The objective of this study was to determine if R. equi IgG purified from commmercially available hyperimmune R. equi plasma and delivered to the lungs of adult ponies would cause a local inflammatory response and if increases in total and R. equi specific IgG occurred post administration. IgG was purified and concentrated from plasma via protein G affinity chromatography. A cross over study was performed. Eight healthy adult ponies were randomly assigned to two groups of four; each pony acted as its own control. Either the IgG product or 0.9% Saline was delivered via a vibrating mesh nebulizer during the first treatment phase. During the second treatment phase ponies recieved the oppostie treatment. A 4 week washout period was allowed between phases. Bronchoalveolar fluid was recovered using a low volume endoscopic technique prior to aerosolization (time 0), and at 1 hr, 6 hrs, and 24 hours post administration. The BAL fluid total IgG concentration and R. equi specific IgG titers were determined via ELISA and cytologic analysis was performed. No clinically significant local inflammatory response was identified in response to IgG treatment. While total IgG concentrations were increased at T1 compared to T0, no significant effects of time were found (P=0.19). However, overall significantly higher concentrations of total IgG were found after administration of saline when compared to IgG administration (P=0.023).  While the R. equi specific titer increased at T1 after IgG administration, no significant difference was identified between treatment or time (P=0.261). Overall the individual response to IgG was variable. It is possible that the protein rich IgG acted as a relatively hypertonic solution and caused fluid influx from the pulmonary parenchyma after treatment thereby diluting the total IgG present when compared to saline administration. This conclusion cannot be verified as BAL dilution correction was not performed. However, it is unknown what titer or level of increased IgG is nessecary to assist with prevention of disease. Future research should focus on the effect of R. equi specific IgG on pulmonary cells to determine if administration of local R. equi specific IgG would alter intrapulmonary immune responses to R. equi. / Master of Science

No / Streptococcus equi is the causative agent of strangles, a prevalent and highly contagious disease of horses. Despite the animal suffering and economic burden associated with strangles, little is known about the molecular basis of S. equi virulence. Here we have investigated the contributions of a specific lipoprotein and the general lipoprotein processing pathway to the abilities of S. equi to colonize equine epithelial tissues in vitro and to cause disease in both a mouse model and the natural host in vivo. Colonization of air interface organ cultures after they were inoculated with a mutant strain deficient in the maturase lipoprotein ( prtM138-213, with a deletion of nucleotides 138 to 213) was significantly less than that for cultures infected with wild-type S. equi strain 4047 or a mutant strain that was unable to lipidate preprolipoproteins ( lgt190-685). Moreover, mucus production was significantly greater in both wild-type-infected and lgt190-685-infected organ cultures. Both mutants were significantly attenuated compared with the wild-type strain in a mouse model of strangles, although 2 of 30 mice infected with the lgt190-685 mutant did still exhibit signs of disease. In contrast, only the prtM138-213 mutant was significantly attenuated in a pony infection study, with 0 of 5 infected ponies exhibiting pathological signs of strangles compared with 4 of 4 infected with the wild-type and 3 of 5 infected with the lgt190-685 mutant. We believe that this is the first study to evaluate the contribution of lipoproteins to the virulence of a gram-positive pathogen in its natural host. These data suggest that the PrtM lipoprotein is a potential vaccine candidate, and further investigation of its activity and its substrate(s) are warranted.

No / Streptococcus equi and Streptococcus zooepidemicus are major etiological agents of upper and lower airway disease in horses. Despite the considerable animal suffering and economic burden associated with these diseases, the factors that contribute to the virulence of these equine pathogens have not been extensively investigated. Here we demonstrate the presence of a homologue of the Streptococcus pneumoniae PsaA protein in both of these equine pathogens. Inhibition of signal peptide processing by the antibiotic globomycin confirmed the lipoprotein nature of the mature proteins, and surface exposure was confirmed by their release from intact cells by mild trypsinolysis. / Project grant 056042 from The Wellcome Trust.

Em função da proximidade cada vez maior entre o cavalo e o homem, é de extrema importância ter conhecimentos das doenças que acometem os equinos, que por ventura, podem acometer seres humanos. Dentre muitas doenças, pode-se citar duas, que promovem grandes perdas econômicas aos rebanhos eqüinos, tanto no tratamento desses rebanhos, como com a morte dos mesmos, dificultando a importação e exportação de animais: a babesiose e a erliquiose (anaplasmose), que podem estar ou não associadas, acometendo um animal, concomitantemente. A presente pesquisa teve como objetivo investigar e diagnosticar doença concomitante babesiose (por Babesia equi ou Theileria equi) e Erliquiose (por Erliquia equi ou Anaplasma phagocytophilum), no estado de São Paulo, em rebanhos eqüinos, utilizando as técnicas de Nested PCR (Nested polymerase chain reaction reação em cadeia pela polimerase para diagnóstico de T. equi e A. phagocytophilum) e c-ELISA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay para diagnóstico de T. equi) ou ELISA indireto (para diagnóstico de A. phagocytophilum) e comparar os resultados obtidos nas diferentes técnicas em 250 amostras de eqüino (sangue total e soro). Como resultado, obteve-se 38,4%, 46% e 36% de positividade, respectivamente, nos testes de pesquisa de hematozoário, c-ELISA e Nested PCR para Theileria equi e 0%, 3% e 0% de positividade, respectivamente, nos testes de pesquisa de hemoparasita, ELISA indireto e Nested PCR para Anaplasma phagocytophilum, não sendo observada a co-infecção de Babesiose e Anaplasmose no rebanho estudo / Due to the increasing proximity between horse and man, it is of extreme importance to understand the diseases that affect horses which by chance may affect humans. Among many diseases, babesiosis and ehrlichiosis (anaplasmosis) promote high economic losses to horses herds in consequence of costs of treatment and also death, making it difficult to import and export animals: They can or not be linked affecting an animal at the same time. This study aimed to investigate and diagnose concomitant babesiosis (Babesia equi and Theileria equi) and ehrlichiosis (for ehrlichia equipment or Anaplasma phagocytophilum) in equine herds of the state of Sao Paulo, using the techniques of Nested PCR (Nested polymerase chain reaction for the diagnosis of T. equi and A. phagocytophilum) and c-ELISA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of T. equi) or ELISA (for diagnosis of A. phagocytophilum). Also to compare results obtained in these different techniques in 250 samples of horse (whole blood and serum). Results showed 38.4%, 46% and 36% positivity, respectively, in tests for the detection of Theileria equi through hematozoan, c-ELISA and Nested PCR and 0%, 3% and 0% positivity, respectively, in tests for the detection of Anaplasma phagocytophilum through blood parasites, indirect ELISA and Nested PCR. It was not observed co-infection Babesiosis and anaplasmosis in the herd study

Infecções pulmonares de potros jovens por Rhodococcus equi resultam em grave pneumonia levando à morte um grande número de animais todos os anos. Até o momento não há nenhuma vacina aceita globalmente para a prevenção da rodococose equina. O único tratamento preconizado é baseado em antibioticoterapia, porém os protocolos clínicos são longos, de alto custo, com efeitos colaterais e tem favorecido a seleção de cepas resistentes aos antibióticos. Diversas estratégias no desenvolvimento de uma vacina segura e eficiente contra a rodococose foram propostas, porém, não induziram um efeito protetor considerável. O principal fator de virulência do R. equi descrito e amplamente estudado é a proteína vapA, no entanto, outras proteínas localizadas na ilha de patogenicidade estão presentes em amostras de R. equi virulento extraídos de animais infectados. Trabalhos recentes têm demonstrado a presença do gene vapG em todas as cepas virulentas e este gene é altamente expresso quando a bactéria reside no interior de macrófagos, tornando-o um possível alvo vacinal. Nosso grupo já possui experiência prévia no uso de linhagem de Salmonella enterica Typhimurium atenuada carreando a proteína vapA. Baseado nos resultados positivos obtidos, foi construída uma linhagem atenuada de S. enterica Typhimurium 3987 expressando a proteína vapG. A administração desta linhagem em camundongos foi capaz de induzir proteção contra R. equi virulento. Os resultados observados foram a colonização e persistência da Salmonella nos órgãos alvo, a redução da carga bacteriana de R. equi, e a indução de um perfil imune protetor semelhante ao observado em animais adultos resistentes. Observou-se o aumento da produção de IL-12p70 e IFN-, alem da presença de níveis aumentados de IL-4 e a redução dos níveis de TNF-. Observou-se também o aumento na subpopulação de células T auxiliares (CD4+) com perfil de memória, além de aumento na população de linfócitos B totais quando comparado aos grupos controles. Este conjunto de resultados indica que a imunização com Salmonella enterica Typhimurium expressando a proteína vapG gera uma resposta imune celular eficiente tornando esta linhagem uma possível candidata a vetor vacinal. Alem disso, sugere que outros antígenos do R. equi podem ser / Pulmonary infections in young foals by Rhodococcus equi result in severe pneumonia, leading to death a large number of animals every year. There is no globally accepted vaccine for the prevention of equine rhodococosis so far. To date, the only acceptable treatment is based on antibiotics, but the clinical protocols are long lasting, expensive, having side effects and favoring the emergence of drug resistant strains. Several strategies for developing a safe and effective vaccine against rhodococosis have been proposed, however, none has induced a significant protective effect. The main virulence factor of R. equi described and extensively studied is the protein vapA, although other proteins encoded by genes in pathogenicity islands are detected in samples of virulent R. equi, isolated from infected animals. Recent works have demonstrated that the vapG gene is present in all virulent strains, and that this gene is highly expressed when bacteria reside within macrophages, making it a potential vaccine target. Our group has already been working with an attenuated Salmonella enterica Typhimurium strain expressing the VapA protein. Even though our results were very promising, we decided to construct a second vaccine strain expressing the VapG protein. Based on the positive results, it was constructed an attenuated strain of S. enterica Typhimurium 3987 expressing the vapG protein. Interestingly, the VapG-expressing strain induced protection against virulent R. equi in mouse model of infection. We could observe colonization and persistence of Salmonella vaccine cells in target organs, with reduction of bacterial loads of R. equi and induction of a protective immune profile similar to that seen in resistant adult animals. We could also observe increased production of IL-12p70 and IFN- in addition to the presence of increased levels of IL-4 and reduced levels of TNF-. Moreover, we detected an increase in the subpopulation of T helper cells (CD4), with a profile of memory, as well as in the population of B lymphocytes, when compared to control groups. This set of results shows that immunization with Salmonella enterica Typhimurium expressing the VapG protein raises an efficient cellular immune response, making this strain a potential candidate for vaccine vector. Furthermore, this work suggests that other R. equi antigens may be taken into account for vaccine construction, besides the VapA protein utilized in the majority of studies.

A infecção por Rhodococcus equi é a causa mais comum de pneumonia em potros durante os primeiros 6 meses de idade e as medidas utilizadas no controle da infecção são freqüentemente ineficientes. Os protocolos de tratamento são longos, de alto custo e nem sempre eficazes. A prevenção da rodococose através da imunização de potros com vacina eficaz e segura tem sido um desafio. Estudos recentes se baseiam na utilização da proteína A associada a virulência (VapA), que tem sido descrita como importante indutora da imunidade contra R. equi. Este estudo avaliou a resposta clínica e imunitária desenvolvida por potros imunizados com cepa atenuada de S. enterica Typhimurium capaz de expressar o antígeno VapA (grupo teste) ou apenas S. enterica Typhimurium sem o gene vapA (grupo controle), antes e após o desafio experimental. Duas etapas experimentais foram estabelecidas de acordo com a via de imunização: intranasal ou oral em até 12 horas após o nascimento e aos 14 dias de idade. Os animais do grupo teste e do grupo controle foram desafiados experimentalmente com cepa virulenta de R. equi 28 dias após o nascimento. Para acompanhar o desenvolvimento dos sinais clínicos, foram realizados exames clínicos, hemogramas e exames complementares de imagem. O padrão de resposta imune desenvolvida foi avaliada através da dosagem de munoglobulinas, mensuração da expressão de citocinas, ensaio de proliferação de linfócitos, isolamento de R. equi e perfil citológico do LTB. As manifestações clínicas foram observadas de maneira menos intensa nos animais do grupo teste da segunda etapa experimental e óbitos decorrentes da rodococose ocorreram apenas nos animais do grupo controle (2/3). Os animais do grupo teste apresentaram uma resposta de IgGb mais intensa quando comparada aos animais do grupo controle, porém não foi observado diferença estatística. A linfoproliferação e a expressão de citocinas de padrão Th1 foram superiores nos animais do grupo teste. Em contraste, os animais do grupo controle apresentaram uma resposta caracterizada pela maior expressão da citocina IL-4. A produção de IgA local foi mais significativa nos animais imunizados com Salmonella carreando vapA. Não foram observados efeitos tóxicos graves resultantes da imunização em nenhuma das etapas experimentais. A vacinação de potros neonatos com S. enterica Typhimurium expressando VapA foi considerada segura, capaz de modular eficientemente a resposta imune e aparentemente capaz de proteger contra a infecção experimental com R. equi. / Rhodoccocus equi is the major cause of pneumonia in foals during the first six months and control measures are frequently ineffective. Treatment protocols are long, expensive and do not always produce good results. Rhodococcosis prevention through immunization of foals using a safe and efficient vaccine is still a challenge. Recent studies are based on the use of the virulence associated protein A (vapA) which has been described as an important inducer of immunity against R. equi. The present study evaluated the clinical and immune response of foals vaccinated with an attenuated strain of S. enterica Typhimurium expressing VapA antigen (test group) or S. enterica Typhimurium without the vapA gene (control group), previous to and following experimental challenge. Two experimental phases were established according to the immunization route: intranasal or oral vaccination up to 12 hrs following birth and at 14 days of age. The experimental and control groups were challenge on day 28 with a virulent stain of R. equi. Clinical examination, complete hemograms and image complementary exams were used to evaluate the development of clinical signs. Immune response patterns were evaluated though immunoglobulin dosage, cytokine expression, lymphocyte proliferation essays, isolation of R. equi and cytological profiles of TBW. Clinical manifestation was less intense in the test group during the second experimental phase, and death occurred only in the control group (2/3) and was due to R. equi pneumonia. The test group produced a more intense IgGb response when compared to controls however no statistical difference was observed. Lymphoproliferation and Th1 cytokine expression were higher in the test group. In contrast, controls produced an IL-4 response. Local IgA was significantly higher in animals immunized with Salmonella carrying vapA. Immunization protocols produced no severe toxic effect. The vaccination of neonatal foals with S. enterica Typhimurium expressing VapA was considered safe, produced efficient modulation of the immune response and is apparently able to protect against experimental R.equi infection.

Lic.-avh. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 3 uppsatser.

Rhodococcus equi é um importante patógeno bacteriano em medicina veterinária, associado, sobretudo, a pneumonias piogranulomatosas em potros no primeiro semestre de vida. São descritos neste trabalho vinte casos de infecção por R. equi em potros recebidos para necropsia no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul entre janeiro de 1997 e janeiro de 2013. Os históricos clínicos obtidos com os veterinários apresentaram grande variabilidade e, mesmo os sinais clássicos de comprometimento respiratório e febre só foram vistos em metade dos casos. Os dados obtidos em uma visita a uma propriedade demonstram que a superpopulação de potros e a introdução de fêmeas no grupo de parição contribuíram para a ocorrência de um surto. Exames de necropsia e de histologia revelaram que pneumonia piogranulomatosa multifocal foi a forma de apresentação mais constante (dezenove casos), seguida por linfadenite piogranulomatosa (dez casos) e tiflocolite piogranulomatosa e ulcerativa (cinco casos). Três animais apresentaram osteomielite piogranuloamatosa, dos quais, dois em vértebras. Uveítes e polissinovites assépticas foram constatadas em três casos. Exame imuno-histoquímco anti-Rhodococcus equi revelou-se positivo em todos os pulmões com lesões, embora os linfonodos tenham sido positivos em apenas três das nove amostras testadas. O exame bacteriológico das amostras de necropsia foi positivo em quinze casos clínicos, assim como em uma amostra de solo da propriedade visitada. O exame de reação da polimerase em cadeia (PCR) revelou o gene de virulência VapA de R. equi em todos os isolados clínicos, mas não na amostra de solo. Adicionalmente os pulmões foram testados por imuno-histoquímica para Pneumocystis sp.e apresentaram marcação em treze dos vinte casos. / Rhodococcus equi is an important bacterial pathogen in veterinary medicine, especially associated with piogranulomatous pneumonia in foals under six months of age. Twenty cases of R. equi infection in foals received for necropsy at the Pathology Veterinary Sector (SPV) of the Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS) between January 1997 and January 2013 are described in this paper. Clinical history obtained with veterinary practitioners presented high variability, and even classical respiratory signs and fever were only observed in half of the cases. Data collected in an investigative visiting to a breeding farm showed that the foal superpopulation and the introduction of females to the parturition group contributed to the occurrence of an outbreak. Necropsy and histologic examinations revealed that multifocal piogranulomatous pneumonia was the most constant presentation (nineteen cases), followed by piogranulomatous lymphadenitis (ten cases) and piogranulomatous and ulcerative typhlocolitis (five cases). Three animals presented piogranulomatous osteomyelitis, two of them in vertebrae. Aseptic uveitis and polisynovitis were verified in three cases. Anti-Rhodococcus equi immunohistochemical examination stained positive in all lungs containing lesions, although lymphnodes have stained positive in only three of nine samples tested. Bacteriologic examination of the necropsy samples was positive in fifteen cases and in a soil sample from the visited breeding farm. Polymerase chain reaction (PCR) test revealed the VapA virulence factor of R.equi in all clinical isolates, but not in the soil sample. Additionally, the lungs were tested to the presence of Pneumocystis sp. by immunohistochemistry, and stained positive in thirteen of twenty cases.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus equi is the etiological agent of strangles. Opportunistic agents from the same group are frequently isolated from horses with strangles and may induce mistake diagnostic. Among the subspecies of S. equi the phenotypic characteristics are almost undistinguishable; however the pathogenic potential is widely differentiated. The objective of this study was to determine the phenotypic and molecular characteristics of S. equi isolates obtained from samples of clinical cases of strangles by sequencing the hsp60 gene. By phenotypical assays 26 strains of Streptococcus sp. were identified, 18 were characterized as S. equi subsp. equi, five as S. equi subsp. zooepidemicus, two as S. dysgalactiae subsp., equisimilis, and one as Streptococcus sp.; However using molecular characterization, 21 isolates were identified as S. equi subsp. equi and five as S. equi subsp. zooepidemicus. The analysis of the hsp60 sequence is a good discriminatory tool and can be useful as a method of differentiation, principally for the characterization of atypical isolates / Streptococcus equi subesp. equi é o agente etiológico da adenite eqüina. Outros agentes pertencentes ao mesmo grupo, como S. equi subesp. zooepidemicus são freqüentemente isolados de animais com sinais de adenite, podendo originar diagnósticos equivocados. As diferenças bioquímicas são pequenas para as subespécies de S. equi, enquanto o potencial virulento é muito diferenciado, havendo, portanto, necessidade de uma correta diferenciação entre os isolados. O presente trabalho teve como objetivo realizar a comparação fenotípica e molecular de isolados de S. equi, obtidos de casos de adenite eqüina, pela análise de seqüências parciais do gene hsp60. De 26 amostras de Streptococcus sp. analisadas, 18 foram bioquimicamente identificadas como S. equi subesp. equi, cinco como S. equi subesp. zooepidemicus, dois isolados S. dysgalactiae subesp. equisimilis e para um isolado não foi possível determinar a espécie. Pela análise das seqüências, 21 isolados foram identificados como S. equi subesp. equi e cinco como S. equi subesp. zooepidemicus. Dentre os isolados utilizados, quatro apresentaram divergência entre os métodos utilizados. A análise de seqüências do gene hsp60 possui um bom poder discriminatório e pode ser um importante método auxiliar na diferenciação de isolados de Streptococcus equi, especialmente para isolados com padrão atípico de fermentação de açucares

A infecção por Rhodococcus equi é a causa mais comum de pneumonia em potros durante os primeiros 6 meses de idade e as medidas utilizadas no controle da infecção são freqüentemente ineficientes. Os protocolos de tratamento são longos, de alto custo e nem sempre eficazes. A prevenção da rodococose através da imunização de potros com vacina eficaz e segura tem sido um desafio. Estudos recentes se baseiam na utilização da proteína A associada a virulência (VapA), que tem sido descrita como importante indutora da imunidade contra R. equi. Este estudo avaliou a resposta clínica e imunitária desenvolvida por potros imunizados com cepa atenuada de S. enterica Typhimurium capaz de expressar o antígeno VapA (grupo teste) ou apenas S. enterica Typhimurium sem o gene vapA (grupo controle), antes e após o desafio experimental. Duas etapas experimentais foram estabelecidas de acordo com a via de imunização: intranasal ou oral em até 12 horas após o nascimento e aos 14 dias de idade. Os animais do grupo teste e do grupo controle foram desafiados experimentalmente com cepa virulenta de R. equi 28 dias após o nascimento. Para acompanhar o desenvolvimento dos sinais clínicos, foram realizados exames clínicos, hemogramas e exames complementares de imagem. O padrão de resposta imune desenvolvida foi avaliada através da dosagem de munoglobulinas, mensuração da expressão de citocinas, ensaio de proliferação de linfócitos, isolamento de R. equi e perfil citológico do LTB. As manifestações clínicas foram observadas de maneira menos intensa nos animais do grupo teste da segunda etapa experimental e óbitos decorrentes da rodococose ocorreram apenas nos animais do grupo controle (2/3). Os animais do grupo teste apresentaram uma resposta de IgGb mais intensa quando comparada aos animais do grupo controle, porém não foi observado diferença estatística. A linfoproliferação e a expressão de citocinas de padrão Th1 foram superiores nos animais do grupo teste. Em contraste, os animais do grupo controle apresentaram uma resposta caracterizada pela maior expressão da citocina IL-4. A produção de IgA local foi mais significativa nos animais imunizados com Salmonella carreando vapA. Não foram observados efeitos tóxicos graves resultantes da imunização em nenhuma das etapas experimentais. A vacinação de potros neonatos com S. enterica Typhimurium expressando VapA foi considerada segura, capaz de modular eficientemente a resposta imune e aparentemente capaz de proteger contra a infecção experimental com R. equi. / Rhodoccocus equi is the major cause of pneumonia in foals during the first six months and control measures are frequently ineffective. Treatment protocols are long, expensive and do not always produce good results. Rhodococcosis prevention through immunization of foals using a safe and efficient vaccine is still a challenge. Recent studies are based on the use of the virulence associated protein A (vapA) which has been described as an important inducer of immunity against R. equi. The present study evaluated the clinical and immune response of foals vaccinated with an attenuated strain of S. enterica Typhimurium expressing VapA antigen (test group) or S. enterica Typhimurium without the vapA gene (control group), previous to and following experimental challenge. Two experimental phases were established according to the immunization route: intranasal or oral vaccination up to 12 hrs following birth and at 14 days of age. The experimental and control groups were challenge on day 28 with a virulent stain of R. equi. Clinical examination, complete hemograms and image complementary exams were used to evaluate the development of clinical signs. Immune response patterns were evaluated though immunoglobulin dosage, cytokine expression, lymphocyte proliferation essays, isolation of R. equi and cytological profiles of TBW. Clinical manifestation was less intense in the test group during the second experimental phase, and death occurred only in the control group (2/3) and was due to R. equi pneumonia. The test group produced a more intense IgGb response when compared to controls however no statistical difference was observed. Lymphoproliferation and Th1 cytokine expression were higher in the test group. In contrast, controls produced an IL-4 response. Local IgA was significantly higher in animals immunized with Salmonella carrying vapA. Immunization protocols produced no severe toxic effect. The vaccination of neonatal foals with S. enterica Typhimurium expressing VapA was considered safe, produced efficient modulation of the immune response and is apparently able to protect against experimental R.equi infection.