Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseTRA.pdf: 6023275 bytes, checksum: 87890c0b29cd99b76805b302af8bc9ac (MD5) Previous issue date: 2006-05-17 / This work involved the study of plant extracts of the Rutaceae species. Among 16 extracts tested in assays carried out with T. cruzi gGAPDH and L. tarentolae APRT enzymes and trypomastigote forms of T. cruzi, four showed significant activities at least in one of them. The petroleum ether extract of stems of Conchocarpus macrophyllus (CMCF) and the methanolic extract of leaves of Rauia sp (RFM) showed 94% and 75% of parasitic lyses on trypomastigote forms of T. cruzi. The methanolic extract of leaves of Rauia sp1 (RF1M) showed 74% of inhibition of gGAPDH enzyme and the dichloromethane extract of stems of Conchocarpus macrophyllus (CMCD) showed 74% of inhibition of APRT enzyme. The methanolic extract of leaves of Rauia sp1 (RF1M) showed 67,9% of inhibition on the APRT enzyme assay. The phytochemical study of Rauia sp allowed the isolation of 30 substances among them 4 are described for the first time, the coumarins 3-ethylrauianin and 5-methoxyrauianin and the alkaloids 7-hydroxy-8-methoxy-N-methylflindersine and 8- hydroxy-Nmethylflindersine that is described as a natural product at first time. Among them 26 have already been described in the literature the coumarins murranganone, 7- methoxy-8-(2-acetyloxy-3-methyl-1-oxobut-2-enyl)-coumarin, isomurranganone, murralongin, murrangatin, munomicrolin, murrangatin diacetate, rauianin, umbeliferone e isoescopoletin, the alkaloids N-methyl-4-methoxy-2-quinolone, mirtopsine, dictamine, γ-fagarine, skimmianine, Z-dimethylrhoifolinate, zantobungeanine, zantodioline and veprissine, the amides paprazine and N-transferuloyltyramine, the flavone 3,7,4 -trimethoxy-5-hydroxyflavone, the lignan siringaresinol, the fenolic coumpound vanilic acid and the steroids β-sitosterol and stigmasterol. The phytochemical study of Conchocarpus macrophyllus allowed the isolation of 4 substances the alkaloids arborinine and methylarborinine and the steroids β-sitosterol and stigmasterol. Among the substances tested in one or more assays none of them showed satisfactory results, leading to conclude that either the active compounds have not been isolated or their activity is related to the combination effects. / Este trabalho envolveu estudo fitoquímico de plantas pertencentes à família Rutaceae. Foram testados 16 extratos de plantas pertencentes à família Rutaceae em ensaios sobre as enzimas GAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae e sobre formas tripomastigotas de T. cruzi quatro apresentaram atividades satisfatórias em pelo menos um dos ensaios a que foram submetidos. O extrato em éter de petróleo do caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCE) e o extrato metanólico das folhas de Rauia sp (RFM) apresentaram 94% e 75% de lise parasitária frente às formas tripomastigotas de T. cruzi. O extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou 74% de inibição frente à enzima GAPDH e o extrato diclorometânico do caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCD) apresentou 77% de inibição sobre a enzima APRT. O extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou resultado próximo ao considerado satisfatório (67,9% de inibição) no ensaio sobre a enzima APRT. O estudo fitoquímico de Rauia sp resultou no isolamento de 30 substâncias. Destas, 4 são inéditas na literatura; as cumarinas 3-etilrauianina e 5-metoxirauianina e os alcalóides 7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina e 8-hidroxi-N-metilflindersina, este último não foi ainda relatado como produto natural e 26 já foram descritas na literatura; as cumarinas murranganona, 7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-2- enil)-cumarina, isomurranganona, murralongina, murrangatina, munomicrolina, acetato de murrangatina, rauianina, umbeliferona e isoescopoletina, os alcalóides Nmetil- 4-metoxi-2-quinolona, mirtopsina, dictamina, γ-fagarina, esquimianina, Zrhoifolinato de dimetila, zantobungeanina, zantodiolina e veprissina, as amidas paprazina e N-trans-feruloiltiramina, a flavona 3,7,4 -trimetoxi-5-hidroxi flavona, a lignana siringaresinol, o composto fenólico ácido vanílico e a mistura dos esteróides sitosterol e estigmasterol. O estudo de Conchocarpus macrophyllus resultou no isolamento de 4 substâncias, os alcalóides acridônicos arborinina e metilarborinina e a mistura dos esteróides sitosterol e estigmasterol. Dentre as substâncias que tiveram o potencial biológico avaliado frente a um ou mais ensaios nenhuma apresentou resultado satisfatório.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2112.pdf: 5693137 bytes, checksum: ed718439c222617a1ea873a2cb8344f3 (MD5) Previous issue date: 2008-10-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present work describes the search of bioactive secondary metabolites isolated from plants, against enzymes: gGAPDH (glyceraldehydes-3- phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi and lysosomal cathepsins K, V, L and S. This work is divided in two parts: Part I: Study of the oil from the nut shells of Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - Chagas disease, a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, is a major public health problem affecting millions of individuals in Latin America. On the basis of the essential role in the life cycle of T. cruzi, the enzyme gGAPDH has been considered an attractive target for the development of novel antitrypanosomatid agents. From the dicloromethane extract of A. occidentale were isolated phenolic compounds which were investigated on their inhibition activity against gGAPDH and trypomastigote forms of T. cruzi. The most promising compound was the 6-n-pentadecylsalicylic acid (AC1) with IC50 values of 28 μM against gGAPDH and 66.7 μg/mL against trypomastigote forms. In addition, a detailed mechanistic characterization of the effects of AC1 on the T. cruzi gGAPDHcatalyzed reaction showed clear noncompetitive inhibition with respect to both substrate G-3-P and cofactor NAD+. Part II: Study of natural products and synthetic derivatives searching for inhibitors of lysosomal cysteine peptidases - After completing the human genome, eleven lysosomal cysteine peptidases were identified. Those enzymes are involved in general protein degradation. The lysosomal cysteine peptidases are found in various tissues and those are found in many organs. Cathepsin K is associated to bone resorption, cathepsin L to skin cancer, at last cathepsins V and S are associated to the immune system. In this work, four enzymes (cathepsins K, V, L and S) were selected as a molecular target for the identification of new inhibitors. Some potent inhibitors of cathepsin V were found, and a study including kinetic characterization of the most potent inhibitors, including potency (IC50), mechanism of action and constant Ki was carried out. The most promising compound is the acridone alkaloid citbrasine (107), with values of IC50 of 1.2 μM and Ki of 0.24 μM. Moreover, it was determined that citbrasine is a competitive inhibitor against cathepsin V in relation to the substrate ZFRMCA. Additionally, it was carried out the study of molecular modeling for acridone alkaloids that showed significant inhibition of cathepsin V. / Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos de plantas, com o intuito de serem avaliados contra as enzimas: gGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal) do Trypanosoma cruzi e as catepsinas lisossomais K, V, L e S. A descrição deste trabalho está dividida em duas partes. Parte I: Estudo do óleo das cascas da castanha de Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - A doença de Chagas, uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública que afeta milhões de pessoas na América Latina. Com base no papel essencial no ciclo de vida de T. cruzi, a enzima gGAPDH tem sido considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes tripanocidas. Do extrato diclorometânico das cascas da castanha de A. occidentale obtiveram-se compostos fenólicos que foram avaliados frente à enzima gGAPDH e as formas tripomastigotas de T. cruzi. A substância mais promissora foi o ácido 2-pentadecenil-6- hidroxibenzóico (AC 1), com valores de IC50 de 28 μM na enzima gGAPDH e 66,7 μg/mL nas formas tripomastigostas. Além disso, foi determinado que AC1 é um inibidor do tipo não-competitivo para a enzima gGAPDH em relação tanto ao substrato G-3-P (Ki = 2 μM ) quanto ao cofator NAD+ (Ki = 4 μM). Parte II: Estudo de produtos naturais e derivados sintéticos buscando inibidores de cisteíno peptidases lisossomais - Depois de completado o genoma humano, onze cisteíno peptidases lisossomais foram identificadas. Essas enzimas têm a função primária de degradar proteínas, de forma não seletiva, dentro do lisossomo e são encontradas em vários órgãos e tecidos. A catepsina K está associada ao processo de reabsorção óssea, catepsina L ao câncer de pele e as catepsinas V e S ao sistema imune. Neste trabalho, foram selecionadas quatro enzimas (catepsinas K, V, L e S) como alvos moleculares para a identificação de novos inibidores. Foi realizada a caracterização cinética dos inibidores mais potentes frente à catepsina V, através da potência biológica (IC50), mecanismo de ação e constante Ki. A substância mais promissora foi o alcalóide acridônico citibrasina (107), com valor de IC50 de 1,2 μM e Ki de 0,24 μM. Além disso, foi determinado que citibrasina é um inibidor do tipo competitivo para a catepsina V em relação ao substrato ZFRMCA. Adicionalmente foi realizado o estudo de modelagem molecular para os alcalóides acridônicos que apresentaram inibição significativa frente à catepsina V.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6532.pdf: 4134216 bytes, checksum: 66fda1fc89e3d69ae6b01c3cbca83d4e (MD5) Previous issue date: 2015-02-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cathepsin D is an aspartyl endopeptidase involved in many pathological processes when overexpressed. In addition, it is responsible for degradation of hemoglobin ingested by parasites of schistosomiasis. For these reasons cathepsin D is considered an important target for chemotherapeutic intervention. The assays commonly performed to evaluate the inhibition of this enzyme monitor reaction products generated from the cleavage of fluorogenic peptide substrates or human hemoglobin in the presence of inhibitors that may exhibit autofluorescence/absorbance at the same wavelength used. Considering this problem, this paper presents the development and application of four methodologies for cathepsin D assays. In two methodologies the assays were performed in solution, and in one of them was used isolated bovine cathepsin D, and the other employed an extract of proteins taken from Schistosoma mansoni adult worms. A third assay was developed to evaluate inhibitors by means of a CatD-IMER bioreactor coupled to a multidimensional system in which it is possible to monitor the immobilized enzyme activity directly by quantifying the product formed. Finally, the last methodology was carried out by immobilizing the substrate human hemoglobin in the quartz crystal. The hydrolysis of hemoglobin by cathepsin D was evaluated by using a Quartz Crystal Microbalance technique, a method that monitor the enzyme activity by mass variations. For the enzymatic assays, twenty plant extracts were evaluated, which led to the isolation and identification of the alkaloid evolitrine, the compound 4-hydroxy-3- methoxycinnamaldehyde and the flavonoids orientin and isovitexina. It were also tested 31 pure compounds, among them, the substance (Z)-2-(pentadec-5- enyl)benzene-1,4-diol, which showed significant activity both against the isolated enzyme as the protein extract of S. mansoni. Finally, recombinant cathepsin D from S. mansoni was cloned and expressed using E. coli system, and in vitro studies of isolated natural product compounds showed excellent results regarding the limonoid cedrelona against somules and adult worms of S. mansoni. / A catepsina D é uma aspartil endopeptidase envolvida em muitos processos patológicos quando expressa de forma desregulada. Além disso, é responsável pela degradação da hemoglobina ingerida por parasitos causadores da esquistossomose. Por esses motivos a catepsina D é considerada um alvo importante na busca de inibidores. Os ensaios comumente realizados para avaliação da inibição dessa enzima monitoram produtos reacionais gerados a partir da clivagem de substratos peptídicos fluorogênicos ou a hemoglobina humana, na presença de inibidores, que podem apresentar autofluorescência/absorbância nos mesmos comprimentos de onda utilizados. Considerando esta problemática, este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de quatro metodologias para a realização de ensaios com a catepsina D. Em duas metodologias os ensaios são realizados em solução, sendo que, em uma delas utiliza-se a catepsina D bovina isolada, e na outra se emprega um extrato de proteínas retirado de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Um terceiro ensaio foi desenvolvido para estudo de inibidores por meio do biorreator CatD-IMER acoplado a um sistema multidimensional no qual é possível monitorar a atividade da enzima imobilizada diretamente por meio da quantificação do produto formado. Por fim, a última metodologia foi desenvolvida imobilizando-se o substrato hemoglobina humana em cristal de quartzo. Sua hidrólise pela catepsina D foi avaliada por meio do uso da técnica de Microbalança de Cristal de Quartzo, uma metodologia que monitora a atividade enzimática através de variações de massa. Nos ensaios enzimáticos foram avaliados 20 extratos de plantas, que levaram ao isolamento e identificação do alcaloide evolitrina, do composto 4-hidroxi-3-metoxicinamaldeído e dos flavonoides orientina e isovitexina. 31 compostos puros também foram ensaiados e, dentre estes, a substância (Z)-2-(pentadec-5-enil)benzeno-1,4-diol se destacou apresentando uma atividade expressiva tanto frente à enzima isolada quanto em relação ao extrato de proteínas de S. mansoni. Para finalizar, a catepsina D recombinante de S. mansoni foi clonada e expressa em sistema E. coli, e ensaios in vitro com compostos isolados de produtos naturais mostraram excelentes resultados em relação ao limonoide cedrelona frente à esquistossômulos e vermes adultos de S. mansoni.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6656.pdf: 3440001 bytes, checksum: e741a521796c90cb1416917d9ca4cb14 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The aim of this work is search for cysteine proteases inhibitors using a bioactivity-guided assay. We have selected different plants for the initial screening. Among all evaluated extracts, the ones obtained from Myrcia lingua Berg. showed to be the most potent. Cathepsin B and L are cysteine proteases which play a role in the degradation of extracellular matrix and facilitate tumor progression. Among the obtained inhibitors, flavonoids were the most active against CTSB (IC50 values from 4.9 to 37.2 μM). On the other side, triterpenes were more potent against CTSL (IC50 values from 2.4 to 39.5 μM). The triterpenes showed competitive inhibition and the flavonoids showed uncompetitive inhibition. Aiming to explore enzyme inhibition on tumor cells, we report proteolysis assay using live cell 3D model that allows to localize and to quantify proteolysis in live triple negative breast cancer cells. The natural inhibitors isolated from plants were evaluated against proteases on cell lysate but did not demonstrate good inhibition and we decided to evaluate synthetic cathepsin B inhibitors. A dipeptide nitrile compound (JK_1) was synthesized and then complexed with ruthenium II (JK_2). Caged bioactive molecules that can be active upon irradiation became a strategy to reduce side effects in surrounding tissues and facilitate spatial control over cysteine protease activity. On pure enzyme activity assay JK_2 was less active under dark (IC50 3.4 μM) comparing with light irradiation (IC50 0.3 μM), corresponding to a ratio of 12:1. Proteolysis assay using live cell demonstrated the inhibition of DQ-collagen IV by reducing fluorescence. Thus, the outcomes of this study could contribute to identify new hits for the development of potential anticancer drugs, once live cell imaging proteolysis assay is useful for verifying the efficacy of cathepsin inhibitors prior to testing in in vivo models. / Este trabalho apresenta o estudo biomonitorado de espécies de plantas do cerrado paulista na busca de inibidores enzimáticos de catepsinas B e L. Dentre todos os extratos avaliados, a espécie Myrcia lingua Berg. se destacou pela elevada potência. Para avaliação da inibição enzimática foram selecionadas as catepsinas B e L, que são cisteíno proteases responsáveis pela degradação da matriz extracelular. Foram isolados compostos bioativos de diferentes classes sendo que os flavonoides foram os mais ativos sobre CTSB (IC50 entre 4,9 - 37,2 μM) e os triterpenos mais eficazes sobre CTSL (IC50 entre 2,4 - 39,5 μM). Os triterpenos foram identificados como inibidores competitivos da CTSL e os flavonoides como inibidores incompetitivos da CTSB. Com intuito de realizar investigação mais detalhada ao nível celular, optou-se por realizar ensaios de avalição da proteólise tumoral in vitro em linhagens de câncer de mama triplamente negativa. Os inibidores naturais apresentaram resultados pouco satisfatórios e com isso buscou-se avaliação de inibidores sintéticos de proteases. O composto sintético dipeptídeo nitrila (JK_1), inibidor da CTSB, foi complexado com rutênio II (JK_2) e através da reação de fotoativação buscou-se uma estratégia para delimitar a ação tecidual dos inibidores como forma de obter uma melhor localização do efeito terapêutico na região tumoral. Sobre a catepsina B o inibidor JK_2 foi menos ativo no escuro (IC50 3,4 μM) quando comparado ao exposto a radiação (IC50 0,3 μM) apresentando uma razão de 12:1. Nos ensaios de proteólise tumoral 3D vizualizou-se inibição da degradação de DQ-colágeno IV através da redução da fluorescência. Deste modo, os resultados obtidos contribuem para a busca de novos protótipos, uma vez que os ensaios proteolíticos em células permitem uma avaliação mais detalhada dos inibidores das proteases, antes de serem encaminhados para testes in vivo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1979.pdf: 2208972 bytes, checksum: e233199cf0f55587baf4e545b627b83a (MD5) Previous issue date: 2008-08-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work reports the quantification of NADH formed by an immobilized enzyme reactor (IMER) of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of T. cruzi using multidimensional high-performance liquid chromatography. For this, The IMER was used in the first dimension while an analytical C8 column was used in the second dimension. The conditions of the pre-treatment of the fused silica capillary tubes and the covalent immobilization of the enzyme into the capillary were successfully optimized, resulting in increased enzymatic activity and stability. Kinetic studies for the T. cruzi GAPDH-IMER were carried out to verify the influence of the immobilization over the enzyme affinity for the substrate and cofactor. The kinetic results for the IMERs of human and parasite GAPDH enzymes were compared to those obtained with the enzymes in solution, and showed that the covalent immobilization method used affected mainly the affinity of the human enzyme for the substrate. The human and parasite GAPDH-IMERs were employed for the ligand screening. The ligands recognized by the IMERs were the same identified by the enzymes in solution, showing that the immobilized enzymes kept the ability of recognizing the activity compounds modulators. The IMERs demonstrated to be a useful tool also for inhibitors binding reversibility characterization. In view of the high costs and difficulties involved on enzyme purification, the methods described in this work represents a valuable way of preserving enzyme activity and carrying out a variety of biochemical experiments. / Este trabalho descreve a quantificação do NADH formado pela reação do biorreator da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de T. cruzi usando cromatografia liquida de alta eficiência multidimensional. Para isto, o biorreator foi usado na primeira dimensão e uma coluna analítica C8 na segunda dimensão. As etapas de pré-tratamento dos capilares de s匀ica fundida e da imobilização covalente da enzima, neste suporte, foram otimizadas com sucesso, resultando no aumento da atividade e da estabilidade da enzima. Os estudos cin騁icos para a enzima GAPDH-Tc imobilizada foram realizados para verificar se o método de imobilização empregado afetou a afinidade da enzima pelo substrato ou cofator. Os resultados obtidos com os biorreatores das enzimas GAPDH-Tc e humana foram comparados 瀲ueles obtidos com as enzimas em solução, e evidenciaram que o método de imobilização covalente afetou principalmente a afinidade da enzima humana pelo substrato. Os biorreatores das enzimas do parasita e humana foram empregados para a triagem de ligantes. Os ligantes reconhecidos pelos biorreatores foram os mesmos identificados pelas enzimas em solução, evidenciando que a enzima imobilizada reteve a capacidade de reconhecer os compostos capazes de modular a atividade enzim疸ica. Os biorreatores mostraram-se uma ferramenta 偀il na caracterização dos inibidores quanto ・reversibilidade da ligação. Considerando os altos custos e as dificuldades envolvidas na purificação de enzimas, os procedimentos descritos neste trabalho representam um valioso método para preservar a atividade enzim疸ica e para a realização de uma variedade de ensaios bioquímicos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3752.pdf: 3408960 bytes, checksum: 6c7acb0ed95bf974942c00994cacd869 (MD5) Previous issue date: 2011-01-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present work describes the search of bioactive secondary metabolites in plant species of genus Zanthoxylum and synthetic derivatives seeking specific inhibitors of cathepsins L and V. The natural products are involved in approximately 50% of all drugs marketed. Cathepsins represent a class of enzymes that has the primary function of randomly degrade proteins at lysosomes, but are also involved in different pathologies, such as, atherosclerosis, rheumatoid arthritis, osteoporosis and various cancers. This work was carried out monitoring Zanthoxylum extracts by fluorimetric assays and by Highperformance liquid chromatography (HPLC). Among the species studied, the most promising extracts were methanol and dichloromethane extracts of Zanthoxylum acuminatum, the latter being selected for isolation. The chromatographic methodology afforded the isolation of a triterpene: lupeol (1), the coumarins umbelliferone (2), heradenol (3), nordentatin (4), anisocoumarin (5), derivated of 6´,7´-epoxy-7-geranyloxycoumarin (6); canthinonic alkaloids 5-methoxycantin-6-one (7), 4,5-dimehoxycantin-6-ona (8); β-carboline alkaloid; 7-hydroxi-1-ethyl-β-carboline (9); and acridone alkaloid arborinine (10). All were tested at concentration of 25 mM and coumarin 5 inhibited over 50%, showing more activity and selective against cathepsin L. The value potency (IC50) of this compound was 30 μM for cathepsin L and 102 μM for cathepsin V. Furthermore, were determined the potency values, selectivity and mechanism of action acridones alkaloids isolated from Swinglea glutinosa, N-aryl anthranilic acids, synthetic acridone alkaloids and a series of alkaloids 4-quinoline-2-substituted. The most promising compound was the alkaloid acridone AC_05 with a IC50 of 0.5 μM and Ki of 0.18 μM. Moreover, the compound AC_05 presented as a competitive inhibitor against both cathepsins, which is consistent with the interaction model proposed by molecular modeling. / Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos em espécies de plantas do gênero Zanthoxylum e a partir de derivados sintéticos visando inibidores específicos das catepsinas L e V. Os produtos naturais estão envolvidos em cerca de 50% de todos os fármacos comercializados. As catepsinas representam uma classe de enzimas que têm função primária de degradar aleatoriamente proteínas nos lisossomos e também estão envolvidas em diferentes patologias, tais como aterosclerose, artrite reumatóide, osteoporose e diferentes tipos de cânceres. Neste trabalho foi realizado o monitoramento dos extratos do gênero Zanthoxylum por ensaios fluorimétricos e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Dentre as espécies avaliadas, os extratos mais promissores foram os extratos metanólico e diclorometânico e de Zanthoxylum acuminatum, sendo este último selecionado para isolamento. A metodologia cromatográfica levou ao isolamento de um triterpeno; o lupeol (1), as cumarinas; a umbeliferona (2), heradenol (3), nordentatina (4), anisocumarina (5),derivado do 6´, 7´-epoxi-7-geraniloxicumarina (6); alcalóides do tipo cantinônicos; 5-metoxicantin-6-ona (7), 4,5-dimetoxicantin-6-ona (8); um alcalóide β-carbonílico; 7- hidroxi-1-etil-β-carbolina (9); e um do tipo acridônico; arborinina (10). Todos foram ensaiados na concentração de 25 μM e a cumarina 5 apresentou inibição superior a 50%, mostrando maior ativade e seletivade frente a catepsina L. O valor de potência (IC50) deste composto foi 30 μM para a catepsina L e de 102 μM para a catepsina V. Além disso, foram determinados os valores de potência, seletividade e mecanismo de ação para alcalóides acridônicos isolados de Swinglea glutinosa, ácidos N-aril antranílicos, alcalóides acridônicos sintéticos e uma série de alcalóides 4- quinolínicos-2-substituídos. O composto considerado mais promissor foi o alcalóide acridônico AC_05, com valor IC50 de 0,5 μM e Ki 0,18 μM. Além disto, este composto AC_05 apresentou-se como um inibidor competitivo frente as duas catepsinas, estando de acordo com o modelo de interação proposto por modelagem molecular.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objectives of this study were to characterize root-knot and lesion nematode populations of sugar cane fields of the Rio Grande do Sul state, and to evaluate the reaction of sugar cane genotypes to Meloidogyne javanica and Pratylenchus zeae. The Meloidogyne spp. populations were characterized biochemically by esterase (Est), and morphologically by the configuration of perineal region of females. The Pratylenchus populations were identified by morphological and morphometric characters. Subsequently, the reaction of ten sugar cane cultivars to M. javanica and P. zeae was evaluated at greenhouse conditions. Ninety Meloidogyne sp. populations were detected of in 67.17% of collected samples and 12 esterastic phenotypes (Est) were identified. Among the root-knot nematode populations purified and identified, 32 of them presented the Est J3 phenotype (Rm: 1.00; 1.24; 1.40), 51 populations, Est J2 (Rm: 1.00; 1.23), and four populations the phenotype Est J2a (Rm : 1.00; 1.40), typical of M. javanica, that corresponded to 19.75%, 31.48% and 2.47% of the samples, respectively. Four populations of M. incognita Est I1 (Rm: 1.02), and 25 of M. incognita Est I2 (Rm: 1.02; 1:09) phenotypes, corresponding to 2.47% and 15.43% of Meloidogyne spp. samples, respectively, were also detected and identified. In addition, 12 populations were identified as M. arenaria Est A2 (Rm: 1.26, 1.32), three populations of M. ethiopica Est E3 (Rm: Rm: 0.92; 1.15; 1.32), three of M. hapla Est. H1 (Rm: 1.17), and just one of M. luci (Rm: 1.00; 1.16; 1.34), corresponding to 7.41, 1.85, 1.85 and 0.62% of the root-knot nematode populations, respectively. Among the atypical species detected in this study, six populations of Meloidogyne sp.1 were identified with the phenotype Est Sc 1 (Rm: 0.86; 0.94), 12 Meloidogyne sp.2 as Est Sc 2 (Rm: 1.05; 1.29), and nine Meloidogyne sp.3 as Est A1 (Rm: 1.26), corresponding to 4.47, 9.05, and 6.71% of the root-knot nematodepopulations, respectively. However, by the perineal configurations, these populations could not be identified. Pratylenchus spp. was detectedin 98,8% of the collected samples. In the samples morphologica and morphometrically characterized to species of Pratylenchus, 51 populations were identified as P. zeae (84.61%) and 23 populations as P. brachyurus (35.38%). Evaluating the resistance reaction of sugar cane genotypes to both nematodes, although M. javanica and P. zeae have showed FR> 1.00 for all tested genetic materials, it was verified different levels of susceptibility. However, lower M. javanica reproduction was observed in RB008347, RB877935, RB975944, and 'RB987932; and either for P. zeae in RB987932 and RB966928 genotypes. / Teve-se por objetivo neste estudo caracterizar as populações do nematoide das galhas e das lesões em um levantamento realizado em lavouras de cana-de-açúcar do Estado do Rio Grande do Sul; e, avaliar a reação de genótipos da cultura as espécies Meloidogyne javanica e Pratylenchus zeae. As populaçõesde Meloidogyne spp. obtidas foram caracterizadas bioquimicamente através da isoenzima esterase (Est), e morfologicamente através da configuração da região perineal das fêmeas. As populações de Pratylenchus foram identificadas por meio de caracteres morfológicos e morfométricos. Posteriormente, avaliou-se em casa de vegetação a reação de 10 genótipos de cana-de-açúcar a M. javanica e P. zeae. Detectou-se 90 populações de Meloidogyne spp. em 67,17% das amostras coletadas e identificou-se 12 fenótipos esterásticos (Est). Entre as populações do nematoide das galhas purificadas e identificadas, 32 apresentaramo fenótipo Est J3 (Rm: 1.00; 1.24; 1.40), 51 populações, Est J2 (Rm: 1,00; 1,23), e, quatro com o fenótipo Est J2a (Rm: 1.00; 1.40), tipicas de M. javanica, as quais corresponderam a 19,75%, 31,48% e 2,47%, respectivamente. Também foram detectadas e identificadas quatro populações de M. incognita Est I1 (Rm: 1.02) e 25 com o fenótipo Est I2 (Rm: 1.02; 1.09), as quais corresponderam a 2,47 % e 15,43% das amostras de Meloidogyne spp., respectivamente. Além disso, foram identificadas 12 populações de M. arenaria Est A2 (Rm: 1.26; 1.32), três de M. ethiopica Est E3 (Rm: 0.92, 1.15, 1.32), três de M. hapla Est H1 (Rm: 1.17), e uma de M. luci (Rm: 1.00; 1.16; 1.34) que corresponderam a 7,41, 1,85, 1,85 e 0,62% das populações encontradas, respectivamente. Entre as populações atípicas, foram detectadas seis populações de Meloidogyne sp.1 com o fenótipo Est Sc 1 (Rm: 0.86; 0.94), 12 de Meloidogyne sp.2 Est Sc 2 (Rm: 1.05; 1.29) e nove de Meloidogyne sp.3 Est A1 (Rm: 1.26), correspondendo a 4,47, 9,05, e 6,71% das populações do nematoide das galhas, respectivamente; no entanto, pelas configurações perineais,essas populações não puderam ser identificadas. Detectou-se Pratylenchus spp. em 98,8% das amostras coletadas. Nas amostras caracterizadas morfologicamente quanto às espécies do gênero Pratylenchus, foram identificadas 51 populações de P.zeae (84,61%)e 23 populações de P. brachyurus (35,38%). Na avaliação da reação da cana-de-açúcar aos dois nematoides, embora M. javanica e P. zeae tenham apresentado FR>1,00 em todos os genótipos testados, observou-se diferentes níveis de suscetibilidade; porém, menor reprodução de M. javanicafoi observada nos genótipos RB008347, RB877935, RB975944 e RB987932; e de P. zeae em RB987932 e RB966928.

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No. of bitstreams: 1 DissTLS.pdf: 2364039 bytes, checksum: 1ad7c970d8a6bfb5f467365e9eac2564 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / This work describes the isolation of bioactive secondary metabolites of the plant species Bowdichia virgilioides in the search for selective inhibitors of cathepsins K, L and V. Cathepsins are enzymes that have as primary function the degradation of proteins in the lysosomes, and are also related to development of diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, atherosclerosis and various cancers. This dissertation describes the bioactivity-guided study of the ethanol extracts and fractions obtained from the stems and leaves of B. virgilioides through fluorimetric inhibition assay of the enzymes studied. The extracts of B. virgilioides were subjected to successive fractionations using different chromatographic techniques leading to several pure substances. The isolated substances had their structures elucidated by NMR uni- and bi-dimensional and mass spectrometry. The hexane and ethyl acetate fractions of stem afforded eleven substances: 2 triterpenes, lupeol and lupenona; the mixture of steroids β-sitosterol and stigmasterol; 1 ester derivative of trans pcoumaric acid; 1 furofuran lignan, syringaresinol; 1Benzofuran derivative, bowdenol; 1 coumestrol derivative, 8-methoxycoumestrol, and 3 isoflavones, 7,3'-dihydroxy-4'- methoxyisoflavone, 5,4'-dihydroxy-7'-methoxyisoflavone and 4-hydroxy-7-methoxyisoflavone. All compounds were tested on their ability to inhibit the enzymes at a concentration of 100μM. 8-Methoxycoumestrol showed inhibition superior to 70% for cathepsin V. The potency of this inhibitor was determined and the IC50 value was found to be 17.4 ± 1.0μM for cathepsin V. The ester derivative of trans p-coumaric acid also showed good inhibition above 70% for cathepsin L and V at a concentration of 50μg/mL. So, a series of 8 esters derived from p-hydroxybenzoic acid, p-coumaric acid, cinnamic and ferulic were prepared, and have been evaluated regarding their inhibitory activities of the cathepsins at a concentration of 100μM. n-Octyl pcoumarate ester showed the best percentage inhibition for the three enzymes. The constituents of the hexane fraction of leaves of B. virgilioides were analyzed using the techniques 1H NMR and GC-MS. / Este trabalho descreve o isolamento de metabólitos secundários bioativos da espécie vegetal Bowdichia virgilioides buscando inibidores seletivos das catepsinas K, L e V. As catepsinas são enzimas que têm como função primária a degradação de proteínas nos lisossomos e também estão relacionadas ao desenvolvimento de doenças como osteoporose, artrite reumatoide, aterosclerose e diferentes tipos de cânceres. Neste projeto foi realizado o estudo biomonitorado dos extratos etanólicos do caule e das folhas das respectivas frações obtidas de B. virgilioides por ensaio fluorimétrico de inibição frente às enzimas estudadas. Os extratos de B. virgilioides foram submetidos a sucessivos fracionamentos utilizando diferentes técnicas cromatográficas levando a várias substâncias puras. As substâncias isoladas tiveram suas estruturas elucidadas por RMN uni- e bi-dimensionais e espectrometria de massas. O estudo das frações hexânica e de acetato de etila do caule resultou no isolamento de onze substâncias sendo 2 triterpenos: lupeol e lupenona; a mistura dos esteroides β-sitosterol e estigmasterol; 1 éster derivado do ácido trans pcumárico; 1 lignana furofurânica: siringaresinol; 1 derivado benzofurano: bowdenol; 1 derivado do cumestrol: 8-metoxicumestrol e 3 isoflavonas: 7, 3’-diidroxi-4’metoxiisoflavona, 5, 4’-diidroxi-7’-metoxi-isoflavona e 4-hidroxi-7-metoxi-isoflavona. Todas foram ensaiadas na concentração de 100 μM. O 8-metoxicumestrol apresentou inibição superior a 70% para a catepsina V. A potência deste inibidor foi determinada e o valor de IC50 encontrado foi de 17,4 ± 1,0 μM frente à catepsina V. O éster derivado do ácido trans p-cumárico apresentou inibição superior a 70% para as catepsinas L e V na concentração de 50μg/mL. Então, foram preparados uma série de 8 ésteres derivados dos ácidos p-hidroxibenzóico, p-cumárico, cinâmico e ferúlico, que foram avaliados com relação às suas atividades inibitórias frente às catepsinas estudas na concentração de 100μM. O ester p-Cumarato de n-octila apresentou melhor porcentagem de inibição para as três enzimas. Os constituintes da fração hexânica das folhas de B. virgilioides foram analisados em mistura utilizando as técnicas de RMN 1H e CG-EM.

O presente trabalho teve por objetivo estudar a herança genética, determinar o melhor protocolo de extração de DNA para esta espécie, e identificar marcadores moleculares associados à resistência de leiteiro (Euphorbia heterophylla L.) aos herbicidas inibidores da ALS e da PROTOX. A herança genética da resistência foi determinada a partir de cruzamentos entre os biótipos de E. heterophylla suscetível (S) e resistente (R), retrocruzamentos e avanço de geração para F2. A dominância completa da resistência foi comprovada com curvas de dose resposta. Foram testados dez protocolos de extrações de DNA adaptados de métodos descritos na literatura. Os iniciadores específicos para os genes ALS e PROTOX foram desenhados a partir da sequência de DNA consenso destes genes, obtida pelo alinhamento das espécies Manihot esculenta e Ricinus communis. Adicionalmente, foi testada a transferibilidade de vinte marcadores SSRs (sequências simples repetidas) desenhados para o genoma de Manihot esculenta, pois dentre espécies de Euphorbiaceae com maior número de marcadores SSRs desenvolvidos, é a espécie filogeneticamente mais próxima de E. heterophylla. Em relação à herança genética, as frequências observadas nas gerações F1, F2, RCs e RCr não diferiram estatisticamente das frequências esperadas para característica controlada por dois genes dominantes para resistência múltipla e um gene dominante para resistência simples aos inibidores da ALS e PROTOX. Os níveis similares de resistência observados para o heterozigoto F1 e o biótipo homozigoto R, para doses de até 2000 g i.a. ha-1 de fomesafen e doses de até 800 g i.a. ha-1 de imazethapyr, confirmam a dominância completa da resistência aos inibidores da PROTOX e ALS, respectivamente. O protocolo 0,2%BME possibilitou a extração de 7,083 ng μL-1 de DNA, sendo estatisticamente (P=0,05) superior aos demais protocolos. Os compostos fenólicos contaminaram o DNA extraído pelos protocolos FENOL e 3%BME+TB, mas a adição de polivinilpirrolidona (PVP40) no tampão de extração do protocolo 3%BME+TA solucionou este problema. Os iniciadores desenhados para os genes ALS e PROTOX não amplificaram ou não apresentaram polimorfismo visível em gel de agarose entre os biótipos S e R de E. heterophylla. Dez marcadores SSR foram transferidos para E. heterophylla e destes, seis iniciadores apresentaram polimorfismo entre os biótipos S e R. / This study aimed to assess the genetic inheritance, determine the better DNA isolation protocol for this species and to identify molecular markers associated with the Wild Poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) resistance ALS- and PROTOX- inhibiting herbicides and. The genetic inheritance of resistance was determined from crosses between E. heterophylla biotypes susceptible (S) and resistant (R), backcrosses and F2 generation. The complete dominance of resistance was confirmed with dose response curves. Ten adjusted methods for DNA isolation described in the literature were tested. The specific primers for ALS and PROTOX genes were designed from the consensus DNA sequence of these genes, obtained by aligning the gene sequences of the species Manihot esculenta and Ricinus communis L. Additionally, it was assessed the transferability of twenty SSR (simple sequence repeat) markers designed for Manihot esculenta, because among the species of Euphorbiaceae with more developed SSRs markers, because it is the closest relative phylogenetic species of E. heterophylla. Regarding genetic inheritance, the frequencies observed in the F1, F2, RCs and RCr did not differ significantly from the expected frequencies for a trait controlled by two dominant genes for multiple resistance and a single dominant gene for simple resistance to ALS- and PROTOX-inhibiting herbicides. The similar levels of resistance to dosage up to 2000 g i.a. ha-1 of fomesafen and dosage up to 800 g i.a. ha-1 of imazethapyr observed in F1 (heterozygous) and homozygous R biotype confirm the complete dominance of resistance to PROTOX- and ALS-inhibiting herbicides, respectively. The 0.2%BME protocol allowed the isolation of 7,083 ng μL-1 DNA, significantly (P=0.05) higher than other methods. Co-isolation of phenolic compounds was observed in FENOL and 3%BME+TB methods, but the addition of polyvinylpyrrolidone (PVP40) in the protocol extraction buffer 3%BME+TA solved this problem. The primers designed for ALS and PROTOX genes amplified but not showed no visible polymorphism in agarose gel between the S and R biotypes of E. heterophylla. Regarding the SSR transferability, ten markers were transferred to E. heterophylla, however, these six primers showed polymorphism among S and R biotypes.

O presente trabalho teve por objetivo estudar a herança genética, determinar o melhor protocolo de extração de DNA para esta espécie, e identificar marcadores moleculares associados à resistência de leiteiro (Euphorbia heterophylla L.) aos herbicidas inibidores da ALS e da PROTOX. A herança genética da resistência foi determinada a partir de cruzamentos entre os biótipos de E. heterophylla suscetível (S) e resistente (R), retrocruzamentos e avanço de geração para F2. A dominância completa da resistência foi comprovada com curvas de dose resposta. Foram testados dez protocolos de extrações de DNA adaptados de métodos descritos na literatura. Os iniciadores específicos para os genes ALS e PROTOX foram desenhados a partir da sequência de DNA consenso destes genes, obtida pelo alinhamento das espécies Manihot esculenta e Ricinus communis. Adicionalmente, foi testada a transferibilidade de vinte marcadores SSRs (sequências simples repetidas) desenhados para o genoma de Manihot esculenta, pois dentre espécies de Euphorbiaceae com maior número de marcadores SSRs desenvolvidos, é a espécie filogeneticamente mais próxima de E. heterophylla. Em relação à herança genética, as frequências observadas nas gerações F1, F2, RCs e RCr não diferiram estatisticamente das frequências esperadas para característica controlada por dois genes dominantes para resistência múltipla e um gene dominante para resistência simples aos inibidores da ALS e PROTOX. Os níveis similares de resistência observados para o heterozigoto F1 e o biótipo homozigoto R, para doses de até 2000 g i.a. ha-1 de fomesafen e doses de até 800 g i.a. ha-1 de imazethapyr, confirmam a dominância completa da resistência aos inibidores da PROTOX e ALS, respectivamente. O protocolo 0,2%BME possibilitou a extração de 7,083 ng μL-1 de DNA, sendo estatisticamente (P=0,05) superior aos demais protocolos. Os compostos fenólicos contaminaram o DNA extraído pelos protocolos FENOL e 3%BME+TB, mas a adição de polivinilpirrolidona (PVP40) no tampão de extração do protocolo 3%BME+TA solucionou este problema. Os iniciadores desenhados para os genes ALS e PROTOX não amplificaram ou não apresentaram polimorfismo visível em gel de agarose entre os biótipos S e R de E. heterophylla. Dez marcadores SSR foram transferidos para E. heterophylla e destes, seis iniciadores apresentaram polimorfismo entre os biótipos S e R. / This study aimed to assess the genetic inheritance, determine the better DNA isolation protocol for this species and to identify molecular markers associated with the Wild Poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) resistance ALS- and PROTOX- inhibiting herbicides and. The genetic inheritance of resistance was determined from crosses between E. heterophylla biotypes susceptible (S) and resistant (R), backcrosses and F2 generation. The complete dominance of resistance was confirmed with dose response curves. Ten adjusted methods for DNA isolation described in the literature were tested. The specific primers for ALS and PROTOX genes were designed from the consensus DNA sequence of these genes, obtained by aligning the gene sequences of the species Manihot esculenta and Ricinus communis L. Additionally, it was assessed the transferability of twenty SSR (simple sequence repeat) markers designed for Manihot esculenta, because among the species of Euphorbiaceae with more developed SSRs markers, because it is the closest relative phylogenetic species of E. heterophylla. Regarding genetic inheritance, the frequencies observed in the F1, F2, RCs and RCr did not differ significantly from the expected frequencies for a trait controlled by two dominant genes for multiple resistance and a single dominant gene for simple resistance to ALS- and PROTOX-inhibiting herbicides. The similar levels of resistance to dosage up to 2000 g i.a. ha-1 of fomesafen and dosage up to 800 g i.a. ha-1 of imazethapyr observed in F1 (heterozygous) and homozygous R biotype confirm the complete dominance of resistance to PROTOX- and ALS-inhibiting herbicides, respectively. The 0.2%BME protocol allowed the isolation of 7,083 ng μL-1 DNA, significantly (P=0.05) higher than other methods. Co-isolation of phenolic compounds was observed in FENOL and 3%BME+TB methods, but the addition of polyvinylpyrrolidone (PVP40) in the protocol extraction buffer 3%BME+TA solved this problem. The primers designed for ALS and PROTOX genes amplified but not showed no visible polymorphism in agarose gel between the S and R biotypes of E. heterophylla. Regarding the SSR transferability, ten markers were transferred to E. heterophylla, however, these six primers showed polymorphism among S and R biotypes.