L’émergence et la dissémination des bactéries résistantes aux antibiotiques sont préoccupantes. L’infection causée par les bactéries multi-résistantes (BMR) aggrave le pronostic des malades infectés et augmente les dépenses liées à leur prise en charge. Parmi les BMR, les bactéries à Gram négatif (BGN), plus particulièrement les entérobactéries productrices de béta-lactamase à spectre étendu (E-BLSE) sont les plus fréquemment isolées. La résistance aux antibiotiques pourrait avoir un impact sur la morbidité et la mortalité dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI) en raison du potentiel d’émergence et de diffusion de bactéries résistantes aux antibiotiques, et du fardeau des infections bactériennes dans ces pays. Cependant, les données sur la résistance bactérienne sont rares et très majoritairement hospitalières dans les PRFI. De plus, dans ces pays, les infections bactériennes néonatales sévères (septicémies, pneumonies et méningites) représentent encore les principales causes de décès chez les nouveau-nés. Les entérobactéries sont majoritairement responsables de ces infections néonatales. Ainsi, investiguer la transmission d'E-BLSE chez le nouveau-né permettrait de proposer des stratégies de prévention. Ce travail de recherche s’est appuyé sur le programme BIRDY (Bacterial Infections and antibiotic Resistant Diseases among Young children in low-income countries). Le premier objectif était d’estimer la prévalence de la colonisation par des E-BLSE chez les femmes enceintes à Madagascar ainsi que les facteurs favorisant cette colonisation. Les résultats ont montré une prévalence globale de colonisation de 18.5% [IC à 95% 14.5-22.6]. Des facteurs reflétant un niveau socioéconomique plus élevé comme l’accès privatif à l’eau de boisson et avoir une maison individuelle sont associés à la colonisation. Le second objectif de ce travail était d'étudier l'incidence de la première colonisation par des E-BLSE chez les nouveau-nés en milieu communautaire et d'identifier les facteurs de risque d'acquisition. Les résultats révèlent une incidence globale d'acquisitions d'E-BLSE de 10.4 pour 1000 nouveau-nés-jours [IC à 95% : 8.0; 13.4]. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que le faible poids à la naissance HR ajusté 2.7 [IC à 95% 1.2 ; 5.9], l'accouchement par césarienne HR ajusté 3.4 [IC à 95% 1.7 ; 7.1], la prise maternelle d'antibiotique à l'accouchement HR ajusté 2.2 [IC à 95% 1.1 ; 4.5] étaient des facteurs de risque d'acquisition d'E-BLSE. Le troisième objectif était de documenter les infections néonatales. Nous avons trouvé une incidence d'infections néonatales de 30.6 cas pour 1000 naissances vivantes [IC à 95%: 23.4 ; 40.1].Nos résultats montrent que les mesures de santé publique devraient axer sur l’amélioration de la prise en charge de la grossesse et sur le diagnostic précoce des infections néonatales. / The emergence and spread of antibiotic-resistant bacteria is a concern. Infection caused by multidrug-resistant bacteria (MDR) worsens the prognosis of infected patients and increases the costs associated with their management. Among the MDRs, Gram-negative bacteria (GNB), especially extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae (ESBL-PE) are the most frequently isolated. Antibiotic resistance may have an impact on morbidity and mortality in low- and middle-income countries (LMICs) because of the potential for emergence and spread of antibiotic-resistant bacteria, and the burden of bacterial infections in these countries. However, data on bacterial resistance are scarce or came from the hospital, for the great majority, in LMICs. In these settings, severe neonatal bacterial infections (sepsis, pneumoniae and meningitis) still represent the leading causes of death in newborns. Enterobacteriaceaeare responsible for a great part of these neonatal infections. Thus, investigating the transmission of ESBL-PE in newborns would make it possible to propose prevention strategies. This work was based on the BIRDY program (Bacterial Infections and Antibiotic Resistant Diseases among Young Children in Low-Income Countries). The first objective was to estimate the prevalence of colonization by ESBL-PE in pregnant women in Madagascar as well as the risk factors of this colonization. The results showed an overall colonization prevalence of 18.5% [95% CI 14.5-22.6]. Factors reflecting a higher socioeconomic level such as private access to drinking water and having a house are associated with colonization. The second objective of this work was to study the incidence of ESBL-PE colonization in community-based infants and to identify acquisition risk factors. The results reveal an overall incidence of ESBL-PE acquisition of 10.4 per 1000 newborn-days [95% CI: 8.0; 13.4]. In addition, we found that low birth weight adjusted HR 2.7 [95% CI 1.2; 5.9], cesarean section delivery adjusted HR 3.4 [95% CI 1.7; 7.1], maternal intake of antibiotic at delivery adjusted HR 2.2 [95% CI 1.1; 4.5] were risk factors for the acquisition of ESBL-PE. The third objective was to document neonatal infections. We found an incidence of neonatal infections of 30.6 cases per 1000 live births [95% CI: 23.4; 40.1]. Our results suggest that public health measures should focus on the improvement of pregnancy follow-up and early diagnosis of neonatal infections.

Dans le monde entier l’antibiorésistance des entérobactérales communautaires, notamment par production de ß-lactamase à spectre étendu (E-BLSE), conduit à une consommation préoccupante d’antibiotique de dernier recours tels les carbapénèmes. Dérivé de la ticarcilline la témocilline pourrait représentée une alternative y compris sur certaines entérobactérales productrices de carbapénèmase (EPC). Néanmoins, il existe une incertitude concernant les concentrations critiques distinguant les entérobactérales sensibles des résistantes avec trois valeurs selon les pays utilisateurs de témocilline (8 mg/L, 16 mg/L ou 32 mg/L) tandis qu’une harmonisation internationale reste en attente. En ce contexte trois travaux originaux ont été poursuivi ainsi qu’une revue de la littérature. Il fut d’abord étudié in vitro la sensibilité à la témocilline de 762 entérobactérales responsables d’infection urinaire communautaire. Dans un contexte de prévalence faible des E-BLSE (5%) et nulle des EPC, les trois méthodes de routine (disque, automate, Etest) se sont révélées très fiables, la borne épidémiologique pour la témocilline s’établissant à 8 mg/L. Ensuite, l’efficacité de la témocilline vis-à-vis d’entérobactérales productrices ou non de ßlactamases (E-BLSE ou EPC) a été évaluée dans deux modèles murins complémentaires. Il a été montré l’efficacité de la témocilline à un schéma reproduisant la posologie humaine de 2 g toutes 12 h vis-à-vis d’entérobactérales pour lesquels la CMI de la témocilline était de 8 mg/L. L’efficacité de ce schéma posologique, bien que significative, était moindre vis-à-vis des isolats pour lesquels la CMI de la témocilline était de 16 mg/L. Par contre, il ne fut pas observé d’efficacité significative de la témocilline vis-à-vis des isolats avec une CMI à 32 mg/L quelques soit le schéma posologique (2 g toutes les 8 ou 12 h). L’ensemble de ces résultats, ainsi qu’une revue exhaustive des données de la littérature, conduisent à proposer une concentration critique de 8 mg/L pour le schéma posologique de 2 g toutes les 12 h, et de 16 mg/L pour celui de 2 g toutes les 8h. Cette dernière proposition correspondrait au « sensible à forte exposition », nouvelle définition de la catégorisation « intermédiaire » selon les dernières recommandations de l’EUCAST. / Worldwide spread of antimicrobial resistance among community-acquired enterobacterales, especially ESBL, leads to a worrying consumption of last resort antibiotics like carbapenem. Derivative of ticarcillin, temocillin may be an attractive carbapenem-sparing agent including against some carbapenemase-producing enterobacterales (CPE). Nevertheless, there is still uncertainty regarding clinical breakpoints with 3 different values depending on countries (8 mg/L, 16 mg/L, 32 mg/L), moreover international consensus about this issue is awaited. In this context, three original studies were conducted along with a literature review. First, in vitro susceptibility to temocillin of 762 enterobacterales from community-acquired urinary tract infection was studied. In this area of low prevalence of ESBL and no CPE, the three routine susceptibility methods (disk diffusion, automate, Etest) were very accurate, epidemiological cut-off was set to 8 mg/L. Then, temocillin efficacy against enterobacterales producing or not producing ß-lactamase (ESBL or CPE) was assessed by two complementary murine models. We demonstrated that temocillin exposure reproducing 2 g q12h regimen showed efficacy against strains with temocillin MIC of 8 mg/L. This regimen exhibited a lower, even though significant, efficacy against strain with temocillin MIC of 16 mg/L. On the over hand, it was not observed significant efficacy against strain with temocillin MIC of 32 mg/L whatever the regimen used (2 g q12h or q8h). All together this results and the literature review support a clinical breakpoints of 8 mg/L for2 g q12h regimen, and 16 mg/L for 2 g q8h regimen. This last proposition correspond to the new susceptibility category : “Intermediate – Susceptible, increase exposure” from the last EUCAST recommendations.

Salmonella (S.) Infantis-Infektionen des Menschen, oft durch Lebensmittel übertragen, sind weltweit von wachsender Bedeutung. Daher war das Ziel dieser Arbeit ein Lysotypiesystem zur Charakterisierung von S. Infantis-Stämmen zu entwickeln. 154 Bakteriophagen wurden zwecks Evaluierung ihrer diskriminatorischen Fähigkeit für S. Infantis-Stämme getestet. Das etablierte Lysotypiesystem umfasst letztlich 17 Typisierphagen. Insgesamt wurden 1008 S. Infantis-Stämme in dieser Arbeit untersucht, die aus Ausbrüchen und sporadischen Fällen von Gastroenteritiden des Menschen, von Tieren, aus Lebensmitteln, Futtermitteln und durch Umgebungs- untersuchungen von 1973 bis 2009 isoliert wurden. Von den 1008 untersuchten S. Infantis-Stämmen waren 985 Isolate durch das etablierte Lysotypiesystem typisierbar und konnten in 61 Lysotypen (LT) unterteilt werden. 23 Stämme konnten durch die Lysotypie nicht charakterisiert werden. Unter den 61 Lysotypen dominierten vor allem die Lysotypen LT 29 (30 %), LT 1 (21 %), LT 11 (7 %) sowie LT 9 (7 %), die sowohl beim Menschen als auch in Lebensmitteln und bei Tieren vorkamen, und wahrscheinlich als epidemisch relevante Stämme anzusehen sind. Bemerkenswert ist auch der Befund, dass Stämme des LT 23 in Deutschland nur in den 70er Jahren beim Mensch gefunden wurden, was für einen Erregerwandel spricht. Zur molekularen Subdifferenzierung wurden 325 S. Infantis-Isolate verschiedener Herkunft ausgewählt und durch Lysotypie und XbaI-Makrorestriktionsanalyse untersucht, wobei 31 Lyso- und 58 XbaI-Typen identifiziert wurden. Die Analyse von Stämmen (n = 89), die zu mehreren Ausbrüchen gehörten, zeigen innerhalb eines Geschehens einen einheitlichen Lyso- bzw. XbaI-Typ, wie z. B. die Stämme der Ausbrüche in Dobel (LT 29/XbaI 27), in Lüneburg (LT 8/XbaI 43a) und in Stolberg (LT 1/XbaI 34). Es gab darüber hinaus auch sporadische Isolate vom Mensch und von verschiedenen Tierarten (n = 150) mit Lyso-/XbaI-Typ-Kombinationen, die bei verschiedenen Ausbruchsstämmen gefunden wurden. Das könnte auf eine Verbreitung und lange Persistenz dieser Klone hindeuten. Andere sporadische Isolate (n = 86) hingegen wiesen verschiedene Lyso- und XbaI-Typ-Kombinationen auf. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass durch die komplexe Typisierung eine bessere Diskriminierung von S. Infantis-Stämmen möglich wird und dadurch auch eine eindeutigere Erkennung von Ausbrüchen. Bei 50 untersuchten Ausbrüchen (40 Lebensmittelvergiftungen und 10 Hospitalinfektionen, insgesamt 187 Stämme) wurden 12 Lysotypen nachgewiesen. Bei mehreren dieser Ausbrüche wurde der Klon LT 29/XbaI 27 identifiziert, der vermehrt bei Masthähnchen vorkommt. Besonders bemerkenswert ist das Auftreten von S. Infantis als nosokomialer Erreger von Hospitalausbrüchen in deutschen Kliniken. Beispielsweise traten in einer Klinik in Baden-Württemberg seit 2002 immer wieder S. Infantis-Stämme des LT 29/XbaI 27 auf. Eine Lebensmittelvergiftung mit 188 Erkrankten in zwei Krankenhäusern wurde im Jahr 2004 in Bayern durch Backwaren verursacht. Mittels Lysotypie und PFGE konnten alle Stämme von Menschen und Lebensmitteln als LT 53/XbaI 6 charakterisiert werden. Die überwiegende Anzahl der S. Infantis-Infektionen sind lebensmittelbedingt. Bei zwei Ausbrüchen in Nordrhein-Westfalen in den Jahren 2007 und 2008, die durch Schweinebraten und Geflügeldöner verursacht wurden, sind die S. Infantis-Klone LT 1/XbaI 34a und LT 1/XbaI 34 identifiziert worden. Der Typ LT 1/XbaI 34 wurde auch bei Schweinen und bei Masthähnchen nachgewiesen. Die komplexe Typisierung beweist, dass beide Tierspezies als Infektionsquellen für S. Infantis dienen. Eine überregionale Häufung von S. Infantis-Meldungen aus Thüringen, Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen fielen im Oktober 2007 auf, wobei alle S. Infantis-Isolate bezüglich des Lyso-/XbaI-Typs (LT 29/XbaI 27a) identisch waren. Somit lassen sich durch kontinuierliche komplexe Typisierung von S. Infantis-Isolaten auch diffuse Ausbrüche erfassen. Der Serovar S. Infantis ist in Geflügelbeständen weit verbreitet. Isolate aus Masthähnchen, die aus Deutschland, Ungarn und Island stammten, wurden typisiert und in 24 Lysotypen eingeordnet. In Deutschland dominierten bei Masthähnchen Stämme mit folgenden Typisiermustern, LT 4/XbaI 4, LT 29/XbaI 5 und LT 29/XbaI 27. Die Stämme mit der Kombination LT 29/XbaI 5 stammten ursprünglich aus Ungarn. Im Gegensatz dazu wurde bei isländischen Isolaten aus Masthähnchen der bisher in Deutschland und Ungarn nicht vorkommende Lysotyp 61 nachgewiesen. Die Lysotypie weist sowohl darauf hin, dass S. Infantis-Stämme zwischen verschiedenen Ländern zirkulieren als auch darauf, dass es länderspezifische epidemiologische Prozesse gibt. Die Antibiotikaresistenz-Testung gegen 17 Antibiotika ergab, dass 68 % der S. Infantis-Stämme sensibel oder einfachresistent und nur 21 % mehrfachresistent sind. Besorgniserregend war, dass zum ersten Mal vier Isolate des Serovars S. Infantis gefunden wurden, die über eine Extended-Spectrum Beta-Lactamase-vermittelte Resistenz gegen Cephalosporine verfügten, was durch PCR und Sequenzierung bestätigt wurde. Diese mehrfachresistenten Stämme mit den ESBL-Typen CTX-M-1 bzw. TEM-52 gehören zu den häufig vorkommenden Lysotypen LT 1 und LT 29, die auch bei Masthähnchen und Mastschweinen verbreitet sind. Die ESBL-Resistenz bei S. Infantis in Deutschland sollte weiter beobachtet werden. Der routinemäßige Einsatz des entwickelten Lysotypieschemas für den S. Infantis-Serovar wird dazu beitragen, die epidemiologische Analyse zu verbessern.

Direkter Tierkontakt gehört zu den wirkungsvollsten Elementen des Besuchererlebnisses in Zoologischen Gärten. In Streichelzoos hat der Zoobesucher unkontrollierten und unmittelbaren Kontakt mit kleinen Wiederkäuern und insbesondere mit Ziegen. Diese Anlagen können ein Zoonoserisiko darstellen, da Ziegen asymptomatische Träger von verschiedenen zoonotischen Krankheitserregern sein können und in der Vergangenheit bereits Übertragungen auf den Menschen nach Kontakt mit Streicheltieren nachgewiesen wurden. Es sollte das Vorkommen ausgewählter zoonotischer Pathogene (Shigatoxin-produzierende Escherichia coli (STEC), Coxiella burnetii, Campylobacter spp., Arcobacter spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Enterobacteriaceae mit beta-Laktamasen mit breitem Wirkungsspektrum (ESBL), Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) und Dermatophyten) bei klinisch gesunden Ziegen in Streichelzoos Zoologischer Gärten in Deutschland untersucht werden. Aus 21 Herden in 14 tiergärtnerischen Einrichtungen in Deutschland wurden 300 klinisch gesunde Ziegen im Rahmen tierärztlicher Routineuntersuchungen beprobt. Der Nachweis von STEC und Salmonella spp. wurde aus Rektaltupfern über die Anzucht auf GCG-Agar versucht. Für Escherichia coli verdächtige Kulturen wurden auf Blutagar überführt und auf ausgewählte Virulenzgene per PCR untersucht. In der Folge wurde eine Serotypisierung vorgenommen. Nach Coxiella burnetii wurde in Vaginaltupfern der 230 weiblichen Tieren der Studie mittels einer real-time PCR (qPCR) gesucht. Campylobacter spp. und Arcobacter spp. aus Rektaltupfern wurden nach Isolation über Selektivnährböden unter mirkoaerophilen Bedingungen jeweils per Multiplex-PCR und qPCR auf Artebene bestimmt. Rektaltupfer wurden nach einer Kälteanreicherung mit folgender Anzucht auf Selektivnährböden auf Yersinia spp. untersucht. Nach Anzucht über einen ESBL-Selektivagar auf Basis von Rektaltupfern wurden verdächtige Kolonien mit einem VITEK-System artbestimmt und auf mögliche Antibiotikaresistenzen untersucht. Beta-Lactamase-Gene wurden mittels PCR identifiziert. Das aus Nasentupfern stammende Untersuchungsmaterial zum MRSA-Nachweis wurde nach Anreicherung einer Kultur auf einem Selektivnährboden zugeführt. Eventuelle Kolonien wurden auf einen Blutagar transferriert und danach per MALDI-TOF massenspektrometrisch untersucht. Positive Proben wurden durch PCR-Microarray untersucht. Mit einer modifizierten Mackenzie-Brush- Methode gewonnene Hautschuppen wurden über einen Pilzagar und einen selektiven Dermatophytenagar untersucht. Demographische Korrelationen zum Auftreten von Campylobacter spp. wurden mit einem exakten Test nach Fisher evaluiert. Campylobacter spp. wurden bei 22,7 %, STEC bei 20,0 % und Arcobacter spp. bei 1,7 % der 300 getesteten Ziegen nach der Kultur aus Rektaltupfern und der folgenden PCR nachgewiesen. Die Prävalenz von Campylobacter spp. war bei juvenilen höher als bei adulten Tieren (53,0 % gegenüber 14.1 %; p<0,0001). Ein Isolat der Art Escherichia fergusonii trug phänotypisch Hinweise auf eine ESBL, die durch den Nachweis des Gens blaCTX-M-1 bestätigt wurde. Aus den Nasentupfern von 20,7 % der beprobten Ziegen konnte Staphylococcus aureus kultiviert werden, darunter auch ein mecC-positiver MRSA. Weder Salmonella spp. noch Yersinia spp. fanden sich in der Stichprobe und auch der Nachweis von Dermatophyten gelang bei einer häufigen Überwucherung durch ubiquitäre Pilze (19,3 %) nicht. Unter den 230 weiblichen Ziegen der Studie gab es bei zwei Tieren positive PCR- Signale für Coxiella burnetii, die nach ausgiebiger Nachbeprobung und epidemiologischer Prüfung als falsch-positiv gewertet werden mussten. Grundsätzlich muss vom Vorhandensein einiger Zoonoseerreger in Ziegenbeständen in Streichelzoos ausgegangen werden, da Campylobacter spp. und STEC regelmäßig in der Stichprobe auftraten. Damit sollte das Risiko der Übertragung zoonotischer Bakterien von Ziegen auf Zoobesucher beim Betrieb entsprechender Anlagen Berücksichtigung finden. Angemessene Informationen und Einrichtungen zum Waschen der Hände und zur Handdesinfektion sollten in jedem Fall zur Verfügung gestellt werden. Zum genaueren Verständnis des vermehrten Auftretens von Campylobacter spp. bei jungen Ziegen sind weitere Untersuchungen notwendig. Die Identifikation von asymptomatischen Ziegen mit einer Dermatophyteninfektion bedarf einer modifizierten Technik.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Geschichte und tiergärtnerische Bedeutung des Streichelzoos 3 2.2 Ausgewählte Zoonoseerreger bei Ziegen 4 2.2.1 Shigatoxin-bildende Escherichia coli 4 2.2.1.1 Erreger 4 2.2.1.2 Bedeutung bei der Ziege 5 2.2.1.3 Bedeutung beim Menschen 5 2.2.2 Coxiella burnetii 5 2.2.2.1 Erreger 5 2.2.2.2 Bedeutung bei der Ziege 6 2.2.2.3 Bedeutung beim Menschen 7 2.2.3 Campylobacter spp. 7 2.2.3.1 Erreger 7 2.2.3.2 Bedeutung bei der Ziege 8 2.2.3.3 Bedeutung beim Menschen 8 2.2.4 Arcobacter spp. 9 2.2.4.1 Erreger 9 2.2.4.2 Bedeutung bei der Ziege 9 2.2.4.3 Bedeutung beim Menschen 10 2.2.5 Salmonella spp. 10 2.2.5.1 Erreger 10 2.2.5.2 Bedeutung bei der Ziege 11 2.2.5.3 Bedeutung beim Menschen 11 2.2.6 Yersinia spp. 12 2.2.6.1 Erreger 12 2.2.6.2 Bedeutung bei der Ziege 12 2.2.6.3 Bedeutung beim Menschen 13 2.2.7 beta-Laktamasen mit breitem Wirkungsspektrum 13 2.2.7.1 Erreger 13 2.2.7.2 Bedeutung bei der Ziege 14 2.2.7.3 Bedeutung beim Menschen 14 2.2.8 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus 15 2.2.8.1 Erreger 15 2.2.8.2 Bedeutung bei der Ziege 15 2.2.8.3 Bedeutung beim Menschen 16 2.2.9 Dermatophyten 16 2.2.9.1 Erreger 16 2.2.9.2 Bedeutung bei der Ziege 17 2.2.9.3 Bedeutung beim Menschen 17 3 Veröffentlichung 19 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten an der Publikation 19 3.2 Publikation 20 4 Diskussion 31 5 Zusammenfassung 35 6 Summary 37 7 Literaturverzeichnis 39 8 Danksagung

ESBL-producing Enterobacteriaceae are emerging worldwide and they are frequently multi-drug resistant, thus limiting treatment options for infections caused by these pathogens. The overall aim of the thesis was to investigate ESBL-producing Enterobacteriaceae in a Swedish county. First, we developed a molecular method, a multiplex PCR assay for identification of SHV, TEM and CTX-M genes in clinical isolates of Enterobacteriaceae with an ESBL phenotype. From 2002 until the end of 2007 all isolates of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Östergötland, Sweden were further investigated. The prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae was low, &lt;1%, but increasing,while the antibiotic consumption remained unchanged. CTX-M enzymes, particularly CTX-M group 1, dominate in our region as well as in the rest of Europe. Furthermore, we have investigated antimicrobial susceptibility by performing MIC-testing in a large, well-characterized population of CTX-M-producing E. coli. Only three oral antimicrobial agents (fosfomycin, nitrofurantoin and mecillinam) demonstrated susceptibility above 90%. High susceptibility, &gt;90%, was also demonstrated for carbapenems, colistin, tigecycline and amikacin. Sixty-eight per cent of ESBL-producing E. coli was multi-resistant, and the most common multi-resistance pattern was the ESBL phenotype with decreased susceptibility to trimethoprim, trimethoprim-sulfamethoxazole, ciprofloxacin, gentamicin and tobramycin. Isolates belonging to CTX-M group 9 are generally more susceptible to antibiotics than the CTX-M group 1-producing E. coli. Finally, a prospective multicentre case-control study examined the prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae in faecal samples before and after travel abroad and the risk factors of acquisition. Sixty-eight of 226 travellers (30%) had ESBL-producing Enterobacteriaceae in the faecal flora. The geographical area visited had the highest impact on acquisition, with highest the risk for travellers visiting the Indian subcontinent, followed by Asia and Africa north of the equator. Also, acquisition of ESBL-producing Enterobacteriaceae during travel is associated with abdominal symptoms such as diarrhoea. Age also seemed to affect the risk of acquiring ESBL-producing Enterobacteriaceae, the highest risks were found among travellers ≥ 65 years. This thesis has contributed to increased understanding of the epidemiology of ESBL-producing Enterobacteriaceae and their susceptibility to both beta-lactam and non-beta-lactam agents.

TEM and SHV β-lactamases are the most prevalent β-lactamases among Gram-negative bacteria. The introduction and widespread use of expanded-spectrum antibiotics, particularly third generation cephalosporins, has led to the evolution of bacterial strains expressing extended spectrum β-lactamases (ESBLs). ESBLs emerge by genetic point mutation from non-extended spectrum precursors. It was found that multiple β-lactamase families within single isolates complicate the process of detecting the resistance status of isolate using non-quantitative DNA diagnostic methods. Preliminary phenotypic characterisation of probable β-lactamase enzyme family types present in 100 isolates from the Asia-Pacific and South African locales showed that single isolates frequently contained multiple β-lactamase families. SHV, TEM, AMPC and CTX-M β-lactamase families were detected in these isolates using PCR detection methods. Ninety-eight percent of all isolates tested contained as least one β-lactamase gene, with up to four to β-lactamase gene families found to co-exist in single isolates. Kinetic PCR methods for interrogating the polymorphic sites at blaSHV codons 238 & 240 and blaTEM codons 164, 238, 240 as well as promoter polymorphism were developed. A high proportion of blaSHV 238 and 240 mutant alleles was found to correlate with cefotaxime, ceftazidime and aztreonam resistance levels. In an attempt to understand the molecular basis for the co-existence of multiple blaSHV alleles within single isolates, the blaSHV promoter region was cloned from one ESBL expressing isolate. Experimental results showed that blaSHV can exist downstream of two different promoters within a single isolate. Both promoters have previously been reported, and differ by the presence or absence of IS26, which results in a change in the transcription initiation site. The blaSHV gene copy numbers in cis with the different promoters were measured, and it was found that the copy number of the IS26::blaSHV promoter was positively correlated with resistance levels. Cloning and analysis of PCR products showed that different blaSHV variants existed in cis with promoters in individual isolates. However, mutant genes were more abundant downstream of the IS26 promoter. There were no ESBL+ isolates without this promoter. It was concluded that blaSHV in cis with the IS26 promoter is located on an amplifiable replicon, and the presence of the IS26 insertion may facilitate the acquisition of an ESBL+ phenotype. To further confirm the role of IS26 in resistance acquisition, ESBL negative isolates were subjected to serial passage in vitro evolution experiments and fluctuation assays. Results confirm that the insertion of the IS26 element upstream of blaSHV is positively correlated with the ability to exhibit an ESBL phenotype, when such isolates also contain the critical G238S substitution. It was also found that IS26 can catalyse the duplication and mobilisation of blaSHV within an isolate. Fluctuation experiments have shown that the frequency at which such genomic events occur resulting in ESBL phenotypes is extremely low and requires many generations of selection under sub-lethal conditions. A survey of a geographically diverse set of isolates has shown that IS26-blaSHV was found in all of the bacterial populations surveyed. However, it does not appear to be exclusively associated with SHV-mediated ESBL production.

Extended spectrum β-lactamases or ESBLs, which are derived from non-ESBL precursors by point mutation of β-lactamase genes (bla), are spreading rapidly all over the world and have caused considerable problems in the treatment of infections caused by bacteria which harbour them. The mechanism of this resistance is not fully understood and a better understanding of these mechanisms might significantly impact on choosing proper diagnostic and treatment strategies. Previous work on SHV β-lactamase gene, blaSHV, has shown that only Klebsiella pneumoniae strains which contain plasmid-borne blaSHV are able to mutate to phenotypically ESBL-positive strains and there was also evidence of an increase in blaSHV copy number. Therefore, it was hypothesised that although specific point mutation is essential for acquisition of ESBL activity, it is not yet enough, and blaSHV copy number amplification is also essential for an ESBL-positive phenotype, with homologous recombination being the likely mechanism of blaSHV copy number expansion. In this study, we investigated the mutation rate of non-ESBL expressing K. pneumoniae isolates to an ESBL-positive status by using the MSS-maximum likelihood method. Our data showed that blaSHV mutation rate of a non-ESBL expressing isolate is lower than the mutation rate of the other single base changes on the chromosome, even with a plasmid-borne blaSHV gene. On the other hand, mutation rate from a low MIC ESBL-positive (≤ 8 µg/mL for cefotaxime) to high MIC ESBL-positive (≥16 µg/mL for cefotaxime) is very high. This is because only gene copy number increase is needed which is probably mediated by homologous recombination that typically takes place at a much higher frequencies than point mutations. Using a subinhibitory concentration of novobiocin, as a homologous recombination inhibitor, revealed that this is the case.

Introdução - A crescente resistência antimicrobiana em bactérias responsáveis por infecções hospitalares é um grande desafio à Saúde Pública. as B-lactamases de espectro estendido (ESBL), que hidrolisam a maioria dos compostos B-lactâmicos, são reconhecidas mundialmente como um grande problema para pacientes hospitalizados, devido à localização de seus genes em elementos transferíveis, facilitando sua disseminação. Objetivo - Caracterizar geneticamente cepas de Enterobactérias produtoras de ESBL isoladas de pacientes de um hospital público da cidade de São Paulo. Material e métodos - Todas as cepas de enterobactérias produtoras de ESBL isoladas em um ano foram submetidas a análises moleculares pela PCR, com iniciadores específicos para oito genes bla, e as cepas de Klebsiella pneumoniae ESBL positivas (ESBL-Kp) identificadas nesse período foram comparadas pela técnica de PFGE.Resultados - Os genes, bla(tem), bla(shv), bla(ctx-m), bla(per-2) bla(veb) and bla(ges) foram identificados em 9 espécies: Klebsiella pneumoniae (71,5 por cento), Escherichia coli (13,5 por cento), Morganella morganii (6 por cento), Proteus mirabilis (3 por cento), Klebsiella oxytoca (1,5 por cento), Providencia rettgeri (1,5 por cento), Providencia stuartii (1,5 por cento), Enterobacter aerogenes (0,75 por cento). Os genes bla(per-1) e bla(oxa) não foram detectados. O PFGE revelou 8 perfis moleculares principais em 68,4 por cento das ESBL-Kp, e 31,6 por cento das cepas não estavam relacionadas. Conclusões - Os resultados de PCR revelaram uma grande variedade de grupos de ESBL, e aparentemente este é o primeiro relato de grupos GES e VEB em enterobactérias no Brasil. / Introduction - The increasing antimicrobial resistance in pathogenic bacteria causing nosocomial infections is a major public health challenge. The extended-spectrum &#946;-lactamases (ESBL), which hydrolyze most of &#946;-lactams, are recognized worldwide as a great problem to hospitalized patients, due to the transferable location of their genes, which facilitates their spreading. Objective - Genetically characterize ESBL-producing Enterobacteriaceae strains isolated from patients of a Public Hospital in the city of São Paulo. Material and Methods - All Enterobacteriaceae ESBL-producing strains isolated in an 1-year period were submitted to molecular analysis by PCR with specific primers for eight bla genes, and all ESBL Klebsiella pneumoniae (ESBL-Kp) identified in this period were compared by the PFGE technique. Results - Genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaPER-2, blaVEB and blaGES were identified in 9 species: Klebsiella pneumoniae (71,5%), Escherichia coli (13,5%), Morganella morganii (6%), Proteus mirabilis (3%), Klebsiella oxytoca (1,5%), Providencia rettgeri (1,5%), Providencia stuartii (1,5%), Enterobacter aerogenes (0,75%) and Enterobacter cloacae (0,75%). Genes blaPER-1 and blaOXA were not detected in any strain. PFGE revealed 8 distinct main molecular patterns in 68,4% of ESBL-Kp, and 31,6% of the strains were totally unrelated. Conclusions - PCR results showed a great variety of ESBL groups in the institution, and apparently this is the first report of GES- and VEB-ESBL groups in enterobacteria in Brazil. The results suggest the spread of resistance genes in different strains of ESBL-Kp in some hospital wards, and also that some strongly related clones of these bacteria colonized patients from a neonatal ward in a 3-month period.

Introdução - A crescente resistência antimicrobiana em bactérias responsáveis por infecções hospitalares é um grande desafio à Saúde Pública. as B-lactamases de espectro estendido (ESBL), que hidrolisam a maioria dos compostos B-lactâmicos, são reconhecidas mundialmente como um grande problema para pacientes hospitalizados, devido à localização de seus genes em elementos transferíveis, facilitando sua disseminação. Objetivo - Caracterizar geneticamente cepas de Enterobactérias produtoras de ESBL isoladas de pacientes de um hospital público da cidade de São Paulo. Material e métodos - Todas as cepas de enterobactérias produtoras de ESBL isoladas em um ano foram submetidas a análises moleculares pela PCR, com iniciadores específicos para oito genes bla, e as cepas de Klebsiella pneumoniae ESBL positivas (ESBL-Kp) identificadas nesse período foram comparadas pela técnica de PFGE.Resultados - Os genes, bla(tem), bla(shv), bla(ctx-m), bla(per-2) bla(veb) and bla(ges) foram identificados em 9 espécies: Klebsiella pneumoniae (71,5 por cento), Escherichia coli (13,5 por cento), Morganella morganii (6 por cento), Proteus mirabilis (3 por cento), Klebsiella oxytoca (1,5 por cento), Providencia rettgeri (1,5 por cento), Providencia stuartii (1,5 por cento), Enterobacter aerogenes (0,75 por cento). Os genes bla(per-1) e bla(oxa) não foram detectados. O PFGE revelou 8 perfis moleculares principais em 68,4 por cento das ESBL-Kp, e 31,6 por cento das cepas não estavam relacionadas. Conclusões - Os resultados de PCR revelaram uma grande variedade de grupos de ESBL, e aparentemente este é o primeiro relato de grupos GES e VEB em enterobactérias no Brasil. / Introduction - The increasing antimicrobial resistance in pathogenic bacteria causing nosocomial infections is a major public health challenge. The extended-spectrum &#946;-lactamases (ESBL), which hydrolyze most of &#946;-lactams, are recognized worldwide as a great problem to hospitalized patients, due to the transferable location of their genes, which facilitates their spreading. Objective - Genetically characterize ESBL-producing Enterobacteriaceae strains isolated from patients of a Public Hospital in the city of São Paulo. Material and Methods - All Enterobacteriaceae ESBL-producing strains isolated in an 1-year period were submitted to molecular analysis by PCR with specific primers for eight bla genes, and all ESBL Klebsiella pneumoniae (ESBL-Kp) identified in this period were compared by the PFGE technique. Results - Genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaPER-2, blaVEB and blaGES were identified in 9 species: Klebsiella pneumoniae (71,5%), Escherichia coli (13,5%), Morganella morganii (6%), Proteus mirabilis (3%), Klebsiella oxytoca (1,5%), Providencia rettgeri (1,5%), Providencia stuartii (1,5%), Enterobacter aerogenes (0,75%) and Enterobacter cloacae (0,75%). Genes blaPER-1 and blaOXA were not detected in any strain. PFGE revealed 8 distinct main molecular patterns in 68,4% of ESBL-Kp, and 31,6% of the strains were totally unrelated. Conclusions - PCR results showed a great variety of ESBL groups in the institution, and apparently this is the first report of GES- and VEB-ESBL groups in enterobacteria in Brazil. The results suggest the spread of resistance genes in different strains of ESBL-Kp in some hospital wards, and also that some strongly related clones of these bacteria colonized patients from a neonatal ward in a 3-month period.

Multiresistenta gramnegativa bakterier (MRGN) som Escherichia coli och Pseudomonas aeruginosa utgör ett globalt hälsoproblem och på grund av resistensutveckling hos bakterierna behövs nya behandlingsalternativ. Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) är vanligt förekommande hos MRGN och det finns olika typer av ESBL (exempelvis ESBLA och ESBLCARBA). Gemensamt är att det finns få behandlingsalternativ för ESBL-producerande MRGN. Syftet med studien var att undersöka effekten av potentiellt nya behandlingsalternativ mot MRGN i form av cykloserin och ceftazidim tillsammans med β-laktamasinhibitorn avibaktam. För att undersöka minimum inhibitory concentration (MIC) för cykloserin (CYK) mot E. coli (n=26) användes en egenutvecklad buljongspädningsmetod. Isolat av P. aeruginosa med och utan karbapenemasproduktion (n=25) undersöktes avseende MIC för ceftazidim/avibaktam (CZA) med två kommersiella buljongspädningsmetoder.  För CYK låg medianen för E. coli-stammarnas MIC-värden vid 32 mg/L (16 – 64 mg/L) vilket ligger kring det epidemiologiska cut-off värdet för Mycobacterium tuberculosis (32 mg/L), för vilken CYK idag används som behandling.  För CZA låg medianen för P. aeruginosa-stammarnas MIC-värden vid 8 mg/L (&lt;1 - ≥8 mg/L), och 40% (2/5) av de karbapenemasproducerande isolaten var känsliga enligt kliniska brytpunkter (S≤8 mg/L). Sammanfattningsvis visar studien att CYK har MIC-värden mot non-ESBL- och ESBL-producerande E. coli i nivå med andra patogener där preparatet används. Studien visar också att CZA kan ha effekt mot isolat med nedsatt känslighet mot meropenem eller ESBLCARBA-producerande isolat av P. aeruginosa, men isolaten måste resistensbestämmas innan behandling sätts in. / Multiresistant gramnegative bacteria (MRGN) like Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, constitute a global health issue. Due to the resistance development among bacteria, new options for treatment are needed. Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) is common among MRGN, and there are different types of ESBLs (as ESBLA and ESBLCARBA). The increasing lack of treatment alternatives is mutual for the different ESBLs. The purpose of this study was to examine cycloserine and ceftazidime with the β-lactamase-inhibitor avibactam, two potentially new options for treatments effective against MRGN. To examine the minimum inhibitory concentration (MIC) for cycloserine (CYK) against E. coli (n=26) a in-house broth microdilution-method was used. Using two commercial broth microdilution-methods, isolates of P. aeruginosa with and without carbapenemaseproduction (n=23) were examined regarding MIC for ceftazidime/avibactam (CZA).  Regarding CYK, the median MIC-value of the E. coli-strains was 32 mg/L (16 - 64 mg/L), which is around the epidemiological cut-off-value (32 mg/L) for Mycobacterium tuberculosisfor which CYK is being used as treatment. The median of the MIC-values for CZA was 8 mg/L (&lt;1 - ≥8 mg/L) for all P. aeruginosa-strains and 40% (2/5) of the carbapenemaseproducing isolates were sensitive according to the clinical breakpoint (S≤8 mg/L). In summary, this study shows that CYK has MIC-values against non-ESBL- and ESBL-producing E. coli at the same level as other pathogens where CYK is being used. Further, CZA may have effect against the isolates with reduced susceptibility against meropenem and ESBLCARBA-producing P. aeruginosa, although the isolates need to be susceptibility-determined before treatment.