), concentração de enzima (8,2%) e concentração de substrato (170 g.L-1) foram fixadas para a realização da hidrólise assistida por ultrassom, de forma direta e indireta. As variáveis investigadas neste segundo planejamento foram amplitude (%) e fator de pulso (-) durante 2 horas de reação. Com aplicação de sonicação direta, foi possível alcançar 100% de eficiência no processo de conversão do amido. A resposta encontrada para o melhor ensaio (5) foi de 370,86 g.kg-1. Já com aplicação de sonicação indireta, a eficiência do processo caiu pela metade e o melhor resultado foi para o ensaio de número 6, com concentração de 162,96 g ART/ kg de substrato. Uma cinética para o melhor ensaio de sonicação direta foi desenvolvida durante 3 horas, atestando que o ultrassom aumenta a velocidade da reação resultando no melhor rendimento em menor tempo comparado às outras técnicas. Para as reações com CO2 supercrítico, foi estudada a influência da umidade, da temperatura e pressão, onde o melhor resultado obtido, entre todas as reações, foi com a utilização de pressão de 175 bar, temperatura de 40ºC e 80% de água adicionada ao bagaço, resultando em 104,28 g de ART por kg de bagaço seco. Esse valor corresponde a 11,53% de eficiência da reação de hidrólise do amido em açúcares redutores totais. De um modo geral, os processos obtiveram um bom desempenho na obtenção de açúcares fermentescíveis, destacando-se o ultrassom em relação as demais tecnologias testadas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4562.pdf: 2986258 bytes, checksum: 5fe70b396cc58a5895fb6425b01994bc (MD5) Previous issue date: 2012-08-10 / Agência Nacional de Petróleo / Soybean hull is a lignocellulosic biomass that contains 38-51% of cellulose, which could be converted to ethanol. In addition, contains 9-14% of protein that can be hydrolyzed by endoproteases, releasing oligopeptides with nutritional applications. Although glycoside and peptide linkages can be hydrolyzed by acids, the cellulose molecules are more resistant than the protein and hemicellulose molecules. In this way, the acid treatment of the biomass would reduce its hemicellulose content, and the remnant cellulose into solid fraction would be more susceptible to hydrolytic enzymes. In this work, different routes of protein, hemicellulose, and lignin solubilization were evaluated, intending to obtain ethanol and soluble oligopeptides from the soybean hull. The protein was recovered as oligopeptides by hydrolysis of the lignocellulosic biomass using the commercial endoprotease Novo-Pro DR at 60oC, pH 9.0, 5 h, and different enzyme concentrations (1, 2, and 4%, m/m). A sequential hydrolysis using chymotrypsin and Novo-Pro DR, both at 1% (m/m) enzyme concentration, was also evaluated. The results showed that hydrolysis with 1% Novo-Pro DR allowed solubilization of 56.9% of protein from the soybean hulls. Nonetheless, at same temperature and pH, in absence of enzyme, was possible to solubilized 45.6% of the proteins. This solubilization is probably due to liberation of the physically aggregated units. The increase of endoprotease concentration from 1 to 2% increased the protein removal to 74%. However, the increase from 2 to 4% not increased significantly the protein solubilization. The use of chymotrypsin, an enzyme with high specificity and that work at mild conditions, allowed a solubilization of 44% protein. Nonetheless, the removal of lignin using chymotrypsin was higher than that using Novo-Pro DR. When in-nature soybean hull was hydrolyzed by acid or protease (1% Novo-Pro DR) followed by acid, the protein removal was around of 90%. The lignocellulosic biomass was hydrolyzed with 3% (v/v) H2SO4, solid:liquid ratio of 1:4, 120oC, and 20 min. 20 min. Carbohydrate analyses showed that the acid treatment allowed to hemicellulose removal around of 46.7% in the xylose form. The protein content of the soybean hull was almost totally solubilized during the acid hydrolysis, without significant loss of cellulose. On the contrary, large cellulose loss was observed during the acid hydrolysis of in-nature soybean hull. In this way, if it is intended to produce a protein hydrolysate containing controlled composition or ethanol from remnant solid fraction, is strongly recommended the previous enzymatic solubilization of the proteins. The chemical composition of the solid biomass after sequential hydrolyses with protease and acid showed cellulose content around of 49% for all samples. So, the biomass treated with 1% (m/m) Novo-Pro DR was saccharified with Acellerase 1500 at 50oC, pH 4.8, and enzyme/substrate ratio of 7 FPU/g of cellulose for 72 h. Under the same conditions, soybean hull in-nature, pretreated with acid, and pretreated with protease were submitted to cellulolytic hydrolyses. The cellulose-to-glucose conversion was around of 40% for the last two biomass. The increase of the enzymatic load to 20 FPU/g of cellulose allowed a cellulose conversion of 55% for biomass pretreated with 1% (m/m) Novo-Pro DR, followed by acid hydrolysis. The supplementation of the Acellarase 1500 with 120 IU of β-glucosidase and 1% (m/m) of pectinase not produced any increased in the cellulose conversion. The biomass was pretreated by organossolv method (50% ethanol, 170oC, and 1h) and saccharified with Acellerase 1500 under the same conditions described above. This procedure yielded a cellulose conversion of 52%, with less removal of hemicellulose. This result showed that lignin was causing greater steric hindrances to the enzymatic attack. The biomass pretreated with acid and with protease (1% Novo-Pro D) followed by acid yielded the same glucose-toethanol conversion, reaching an ethanol concentration around of 13 g/L. / A casca de soja, sendo um residuo lignocelulosico, contem celulose (38-51%) que pode ser convertida a etanol. Alem disso, contem 9-14% de proteinas, que uma vez hidrolisadas por endoproteases podem liberar de forma especifica oligopeptideos com aplicacoes nutricionais. Ligacoes glicosidicas e peptidicas podem ser rompidas por hidrolise acida, sendo hemicelulose mais susceptivel a que celulose. O ataque acido ao material permitiria assim reduzir o conteudo de hemicelulose da biomassa, tornando a celulose que permanece na fracao solida insoluvel mais acessivel as enzimas hidroliticas. Neste trabalho, foram estudadas diferentes rotas de solubilizacao de proteinas, hemicelulose lignina presentes na casca de soja, visando obtencao de etanol da fracao solida e oligopeptideos na fracao liquida. A recuperacao de proteinas na forma de peptideos foi feita hidrolisando-se a biomassa inicialmente com extrato comercial de endoprotease Novo-ProD, a 60oC, pH 9, por 5h, nas concentracoes enzimaticas de 1, 2 e 4% (m/m). Foi tambem testada, na sequencia da hidrolise com Novo-ProD1%, nova hidrolise com quimotripsina 1% (m/m). Os resultados mostraram que a hidrolise proteolitica com 1% de Novo-ProDpermitiu remocao de 56,9% da proteina presente na casca. Contudo, foi tambem verificado que e possivel remover 45,6% das proteinas nas mesmas condicoes, na ausencia de enzima, a pH9,0, possivelmente devido a liberacao de unidades agregadas apenas fisicamente. Um aumento da concentracao de endoproteases de 1% para 2% elevou a remocao para 74% de proteinas, nao se observando aumento significativo na extracao de proteinas aumentandose de 2 para 4%.. Com uso da enzima mais especifica, a quimotripsina, que opera em condicoes mais brandas, foi possivel remover 44% das proteinas, com uma maior remocao de lignina do material, comparando-se com Novo-ProD. Hidrolise acida de casca in natura ou sequencial a hidrolise com Novo-ProD1% sequencial permitiu atingir uma remocao total de aproximadamente 90%de proteinas O material solido remanescente e a casca in natura foram submetidos a hidrolise acida com H2SO4 3% (v/v), razao 1:4 (solido/liquido), 120oC, 20 min. Em todos os casos, as analises de carboidratos mostraram que foi possivel remover aproximadamente 46,7% de hemicelulose, maior parte na forma de xilose. Durante o tratamento acido ocorreu a remocao de quase toda a proteina da casca de soja, sem perda expressiva de celulose, o que se observou ocorrer na hidrolise acida da casca in natura. Assim, seja para obter-se um hidrolisado proteico de composicao controlada, seja para producao de etanol da fracao solida remanescente e recomendavel a remocao enzimatica previa de proteinas. A composicao quimica do material solido apos hidrolises proteolitica e acida sequenciais mostrou teores de celulose similares para todas as amostras (aproximadamente 49 %). Assim, o solido pre-tratado com 1% de Novo Pro-D, foi utilizado para a obtencao dos acucares fermentesciveis usando o complexo enzimatico Acellerase 1500 a 50oC, pH 4,8 e razao enzima/substrato de 7 FPU/g celulose durante 72 h. Nestas mesmas condicoes foram hidrolisadas as amostras de casca in natura pre-tratada com acido, a casca in natura e a casca apos hidrolise proteolitica. A conversao enzimatica de celulose em glicose foi em torno de 40%, tanto para as amostras pre-tratadas com Novo- ProD como para a amostra submetida so a hidrolise acida. Com um aumento de carga enzimatica para 20 FPU/g celulose foi possivel atingir uma conversao de 55% para amostras pre-tratadas com 1% de Novo-ProDe hidrolise acida sequenciais. A suplementacao do complexo enzimatico Acellerase 1500 com 120 UI de β-glicosidase e 1%(m/m) de pectinase nao produziu aumento na conversao enzimatica. A hidrolise da celulose proveniente de pre-tratado por organossolve usando etanol 50% a 170oC por 1 hora resultou em 52% de conversao com uma menor remocao de hemicelulose mostrando que a lignina estava causando o maior impedimento para o ataque enzimatico. A conversao de glicose em etanol foi similar para as amostras pre-tratadas por hidrolise acida e com as hidrolises proteoliticas (1% Novo-ProD) e acidas sequenciais chegando a uma concentracao aproximada de 13 g/L.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6815.pdf: 3994382 bytes, checksum: 2a2e4e4a401cef8480b7d85ce94ee511 (MD5) Previous issue date: 2015-03-06 / For biofuels production, the recovery of lignocellulosic feedstock is seen as a promising alternative, both from environmental and economic point of views. Among the lignocellulosic biomasses most important in Brazil, sugarcane straw plays a prominent position regarding the production of second generation ethanol (E2G), due to its great availability in the field. One of the main challenges involving the production of second generation ethanol is to obtain high conversion rates of polysaccharides into fermentable sugars, in the hydrolysis step. A solid knowledge is an important pre-requisite to optimize the conversion of lignocellulosic biomass into ethanol. In this context, the aim of this work is to study the kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose from hydrothermally pretreated sugarcane straw (HPS) (195oC, 10 min e 200 rpm) and hydrothermally pretreated followed by alkaline pretreatment (NaOH 4% w/v, 30 min, 121oC). The influence of process variables as stirring speed, pH, temperature and, concentration of substrate and enzyme was evaluated. Experiments using HPS were carried out in Erlenmeyers (50oC, pH 5, 5 FPU.gcellulose -1 e 10% solids m/v) with shaking from 0 to 300 rpm. Then, the influences of pH and temperature were analyzed. Initially, the pH was ranged from 3 to 7 and afterwards, the temperature was varied from 40 to 60oC. After determining and setting the ideal conditions of agitation, pH and temperature, it was studied the effect of substrate and enzyme concentration for both pretreated and delignified biomass. In order to verify the effect of substrate concentration, solid load was varied in a range of 2.5 to 10.0% (w/v), in initial velocity and long term assays. Enzyme concentration (Cellic®CTec2 Novozymes S/A) was varied from 275 to 5,000 FPU.Lsolution -1 (5 to 80 FPU.gcellulose -1), with solid load settled at 10% (w/v). Finally, it was possible to fit Michaelis-Menten (MM), modified MM, with and without competitive inhibition by glucose, and Chrastil model. For HPS, modified MM model with inhibition (suitable for heterogeneous system, with high resistance to diffusion) was fitted. For alkaline delignified HPS pseudo-homogeneous and modified MM models were fitted. The Chrastil model was also used to fit long term assays for both pretreated biomass. The fitted models were able to identifying key features of the hydrolysis process, and, therefore, useful within the perspective of engineering bioreactors. / O aproveitamento de resíduos lignocelulósicos é visto como uma alternativa promissora, tanto do ponto de vista ambiental quanto econômico, para produção de biocombustíveis. Dentre as biomassas lignocelulósicas de maior importância no território nacional, a palha de cana-de-açúcar ocupa posição de destaque no que se refere à produção de etanol de segunda geração (E2G) por apresentar grande disponibilidade no campo. Um dos principais desafios que envolvem a produção de E2G é obter altas conversões de polissacarídeos em açúcares fermentescíveis, durante a etapa de hidrólise enzimática, de maneira que otimizar esta etapa requer um bom conhecimento da cinética de reação. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo realizar o estudo cinético da etapa de hidrólise enzimática da fração celulósica da palha de cana-de-açúcar, pré-tratada hidrotermicamente (PTH) (195oC, 10 min e 200 rpm) e pré-tratada hidrotermicamente, seguida de prétratamento alcalino (PA) (NaOH 4% m/v, 30 min, 121oC). Neste estudo, foi analisada a influência das seguintes variáveis de processo: velocidade de agitação, pH, temperatura e concentrações de enzima e substrato. Experimentos empregando palha PTH foram realizados em Erlenmeyers (50oC, pH 5, 5 FPU.gcelulose -1 e 10% sólidos m/v) com agitações de 0 a 300 rpm. Em seguida, foram analisadas as influências do pH e da temperatura. Inicialmente, o pH foi variado de 3 a 7 e, posteriormente, a temperatura foi variada de 40 a 60oC. Após determinadas e fixadas as condições ótimas de agitação, pH e temperatura, estudaram-se os efeitos da concentração de substrato e enzima para ambas as biomassas (PTH e PTH com PTA). Para verificar o efeito da concentração de substrato, a carga de sólidos variou de 2,5 a 10% (m/v), em ensaios de velocidade inicial e de longa duração. A concentração de enzima (Cellic®CTec2 Novozymes S/A) variou de 275 a 5000 FPU.Lsolução -1 (5 a 80 FPU.gcelulose -1), com carga de sólidos fixada em 10% (m/v). Finalmente, foi possível ajustar os modelos de Michaelis-Menten (MM) pseudohomogêneo e MM modificado, com e sem inibição competitiva por glicose, e o modelo de Chrastil. Para a palha PTH um modelo de MM modificado com inibição (adequado para sistemas heterogêneos, com alta resistência à difusão) mostrou-se mais apropriado do que o MM pseudo-homogêneo. Para a palha PTH seguida de PTA, o modelo de MM modificado com inibição também foi mais adequado do que o MM pseudo-homogêneo. O modelo de Chrastil também foi aplicável na modelagem de ambas as biomassas pré-tratadas. Os modelos foram capazes de identificar características essenciais do processo de hidrólise, sendo, úteis dentro da perspectiva da engenharia de biorreatores.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / Xylanases are enzymes which randomly cleave the main chain of xylan, the most abundant non-cellulosic polysaccharide of plants cell wall. Xylanases are commonly produced by a wide range of organisms including bacteria, algae, fungi, protozoa, and certain herbivorous insects and crustaceans also produce xylanases. Leucoagaricus gongylophorus, a mutualistic fungus of leafcutting ant Atta sexdens, secretes enzymes with xylanolytic activity and the gene encoding a xylanase was recently identified. In this work the xylanolytic profile of L. gongylophorus was studied and two enzymes with xylanolytic activity (XyLg1 and XyLg2) were isolated, purified and characterized. XyLg1 has a molecular mass of about 38kDa and pI greater than 4.8. For beechwood xylan substrate XyLg1 showed optimum temperature of 40 °C, optimum pH between 8.5 to 10.5 and Km =14, 7 ± 7.6 mg.ml-1. Due to these features XyLg1 may be used in processes such as bio-bleaching pulp. XyLg1 was also analyzed by mass spectrometry technique being associated with a polygalacturonase of the same fungus. Kinetic studies of the XyLg1 using polygalacturonic acid as substrate were developed (optimum pH= 5.5, optimum temperature between 50 and 60 ° C and Km= 2.2 ± 0.5 mg.ml-1). XyLg2 has molecular weight of about 24kDa and pI less than 4.8, and thus it is an acid protein. Parameter such as optimum temperature (70 °C) and pH (4.0) as well as the kinetic parameters (Km 7.4 ± 2.0 mg.ml-1) using beechwood xylan as substrate were determined for XyLg2. This enzyme exhibits desirable characteristics for improving animal feed, for example. LgXyn2 shows no activity with polygalacturonic acid. For the purpose of producing larger amount of xylanase from the L. gongylophorus the gene sequence encoding a xylanase (LgXyn1, GenBank: EF208066.1) was used to synthesize forward and reverse primers and was possible to amplify a different gene (xyl) that encodes the synthesis of a new xylanase called here LgXyn2. The gene was cloned into pETSUMO vector and the recombinant expressed in E.coli has no activity even when histidine tail (fusion) is removed with Sumo protease. These results suggest that the glycosylation is an important factor for xylanolitic activity. Then the xyl gene was cloned into pPICZalphaA vector and LgXyn2 was expressed in P. pastoris, secreted into the extracellular medium and the enzyme has xylanolitic activity. This result showed that the new gene (xyl) encodes a functional enzyme and that P. pastoris is a efficient system to obtain the active enzyme. / Xilanases são enzimas que, randomicamente, clivam a cadeia principal da xilana, o polissacarídeo não celulósico mais abundante da parede celular de plantas. As xilanases são comumente produzidas por uma grande gama de organismo incluindo bactérias, algas, fungos, protozoários, sendo que alguns insetos herbívoros e crustáceos também produzem xilanases. Leucoagaricus gongylophorus, é um fungo mutualístico da formiga saúva Atta sexdens, que secreta enzimas com atividade xilanolítica e o gene que codifica para uma xilanase foi recentemente identificado. Neste trabalho o perfil xilanolítico do fungo L. gongylophorus foi estudado e duas enzimas nativas com atividade xilanolítica (XyLg1 e XyLg2) foram isoladas, purificadas e caracterizadas. XyLg1 apresenta massa molecular aproximado de 38kDa e pI maior do que 4,8. Para o substrato xilana de faia a enzima apresentou temperatura ótima de 40°C, pH ótimo entre 8,5 a 10,5 e Km14,7 ± 7,6 mg.ml- 1. Devido a essas características a XyLg1 poderá ser utilizada em processos como o biobranqueamento da celulose. XyLg1 também foi analisada por espectrometria de massas sendo relacionada com uma poligalacturonase do mesmo fungo. Estudos cinéticos da XyLg1 utilizando ácido poligalacturônico como substrato foram realizados (pHótimo= 5,5, temperatura ótima entre 50 e 60°C, Km 2,2 ± 0,5 mg.ml-1). A XyLg2 apresenta massa molecular aproximada de 24kDa e pI menor que 4,8, sendo assim uma proteína ácida. Parâmetros ótimos de temperatura (70°C) e pH (4,0), assim como o parâmetro cinético (Km 7,4 ± 2,0 mg.ml-1) utilizando xilana de faia como substrato foram determinados para a XyLg2. Esta enzima apresenta características desejáveis para melhoramento da alimentação animal, por exemplo. A LgXyn2 não apresenta atividade frente ao ácido poligalacturônico. Com o propósito de produzir elevados níveis de xilanases do L. gongylophorus, a sequência que codifica para a xilanase (LgXyn1, GenBank: EF208066.1) foi utilizada para a síntese de oligonucleotídeos foward e reverse e foi possível amplificar um gene diferente (xyl) que codifica a síntese de uma nova xilanase denominada aqui LgXyn2. O gene foi clonado no vetor pETSUMO e a enzima recombinante expressa em E. coli não apresenta atividade mesmo quando a cauda de histidina (fusão) é removida com Sumo protease. Então o gene xyl foi clonado no vetor pPICZα-A e a LgXyn2 foi expressa em P. pastoris, secretada para o meio extracelular e a enzima apresenta atividade xilanolítica. Este resultado mostra que o gene (xyl) codifica para uma enzima funcional e que a P. pastoris é um sistema eficiente para obter esta xilanase.