Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4136.pdf: 5493903 bytes, checksum: 43bf6490c910378ad1f093d9b1f60982 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / Purine Nucleoside Phosphorylases (PNPs) are key enzymes of the purine salvage pathway, and therefore are considered attractive targets for new drugs search. In this context, the development of effective and selective bioassays for PNP ligands screening is an important task. This work describes the covalent immobilization of human and Schistossoma mansoni PNP on fused silica capillaries. The activity of the immobilized enzyme reactors (IMERs) was monitored on line, employing multidimensional zonal chromatography, by the quantification of the product formed throughout the enzymatic reaction. This method enabled the determination of kinetic constants, screening, identification and characterization of enzymatic inhibitors. Two potent human PNP inhibitors were recognized and characterized. Through the use of inhibitors with different potencies, previously characterized by zonal chromatography, the affinity-based ligands screening employing frontal chromatography was validated. Frontal affinity chromatography analysis demonstrated to be a valuable method for the rapid identification of new ligands, while the main advantage of the multidimensional zonal chromatography method herein described consists on the ability to directly evaluate the effect of the ligands in the biological function of these enzymes. The methods described in this work represent an improvement to the PNPs inhibitors consolidated screening assays, since they directly quantify the enzymatic reaction product or are able to rank the inhibitors according to their affinities, resulting in a rapid automated analysis and false positives free. / Purina Nucleosídeo Fosforilases (PNPs) são enzimas chave na via de salvação de purinas, e por isso são consideradas alvos atrativos para a busca por novos fármacos. Nesse contexto, o desenvolvimento de bioensaios seletivos e eficazes para a triagem de novos ligantes das PNPs é de importância crucial. Este trabalho descreve a imobilização covalente das PNPs humana e de Schistosoma mansoni em capilares de sílica fundida. A atividade das enzimas imobilizadas (IMERs) foi monitorada on line, por cromatografia zonal multidimensional, através da quantificação do produto formado na reação enzimática. Este método possibilitou a determinação das constantes cinéticas, a triagem, identificação e caracterização de inibidores enzimáticos. Dois inibidores potentes da PNP humana foram reconhecidos e caracterizados. Através do uso destes inibidores de diferentes potências, previamente caracterizados por cromatografia zonal, a triagem de ligantes por afinidade empregando a cromatografia frontal foi validada para o IMER baseado na PNP humana. As análises por cromatografia de afinidade frontal demonstraram ser uma estratégia valiosa na identificação rápida de novos ligantes, enquanto o método multidimensional desenvolvido apresenta como principal vantagem a capacidade de avaliar diretamente o efeito dos ligantes na função biológica destas enzimas. Os métodos descritos neste trabalho representam um avanço aos métodos consolidados de triagem de inibidores das PNPs, pois quantifica diretamente o produto formado da reação enzimática ou os classifica por afinidade, resultando em análises rápidas, automatizadas e sem falsos positivos.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Física, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-25T17:09:28Z No. of bitstreams: 1 2017_MônicadeAbreuSilva.pdf: 18669190 bytes, checksum: 78691eaf8a5bfe3f12f24d8bb580e02b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-06-06T18:55:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MônicadeAbreuSilva.pdf: 18669190 bytes, checksum: 78691eaf8a5bfe3f12f24d8bb580e02b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T18:55:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MônicadeAbreuSilva.pdf: 18669190 bytes, checksum: 78691eaf8a5bfe3f12f24d8bb580e02b (MD5) Previous issue date: 2017-06-06 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. / O Alzheimer é uma doença neurodegenerativa progressiva que compromete o sistema cognitivo e causa demência. Em geral, a doença de Alzheimer (DA) afeta pessoas com mais de 65 anos de idade e projeções futuras indicam que a população com DA irá aumentar significativamente, causando forte impacto social. Os fármacos atualmente comercializadas somente amenizam a progressão da doença. Nesse sentido, a busca por novos fármacos é um tema relevante na química medicinal. O objetivo principal deste trabalho é a modelagem molecular de novos agentes terapêuticos para o tratamento da DA. A estrategia terapêutica aqui adotada é a hipótese colinérgica. Um conjunto de candidatos a inibidores da acetilcolinesterase foi desenhado a partir de um composto natural obtido a partir do líquido da casca da castanha de caju (cardanol) com o intuito de modular positivamente a ação colinérgica através da inibição da acetilcolinesterase. Uma triagem in silico foi realizado baseado em descritores eletrônicos e relação quantitativa de estrutura-atividade para melhor compreender o perfil inibitório desses candidatos. A análise de componentes principais foi capaz de agrupar ligantes com perfil inibitório similar mostrando que esses descritores poderiam guiar o planejamento de novos agentes anticolinérgicos. O conhecimento dos modos de interação entre o ligante o sítio ativo biológico é essencial para o planejamento de fármacos. Com o intuito de investigar essas interações, simulações de dinâmica molecular e docking foram empregadas. A caracterização detalhada com movimento coordenado intrínseco do sítio ativo, o qual desempenha importante papel para o mecanismo de interação receptor-ligante, é apresentada aqui. Por meio do tratamento estatístico, os modos de interação mais favoráveis revelaram como o ambiente proteico foi modificado na presença dos ligantes. / Alzheimer is a neurodegenerative progressive disease which comprimises the cognitive system and causes dementia. In general, the Alzheimer disease (AD) affects elderly people over 65 years and the future projections indicate that population with AD will increase significantly, causing a huge social impact factor. The drugs currently marketed only smooth the progression of this disease and present adverse effects. In this sense, the search of the new drugs is a relevant theme to the medicinal chemistry. The main goal of this work is the molecular modeling of new therapeutic agents for treating AD. The therapeutic strategy adopted here is the cholinergic hypothesis. A set of acetylcholinesterase inhibitor candidates was designed from a natural compound obtained from the cashew nutshell liquid (cardanol) in order to modulate positively the cholinergic function through the inhibition of the acetylcholinesterase. An in silico screeening was performed based on electronic descriptors and quantitative structure- relationship activity to better understand the inhibitory profile of these candidates. Principal component analysis was able to cluster ligands with similar inhibitory profile showing that these descriptors could guide new anticholinergic drug design. The knowledge of the interaction modes between the ligand and biological active site is essential for the drug design. In order to investigate these interactions, molecular dynamics combined with molecular docking simulations were employed. A detailed characterization of the intrinsic coordinated moviment of the active site, which plays an important hole for the receptor-ligand interaction mechanism, is presented here. From a statistical treatment, the most favourable interaction modes revealed how the protein enviroment was modified in the presence of the ligands.

Resumo não disponível

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-11-27T14:56:34Z No. of bitstreams: 1 2014_EricaCristinaMorenoNascimento.pdf: 11962854 bytes, checksum: a392edd39bbc205ab81d950bfc0af4e3 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T14:22:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_EricaCristinaMorenoNascimento.pdf: 11962854 bytes, checksum: a392edd39bbc205ab81d950bfc0af4e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T14:22:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_EricaCristinaMorenoNascimento.pdf: 11962854 bytes, checksum: a392edd39bbc205ab81d950bfc0af4e3 (MD5) / A Doença de Alzheimer (DA) é um tipo de demência degenerativa e progressiva de grande preocupação social. Estima-se hoje que, 45 milhões de pessoas no mundo apresentem algum tipo de demência, dentre essas, 25 milhões apresentam sintomas característicos da doença de Alzheimer. O estilo de vida imposto pela situação social e econômica e alterações no estado emocional causadas por traumas e doenças vêm contribuindo para o aumento dos casos de pessoas onde são observadas modificações no seu estado comportamental (estados depressivos: ED). Dados da Organização Mundial de Saúde indicam que mais de 20% da população mundial sofra fisiologicamente com alterações no seu estado emocional originando estados depressivos de alguma natureza. Por não terem suas causas determinadas e nem serem conhecidos os mecanismos que desencadeiem estas alterações nos estados neurológicos dos pacientes, estratégias de tratamento são empregadas para tentar sanar o problema, ou trazer melhora no estado de vida dos pacientes. As estratégias mais utilizadas para tratar pacientes com DA e ED estão relacionadas ao uso de drogas que atuem nas sinapses de maneira a inibir a função de enzimas responsáveis pela ativação e desativação dos neurotransmissores envolvidos diretamente nos processos que ocasionam as demências e o ED. A estratégia mais usada para tratar pacientes com DA é a terapia colinérgica, que consiste no uso de fármacos com ação inibitória frente à acetilcolinesterase (AChE) para impedir o decréscimo da concentração da acetilcolina nas fendas sinápticas. As drogas tacrina, donepezil, galantamina e a rivastigmina são drogas aprovadas para o tratamento da DA, classificadas como inibidoras da acetilcolinesterase (AChEI). Outras drogas como o metrifonato, diclorvos, huperzina A, fenserina e o dímero da tacrina estão em fases de teste clínico. O tratamento clássico da depressão é feito com o uso de medicamentos que promovam o aumento da serotonina nas regiões sinápticas, seja inibindo a ação das enzimas monoamina oxidase A e monoamina oxidase B que degradam o neurotransmissor, seja pela inibição seletiva de recaptura deste neurotransmissor pelos receptores específicos a essa função. As drogas moclobemida, isocarboxazida, iproniazida, tranilcipromina, fenelzina foram amplamente utilizadas no tratamento de ED, porém seus efeitos colaterais severos as classificam como drogas restritas ao uso, caso outras drogas não sejam eficientes. As drogas inibidoras das isoformas da monoamina oxidase de segunda geração, Clorgilina, Nialamida selegilina e rasigilina foram desenvolvidas para amenizar o tratamento do ED. Na tentativa de produzir drogas multi-alvos foi proposta a droga hibrida ladostigil, como potente inibidor da acetilcolinesterase e da monoamina oxidade B. Neste trabalho, foram realizados diversos estudos teóricos quânticos no intuito de elucidar o perfil farmacofórico de conhecidas drogas empregadas no tratamento da DA e do ED. Para isso foram realizados cálculos no vácuo e em meio solvatado no nível semi-empírico e ab initio para determinação de parâmetros estruturais, eletrônicos e espaciais dos inibidores das enzimas. Outra série de estudos, simulando o ambiente intracelular in sílico, foram também realizados para compreender o mecanismo de inibição da AChE, quando a enzima interage com alguns de seus inibidores. O método de multivariáveis de análise das componentes principais (PCA) foi aplicado a 20 parâmetros, das drogas citadas, para determinação do perfil farmacofórico dos inibidores das proteínas aqui estudadas. Os parâmetros foram obtidos através dos cálculos no vácuo e no modelo de solvatação CPCM em nível B3LYP/6- 31+G(d,p). O estudo da PCA foi realizado para reduzir o espaço amostral de propriedades, a fim de obter as propriedades que são relevantes e comuns entre essas drogas, que têm estrutura molecular diferenciada e, no entanto, apresentam os mesmos alvos. Com o intuito de determinar qualitativa e quantitativamente as interações entre a acetilcolinesterase e alguns de seus inibidores foram realizadas uma série de simulações utilizando o método híbrido QM/MM MD e vários cálculos teóricos usando o método FEP nos níveis AM1/MM empregando a biblioteca fDynamo. Propriedades eletrônicas, como a energia do orbital HOMO-1, dipolo e propriedades estruturais como, o tamanho da droga e a distância entre os dois hidrogênios mais ácidos da molécula são algumas das componentes principais participantes do perfil farmacofórico que correlacionam as drogas estudadas. As energias livres de interação dos sistemas proteína-ligante foram calculadas e observou-se uma grande contribuição da componente de van der Waals para as interações entre a acetilcolinesterase e seus inibidores. ___________________________________________________________________________ ABSTRACT / Alzheimer's disease (AD) is a degenerative and progressive type of dementia of great social concern. The latest worldwide estimate shows that 45 million people have some form of dementia, among these 25 million have symptoms of Alzheimer's disease. The lifestyle imposed by social and economic conditions and changes in emotional state caused by trauma and disease have contributed to the increase in cases of people where changes in behavioral state (depressive states: DS) are observed. The World Health Organization estimates that more than 20% of the world population suffers physiologically with changes in its emotional state resulting in depressive states. The AD and DS specific causes and the mechanisms that trigger these changes in the neurological status of patients are not known, thus treatment strategies are employed to try to minimize the effect, or bring improvement in the state of patient life. The most common strategies used to treat patients with AD and DS are related to use drugs that act at the synapses so as to inhibit the function of enzymes responsible for the activation and deactivation of the neurotransmitters directly involved in the processes that cause dementia and the depression. The most used strategy to treat patients with AD is the cholinergic therapy, which consists in use drugs with inhibitory effects against acetylcholinesterase (AChE), in order to prevent the decrease of the concentration of acetylcholine (the neuroreceptor) in the synaptic region. Tacrine, donepezil, galanthamine and rivastigmine are drugs approved for treatment of AD and are classified as inhibitors of acetylcholinesterase. Other drugs such as metrifonate, dichlorvos, huperzine, phenserine and the tacrine dimmer are in stages of clinical testing. The classical treatment of depression is done with the use of drugs that promote the increase of serotonin in the synaptic cleft, either inhibiting the action of the enzymes monoamine oxidase A and monoamine oxidase B, that degrades the neurotransmitter, or by selective inhibition of the reuptake of this neurotransmitter by specific receptors to such function. The drug moclobemide, isocarboxazid, iproniazid, tranylcypromine, phenelzine, have been widely used in the treatment of DS. Nevertheless, its severe side effect classifies as restricted to use, only if other drugs are not effective. The second generation drugs that inhibit monoamine oxidase isoforms Clorgyline, Nialamide selegiline and rasagiline were developed to help the treatment of depression. In an attempt to produce a multitarget drug, ladostigil a hybrid drug was proposed as a potent inhibitor of acetylcholinesterase and monoamine oxidase B. In this work several quantum theoretical approach were undertaken in order to elucidate the pharmacophore profile of known drugs used in the treatment of AD and DS. For this purpose calculations in vacuum and solvated medium at the semi-empirical and ab initio level were performed for determination of structural, electronic and spatial parameters of enzyme inhibitors. Another series of studies simulating the intracellular environment in silico was used in order to understand the mechanism of acetylcholinesterase inhibition, when enzyme interacts with some of its inhibitors. The multivariate method of the principal components analysis (PCA) was applied to selected 20 parameters of drugs cited before to determining the pharmacoforic profile of those protein inhibitors. The multivariate method of the principal components analysis was applied to selected 20 parameters of drugs cited before in order to determine the pharmacophoric profile of these protein inhibitors. The parameters were obtained from the calculations in vacuum and CPCM solvation model at the DFT B3LYP/6-31+G(d,p) level. PCA study was applied to reduce the sample space of properties to obtain the most relevant properties common to these drugs, which have the same target but have different molecular structure. A huge number of simulations were performed using the hybrid method QM/MM MD in order to qualitatively and quantitatively determine the interactions between acetylcholinesterase and some of its inhibitors. Additionally several theoretical calculations applying FEP method using the fDynamo library in AM1/MM level to compute the free binding energy of the systems acetylcholinesterase-inhibitor were performed. Electronic properties such as the orbital energy of HOMO-1 and the dipole momentum; structural properties such as the size of the drug and the distance between the two most acidic hydrogens of the molecule are some main components of the pharmacophoric profile correlating the drugs studied here. Free energies of interaction of the protein-ligand systems were calculated and revealed a major contribution of the van der Waals component to the interactions between acetylcholinesterase and its inhibitors.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-18T15:03:55Z No. of bitstreams: 1 2015_GiselleXavierReisBrumana.pdf: 4892460 bytes, checksum: a3eca4debdf6d2e1c955667874bff754 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-21T20:23:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_GiselleXavierReisBrumana.pdf: 4892460 bytes, checksum: a3eca4debdf6d2e1c955667874bff754 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T20:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_GiselleXavierReisBrumana.pdf: 4892460 bytes, checksum: a3eca4debdf6d2e1c955667874bff754 (MD5) / O adenocarcinoma mamário, assim como outras manifestações do câncer, é o fenótipo patológico desencadeado por processos multifatoriais e desenvolvimento multiprocessual, decorrente de alterações do controle de proliferação e crescimento celular. Nesse estudo os efeitos do inibidor de proteases black-eyed pea trypsin chymotrypsin inhibitor (BTCI) foram avaliados na viabilidade e proliferação de células de adenocarcinoma mamário (MDA-MB-231), in vitro, visando caracterizar o BTCI como potencial agente anticarcionogênico nesse tipo de câncer, ensaios de viabilidade celular, avaliações de morte celular e ciclo celular por citometria de fluxo, bem como o estudo da geração de espécies moleculares reativas de oxigênio (EROS). A partir da determinação da Concentração Inibitória (IC50) de BTCI (267,4 µM em 24 horas) a interferência deste inibidor sobre o ciclo celular da linhagem em questão foi avaliada e um aumento do número de células na fase G2 foi observado, assim como a presença de DNA fragmentado. A via de morte das células de adenocarcinoma mamário tratadas com BTCI foi estudada e constatou-se que a média das células que sofreu morte por apoptose foi de 89,4%, valor significativo, sendo p<0,001. Ademais, o processo de oxidação celular via Espécies Reativas de Oxigênio (EROS) foi intensificado em 24h de incubação. Os resultados obtidos indicam que o BTCI causa efeitos citostático e citotóxico nas células analisadas, sendo a principal via de morte celular a apoptose, processo que pode estar associado à oxidação celular através de radicais livres de oxigênio. / The mammary adenocarcinoma as well as other manifestations of cancer, is the pathological phenotype triggered by multifactorial processes and multiprocessual development, due to proliferation and cell growth control changes. In this study the effects of the black-eyed pea trypsin chymotrypsin protease inhibitor (BTCI) were evaluated in breast adenocarcinoma cell (MDA-MB-231) proliferation and feasibility in vitro, in order to characterize the BTCI as a potential anticarcinogenic agent for this type of cancer cell. Thus viability assays, assessments of cell cycle and cell death by flow cytometry, as well as study of the generation of reactive oxygen molecular species (ROS) were performed. Upon determining the inhibitory concentration (IC50) of BTCI (267.4 uM in 24 hours) the interference of the inhibitor on cell cycle was evaluated and an increased number of cells in the G2 phase was observed, as well as presence of fragmented DNA. The death pathway of mammary adenocarcinoma cells treated with BTCI was studied and it was found that the average of the cells that entered death process by apoptosis was 89.4%, significant value p<0.001. Furthermore, cell oxidation process via Oxigen Reactive Species (ROS) was intensified after 24 hours of incubation. The results indicate that BTCI has cytostatic and cytotoxic effects on the analyzed cells. The main pathway of cell death was apoptosis, a process that may be associated with cellular oxidation by oxygen free radicals.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A diabete Mellitus (DM) é na atualidade um dos maiores problemas de saúde pública, sendo caracterizada como um distúrbio metabólico complexo, resultante tanto da resistência à ação da insulina, como da disfunção das células β. Atualmente, uma nova classe de fármacos, os inibidores da enzima dipeptidil peptidase 4 (DPP-4), demonstrou eficiência terapêutica e segurança no tratamento de pacientes com DM devido ao aumento do hormônio peptídeo-1 semelhante ao glucagon. Entretanto, por tratar-se de uma classe nova de medicamentos, pouco se sabe sobre os efeitos desses fármacos no que diz respeito aos parâmetros metabólicos, bem como a função mitocondrial. Neste contexto, o presente trabalho, tem como objetivo avaliar os efeitos da administração de diferentes inibidores de DPP-4 (linagliptina, vildagliptina, sitagliptina e saxagliptina) sobre parâmetros do metabolismo energético em cérebro, coração e fígado de ratos adultos. Os resultados desse estudo demonstraram que a administração subcrônica de linagliptina aumentou a atividade dos complexos I e IV no hipocampo e cerebelo, enquanto no fígado, houve um aumento na atividade dos complexos II e II-III. No entanto, no coração observou-se uma inibição da atividade do complexo IV e da succinato desidrogenase. Já a administração de vildagliptina aumentou a atividade do complexo I no hipocampo, e a atividade da creatina quinase no cerebelo e córtex cerebral. No fígado observou-se um aumento na atividade dos complexos II e II-III, enquanto no coração houve um aumento na atividade dos complexos I e II-III. A administração de sitagliptina causou um aumento na atividade do complexo I no hipocampo e cerebelo, enquanto que a atividade do complexo II foi reduzida no córtex cerebral. Observou-se também um aumento na atividade da creatina quinase em todas as estruturas cerebrais analisadas. Já no fígado verificou-se um aumento apenas na atividade do complexo II, e no coração um aumento na atividade dos complexos I e II-III, ao passo que a atividade da succinato desidrogenase foi inibida nessa estrutura. Finalizando, constatou-se, que a administração de saxagliptina aumentou a atividade dos complexos I e IV no hipocampo e cerebelo, e a atividade da creatina quinase no hipocampo, cerebelo, estriado e córtex cerebral. No fígado observou-se um aumento na atividade dos complexos II e II-III e da creatina quinase, enquanto no coração verificou-se um aumento da atividade do complexo II-III e da creatina quinase, e uma diminuição da succinato desidrogenase. Por fim, os resultados do presente estudo demonstraram que a administração subcrônica de diferentes inibidores de DPP-4 altera a atividade de enzimas do metabolismo energético. Tomados em conjunto os dados deste estudo e os dados já descritos na literatura, é tentador especular que o aumento na atividade de enzimas do metabolismo energético pode estar envolvido com o mecanismo pelo qual a função mitocondrial é restaurada pelo tratamento com inibidores de DPP-4.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:28:48Z : No. of bitstreams: 1 zeminian_lb_me_botfm.pdf: 506409 bytes, checksum: 08bea6131bbfbe54e0327803c5f6bb14 (MD5) / Ministério da Saúde / O vírus da Hepatite C (VHC) é um importante patógeno associado com doença hepática crônica sendo que alguns infectados podem desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular. O tratamento da hepatite C crônica visa a resposta virológica sustentada (RVS), definida como níveis de RNA viral indetectáveis no soro por seis meses depois do término do tratamento. Atualmente, a terapia padrão ouro é a combinação de interferon α peguilado e ribavirina, porém esse esquema terapêutico vem se mostrando eficaz em, apenas, 50% dos pacientes infectados com o genótipo 1, o mais prevalente no Brasil. Portanto, novas drogas mais eficazes e menos tóxicas estão sendo desenvolvidas para melhorar a assistência aos pacientes infectados pelo VHC, entre as quais merecem destaque os inibidores da serina protease NS3, a qual é uma enzima essencial para a replicação do VHC e assim um potencial alvo para novas terapias antivirais. Entretanto, a emergência de variantes resistentes é o maior obstáculo para o sucesso da terapêutica. Variantes resistentes já foram isoladas em pacientes tratados com os inibidores de protease e, estão associadas com a falência terapêutica. Porém o impacto dessas variantes resistentes em pacientes virgens de tratamento ainda não foi esclarecido e, esse tipo de informação pode avaliar o impacto dos inibidores de protease na terapia antiviral. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de mutações de resistência e polimorfismos genéticos na região genômica NS3 do VHC em 37 pacientes virgens de tratamento com inibidores de protease infectados com genótipo 1. RNA viral sérico foi utilizado como fonte para amplificação e seqüenciamento da região NS3 do VHC e, avaliar a presença de mutações de... / The Hepatitis C Virus (HCV) is an important pathogen associated with chronic hepatic disease and some infected patients can develop cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The treatment of chronic hepatitis C aimed the sustained virological response (SVR), defined as having undetectable serum HCV RNA at the end of therapy for at least 6 months. Currently, the gold standard therapy is a combination of pegylated interferon-α and the ribavirin, however this treatment present efficacy in only 50% of patients infected with genotypes 1, the most prevalent in Brazil. Then, new drugs more effective and less toxic have been developed to improve the attendance of the HCV infected patients as the serine protease NS3 inhibitors, which is an enzyme essential to HCV replication and main target of new antiviral therapies. However, the emergence of drug resistant variants has been the major obstacle to therapeutic successful. Resistant variants have already been isolated in patients treated with protease inhibitors and, these resistant variants are associated with non response to treatment. But the impact of the resistant variants in naïve protease inhibitors patients is unclear yet and, this information can evaluate the impact of protease inhibitors in antiviral therapeutic. The goal of this study was evaluate the presence of resistance mutations and genetic polymorphisms in the NS3 genomic region of HCV in 37 protease inhibitors-naive genotype 1 HCV infected patients. Serum viral RNA was used as source to amplification and sequencing of NS3 region of HCV and, evaluates the presence of resistance mutations and polymorphisms in this region. The results showed that only 07 (18.9%) samples presented resistant variants, the mutations... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by ALEXANDRA DANIELA BARRIOS EGUILUZ (alexandra_be88@hotmail.com) on 2018-04-26T15:34:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Alexandra Daniela Barrios Eguiluz.pdf: 2081089 bytes, checksum: 486c23815d757cd635ac788df1396c47 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-05-02T19:02:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 eguiluz_adb_me_araiq_int.pdf: 2011000 bytes, checksum: becbe4b2b7cc79b7be570531023dc459 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-02T19:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eguiluz_adb_me_araiq_int.pdf: 2011000 bytes, checksum: becbe4b2b7cc79b7be570531023dc459 (MD5) Previous issue date: 2018-04-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O fator de tradução de eucariotos eIF5A é descrito como a única proteína que apresenta o aminoácido hipusina, o qual é gerado por uma modificação pós-traducional essencial para a proliferação celular em todos os eucariotos estudados até o momento, sendo que a enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) é responsável pela primeira etapa da formação desse aminoácido em eIF5A. Portanto, a inibição de DHPS também impede a modificação de eIF5A, tornando esta proteína não funcional, o que pode ter aplicação no tratamento dos tipos de câncer em que o fator está envolvido. Embora N1-guanil-1,7-diamino-heptano (GC7) seja potente inibidor da enzima DHPS, foram observados outros efeitos na célula devido à atuação do composto em alvos não específicos. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo a busca por novos inibidores de DHPS, com baixa citotoxicidade e que reduzam a proliferação celular ou que inibam o crescimento de micro-organismos eucarióticos patogênicos, como algumas espécies de fungos. Primeiramente, foi avaliada a citotoxicidade de diferentes compostos com núcleo guanidínico frente a macrófagos murinos. Entre os compostos testados, aqueles que apresentaram menor citotoxicidade foram o composto GC7 e os compostos de núcleo guanidínico com um grupo fenil substituído em para por uma metila e outro por um flúor. A partir deste resultado, os compostos foram submetidos à avaliação de sua atividade antiproliferativa frente às mesmas células. GC7 promoveu inibição da proliferação como já descrito na literatura, mas os compostos testados não tiveram efeito na proliferação. Por meio de avaliação in vitro da inibição direta sobre a enzima DHPS, os compostos de núcleo guanidínico com um grupo fenil substituído em para por Br, I e sem substituição mostraram inibição da atividade enzimática com uma resposta dose-dependente. Pela avaliação da susceptibilidade, o composto TrisBrEsp, com três grupos guanidínicos substituídos, apresentou as menores concentrações inibitória e fungicida mínimas contra espécies de Candida, Cryptococcus e Paracoccidioides, enquanto que GC7 mostrou inibição do crescimento apenas para as espécies de Cryptococcus. Assim, embora GC7 e os compostos testados com núcleo guanidínico contendo uma fenila substituída por um grupo halogênio ou um apolar apresentem inibição direta sobre a enzima DHPS, não foi possível, nas concentrações testadas, confirmar a atividade que o inibidor GC7 possui, que é a de retardar a proliferação celular. Por outro lado, o mecanismo da inibição do crescimento dos fungos aqui testados deve ser melhor estudado, visto que GC7 apresentou pouco efeito inibidor e o composto com melhor atividade não inibiu a DHPS diretamente nas concentrações testadas. / Eukaryotic translation factor eIF5A is described as the only protein that presents the amino acid hypusine that is generated by a post-translational modification, which is essential for cell proliferation in all the eukaryotes studied to date. The enzyme deoxyhypusine synthase (DHPS) is responsible for the first stage of formation of this amino acid in eIF5A. Therefore, the inhibition of DHPS also prevents the modification of the eIF5A, making this protein non-functional, which may have application in the treatment of cancer kinds in which this factor is involved. Although N1-guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7) is a strong inhibitor of the DHPS enzyme, other effects on the cell were observed due to the acting of the compound on non-specific targets. Thus, the present work aims to search for new DHPS inhibitors, with low cytotoxicity and able to reduce cell proliferation or inhibit the growth of pathogenic eukaryotic microorganisms such as some fungal species. Firstly, the cytotoxicity of different compounds with guanidinic nucleus against murine macrophages was evaluated. Among the compounds tested, those that showed the lowest cytotoxicity were the GC7 compound and the guanidine core compounds with a phenyl group substituted in para for one methyl and another with fluorine. From these data, the antiproliferative activity of the compounds towards the same cells was evaluated. GC7 promoted inhibition of proliferation as already described in the literature, but the compounds tested had no effect on proliferation. By means of in vitro evaluation of direct inhibition on the DHPS enzyme, the guanidine core compounds with a phenyl group substituted in the para position by Br, I and without substitution showed inhibition of enzyme activity with a dose-dependent response. By the susceptibility evaluation, the TrisBrEsp compound with three-substituted guanidine groups showed the lowest concentrations for inhibitory and minimum fungicidal against Candida, Cryptococcus and Paracoccidioides species. Whereas, the GC7 showed inhibition of growth only for Cryptococcus species. Thus, although GC7 and compounds tested with a guanidine nucleus containing a phenyl substituted by a halogen or a nonpolar group show direct inhibition on the DHPS enzyme, it was not possible, at the concentrations tested, to confirm the activity of the GC7 inhibitor, which is to retard cell proliferation. On the other hand, the mechanism of inhibition of the growth of the fungi tested here should be better studied, since the GC7 showed little inhibitory effect and the compound with the best activity did not inhibit the DHPS directly at the tested concentrations.

Resumo não disponível

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T14:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_M.pdf: 3471105 bytes, checksum: aa20d26751e5da61ad13b4f683a3fafe (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulina / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extract / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas