La régulation de la transcription des gènes par les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ joue un rôle important dans la croissance cellulaire et dans le développement du cancer du sein. Une augmentation de l’expression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrèle avec un phénotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous démontrons un mécanisme de boucle de régulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et l’activité transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancéreuses mammaires. L’activité transcriptionnelle de ER et l’expression de gènes cibles de ER, dont SDF-1 lui-même, sont augmentées dans la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 en réponse à SDF-1. Ces effets sont bloqués par l’anti-estrogène fulvestrant et par la délétion de CXCR4. Par ailleurs, l’expression des gènes et la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 en réponse à l’estrogène sont altérées par l’inhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rôle important dans le cancer du sein. La surexpression et la dérégulation de la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase ErbB2 corrèlent avec un phénotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement reliées dans la régulation de la réponse de ER dans les cellules cancéreuses mammaires n’est pas connue. Nous démontrons ici que CXCR4 régule négativement l’expression protéique de ErbB2 et de son partenaire d’interaction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altère l’activation de la voie PI3-K/Akt par le dimère ErbB2/ErbB3 en réponse à héréguline alors qu’en présence de SDF-1, les niveaux d’activation sont récupérés. Nous avons trouvé que héréguline-β promouvoit la phosphorylation de la sérine 339 de CXCR4, un site important pour l’internalisation et la signalisation du récepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 à CXCR4 est favorisé par ErbB3 et héréguline-β. L’activité transcriptionnelle ainsi que l’expression des gènes cibles de ER en réponse à l’héréguline sont relevées avec l’expression de CXCR4 et partiellement récupérées avec l’addition de SDF-1. Ces résultats démontrent que le recrutement de CXCR4 à ErbB2 altère la signalisation médiée par ErbB2/ErbB3 ainsi que l’activité hormonale de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. Nous travaux ont permis d’identifier et de caractériser l’impact de la signalisation médiée par des récepteurs membranaires sur la réponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer à la résistance aux thérapies endocriniennes et donc cibler les récepteurs impliqués s’avèrerait utile pour améliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches. / Induction of estrogen-regulated gene transcription by estrogen receptors ERα and ERβ plays an important role in breast cancer development and growth. High expression of the chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12/SDF-1 has also been correlated with aggressive breast tumor phenotypes. Here, we describe a positive regulatory loop between CXCR4/SDF-1 signaling pathway and ER transcriptional competence in human breast cancer cells. Treatment of breast carcinoma MCF-7 cells with SDF-1 increased ER transcriptional activity and expression of ER target genes, including SDF-1 itself. These effects were blocked by the antiestrogen ICI-182780 and by CXCR4 silencing, and conversely, estrogen-induced gene expression and growth of MCF-7 cells were impaired upon CXCR4 inhibition. Growth factor signaling also plays an important role in breast cancer. Overexpression and deregulated signaling of receptor tyrosine kinase ErbB2 correlate with aggressive breast tumor phenotype and poor outcomes. However, how ErbB2 and CXCR4 signaling is functionally related to regulate ER response in breast cancer cells is not known. Here we show that steady-state levels of ErbB2 and its dimeric partner ErbB3, as well as ErbB2 tyrosine phosphorylation were negatively regulated with the expression of CXCR4. CXCR4 downregulated ErbB2/ErbB3 dimer activation of the PI3-K/Akt pathway in response to ErbB3 ligand heregulin-β, whereas addition of SDF-1 restored activation levels. We found that heregulin-β promoted CXCR4 phosphorylation at serine 339, an important site for CXCR4 internalization and signaling. In addition, ErbB2 recruitment to CXCR4 was enhanced by ErbB3 and heregulin-β. Transcriptional activity and gene expression measurement showed that the hormonal repression of ER was relieved with the expression of CXCR4 and partially recuperated with the addition of SDF-1. Together, these results show that CXCR4 recruitment to ErbB2 alters ErbB2/ErbB3 signaling pathway and downstream regulation of ER hormonal activity in in breast cancer cells. Our work has enabled us to identify and characterize the impact of membrane receptors signaling on ER transcriptionnal response in breast cancer cells. Membrane signaling is one of the factors involved in endocrine therapy resistance and targeting the receptors implicated could be benificial to improve existing treatments and to work on the creation of new ones.

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La croissance de deux tiers des tumeurs mammaires dépend des œstrogènes. Le réseau de gènes responsable de propager les signaux prolifératifs des œstrogènes est encore mal connu. Des micropuces d’ADN de cellules de carcinome mammaire MCF7 traitées à l’œstradiol (E2) avec ou sans l’inhibiteur de synthèse protéique cycloheximide (CHX) ont permis d’identifier de nombreux gènes cibles primaires et secondaires. La séquence des promoteurs des gènes cibles a été criblée à l’aide d’une banque de 300 matrices modélisant les sites reconnus par divers facteurs de transcription. Les éléments de réponse aux œstrogènes (ERE) sont enrichis dans les promoteurs des gènes primaires. Les sites E2F sont enrichis dans les promoteurs des gènes cible secondaires. Un enrichissement similaire a été observé avec les régions liées par ERα et E2F1 en ChIP-on-chip pour chacune des catégories de gènes. La croissance des cellules de carcinome mammaire est inhibée par des traitements à l’acide rétinoïque (RA). L’analyse de micropuces d’ADN de MCF7 traitées avec RA a permis d’identifier de nombreux gènes cibles potentiels. Un enrichissement d’éléments de réponse à l’acide rétinoïque (RARE) est observable dans les promoteurs de ces gènes après avoir exclus les RARE se trouvant à l’intérieur d’éléments transposables. Des RARE présents dans des éléments transposables spécifiques aux primates sont aussi fixés in vivo dans les promoteurs de cibles connues de RA : BTG2, CASP9 et GPRC5A. Certains gènes cibles de RA dans les MCF7 sont aussi des cibles de E2, suggérant que le contrôle que ces molécules exercent sur la prolifération est en partie attribuable à des effets opposés sur un ensemble commun de gènes. / Two thirds of breast tumours depend on estrogens for their growth. The network of genes mediating the proliferative effect of estrogens is not fully characterized. Putative primary and secondary estrogen target genes were identified with microarray analysis of MCF7 breast cancer cells treated with estradiol (E2) in presence or absence of the protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX). The promoters of the target genes were screened for transcription factor binding sites with a collection of 300 matrix based DNA-binding profiles. Estrogen response elements (EREs) were enriched in the promoters of primary target genes. E2F binding sites were enriched in the promoters of secondary target genes. Similar enrichment was also observed in regions bounds by ERα and E2F1 in ChIP-on-chip experiments for each set of target genes. Retinoic acid (RA) treatment of mammary carcinoma cells inhibits their growth. Putative target genes were identified through microarray analysis of MCF7 cells treated with RA. Enrichment of retinoic acid response elements (RARE) was observed in their promoters after removing the elements found within transposable elements. Although transposable elements mask the enrichment, RARE within primate specific transposable elements are bound in vivo by retinoic acid receptors in the promoters of known target genes BTG2, CASP9 and GPRC5A. Some of the RA target genes in MCF7 cells are also target genes of E2 suggesting that these two molecules exert their effects on cell proliferation in part by opposite action on a common set of genes.

La régulation de la transcription des gènes par les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ joue un rôle important dans la croissance cellulaire et dans le développement du cancer du sein. Une augmentation de l’expression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrèle avec un phénotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous démontrons un mécanisme de boucle de régulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et l’activité transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancéreuses mammaires. L’activité transcriptionnelle de ER et l’expression de gènes cibles de ER, dont SDF-1 lui-même, sont augmentées dans la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 en réponse à SDF-1. Ces effets sont bloqués par l’anti-estrogène fulvestrant et par la délétion de CXCR4. Par ailleurs, l’expression des gènes et la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 en réponse à l’estrogène sont altérées par l’inhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rôle important dans le cancer du sein. La surexpression et la dérégulation de la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase ErbB2 corrèlent avec un phénotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement reliées dans la régulation de la réponse de ER dans les cellules cancéreuses mammaires n’est pas connue. Nous démontrons ici que CXCR4 régule négativement l’expression protéique de ErbB2 et de son partenaire d’interaction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altère l’activation de la voie PI3-K/Akt par le dimère ErbB2/ErbB3 en réponse à héréguline alors qu’en présence de SDF-1, les niveaux d’activation sont récupérés. Nous avons trouvé que héréguline-β promouvoit la phosphorylation de la sérine 339 de CXCR4, un site important pour l’internalisation et la signalisation du récepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 à CXCR4 est favorisé par ErbB3 et héréguline-β. L’activité transcriptionnelle ainsi que l’expression des gènes cibles de ER en réponse à l’héréguline sont relevées avec l’expression de CXCR4 et partiellement récupérées avec l’addition de SDF-1. Ces résultats démontrent que le recrutement de CXCR4 à ErbB2 altère la signalisation médiée par ErbB2/ErbB3 ainsi que l’activité hormonale de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. Nous travaux ont permis d’identifier et de caractériser l’impact de la signalisation médiée par des récepteurs membranaires sur la réponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer à la résistance aux thérapies endocriniennes et donc cibler les récepteurs impliqués s’avèrerait utile pour améliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches. / Induction of estrogen-regulated gene transcription by estrogen receptors ERα and ERβ plays an important role in breast cancer development and growth. High expression of the chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12/SDF-1 has also been correlated with aggressive breast tumor phenotypes. Here, we describe a positive regulatory loop between CXCR4/SDF-1 signaling pathway and ER transcriptional competence in human breast cancer cells. Treatment of breast carcinoma MCF-7 cells with SDF-1 increased ER transcriptional activity and expression of ER target genes, including SDF-1 itself. These effects were blocked by the antiestrogen ICI-182780 and by CXCR4 silencing, and conversely, estrogen-induced gene expression and growth of MCF-7 cells were impaired upon CXCR4 inhibition. Growth factor signaling also plays an important role in breast cancer. Overexpression and deregulated signaling of receptor tyrosine kinase ErbB2 correlate with aggressive breast tumor phenotype and poor outcomes. However, how ErbB2 and CXCR4 signaling is functionally related to regulate ER response in breast cancer cells is not known. Here we show that steady-state levels of ErbB2 and its dimeric partner ErbB3, as well as ErbB2 tyrosine phosphorylation were negatively regulated with the expression of CXCR4. CXCR4 downregulated ErbB2/ErbB3 dimer activation of the PI3-K/Akt pathway in response to ErbB3 ligand heregulin-β, whereas addition of SDF-1 restored activation levels. We found that heregulin-β promoted CXCR4 phosphorylation at serine 339, an important site for CXCR4 internalization and signaling. In addition, ErbB2 recruitment to CXCR4 was enhanced by ErbB3 and heregulin-β. Transcriptional activity and gene expression measurement showed that the hormonal repression of ER was relieved with the expression of CXCR4 and partially recuperated with the addition of SDF-1. Together, these results show that CXCR4 recruitment to ErbB2 alters ErbB2/ErbB3 signaling pathway and downstream regulation of ER hormonal activity in in breast cancer cells. Our work has enabled us to identify and characterize the impact of membrane receptors signaling on ER transcriptionnal response in breast cancer cells. Membrane signaling is one of the factors involved in endocrine therapy resistance and targeting the receptors implicated could be benificial to improve existing treatments and to work on the creation of new ones.

Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides, classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des LARNnc dans différents systèmes eucaryotes. Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84. Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil d'activation du promoteur PHO84. Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs (ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7 comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur. De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur. / Transcription is the initial step in gene expression and is subject to extensive regulation. Recently, analyses in diverse eukaryotes have revealed that in addition to protein coding genes, transcription occurs throughout the noncoding genome, producing non-coding RNAs of various lengths. Non-coding RNAs longer than 200 nucleotides, classified as long non-coding RNAs (lncRNAs), represent the most abundant class of non-coding transcripts, whose functions however are poorly understood. Recent studies suggest that many lncRNAs might have roles in transcription regulation. The goal of my PhD thesis was to elucidate the mechanisms of lncRNA mediated transcription regulation in different eukaryotic systems. For my first project, I investigated the role of an antisense long noncoding RNA in transcription regulation of the high-affinity phosphate transporter gene PHO84 in the unicellular eukaryote S. cerevisiae. Previous studies showed that deletion of the nuclear exosome component Rrp6 results in increased antisense expression and repression of PHO84. It was suggested that the loss of Rrp6 results in antisense stabilization at the PHO84 locus, leading to recruitment of the histone de-acetylase Hda1 and repression of PHO84. However, most of the mechanistic details of how Rrp6p functions in regulating PHO84 transcription were not understood. Combining single cell methods with biochemical and genetic approaches, we showed that antisense RNA levels are regulated primarily during transcriptional elongation by the Nrd1-Nab3-Sen1 complex, which requires Rrp6 for efficient recruitment to the 3’end of PHO84. Furthermore, we reveal anti-correlated expression of sense and antisense, which have distinct modes of transcription. In summary, our data suggest a model whereby antisense transcriptional read-through into the PHO84 promoter regulates the activation threshold of the gene. For my second project, I investigated the roles of enhancer derived RNAs (eRNAs). eRNAs are lncRNAs transcribed from enhancers that have been suggested to regulate transcription through different mechanisms, including enhancer-promoter looping, RNA polymerase elongation, and chromatin remodeling. However, no coherent model of eRNA function has yet emerged. Using MCF7 breast cancer cells as a model system, we sought to determine how estrogen (E2) induced eRNAs participate in estrogen receptor alpha (ERα) mediated transcription regulation at the single allele level. Using single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH), we revealed that upon E2 induction eRNAs are induced with similar kinetics as target mRNAs, but are localized exclusively in the nucleus, mostly chromatin associated, and are less abundant than mRNAs. Surprisingly, we found that eRNAs are rarely co-transcribed with their target loci, indicating that active gene transcription does not require the continuous synthesis or accumulation of eRNAs at the enhancer. Furthermore, using sub-diffraction-limit distance measurements, we demonstrated that co-transcription of eRNAs and mRNAs rarely occurs within a closed enhancer-promoter loop. Moreover, we revealed that basal eRNA transcription does not require ERα or the histone methyltransferase MLL1, which activates the enhancer through H3K4 mono-methylation. Altogether, our findings showed that eRNAs may play a role during promoter activation, but are not required to sustain mRNA transcription or stabilize enhancer-promoter looping interactions.

TP53 est l'un des gènes les plus fréquemment mutés dans le cancer du sein (~ 30% de tumeurs) et code pour le suppresseur de tumeur p53. La majorité des mutations TP53 observées dans le cancer du sein sont exclusives à chaque sous-type, avec une fréquence de mutation élevée (75-80%) dans les sous-types de récepteurs aux œstrogènes négatifs (statut ER-), qu’ils soient de type HER2 + ou basal, alors que cette fréquence est plus faible (15-30%) dans les tumeurs ER + de sous-types de luminal A ou B. Les tumeurs mammaires ER + dépendent des œstrogènes pour leur croissance et peuvent être traitées avec des anti-œstrogènes, alors que les tumeurs ER- sont résistantes à un tel traitement. Il a été publié que p53 régule positivement l'expression de ER, suggérant que des mutations pourraient contribuer à la perte de ER. Nous avons donc émis l'hypothèse que les mutations TP53 trouvées dans les sous-types ER- pourraient provoquer la perte d'expression de ER, de la dépendance aux œstrogènes pour la prolifération, et de la sensibilité aux anti-œstrogènes. L'expression de TP53, qui n’est pas muté dans la lignée cellulaire de cancer du sein ER + MCF-7, a été supprimée par une approche CRISPR-Cas9. Un panel de mutations de TP53 a été sélectionné en fonction de leur distribution dans les différents sous-type, des niveaux ER associés à la présence de ces mutations et de leur fréquence dans des collections de tumeurs à grande échelle. Ces mutations ont ensuite été introduites dans une lignée cellulaire clonale TP53 KO par rétrovirus. Ni la suppression de TP53 ni l'introduction de mutations en combinaison avec la stimulation Nutlin-3a n'ont affecté l'expression de ER dans les cellules MCF7. En outre, alors que la sensibilité à Nutlin-3a est abolie dans les lignées cellulaires KO ou porteuses de mutations de p53, aucune capacité proliférative supplémentaire n'a été observée en présence d'estradiol. Enfin, l'arrêt du cycle cellulaire par les anti-œstrogènes n'a pas été aboli par le KO de TP53. Cependant, le TP53 KO a démontré, outre une résistance à la doxorubicine et aux rayonnements ionisants, une capacité accrue de croissance clonale en l'absence d'oestrogènes. Cela suggère que la mutation TP53 n'est pas impliquée dans les phénotypes liés à ER+, mais pourrait constituer un médiateur de transition vers une croissance indépendante des œstrogènes. / TP53 is one of the most commonly mutated genes in breast cancer (~30% tumors) and encodes the tumour suppressor p53. The majority of TP53 mutations observed in breast cancer are enriched in different subtypes, with an overall higher frequency of mutation found in the estrogen receptor negative (ER-) subtypes of HER2+ and basal-like (75-80%) compared to the ER+ subtypes of luminal A and B (15-30%). ER+ breast tumours are dependent on estrogens for growth and may be treated with endocrine therapies, whereas ER- tumours are resistant to such treatments. p53 has been reported to regulate ER expression, suggesting that mutations could contribute to loss of ER. We therefore hypothesized that the TP53 mutations found in ER- subtypes may directly or indirectly lead to loss of ER expression levels and of estrogen-dependent proliferation and antiestrogen sensitivity. Wildtype TP53 expression in the ER+ breast cancer cell line MCF-7 was suppressed by CRISPR-Cas9. A panel of TP53 mutations was selected based on subtype bias, associated ER levels, and mutation frequency. This panel was then stably expressed into the TP53 KO clonal cell lines using retroviral expression vectors. Neither suppression of TP53 or introduction of mutations in combination with Nutlin-3a stimulation suppressed estrogen receptor expression in MCF7 cells. Furthermore, while sensitivity to Nutlin-3a was abolished in the mutant p53 bearing cell lines in proliferation assays in the presence of estradiol, no estrogen-independent proliferative capacity was observed. Finally, antiestrogen-mediated cell cycle arrest was not relieved upon TP53 KO. However, TP53 KO demonstrated an increased capacity for clonal growth in the absence of estrogens, and resistance to doxorubicin and ionizing radiation. Our results suggest that TP53 mutations are not involved in loss of ER+ related phenotypes but may act as mediators of transition to estrogen-independent growth.

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<p>U ovoj doktorskoj disertaciji&nbsp; razvijen&nbsp; je fluorescentni test u kvascu za identifikaciju potencijalnih prirodnih ili sintetičkih liganada&nbsp; ER&alpha;, ER&beta; ili AR i kvantifikaciju&nbsp; njihovog&nbsp; afiniteta&nbsp; vezivanja sa mogućno&scaron;ću testiranja čitavih biblioteka modifikovanih steroida i ksenoestrogena. Takođe, opisana&nbsp; je primena optimizovanog biosenzora&nbsp; za&nbsp; procenu&nbsp; estrogenog&nbsp; potencijala sintetskih steroida i odabranih biljnih ekstrakata bogatih jedinjenjima fitoestrogenih osobina. U cilju potpunijeg sagledavanja mehanizma&nbsp; delovanja&nbsp; odabranih&nbsp; modifikovanih&nbsp; steroida&nbsp; ispitana&nbsp; je&nbsp; njihova antiproliferativna aktivnost prema ćelijskim&nbsp; linijama estrogen receptor pozitivnog kancera dojke&nbsp; (MCF-7) i kancera prostate (PC-3), dok su&nbsp; in silico metodom molekularnog&nbsp; dokinga&nbsp; predviđene&nbsp; energije&nbsp; i&nbsp; geometrije&nbsp; vezivanja&nbsp; ovih&nbsp; jedinjenja za ligand-vezujuće&nbsp; domene&nbsp; ER&alpha; i ER&beta;. Drugi deo ovog rada obuhvata razvoj testa za&nbsp; ispitivanje aktivnosti humanog enzima aromataze,&nbsp; heterologno eksprimiranog u ćelijama&nbsp; kvasca&nbsp; Saccharomyces cerevisiae&nbsp; i/ili&nbsp; bakterija Escherichia coli, u prisustvu&nbsp; ili&nbsp; odsustvu&nbsp; inhibitora.&nbsp; Interakcije modifikovanih&nbsp; steroida, odabranih na osnovu strukture,&nbsp; sa&nbsp; aromatazom&nbsp; ispitane&nbsp; su&nbsp; osetljivim spektroskopskim metodama, praćenjem promene spinskog stanja Fe iz hem grupe ili promene fluorescencije ostatka&nbsp; triptofana&nbsp; iz&nbsp; aktivnog&nbsp; centra usled konformacione&nbsp; promene&nbsp; proteina, izazvane interakcijom sa ligandom. Razvijeni in vitro testovi bez upotrebe radioaktivnih izotopa su, osim&nbsp; visoke efikasnosti&nbsp; i&nbsp; bezbednosti&nbsp; po&nbsp; korisnika&nbsp; i&nbsp; okolinu, pokazali&nbsp; specifičnost&nbsp; i&nbsp; ekonomičnost&nbsp; u preliminarnom&nbsp; skriningu&nbsp; liganada&nbsp; steroidnih receptora&nbsp; i inhibitora aromataze. Jedinjenja&nbsp; kod kojih je detektovana&nbsp; značajna biolo&scaron;ka aktivnost mogu potencijalno poslužiti kao osnova za razvoj terapeutika u lečenju hormon-zavisnih bolesti i stanja, koja danas predstavljaju globalni zdravstveni problem.</p> / <p>In&nbsp; this&nbsp; doctoral&nbsp; dissertation,&nbsp; a&nbsp; fluorescent&nbsp; assay&nbsp; in&nbsp; yeast&nbsp; was&nbsp; developed&nbsp; for&nbsp; identification&nbsp; of&nbsp; potential&nbsp; natural or synthetic ligands of ER&alpha;, ER&beta; or AR and<br />quantification&nbsp; of&nbsp; their&nbsp; binding&nbsp; affinity,&nbsp; as&nbsp; well&nbsp; asevaluation&nbsp; of&nbsp; the&nbsp; estrogenic&nbsp; potential&nbsp; of&nbsp; synthetic steroids&nbsp; and&nbsp; selected&nbsp; plant&nbsp; extracts&nbsp; rich&nbsp; in phytoestrogen&nbsp; content.&nbsp; The&nbsp; assay&nbsp; could&nbsp; be&nbsp; used&nbsp; to&nbsp; screen&nbsp; libraries&nbsp; of&nbsp; modified&nbsp; steroids&nbsp; and xenoestrogens.&nbsp; In&nbsp; order&nbsp; to&nbsp; better&nbsp; understand&nbsp; the biomedical&nbsp; potential&nbsp; of&nbsp; selected&nbsp; modified&nbsp; steroids, results&nbsp; were&nbsp; compared&nbsp; to&nbsp; antiproliferative&nbsp; activity against&nbsp; estrogen&nbsp; receptor&nbsp; positive&nbsp; breast&nbsp; cancer (MCF-7)&nbsp; and&nbsp; prostate&nbsp; cancer&nbsp; (PC-3)&nbsp; cell&nbsp; lines. Binding&nbsp; energies&nbsp; and&nbsp; the&nbsp; geometry&nbsp; of&nbsp; binding&nbsp; of these&nbsp; compounds&nbsp; for&nbsp; ER&alpha;&nbsp; and&nbsp; ER&beta;&nbsp; ligand&nbsp; binding domains&nbsp; were&nbsp; predicted&nbsp; in&nbsp; silico&nbsp; by&nbsp; molecular&nbsp; docking&nbsp; methods.&nbsp; The&nbsp; second&nbsp; part&nbsp; of&nbsp; this&nbsp; study includes development&nbsp; of&nbsp; an&nbsp; assay&nbsp; for&nbsp; study&nbsp; of&nbsp; aromatase&nbsp; activity&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; presence&nbsp; or&nbsp; absence&nbsp; of inhibitors&nbsp; by&nbsp; heterologous&nbsp; expression&nbsp; of&nbsp; human aromatase&nbsp; in&nbsp; Saccharomyces&nbsp; cerevisiae&nbsp; and/or Escherichia&nbsp; coli&nbsp; cells,&nbsp; as&nbsp; model-organisms. Furthermore, interactions between modified steroids, selected&nbsp; according&nbsp; to&nbsp; their&nbsp; structure,&nbsp; and&nbsp; aromatase were&nbsp; tested&nbsp; using&nbsp; sensitive&nbsp; spectroscopic&nbsp; methods based on ligand-induced changes&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; spin state of Fe&nbsp; from&nbsp; the&nbsp; heme&nbsp; group&nbsp; or&nbsp; changes&nbsp; in&nbsp; the fluorescence&nbsp; of&nbsp; a&nbsp; tryptophan&nbsp; residue&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; active site.&nbsp; The&nbsp; non-radioactive&nbsp; in&nbsp; vitro&nbsp; assays&nbsp; developed&nbsp; here, besides high efficiency, user and environmental safety,&nbsp; also&nbsp; have&nbsp; greater&nbsp; specificity&nbsp; and&nbsp; are&nbsp; more cost-effective&nbsp; for&nbsp; preliminary&nbsp; screening&nbsp; of&nbsp; steroid receptor&nbsp; ligands&nbsp; and&nbsp; aromatase&nbsp; inhibitors. Additionally,&nbsp; compounds&nbsp; identified&nbsp; to&nbsp; express significant biological activity can serve as a basis for the&nbsp; development&nbsp; of&nbsp; potential&nbsp; therapeutics&nbsp; in&nbsp; the treatment&nbsp; of&nbsp; hormone-dependent&nbsp; diseases&nbsp; and conditions, a global health issue today.</p>

This thesis examines the rapid, non-genomic effects of estrogens on neural plasticity and learning. Estrogens are classically known to affect gene transcription events, however they have more recently been found to also rapidly activate second messenger systems within 1hr of administration. Therefore, we first examined the rapid effects of 17β-estradiol, and an estrogen receptor (ER) α and ERβ agonist on three different learning paradigms: object placement, object recognition, and social recognition. We found that both systemic injections and intrahippocampal delivery of 17β-estradiol and the ERα agonist improved performance on all 3 learning paradigms within 40min of hormone administration. However, the ERβ agonist administered systemically or intrahippocampally, improved performance only on the object placement learning paradigm, while having no effect on object recognition, and impairing social recognition at high doses. To elucidate how estrogens might rapidly affect learning, we examined how estrogens rapidly affect the neural plasticity of CA1 hippocampal neurons. We found that 17β-estradiol and the ERα agonist increased dendritic spine density in CA1 hippocampal neurons within 40min of administration, suggesting that estrogens rapidly increase the density of synapses within this brain region. Conversely, the ERβ agonist did not affect spine density, or decreased spine density. In addition, by using whole-cell patch clamp recordings of CA1 pyramidal neurons, we were able to determine that 17β-estradiol and the ERα agonist rapidly reduced AMPA receptor (but not NMDA receptor) mediated membrane depolarizations after 15min of hormone application. Similar to above, the ERβ agonist had no effect on AMPA or NMDA receptor mediated membrane depolarizations. These data suggest that estrogens rapidly promote the development of immature synapses (which contain low levels of synaptic AMPA receptors) within the CA1 hippocampus. Immature spines provide synaptic sites at which new memories can be stored and are thought of as “learning spines” (Kasai et al, 2003). Therefore, estrogens (through ERα) may rapidly induce the formation of hippocampal immature spines to promote learning. / Funded by NSERC

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