A seqüência de nucleotídeos codificante do peptídeo derivado da hidrólise da canatoxina (jaburetox-2Ec), foi clonada e expressa nos sistema pET101/E. coli BL 21. Neste trabalho, estudamos a estabilidade dos plasmídeos da série pET contendo a seqüência codificante do jaburetox-2Ec no sistema de expressão E. coli BL 21 (Mulinari, 2004), e as condições para aumentar produção do peptídeo recombinante, avaliando a velocidade de transferência de oxigênio, o controle do pH, e a utilização da lactose como indutor em substituição ao IPTG. O cultivo da bactéria recombinante em incubadora orbital contendo 10 g/l de lactose como indutor produziu 1,26 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total após oito horas de cultivo. A estabilidade do plasmídeo e a expressão do peptídeo recombinante foram estudadas em biorreatores. A expressão do jaburetox-2Ec foi fortemente afetada pelo pH da cultura, com a diminuição de mais de 50 % da concentração desse peptídeo quando ocorre acidificação do meio de cultura. Da mesma forma, o aumento da aeração e agitação tem efeito negativo sobre a produção do peptídeo, diminuindo em sete vezes a produção do jaburetox-2Ec Apesar do aumento da biomassa devido ao cultivo da E. coli recombinante em meio mínimo, contendo como fonte de carbono a glicose, isto não representou aumento da concentração do peptídeo recombinante. Contudo, sob a melhor condição de cultivo em biorreator estudada (pH controlado e menor transferência de oxigênio), obteve-se uma produção de 7,14 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total, representando em torno de 2 % da proteína total da célula. Em todas as bateladas, após atingir a máxima expressão do peptídeo, essa concentração diminui provavelmente devido à atividade das proteases da célula causando a degradação do peptídeo recombinante. A carga metabólica imposta à célula devido à expressão do jaburetox-2Ec, é uma das possíveis causas da instabilidade do plasmídeo observada em todas as bateladas.

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres. / Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.

SILVA, Antonio Vinicios Alves da. Avaliação dos eeitos da infecção pela Escherichia coli enteroagregativa (CEPA 239-1) na evolução clonal e resposta pró-inflamatória de células intestinais in vitro e sua modulação com alanil-glutamina. 2012. 112 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-06-03T11:39:14Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_avasilva.pdf: 2080618 bytes, checksum: 4ffbece9d97e80544378a0794f5d2971 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-06-03T11:39:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_avasilva.pdf: 2080618 bytes, checksum: 4ffbece9d97e80544378a0794f5d2971 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-03T11:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_avasilva.pdf: 2080618 bytes, checksum: 4ffbece9d97e80544378a0794f5d2971 (MD5) Previous issue date: 2012 / Death from acute diarrhea has been reduced since 80´s. However diarrhoeal diseases account for nearly 1.34 million deaths a year among children under-five years of age, making them the second most common cause of child deaths worldwide. As mortality acute diarrhea was reduced, persistent diarrhea (PD) has become a major enteric diseases infant collaborating to morbidity of affected populations. Small intestinal mucosa injury that becomes prolonged has been named as a central mechanism in the pathophysiology of PD. The protein malnutrition and infection by Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) are strongly associated with development PD. The present study investigated the effect of supplementation of Alanyl-Glutamine on monolayer of intestinal cells in the absence of infection, evaluated some parameters of the injury caused by EAEC (strain 239-1) on the intestinal mucosa in vitro and modulation of such injury by Alanyl-Glutamine 10mM. The result show that effects of supplementation of Alanyl-Glutamine 10mM is no different from effects free glutamine 4mM. Compared to E. coli HS, EAEC infection reduced the number of migrating cells, increased the percentage of necrosis, decreased the proliferation and transcription-reverse from small GTPases (RhoA, Rac1 and Cdc42), within 6 hours of contact. The contact EAEC reduced transcription of IL-8 (6h and 0h), NF-κB (6h) and TLR5 (6h and 12h) and increased TNF-α expression. The treatment of infection with Ala-Gln 10mM altered the following parameters: reduced the percentage of necrosis, increase of cell migration, although it has not caused changes in the transcription of Rho GTPases genes, increased transcription IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h and 12h). Treatment with dipeptidio significantly reduced the secretion of TNF-α (12h) while increased protein expression of IL-6 (6 e 12h). In conclusion, found that glutamine deprivation decreases cellular response against the infectious stimulus. The EAEC appears to minimize the innate host immune defenses by reducing the transcription of NF-kB and TLR5 and limit the increased transcription of IL-8. The Ala-Gln seems to make the cell more reactive against injurious stimuli, increasing their responsiveness through increased transcriptional IL-8, NF-kB and TLR5. Moreover increased protein expression of IL-6 appears to be one of the mechanisms by which promotes Ala-Gln protective effect on the intestinal epithelial barrier. / A morte por diarreia aguda tem apresentado grande declínio desde a década de 80 em todas as regiões do mundo. Entretanto as doenças diarreicas ainda são responsáveis por 1,34 milhões de mortes infantis a cada ano e representam a segunda maior causa de mortalidade no grupo etário com idade inferior a 5 anos. Com o declínio de mortalidade por casos de diarreia aguda a diarreia persistente (DP) se tornou uma das principais doenças entéricas infantis contribuindo para morbidade das populações afetadas. Uma lesão no intestino delgado que se torna prolongada tem sido colocada como elemento central da patofisiologia da DP. A desnutrição proteica e a infecção por Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) estão fortemente associados ao desenvolvimento da DP. O presente estudo investigou o efeito da suplementação de Alanil-Glutamina sobre monocamada de células da mucosa intestinal na ausência de infecções. Avaliou alguns parâmetros da lesão promovida por EAEC (cepa 239-1) sobre a mucosa intestinal in vitro e a modulação de tal dano pela Alanil-Glutamina 10Mm. Os resultados obtidos mostram que os efeitos da suplementação de Ala-Gln 10mM não diferem dos efeitos exibidos pela glutamina livre 4mM. Em relação a cepa comensal E. coli HS, a infecção com EAEC reduziu de forma significativa a quantidade de células em migração, aumentou o percentil de necrose, diminuiu a proliferação celular e reduziu significativamente a transcrição dos genes das pequenas GTPases (RhoA, Cdc42 e Rac1) após 6h de contato com enterócitos. O contato com EAEC reduziu a transcrição de IL-8 (0h e 6h), NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h) e aumentou a expressão proteica de TNF- α (12h). O tratamento da infecção com Ala-Gln 10mM alterou significativamente os seguintes parâmetros: aumento da quantidade de células em migração embora não tenha causado alteração na transcrição dos genes da pequenas GTPases, redução do percentual de necrose, aumento da proliferação celular, aumento da transcrição IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h). O tratamento com o dipeptidio reduziu significativamente a secreção de TNF-α (12h) enquanto aumentou a expressão proteica de IL-6 (6 e 12h). Em conclusão, verificamos que a privação de glutamina diminui a resposta celular frente ao estímulo infeccioso. A EAEC, por sua vez, parece minimizar as defesas imunes inatas hospedeiro ao reduzir a transcrição de NF-kB e TLR5 e limitar o aumento da transcrição de IL-8. A Ala-Gln parece tornar a célula mais reativa frente aos estímulos lesivos, aumentando sua capacidade de resposta através do aumento transcricional de IL-8, NF-kB e TLR5. Por outro lado o aumento da expressão proteica de IL-6 parece ser um dos mecanismos pelas quais Ala-Gln promove efeito protetor sobre a barreira epitelial intestinal.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:09:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327152.pdf: 1393303 bytes, checksum: 6ae9b5f6dfed5a6216812c0c640c6327 (MD5) Previous issue date: 2014 / As enterobactérias são patógenos oportunistas responsáveis por cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias. Além disso, têm se tornado um desafio no tratamento de doenças infecciosas, principalmente em hospitais, devido à facilidade com que adquirem genes de resistência. A produção de ß-lactamases de espectro estendido ESBL) é o mecanismo de resistência mais importante das enterobactérias. Dentre as diversas ESBLs descritas na literatura, as do tipo TEM, SHV e CTX-M são as mais disseminadas mundialmente. O objetivo deste estudo foi avaliar por meio de métodos fenotípicos e genotípicos, o perfil de resistência de estirpes de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. produtoras de ESBL isoladas de pacientes internados no Hospital Universitário Professor Polydoro Ernani de San Thiago. Foram identificadas 145 amostras isoladas de sangue, urina, secreção traqueal e de ferida cirúrgica de pacientes internados. Foram realizados testes de suscetibilidade aos antimicrobianos e detecção fenotípica de ESBL pelo Teste de Disco Aproximação. A pesquisa genotípica de ESBLs foi feita para os genes blaTEM, blaSHV e blaCTX-M por duas reações de PCR multiplex. E a identidade dos produtos amplificados de cada gene foi confirmada por sequenciamento. A avaliação da similaridade genética entre os isolados foi realizada por meio de RAPD-PCR. Do total de isolados, foram identificados 66,9% de E. coli, 25,5% de K. pneumoniae, 4,1% de Enterobacter cloacae e 3,4% de Enterobacter aerogenes. Além disso, 73% das amostras de urina foram de E. coli, 22% de K. pneumoniae, 1,7% de E. cloacae 3,4% de E. aerogenes. Das amostras de sangue 57,1% foram de E. coli, 28,6% de K. pneumoniae, 7,1% de E. cloacae e 7,1% de E. aerogenes. E de ferida, 25% dos isolados foram de E. coli, 50% de K. pneumoniae e 25% de E. cloacae. A prevalência de ESBL nos isolados foi de 27,6%, sendo que 32,5% dos isolados foram de E. coli, 60 % de K. pneumoniae e 7,5% de E. cloacae. O gene blaTEM foi detectado em 82,5% (33) das amostras, blaSHV 60% (24) dos isolados e blaCTX-M em 42,5% (17), 17,5% (7) e 12,5% (5) para CTX-M Grupo 1, Grupo 2 e Grupo 9, respectivamente. Além disso, 77% dos isolados ESBL positivos expressavam mais de uma enzima. O sequenciamento confirmou a identidade de todos os produtos amplificados. Na genotipagem por RAPD, as amostras de K. pneumoniae foram mais semelhantes entre si que os isolados de E. coli, e duas das três estipes de E. clocae possuíam o mesmo perfil eletroforético. Entretanto, apesar de algumas diferenças pontuais, a maioria dos isolados foram classificadospelo menos como "possivelmente relacionados" segundo os critérios de Tenover. Portanto, com os resultados obtidos nesse estudo, sugere-se a existência de uma estirpe de K. pneumoniae endêmica no HU/UFSC, disseminada por todos os setores, situação semelhante à observada com as estirpes de E. coli.<br> / Abstract : Enterobacteriaceae are opportunistic pathogens responsible for approximately 70% of urinary infections and 50% of septicemia. Furthermore, it has become a challenge in the treatment of infectious diseases, especially in hospitals, due to the easiness with which acquire resistance genes. The production of Extended Spectrum ß-lactamase (ESBL) is the most important mechanism of resistance of Enterobacteriaceae. Among the several ESBLs described in the literature, ESBL like TEM, SHV and CTX-M are the most widespread worldwide. The aim of this study was to evaluate by phenotypic and genotypic methods, the resistance profile of strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. ESBL-producing isolates from inpatients at the University Hospital Professor Polydoro Ernani San Thiago. 145 strains isolated from blood, urine, tracheal aspirates and wound inpatients were identified. Antimicrobial susceptibility test and phenotypic ESBL detection by Disk Approximation Test were performed. ESBLs Genotypic survey were taken for blaTEM, blaSHV and blaCTX-M genes by two multiplex PCR reactions. And the identity of the amplified product of each gene was confirmed by sequencing. The genetic similarity of isolates was performed by RAPD-PCR. The total isolates, 66.9% were E. coli, 25.5% were K. pneumoniae, 4.1% were Enterobacter cloacae and 3.4% were Enterobacter aerogenes. In addition, 73% of the urine samples were E. coli, 22% were K. pneumoniae, 1.7% were E. cloacae and 3.4% were E. aerogenes. Blood samples were 57.1% of E. coli, 28.6% of K. pneumoniae 7.1% of E. cloacae and 7.1% of E. aerogenes. And wound, 25% of the isolates were E. coli, 50% were K. pneumoniae and 25% were E. cloacae. The ESBL prevalence in isolates was 27.6% and 32.5% of these were E. coli, 60% were K. pneumoniae and 7.5% were E. cloacae. The blaTEM gene in 82.5% (33) samples, blaSHV was detected in 60% (24) isolates and blaCTX-M was detected in 42.5% (17) 17.5% (7) and 12.5% (5) for CTX-M group 1, group 2 and group 9, respectively. Additionally, 77% of ESBL-positive isolates expressing more than one enzyme type. The sequencing confirmed the identity of all PCR products. RAPD genotyping, K. pneumoniae samples were more similar to each otherthan E. coli isolates, and two of the three E. clocae stems had the same electrophoretic profile. However, despite some slight differences, most isolates were classified at least as "possibly related" according to the criteria of Tenover. Therefore, the results obtained in this study suggest the existence of a strain of K. pneumoniae endemic in HU / UFSC, spread across all sectors, similar to that observed with strains of E. coli situation.

GOMES, Antoniella Souza. Efeito protetor do lipopolissacarídeo da Escherichia coli na lesão gástrica por indometacina em ratos : envolvimento da cicloxigenase do tipo 2, no sintase induzida e dos canais de potássio sensíveis ao ATP. 2005. 121 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-06T16:06:27Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_asgomes.pdf: 2321527 bytes, checksum: 736f76f0073acd15002243376fa8a6be (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-07T11:38:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_asgomes.pdf: 2321527 bytes, checksum: 736f76f0073acd15002243376fa8a6be (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T11:38:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_asgomes.pdf: 2321527 bytes, checksum: 736f76f0073acd15002243376fa8a6be (MD5) Previous issue date: 2005 / The role of the LPS in the defense of the gastric mucosa is still not established. AIMS: 1-To verify the protective effect of the LPS in the gastric damage (GD), in the neutrophil infiltration (NI), in the increase of the leukocyte of adhesion, in the reduction of the induced glutathione levels for indomethacin (INDO) in rats; 2- To investigate the role of the COX-2, NOSi and of ATP-sensitive k channels (KATP) in the protective effect of LPS administration on INDO- induced gastropathy. METHODS: The rats were treated with LPS of E. coli (30, 100 or 300 mg/Kg, e.v.). After 6 hs, INDO was administrated (20mg/Kg, p.o.). Three hs later, the blood was harvested for determination the total and differential number of white blood cell counts. Later, the rats had been sacrificed and the GD was surveyed. Piece of the stomach had been removed for evaluation of the myeloperoxidase (MPO) activity and determination of the glutathione (GSH) levels. The adhesion and rolling of the leukocytes had been evaluated by intravital microscopy. Different groups were treated with rofecoxib, L-NAME, aminoguanidine, dexamethasone, glibenclamide, diazoxide or glibenclamide + diazoxide. After 3 hs of the administration of INDO (20mg/Kg, p.o.), had been evaluated the GD, MPO and GSH. RESULTS: LPS reduced dose- dependently INDO- induced GD and increase in MPO, with the maximal effect at the dose of 300 g/kg and in the time of 6 hs. The LPS treatment neutrophilia induced in INDO induced gastropathy. LPS reverted to the fall of the GSH levels in the stomach with INDO. The LPS treatment decreased the adhesion and increased rolling of the leukocytes when compared with the INDO treated. Rofecoxib, L-NAME, aminoguanidine or dexamethasona had not reverted the protective effect of the LPS. Glibenclamide, but not diazoxide, reverted the protective effect of the LPS in the induced gastropathy for INDO, increasing of significant form the GD, MPO and decreasing the GSH. The diazoxide + glibenclamide association of with did not revert the protective effect of the LPS. CONCLUSIONS: LPS protects against INDO induced GD, through the inhibition of the NI for a reduction of the adhesion of leukocytes to the endothelin and for an increase of the GSH levels in the stomach. This dependent event of the KATP opening. Our data also suggest that the activity of COX-2 and NOSi are not involved in the protective effect of the LPS. / O papel do LPS na defesa da mucosa gástrica ainda não está estabelecido. OBJETIVOS: 1-Verificar o efeito protetor do LPS na lesão gástrica (LG), na infiltração de neutrófilos (IN), no aumento da adesão leucocitária, na diminuição dos níveis de GSH induzidos por indometacina (INDO) em ratos; 2-Investigar o papel da COX-2, NOSi e dos canais de K sensíveis ao ATP (KATP) na gastroproteção do LPS na gastropatia por INDO. MÉTODOS: Os ratos foram tratados com LPS da E. coli (30, 100 ou 300 g/Kg, e.v.). Após 6 hs, foi administrado INDO (20mg/Kg, p.o.). Decorridas 3 hs, o sangue foi colhido para determinação do leucograma. Posteriormente, os ratos foram sacrificados e a LG foi aferida. Fragmentos do estômago foram retirados para avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) e determinação dos níveis de glutationa (GSH). A adesão e o rolling dos leucócitos foram avaliados por microscopia intravital. Diferentes grupos foram tratados com rofecoxib, L-NAME, aminoguanidina, dexametasona, glibenclamida, diazóxido ou glibenclamida + diazóxido. Após 3 horas da administração de INDO (20mg/Kg, p.o.), foram avaliadas a LG, a MPO e GSH. RESULTADOS: LPS reduziu a LG e o aumentou a MPO induzidas por INDO de forma dose-dependente, com o efeito máximo na dose de 300 g/Kg e no tempo de 6 hs. O pré-tratamento com LPS induziu uma neutrofilia na gastropatia induzida pela INDO. LPS reverteu à queda dos níveis de GSH no estômago com INDO. O tratamento com LPS diminui a adesão e aumentou o rolling dos leucócitos quando comparado com o tratado com INDO. Rofecoxib, L-NAME, aminoguanidina ou dexametasona não reverteram o efeito protetor do LPS. Glibenclamida, mas não diazóxido, reverteu o efeito protetor do LPS na gastropatia induzida por INDO, aumentando de forma significativa a LG, MPO e diminuindo a GSH. A associação de glibenclamida com diazóxido não reverteu o efeito protetor do LPS. CONCLUSÕES: LPS protege contra a LG por INDO, através da inibição da IN por uma diminuição da adesão de leucócitos ao endotélio e por um aumento dos níveis de GSH no estômago. Este evento dependente da abertura de KATP. Nossos dados também sugerem que a atividade de COX-2 e NOSi não estão envolvidos no efeito protetor do LPS.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-03-26T20:18:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Laura Kreuz Fagundes.pdf: 1415672 bytes, checksum: 1fde045222456c682c0b2bccf12e7942 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-04-09T19:28:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Laura Kreuz Fagundes.pdf: 1415672 bytes, checksum: 1fde045222456c682c0b2bccf12e7942 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T19:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Laura Kreuz Fagundes.pdf: 1415672 bytes, checksum: 1fde045222456c682c0b2bccf12e7942 (MD5) Previous issue date: 2013-08 / A Escherichia coli de aderência difusa (DAEC), um patotipo diarreiogênico de E. coli, corresponde a um grupo heterogêneo sem marcador de virulência comum a todos os isolados e de papel controverso na diarreia infantil. O objetivo deste estudo foi caracterizar genotipica e fenotipicamente amostras de DAEC, portadoras e não portadoras de adesinas Afa/Dr, isoladas de crianças com e sem diarreia. Em 70 amostras de DAEC, PCR foi realizado para pesquisa de genes descritos em DAEC, EAEC ou UPEC, que codificam: (i) oito adesinas fimbriais e afimbriais (fimH, papC, sfa, aggA, aafA, agg3A, aidA/aah, afaC); (ii) cinco toxinas (pet, astA, set1A, sat, hlyA); (iii) três proteínas captadoras/receptora de ferro (irp2, iucA, chuA/shuA); (iv) invasina (daaD) e; antígeno 43 (agn43). Ensaio de formação de biofilme foi realizado a partir da bactéria cultivada em caldo Luria-Bertani e inoculada em placas de poliestireno com DMEM suplementado com 0,4% glicose. A leitura da densidade ótica (DO490) foi realizada após coloração com safranina. Soroaglutinação para 23 antígenos O (Probac do Brasil) foi realizada em 50% das DAEC. Método de difusão de disco foi realizado para testar a suscetibilidade a 13 antimicrobianos. A presença de pelo menos um gene que codifica adesinas, toxinas, proteínas captadoras/receptora de ferro, invasina ou antígeno 43 foram encontrados em 58,6%, 51,4%, 80%, 48,6% e 57,1%, respectivamente, com os genes fimH, irp2, agn43, iucA, chuA/shuA, presentes em mais de 50% das amostras. Gene afaC+ (PCR) e/ou sonda afaBC+ (hibridização de colônias) classificou 50% das DAEC como Afa/Dr, sendo pet, sat, irp2, iucA, chuA/shuA e agn43 significantes nessas amostras (p<0,05). Do total das DAEC, 44,3% foram formadoras de biofilme, igualmente distribuídas entre as Afa/Dr e não Afa/Dr, e nenhum gene foi associado com esse fenótipo. Sorologia de 35 amostras evidenciou os seguintes sorogrupos: 1 O29, 2 O125, 2 O127 e 7 O86. Todas as O86 foram de DAEC Afa/Dr. Maiores frequências de resistência antimicrobiana foram encontradas para ampicilina (55,7%), sulfametoxazol/trimetoprim (35,7%) e tetraciclina (28,6%) e o perfil resistente/intermediário para amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, sulfametoxazol/trimetoprim foi significante nas DAEC Afa/Dr, assim como a multi-droga resistência (p<0,05). Em conclusão, observou-se: (i) alta frequência de fimH e pet e presença de agn43, até então não descrito em DAEC, em frequências similares àquelas encontradas em EAEC, UPEC e EAEC/UPEC, respectivamente; (ii) que as amostras de DAEC Afa/Dr e não Afa/Dr constituíram grupos com perfis genéticos diferenciados entre si; (iii) poucos sorogrupos foram encontrados entre as DAEC; (iv) frequências de resistência menores quando comparado com as poucas descrições em DAEC, sugerindo uma menor pressão seletiva da população do presente estudo e; (v) amostras de DAEC Afa/Dr podem representar um importante reservatório de genes de resistência a antimicrobianos, além de diversos fatores de virulência. / The diffusely adherent Escherichia coli (DAEC), a diarrheagenic pathotype of E. coli, represent a heterogeneous group without a virulence marker common to all isolates and with a controversial role in childhood diarrhea. The aim of this study was to characterize phenotypic and genotypic samples of DAEC, with or without Afa/Dr adhesins, isolated from children with and without diarrhea. In 70 samples DAEC, PCR was performed to search for genes described in DAEC, EAEC or UPEC, encoding: (i) eight fimbrials and afimbrials (fimH, papC, sfa, aggA, aafA, agg3A, aida/aah, afaC ), (ii) five toxins (pet, astA, set1A, sat, hlyA), (iii) three iron-chelators (irp2, yucA, chuA/shuA), (iv) invasin (daad) and; antigen 43 (agn43). Biofilm formation assay was carried out from the bacteria grown in Luria-Bertani broth and inoculated in microtiter plates with DMEM 0.4% glucose. Optical density (OD490) was measured after safranin staining. Seroagglutination for 23 O antigens (Probac Brazil) was performed in 50% of DAEC strains. Disk diffusion method was conducted to test the susceptibility to 13 antimicrobial agents. The presence of at least one gene encoding for adhesins, toxins, iron chelators or invasin were found in 58.6%, 51.4%, 80% and 48.6%, respectively, with the genes fimH, irp2, agn43, yucA, chuA/shuA, present in over 50% of the strains. afaC+ gene (PCR+) and/or afaBC+ probe (colony hybridization) classified 50% of DAEC as Afa/Dr, being pet, sat, irp2, yucA, chuA/shuA and agn43 significant in these strains (p<0,05). Ou of the 70 DAEC, 44.3% were biofilm former, equally present among Afa/Dr and non Afa/Dr, and no gene has been associated with this phenotype. Serology of 35 strains showed the following serogroups: 1 O29, 2 O125, 2 O127 and 7 O86. All O86 were DAEC Afa/Dr. Higher frequency of antimicrobial resistance were found for ampicillin (55.7%), trimethoprim/sulfamethoxazole (35.7%) and tetracycline (28.6%) and the pattern resistant/intermediate to amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin, sulfamethoxazole/trimethoprim was significant in Afa/Dr DAEC, as well as the multi-drug resistance (p <0.05). In conclusion, we observed: (i) a high frequency of fimH and pet and the presence of agn43, hitherto not described in DAEC, at similar frequencies to those found in EAEC, UPEC and EAEC/UPEC, respectively; (ii) that the samples Afa/Dr and non Afa/Dr DAEC constituted groups with different genetic profiles to each other; (iii) a few serogroups were found among DAEC; (iv) smaller resistance frequencies when compared with the few descriptions of DAEC, suggesting a lower selective pressure of the population of the present study and; (v) DAEC Afa/Dr strains may represent an important reservoir of antibiotic resistance genes, beyond several virulence factors.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-30Bitstream added on 2014-06-13T20:44:51Z : No. of bitstreams: 1 thomazini_cm_dr_botfm.pdf: 892086 bytes, checksum: 330ae89e0fa48c19f97f1eac213d0a4c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Intestinal population of Escherichia coli is increased in patients suffering from inflammatory bowel disease (IBD), but the reason for this elevation and particular features of these bacteria are not fully known. In this study, the adherence abilities and phenotypes of a collection of 131 E. coli isolates cultured from rectal biopsies of 27 subjects diagnosed with ulcerative colitis (UC), 8 with Crohn’s disease (CD) and 19 control patients were investigated, using HEp-2 cells in assays of 3 and 6h of bacteria-cell contact. The isolates were also PCR screened for the presence of markers linked to adherence and invasion: plasmid of aggregative adhesion (pAA) and the aggregative adherence fimbriae R (aggR), E. coli attaching and effacing (eae), invasion-associated locus (ial) and invasion plasmid antigen H (ipaH) genes. Enteroagregative E. coli (EAEC) strains, as detected in 3h adherence assays, were found in 25/35 (71.4%) IBD patients and in 5/19 (26.3%) controls (P<0.02). None of the strains had ial or ipaH, and those from CD patients were also negative for other investigated markers. Three UC patients had strains harboring both pAA and aggR and another 4 UC patients had eae+ strains. The results of the present study showed that EAEC were the dominant E. coli group found in the colonic mucosa of IBD patients. In addition, the detection of virulence markers in strains from 7/27 UC (25,9%), but in none from CD patients (p<0.02) suggests the involvement of known potentially pathogenic (typical) EAEC with ulcerative colitis

A seqüência de nucleotídeos codificante do peptídeo derivado da hidrólise da canatoxina (jaburetox-2Ec), foi clonada e expressa nos sistema pET101/E. coli BL 21. Neste trabalho, estudamos a estabilidade dos plasmídeos da série pET contendo a seqüência codificante do jaburetox-2Ec no sistema de expressão E. coli BL 21 (Mulinari, 2004), e as condições para aumentar produção do peptídeo recombinante, avaliando a velocidade de transferência de oxigênio, o controle do pH, e a utilização da lactose como indutor em substituição ao IPTG. O cultivo da bactéria recombinante em incubadora orbital contendo 10 g/l de lactose como indutor produziu 1,26 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total após oito horas de cultivo. A estabilidade do plasmídeo e a expressão do peptídeo recombinante foram estudadas em biorreatores. A expressão do jaburetox-2Ec foi fortemente afetada pelo pH da cultura, com a diminuição de mais de 50 % da concentração desse peptídeo quando ocorre acidificação do meio de cultura. Da mesma forma, o aumento da aeração e agitação tem efeito negativo sobre a produção do peptídeo, diminuindo em sete vezes a produção do jaburetox-2Ec Apesar do aumento da biomassa devido ao cultivo da E. coli recombinante em meio mínimo, contendo como fonte de carbono a glicose, isto não representou aumento da concentração do peptídeo recombinante. Contudo, sob a melhor condição de cultivo em biorreator estudada (pH controlado e menor transferência de oxigênio), obteve-se uma produção de 7,14 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total, representando em torno de 2 % da proteína total da célula. Em todas as bateladas, após atingir a máxima expressão do peptídeo, essa concentração diminui provavelmente devido à atividade das proteases da célula causando a degradação do peptídeo recombinante. A carga metabólica imposta à célula devido à expressão do jaburetox-2Ec, é uma das possíveis causas da instabilidade do plasmídeo observada em todas as bateladas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-20Bitstream added on 2014-06-13T18:39:10Z : No. of bitstreams: 1 schwach_e_me_botfmvz.pdf: 712070 bytes, checksum: a9282b39b108a2afa8d034ca14ba042a (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência das estações climáticas, do sistema de verificação dos programas de autocontrole e da implementação do ponto crítico de controle 1B (PCC 1B, revisão da contaminação de carcaças para conteúdo gastrointestinal) sobre a contaminação microbiana na superfície das carcaças bovinas. Foi realizado um trabalho de monitoramento microbiano da contaminação de carcaças, por um período de dois anos, de janeiro de 2005 a dezembro de 2006, obtendo-se 2250 amostras, permitindo um amplo conhecimento da prevalência da Escherichia coli. As amostras foram obtidas pela técnica de esfregaço de superfície de carcaças, após 24h de resfriamento das mesmas, utilizando-se swab em uma área total de 400cm2, divididos em quatro pontos da carcaça de 100cm2 cada um. A análise laboratorial seguiu as recomendações técnicas da AOAC. As contagens médias de E. coli expressas em Log UFCx100/cm2 foram, respectivamente, 1,15 e 0,27 para 2005 e 2006, representando diferença estatística (P<0,0001) entre os dois períodos avaliados. As contagens de E. coli nas estações de chuva e seca foram, respectivamente, de 0,68 e 0,71, estes valores médios apresentaram P < 0,0096 e apesar da diferença, houve pouca variação, adotamos como princípio a significância a partir de 0,0001 e assim consideramos que não houve diferença significativa. A comparação entre os grupos em função da implantação do sistema de verificação dos programas de autocontrole em junho de 2005 apresentou resultados médios de 1,42 para o grupo antes da implantação do sistema e 0,45 para o grupo posterior a implantação do sistema (P < 0,0001). A comparação entre os grupos em função da implementação do sistema de monitoramento e ações corretivas do HACCP, especialmente o PCC 1B com início em fevereiro de 2006 apresentou diferenças, com valores médios da contagem microbiana de 1,02 para o grupo anterior... / This study aims to evaluate the influence of seasonal climatic variations, of the self-monitoring control programs and of monitoring implemented under critical control point 1B (CCP - 1B) about superficial microbial contamination on beef carcasses. Microbial contamination monitoring was done during two years, from January 2005 to December 2006 collecting about 2250 samples, allowing considerable data, showing prevalence in count numbers of Escherichia coli. The samples were obtained by standard technique of swabbing the carcasses surfaces after a 24h refrigeration period; swabs were taken from 400cm2 each on four different 100cm2 sample areas. Lab analysis followed AOAC recommendations. The average count of E.coli expressed as Log UFCx100/cm2 were 1,15 for 2005 and 0,27 for 2006, which representing a (P<0,0001) statistical difference between the mentioned periods. The counts of E. coli through the rain and dry seasons were 0,68 and 0,71 on average showing P<0,0096 and despite this difference, had little variation. We adopted as significant in principle values larger than 0,0001, an so considered the difference not significant. Comparison between groups according to the implementation of self-monitoring control programs as of June 2005 showed averages of 1,42 for before implementation and 0,45 for the group after implementation of the control system (P<0001). The comparison between groups before and after implementation of hazard analysis and critical control points (HACCP) corrective actions and monitoring system starting on February 2006 showed differences on the average microbial count: 1,02 for the group before the implementation and 0,26 for the group after it (P<0,0001). Considering the analysis of the E. coli count on the surfaces of bovine carcasses, it can be said that it is not affected by the rain and dry seasons in regard of microbial contamination, use of self-monitoring control programs had a positive effect on the reduction of...

Resumo: Não disponível / Abstract: Intestinal population of Escherichia coli is increased in patients suffering from inflammatory bowel disease (IBD), but the reason for this elevation and particular features of these bacteria are not fully known. In this study, the adherence abilities and phenotypes of a collection of 131 E. coli isolates cultured from rectal biopsies of 27 subjects diagnosed with ulcerative colitis (UC), 8 with Crohn's disease (CD) and 19 control patients were investigated, using HEp-2 cells in assays of 3 and 6h of bacteria-cell contact. The isolates were also PCR screened for the presence of markers linked to adherence and invasion: plasmid of aggregative adhesion (pAA) and the aggregative adherence fimbriae R (aggR), E. coli attaching and effacing (eae), invasion-associated locus (ial) and invasion plasmid antigen H (ipaH) genes. Enteroagregative E. coli (EAEC) strains, as detected in 3h adherence assays, were found in 25/35 (71.4%) IBD patients and in 5/19 (26.3%) controls (P<0.02). None of the strains had ial or ipaH, and those from CD patients were also negative for other investigated markers. Three UC patients had strains harboring both pAA and aggR and another 4 UC patients had eae+ strains. The results of the present study showed that EAEC were the dominant E. coli group found in the colonic mucosa of IBD patients. In addition, the detection of virulence markers in strains from 7/27 UC (25,9%), but in none from CD patients (p<0.02) suggests the involvement of known potentially pathogenic (typical) EAEC with ulcerative colitis / Orientador: Maria Aparecida Marchesan Rodrigues / Coorientador: Josias Rodrigues / Banca: Carlos Roberto Victória / Banca: Lígia Sassaki / Banca: Cleverson Teixeira Soares / Doutor