Orientadores: Francisco Maugeri Filho, Rubens Maciel Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-18T03:50:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_MariaIsabel_D.pdf: 3990444 bytes, checksum: 20b412447dd741ce34501deea5834cf8 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Neste trabalho é considerado um processo contínuo de purificação de enzimas baseado no princípio da cromatografia por afinidade constituído de um estágio de adsorção e outro de desorção interligados, ambos do tipo CSTR, com reciclo da resina. O processo foi modelado matematicamente através dos balanços de massa e equações cinéticas (modelo determinístico) obtendo-se um sistema de equações diferenciais ordinárias (E.D.O.), com resolução numérica por Runge-Kutta 4ª ordem para o estado transiente e resolução analítica para estudos no estado estacionário. Com o intuito de verificar a influência dos parâmetros operacionais e cinéticos no rendimento e produtividade do processo, foi realizado um estudo de análise paramétrica com cálculo do fator de sensibilidade dos parâmetros nas condições de estado estacionário. A dinâmica do processo foi estudada através de simulações no estado transiente, permitindo a escolha da vazão de alimentação no segundo estágio (F2), corno a melhor variável manipulável. O controle do processo foi considerado utilizando-se controladores clássicos do tipo "feedback" com leis de controle PI (proporcional-integral) e PID (proporcional-integral-derivativo). Ambos mostraram-se bastante eficientes mesmo com significantes atrasos na medida da variável que se deseja controlar. Posteriormente, urna estratégia de controle não convencional do tipo "feedback-feedforward" foi desenvolvida e analisada, permitindo urna operação mais robusta com relação aos atrasos na análise, sem prejuízo da performance do processo. Através da metodologia de planejamento experimental e análise da superfície de resposta foi investigada a otimização do sistema, sendo possível então estabelecer faixas de operação das variáveis do processo visando a maxirnização do rendimento e da produtividade dentro das limitações operacionais. / Abstract: The CARE (Continuous Adsorption Recycling Extraction) system, studied m this work, is a continuous enzyme purification process, which consists of two well mixed reactors with solid adsorbed recycle, containing one adsorbing stage (1st reactor) and one desorbing stage (2nd reactor). A mathematical model based on fundamental mass balances and adsorption kinetics has been developed (deterministic model). A set of ordinary deferential equations numerically integrated using the 4th order Runge-Kutta's method, was obtained. The parametric analysis and parameters sensitivity studies were performed considering steady state behavior. The appropriate manipulated variable, the flow rate at the 2nd stage, was determined from the dynamic responses of the system, so that the control structure could be defined. Firstly, classical PI (proportional-integral) and PID (proportional-integral derivative) feedback control strategies were studied. Both of them showed good performance even when considerable time-delays in the on line analysis of the control variable were considered. Later, the non-conventional feedback - feed forward control strategy was also studied and showed a very robust operation since higher time-delays were successfully managed, without affecting the performance of the system. The optimization of the process, based on the maximization oí both recovery yield and productivity, was carried out using the response surface analysis method, so that the optimal ranges for the different variables could be determined. / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Resumo: Lipases são enzimas amplamente distribuídas nos seres vivos e apresentam a função biológica de hidrolisar ligações ésteres de triacilgliceróis, liberando diacilgliceróis, monoacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Dependendo da atividade de água estas enzimas catalisam outras reações como esterificação, transesterificação, aminólise e lactonização, importantes em diversas aplicações biotecnológicas dessas enzimas. Neste trabalho, uma linhagem de Candida viswanathii foi selecionada, entre outras noventa linhagens de fungos filamentosos e leveduras, como produtora de lipase e suas condições de cultivo foram estudadas em cultivos submersos e em substratos sólido, visando o aumento da produção da enzima. Outro objetivo deste trabalho também foi purificar, imobilizar e caracterizar a lipase produzida nas condições estabelecidas em cultivos submersos. Os resultados obtidos nos cultivos submersos indicaram que, entre as substâncias puras testadas, trioleína e ácido oléico foram os melhores indutores da atividade lipase. Contudo, as melhores condições de cultivo e produção de lipase foram alcançadas utilizando azeite de oliva 1,5% (m/v), extrato de levedura 0,2% (m/v), agitação de 210 rpm, pH 6,0, temperatura de 27,5 ºC, após 72 h de cultivo (biomassa 19,0 g/L; atividade 100 U). A adição de 0,1% (m/v) de lecitina de soja aumentou em 1,5 vezes a produção de lipase (147,5 U). A caracterização bioquímica da lipase do caldo fermentado revelou que se tratava de uma lipase ácida com pH ótimo de 3,5, propriedade descrita pela primeira vez para uma lipase do gênero Candida. A temperatura ótima foi de 40 ºC. Esta enzima bruta mostrou-se altamente estável na faixa de pH 4,0 a 5,0 e na temperatura de 40 ºC após 24 h (100%). Nos cultivos sólidos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lipases are widely distributed enzymes in animals, plants, bacteria, yeasts and fungi, which hydrolyses ester bonds of triacylglycerols and fatty acids. In addition, these enzymes also catalyse other reactions as esterification, transesterification, aminolysis and lactonization, depending their water activity. The ability of lipases to perform very specific chemical transformation and their enantioselective properties has made them increasingly popular in many biotechnological applications. In this work, Candida viswanathii was selected among ninety filamentous fungi and yeast strains, due to as its lipase activity and culture conditions were studied aiming to increase the enzyme production. Furthermore, this study aimed to purify, immobilize and characterize the lipase produced in submerged cultures. The results showed that triolein and oleic acid are the best inducers of lipase activity. However, the highest lipase production was obtained from 1.5% (w/v) olive oil and 0.2% (w/v) yeast extract in rotary shaker experiments at 27.5 ºC, pH 6.0 and 210 rpm, after 72 h (19.0 g/L biomass; 100 U lipase activity). The addition of 0.1% (w/v) soy lecithin increased 1.5-fold the lipase production (147.5 U). Biochemical characterization of the crude enzyme revealed an acid lipase with optimum pH of 3.5, a property first described in Candida genus. Optimum temperature activity was 40 ºC. Crude lipase was highly stable at pH 4.0 to 5.0 and at temperature 40 ºC during 24 h (100%). Solid substrates cultures from industrial byproducts, xiv the highest lipase production was obtained in wheat bran and barley spent grain (1:1), 40% (w/w) chicken fat, 3.5% (w/w) yeast extract, humidity 40% after 5 days, at 30°C (153 U/gds). Under these culture conditions, the lipase showed optimum activity at pH 5.0 and 50 ºC, and thermal enzyme stability at pH... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sâmia Maria Tauk-Tornisielo / Coorientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Carlos Renato Corso / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Rosa dos Prazeres Melo Furriel / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-17Bitstream added on 2014-06-13T18:44:35Z : No. of bitstreams: 1 almeida_af_dr_rcla.pdf: 976430 bytes, checksum: 62d71f04fc87fbdf0fbaee3d090185df (MD5) / Lipases são enzimas amplamente distribuídas nos seres vivos e apresentam a função biológica de hidrolisar ligações ésteres de triacilgliceróis, liberando diacilgliceróis, monoacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Dependendo da atividade de água estas enzimas catalisam outras reações como esterificação, transesterificação, aminólise e lactonização, importantes em diversas aplicações biotecnológicas dessas enzimas. Neste trabalho, uma linhagem de Candida viswanathii foi selecionada, entre outras noventa linhagens de fungos filamentosos e leveduras, como produtora de lipase e suas condições de cultivo foram estudadas em cultivos submersos e em substratos sólido, visando o aumento da produção da enzima. Outro objetivo deste trabalho também foi purificar, imobilizar e caracterizar a lipase produzida nas condições estabelecidas em cultivos submersos. Os resultados obtidos nos cultivos submersos indicaram que, entre as substâncias puras testadas, trioleína e ácido oléico foram os melhores indutores da atividade lipase. Contudo, as melhores condições de cultivo e produção de lipase foram alcançadas utilizando azeite de oliva 1,5% (m/v), extrato de levedura 0,2% (m/v), agitação de 210 rpm, pH 6,0, temperatura de 27,5 ºC, após 72 h de cultivo (biomassa 19,0 g/L; atividade 100 U). A adição de 0,1% (m/v) de lecitina de soja aumentou em 1,5 vezes a produção de lipase (147,5 U). A caracterização bioquímica da lipase do caldo fermentado revelou que se tratava de uma lipase ácida com pH ótimo de 3,5, propriedade descrita pela primeira vez para uma lipase do gênero Candida. A temperatura ótima foi de 40 ºC. Esta enzima bruta mostrou-se altamente estável na faixa de pH 4,0 a 5,0 e na temperatura de 40 ºC após 24 h (100%). Nos cultivos sólidos... / Lipases are widely distributed enzymes in animals, plants, bacteria, yeasts and fungi, which hydrolyses ester bonds of triacylglycerols and fatty acids. In addition, these enzymes also catalyse other reactions as esterification, transesterification, aminolysis and lactonization, depending their water activity. The ability of lipases to perform very specific chemical transformation and their enantioselective properties has made them increasingly popular in many biotechnological applications. In this work, Candida viswanathii was selected among ninety filamentous fungi and yeast strains, due to as its lipase activity and culture conditions were studied aiming to increase the enzyme production. Furthermore, this study aimed to purify, immobilize and characterize the lipase produced in submerged cultures. The results showed that triolein and oleic acid are the best inducers of lipase activity. However, the highest lipase production was obtained from 1.5% (w/v) olive oil and 0.2% (w/v) yeast extract in rotary shaker experiments at 27.5 ºC, pH 6.0 and 210 rpm, after 72 h (19.0 g/L biomass; 100 U lipase activity). The addition of 0.1% (w/v) soy lecithin increased 1.5-fold the lipase production (147.5 U). Biochemical characterization of the crude enzyme revealed an acid lipase with optimum pH of 3.5, a property first described in Candida genus. Optimum temperature activity was 40 ºC. Crude lipase was highly stable at pH 4.0 to 5.0 and at temperature 40 ºC during 24 h (100%). Solid substrates cultures from industrial byproducts, xiv the highest lipase production was obtained in wheat bran and barley spent grain (1:1), 40% (w/w) chicken fat, 3.5% (w/w) yeast extract, humidity 40% after 5 days, at 30°C (153 U/gds). Under these culture conditions, the lipase showed optimum activity at pH 5.0 and 50 ºC, and thermal enzyme stability at pH... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Silvio Silvério da Silva / Banca: Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi / Banca: Elisa Helena Giglio Ponsano / Banca: Roberto da Silva / Resumo: Xilanases e β-xilosidases são as principais enzimas responsáveis pela degradação da xilana, o segundo principal constituinte da parede celular vegetal. Tanto a produção destas enzimas por micro-organismos, quanto a caracterização bioquímica das mesmas têm sido amplamente estudadas devido às suas inúmeras aplicações biotecnológicas. Neste trabalho, as principais xilanase e β-xilosidase produzidas por uma linhagem de Penicillium janczewskii em meio de cultura líquido foram purificadas por métodos clássicos de purificação de proteínas, sendo, posteriormente, caracterizadas bioquimicamente. A xilanase apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 65 °C e a β-xilosidase em pH 5,0 e a 75 °C. Ambas as enzimas apresentaram características interessantes principalmente com relação à atividade ótima de ambas as enzimas em elevadas temperaturas, a prolongada estabilidade da β-xilosidase a 60 °C, e a estabilidade da xilanase em pH mais alcalinos, considerando-se algumas de suas possíveis aplicações. Visando uma futura aplicação, a produção destas enzimas foi avaliada em cultivos sólidos utilizando-se como substrato o bagaço de malte, resíduo da indústria cervejeira. As melhores condições para produção enzimática foram: utilização da umidade inicial do substrato de 50% fornecida com solução de sais de Vogel, tempo de cultivo de sete dias a 25 °C para produção de xilanases e a 20 °C para produção de b-xilosidases. O material fermentado apresentou aumento no teor protéico, na quantidade de alguns aminoácidos essenciais e ausência de micotoxinas. Ainda com um enfoque ambiental o filtrado de cultura de P. janczewskii, produzido em condições anteriormente selecionadas, foi aplicado no biobranqueamento de uma polpa kraft de eucalipto pré-branqueada com oxigênio, sendo realizados ensaios para seleção da concentração de xilanases e do tempo de reação / Abstract: Xylanases and β-xylosidases are the main enzymes responsible for the degradation of xylan, the second main constituent of plant cell walls. The production of these enzymes by microorganisms, and their biochemical characterization has been extensively studied due to their wide range of biotechnological applications. In this work, the main xylanase and β-xylosidase produced in liquid cultures by a Penicillium janczewskii strain were purified by classical methods of protein purification, and further biochemically characterized. The xylanase showed optimal activity at pH 6.0 and 65 °C and β-xylosidases at pH 5.0 and 75 °C. Considering some possibilities of applications, the enzymes presented interesting characteristics especially in relation to the optimal activity at high temperatures, the prolonged stability of the β-xylosidase at 60 °C, and the stability of the xylanase in alkaline pH. Aiming at a future application, the production of these enzymes was investigated in solid state fermentation using brewer's spent grain, a residue of the brewing industry, as substrate. The optimized conditions were: 50% initial substrate moisture supplied by Vogel's salt solution, culturing for 7 days at 25 °C for xylanase production and at 20 °C for b-xylosidase production. The fermented substrate showed increase in protein content, in the amount of some essential amino acids, and absence of mycotoxins. Maintaining the environmental focus, the P. janczewskii crude filtrate, produced under previously selected conditions, was applied in the biobleaching of eucalyptus kraft pulp pre-bleached with oxygen. Trials were conducted for the selection of xylanase concentration and reaction time / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-26Bitstream added on 2014-06-13T20:21:35Z : No. of bitstreams: 1 santos_mc_dr_araiq.pdf: 1124332 bytes, checksum: 1e349d4a6fad699f76e186f17e5de53c (MD5) / Outros / As peroxidases são hemeproteínas que catalisam a oxidação de vários xenobióticos na presença de peróxido. A soja é um dos principais produtos de exportação do Brasil e sua manufatura gera subprodutos em grande escala. Um destes, a casca, é uma fonte rica em peroxidase (SBP). Para a otimização da extração da SBP de casca de soja, e condições de ensaio, foi utilizado um planejamento fatorial com metodologia de superfície de resposta, resultando em 128 experimentos. Os dados definiram o meio reacional da SBP: pH 4,5 (transgênicas) e pH 7,0 (tradicionais); temperatura 500C; tratamento do tegumento com obtenção do pó cetonico; NaCl 0,1 mol/L; volume de amostra da enzima 330mL, guaiacol 30mmol/L, H2O2 46 mmol/L, em tampão 50mmol/L. Após, iniciou-se os estudos da SBP de diferentes cultivares: convencionais (BRS 258, BRS 260, BRS 262) e transgênicas (BRS 255 RR, BRS Charrua RR e BRS Pampa RR) de cascas de soja fornecidas pela EMBRAPA, visando estudo comparativo sobre o conteúdo de peroxidase (SBP), e posterior seleção para isolamento da enzima e estudos de seus parâmetros cinéticos. Para isso, a amostra, em pó cetônico, de cada cultivar foi ressuspensa em tampão extrator, a proteína precipitada com sulfato de amônio 70%, o precipitado ressuspenso em tampão extrator e eluído em coluna Sephadex G-25, para dessanilização. Nas frações (eluatos) foram realizados os spots test para identificação de SBP. As cultivares BRS 258, BRS 262, BRS 260 e BRS 255 RR foram selecionadas com maior conteúdo de enzima SBP. Assim, volumes (5mL) de tais cultivares foram eluídos em coluna Sephadex G-100 para purificação parcial e determinação da massa molecular. Com as frações (eluatos) obteve-se “pool” de enzima, onde se efetuou os estudos cinéticos: efeito de cátions mono e divalentes, determinação dos parâmetros cinéticos - kM, vmax, pH ótimo, temperatura ótima... / The peroxidases are hemeproteins that catalyze the oxidation of various xenobiotics in the presence of peroxide. Soybean is a major export products from Brazil and its manufacture creates byproducts in large scale. One of these, the bark is a rich source of peroxidase (SBP). To optimize the extraction of the SBP of soybean seed coat, and test conditions, we used a factorial planning with response surface methodology, resulting in 128 experiments. The data defined the reaction medium SBP pH 4.5 (transgenic) and pH 7.0 (traditional), temperature 500C; treatment of sample to obtain the “acetone powder”, NaCl 0.1 mol / L, sample volume of the enzyme 330 mL, guaiacol 30 mmol / L, H2O2 46 mmol / L in buffer 50mmol / L. After he began the studies of SBP from different cultivars: Conventional (BRS 258, BRS 260, BRS 262) and transgenic (BRS 255 RR, BRS and BRS Pampa RR) soybean seeds coat supplied by EMBRAPA, doing comparative study on the content of peroxidase (SBP), and subsequent selection to isolate the enzyme and studies of its kinetic parameters. For this, the sample in “acetone powder” of each cultivar was re-suspended in extraction buffer, the protein precipitated with ammonium sulfate 70%, the precipitate resuspended in extraction buffer and eluted in Sephadex G-25 column, for desalination. In the fractions (eluates) were performed to identify test spots SBP. BRS 258, BRS 262, BRS 260 and BRS 255 RR were selected with the highest content of enzyme SBP. Thus, volumes (5mL) of these cultivars were eluted in Sephadex G-100 column for partial purification and determination of molecular weight. With the fractions (eluate) obtained a pool of enzyme, which has made the kinetic studies: effects of mono-and divalent cations, determination of kinetic parameters - kM, vmax, optimum pH, optimum temperature. The data showed: i) optimum pH 4.5, ii) the optimum temperature, BRS 260... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-08Bitstream added on 2014-06-13T20:04:39Z : No. of bitstreams: 1 terrasan_crf_dr_rcla.pdf: 2923287 bytes, checksum: 6f131c106722e1d7349212e5619e3b4f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Xilanases e β-xilosidases são as principais enzimas responsáveis pela degradação da xilana, o segundo principal constituinte da parede celular vegetal. Tanto a produção destas enzimas por micro-organismos, quanto a caracterização bioquímica das mesmas têm sido amplamente estudadas devido às suas inúmeras aplicações biotecnológicas. Neste trabalho, as principais xilanase e β-xilosidase produzidas por uma linhagem de Penicillium janczewskii em meio de cultura líquido foram purificadas por métodos clássicos de purificação de proteínas, sendo, posteriormente, caracterizadas bioquimicamente. A xilanase apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 65 °C e a β-xilosidase em pH 5,0 e a 75 °C. Ambas as enzimas apresentaram características interessantes principalmente com relação à atividade ótima de ambas as enzimas em elevadas temperaturas, a prolongada estabilidade da β-xilosidase a 60 °C, e a estabilidade da xilanase em pH mais alcalinos, considerando-se algumas de suas possíveis aplicações. Visando uma futura aplicação, a produção destas enzimas foi avaliada em cultivos sólidos utilizando-se como substrato o bagaço de malte, resíduo da indústria cervejeira. As melhores condições para produção enzimática foram: utilização da umidade inicial do substrato de 50% fornecida com solução de sais de Vogel, tempo de cultivo de sete dias a 25 °C para produção de xilanases e a 20 °C para produção de b-xilosidases. O material fermentado apresentou aumento no teor protéico, na quantidade de alguns aminoácidos essenciais e ausência de micotoxinas. Ainda com um enfoque ambiental o filtrado de cultura de P. janczewskii, produzido em condições anteriormente selecionadas, foi aplicado no biobranqueamento de uma polpa kraft de eucalipto pré-branqueada com oxigênio, sendo realizados ensaios para seleção da concentração de xilanases e do tempo de reação / Xylanases and β-xylosidases are the main enzymes responsible for the degradation of xylan, the second main constituent of plant cell walls. The production of these enzymes by microorganisms, and their biochemical characterization has been extensively studied due to their wide range of biotechnological applications. In this work, the main xylanase and β-xylosidase produced in liquid cultures by a Penicillium janczewskii strain were purified by classical methods of protein purification, and further biochemically characterized. The xylanase showed optimal activity at pH 6.0 and 65 °C and β-xylosidases at pH 5.0 and 75 °C. Considering some possibilities of applications, the enzymes presented interesting characteristics especially in relation to the optimal activity at high temperatures, the prolonged stability of the β-xylosidase at 60 °C, and the stability of the xylanase in alkaline pH. Aiming at a future application, the production of these enzymes was investigated in solid state fermentation using brewer’s spent grain, a residue of the brewing industry, as substrate. The optimized conditions were: 50% initial substrate moisture supplied by Vogel’s salt solution, culturing for 7 days at 25 °C for xylanase production and at 20 °C for b-xylosidase production. The fermented substrate showed increase in protein content, in the amount of some essential amino acids, and absence of mycotoxins. Maintaining the environmental focus, the P. janczewskii crude filtrate, produced under previously selected conditions, was applied in the biobleaching of eucalyptus kraft pulp pre-bleached with oxygen. Trials were conducted for the selection of xylanase concentration and reaction time

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-23. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:11Z : No. of bitstreams: 1 000856545.pdf: 1630760 bytes, checksum: c65e7ba9d827276c90827f03611f61ae (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As lipases (triacilglicerol acil hidrolases, E.C. 3.1.1.3) catalisam a hidrólise das ligações éster de triacigliceróis, operando na interface água/óleo. Estas são enzimas ubíquas, porém as de origem microbiana têm se destacado no cenário industrial atual devido ao seu amplo espectro de aplicação. Dessa maneira, a prospecção de novas fontes de lipases com propriedades distintas é uma linha de pesquisa importante. Dentre os micro-organismos, os fungos vêm sendo explorados para a produção de enzimas por secretarem grandes quantidades de proteínas no meio extracelular que não são nocivas à saúde humana, em sua grande maioria. Este trabalho se insere neste contexto, uma vez que visa purificar e caracterizar as principais propriedades bioquímicas da lipase produzida pelo fungo filamentoso Penicillium sect. Gracilenta CBMAI 1583, isolado de solo de Mata Atlântica e ainda não estudado em relação a essa enzima. O pH e a temperatura ótimos de atividade lipásica foram 4,0 e 70 °C, respectivamente, tanto para a enzima presente no filtrado de cultura quanto para a enzima purificada. As energias de ativação da reação de hidrólise do p-nitrofenil palmitato catalisada pela lipase presente no filtrado de cultura e pela lipase purificada foram 27,01 e 8,77 kJ.mol-1, respectivamente. A enzima do filtrado se mostrou mais estável em relação à temperatura (T(1/2) de 1,5 h, 6,3 e 2,3 min a 50, 60 e 70 °C, respectivamente) e menos estável em relação ao pH (estável apenas entre os pH 5,0 e 7,0) que a enzima purificada. A enzima purificada apresentou T(1/2) de 8,5 min, 33,6 e 15,4 s nas mesmas temperaturas e estabilidade em pH de 2,0 a 8,5. Em relação à estabilidade na presença de surfactantes, os detergentes aniônicos desestabilizaram a estrutura proteica, com consequente perda de atividade, enquanto detergentes não iônicos a 1 % (m/v) ativaram a enzima. A lipase foi purificada em uma única etapa, através de... / Lipases (triacylglycerol acyl hydrolases, EC 3.1.1.3) are ubiquitous enzymes. However microbial enzymes stand out on the current industrial scenario, due to their wide spectrum of application. In this sense, prospection of new sources of lipases with distinct characteristics is an important research field. Among microorganisms, fungi are being explored for enzyme production, because they secrete high amounts of proteins to extracellular medium that are generally regarded as safe for human health. This work is inserted in this context once it aims to purify and to characterize the main biochemical properties of lipase produced by the filamentous fungus Penicillium sect Gracilenta CBMAI 1583, isolated from soil under Atlantic Rainforest and yet not studied in respect to this enzyme. Optima pH and temperature of activity were 4.0 and 70 °C, respectively, for both crude and purified lipase. Activation energys of hydrolysis of pNPP catalyzed by crude and purified lipase were 27.01 and 8.77 KJ.mol-1, respectively. Crude lipase was more stable to temperature (T(1/2) of 1.5 h, 6.3 and 2.3 min at 50, 60 and 70 °C, respectively) and less stable to pH (stable only at pH 5.0 to 7.0), while purified lipase showed the opposite behavior (T(1/2) of 8.5 min, 33.6 and 15.4 s at the same temperatures; and stable at pH 2.0 to 8.5). Regarding the stability in presence of surfactants, anionic detergents destabilized the protein structure with consequent loss of activity, while nonionic detergents at 1 % (w/v) activated the enzyme. Lipase was purified to homogeneity by one step, through a hydrophobic interaction chromatography at low ionic strength using the Phenyl Sepharose resin, as revealed by SDS-PAGE. By this strategy it was possible to recover 80.8 % of initial activity and achieve a purification factor of 516.1. Enzyme molecular mass was estimated to be 52.9 kDa by SDS-PAGE and 85.3 kDa by size exclusion chromatography, suggesting the formation of ...

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: João Atilio Jorge / Banca: Rosa dos Prazeres Melo Furriel / Resumo: As lipases (triacilglicerol acil hidrolases, E.C. 3.1.1.3) catalisam a hidrólise das ligações éster de triacigliceróis, operando na interface água/óleo. Estas são enzimas ubíquas, porém as de origem microbiana têm se destacado no cenário industrial atual devido ao seu amplo espectro de aplicação. Dessa maneira, a prospecção de novas fontes de lipases com propriedades distintas é uma linha de pesquisa importante. Dentre os micro-organismos, os fungos vêm sendo explorados para a produção de enzimas por secretarem grandes quantidades de proteínas no meio extracelular que não são nocivas à saúde humana, em sua grande maioria. Este trabalho se insere neste contexto, uma vez que visa purificar e caracterizar as principais propriedades bioquímicas da lipase produzida pelo fungo filamentoso Penicillium sect. Gracilenta CBMAI 1583, isolado de solo de Mata Atlântica e ainda não estudado em relação a essa enzima. O pH e a temperatura ótimos de atividade lipásica foram 4,0 e 70 °C, respectivamente, tanto para a enzima presente no filtrado de cultura quanto para a enzima purificada. As energias de ativação da reação de hidrólise do p-nitrofenil palmitato catalisada pela lipase presente no filtrado de cultura e pela lipase purificada foram 27,01 e 8,77 kJ.mol-1, respectivamente. A enzima do filtrado se mostrou mais estável em relação à temperatura (T(1/2) de 1,5 h, 6,3 e 2,3 min a 50, 60 e 70 °C, respectivamente) e menos estável em relação ao pH (estável apenas entre os pH 5,0 e 7,0) que a enzima purificada. A enzima purificada apresentou T(1/2) de 8,5 min, 33,6 e 15,4 s nas mesmas temperaturas e estabilidade em pH de 2,0 a 8,5. Em relação à estabilidade na presença de surfactantes, os detergentes aniônicos desestabilizaram a estrutura proteica, com consequente perda de atividade, enquanto detergentes não iônicos a 1 % (m/v) ativaram a enzima. A lipase foi purificada em uma única etapa, através de... / Abstract: Lipases (triacylglycerol acyl hydrolases, EC 3.1.1.3) are ubiquitous enzymes. However microbial enzymes stand out on the current industrial scenario, due to their wide spectrum of application. In this sense, prospection of new sources of lipases with distinct characteristics is an important research field. Among microorganisms, fungi are being explored for enzyme production, because they secrete high amounts of proteins to extracellular medium that are generally regarded as safe for human health. This work is inserted in this context once it aims to purify and to characterize the main biochemical properties of lipase produced by the filamentous fungus Penicillium sect Gracilenta CBMAI 1583, isolated from soil under Atlantic Rainforest and yet not studied in respect to this enzyme. Optima pH and temperature of activity were 4.0 and 70 °C, respectively, for both crude and purified lipase. Activation energys of hydrolysis of pNPP catalyzed by crude and purified lipase were 27.01 and 8.77 KJ.mol-1, respectively. Crude lipase was more stable to temperature (T(1/2) of 1.5 h, 6.3 and 2.3 min at 50, 60 and 70 °C, respectively) and less stable to pH (stable only at pH 5.0 to 7.0), while purified lipase showed the opposite behavior (T(1/2) of 8.5 min, 33.6 and 15.4 s at the same temperatures; and stable at pH 2.0 to 8.5). Regarding the stability in presence of surfactants, anionic detergents destabilized the protein structure with consequent loss of activity, while nonionic detergents at 1 % (w/v) activated the enzyme. Lipase was purified to homogeneity by one step, through a hydrophobic interaction chromatography at low ionic strength using the Phenyl Sepharose resin, as revealed by SDS-PAGE. By this strategy it was possible to recover 80.8 % of initial activity and achieve a purification factor of 516.1. Enzyme molecular mass was estimated to be 52.9 kDa by SDS-PAGE and 85.3 kDa by size exclusion chromatography, suggesting the formation of ... / Mestre

Orientador: Maria Isabel Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:12:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maldonado_RafaelResende_M.pdf: 1875683 bytes, checksum: 3c696cbfa231b172b2aec2339aa46426 (MD5) Previous issue date: 2006 / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Ladaslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Isntituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T01:08:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chagas_ElianaPereira_D.pdf: 9581798 bytes, checksum: 49359674666b604ff2cfcba8f66addc7 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A asparaginase (ASNase-EC 3.5.1.1.) de semente imatura de ervilha (Pisum sativum L.) varo Bolero foi purificada e caracterizada. A ASNase foi dependente de K+ para sua ativação e a presença de íons Ca2+ nos tampões de extração e purificaçcão permitiu uma maior recuperação da atividade da enzima. O Ca2+ pode auxiliar na manutenção da estrutura ativa da enzima. A ASNase apresentou duas isoformas, eluídas separadamente em cromatografia de exclusão. A primeira de 200.000 g/mol com atividade mais baixa e a segunda, com 69.000 g/mol, com a maior atividade, sendo portanto, a principal forma da enzima. A ASNase apresentou pI de 4,5 a 5 e [(m de 2,4 mM para Asn. A enzima foi inibida competitivamente por Gly e Asp, e os resultados indicaram que o Asp seria liberado na reação após o NH4 +. Através das reações imunológicas, foi observado que anticorpo produzido contra a ASNase de semente de ervilha reconheceu bandas na mesma posição que a ASNase de ervilha em extratos de sementes de outras espécies: Crotalaria juncea, C. paulina (ambas dependentes de K+) e C. zanzibarica (independente). A ASNase de ervilha também apresentou reação cruzada com anticorpos produzidos contra ASNase de C. juncea e Lupinus polyphyllus (independente de K+), sugerindo alguma homologia entre as moléculas, e também que a parte da molécula que determina dependência ao K+ não coincide com aquela reconhecida pelo anticorpo / Abstract: Asparaginase (ASNase-EC 3.5.1.1) from immature seed of Pisum sativum L. cv. Bolero was characterized and purified. ASNase from pea seed was dependent upon the presence of K+ for activity and the presence of Ca2+ in the extraction buffers pertmitted a higher recovery of activity. The Ca2+ ions could assist the active ASNase structure. The enzyme showed two active isoforms, eluted separately from exclusion chromatography. The first isoform (200.000 g/mol) presented lower activity and the second (69.000 gjmol) with the highest activity, was the main formo This enzyme showed a pI near to 4,5-5 and a J(m of 2,4 mM for Asn. Gly and Asp were competitive inhibitors of the enzyme. Asp would appear to be released from the enzyme after NH4 +. Western blot analysis demonstrated the presence of bands coinciding with the ASNase from pea seed in seed extract from other species: Crotalaria juncea J Crotalaria paulina (K+dependent) and Crotalaria zanzibarica (K+ -independent). ASN ase from pea seed showed a cross-reaction with antibodies against ASNase from Crotalaria juncea and Lupinus polyphyllus (K+ -independent), suggesting a similarity between the enzymes, and that the part of the molecule involved in the K+ dependency is not coincident with that recognized by the antibody / Doutorado / Doutor em Ciências