ALMEIDA, Alexandra Sampaio. Purificação, caracterização bioquímica e efeito na inibição de biofilmes bacterianos de uma lectina isolada da esponja marinha Aaptos sp. 2017. 60 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Pesca)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-05-18T18:21:13Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_asalmeida.pdf: 1075533 bytes, checksum: 6de40151523ee11e9c198952750a0cec (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-18T23:37:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_asalmeida.pdf: 1075533 bytes, checksum: 6de40151523ee11e9c198952750a0cec (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T23:37:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_asalmeida.pdf: 1075533 bytes, checksum: 6de40151523ee11e9c198952750a0cec (MD5) Previous issue date: 2017 / Belonging to the porifera phylum (from Latin porus, pore, + beast, bearer of), sponges are the most primitive multicellular animals on the planet. They are sessile, benthic, being predominantly marine. In recent decades, sponges have proved to be an abundant and promising source of bioactive compounds, such as lectins. Lectins can be defined as proteins/ glycoproteins of nonimmune origin that bind and/or precipitate carbohydrates and glycoconjugates and substances containing them, free in solution or on the cell surface, without changing the covalent structure of the glycosidic bonds, reversibly and not covalent. Thus, the objective of the present work was to purify, characterize biochemically and test possible biological activities of a lectin present in the marine sponge Aaptos sp. The novel lectin (AL - Aaptos Lectin) was isolated from the combination of affinity chromatography on Guar gum matrix followed by molecular exclusion chromatography on UPLC system. AL was able to agglutinate native and enzymatically treated rabbit erythrocytes and was inhibited by galactosides. The new protein is stable at neutral to alkaline pH, is thermolabile by totally losing its activity at 40 ° C, and its molecular mass determined by spectrometry was 13.655 ± 2 Da. According to circular dichroism the lectin consists of 28% α-helix, 26% β-sheet, and 46% random region. AL was nontoxic against artemia nauplii and was not able to inhibit bacterial biofilm formation but was able to reduce the number of viable E. coli bacteria cells. Further studies will be needed to elucidate the structure of the lectin and to discover possible biotechnological applications of the new protein. / Pertencentes ao filo porifera (do latim porus, poro, + fera, portador de), as esponjas são os animais multicelulares mais primitivos do planeta. São sésseis, bentônicas, sendo predominantemente marinhas. Nas últimas décadas, as esponjas têm se revelado como uma abundante e promissora fonte de compostos bioativos, como por exemplo as lectinas. As lectinas podem ser definidas como proteínas/glicoproteínas de origem não imune que se ligam e/ou precipitam carboidratos e glicoconjugados e substâncias que os contenham, livres em solução ou na superfície celular, não alterando a estrutura covalente das ligações glicosídicas, de forma reversível e não covalente. Dessa forma, objetivo do presente trabalho foi purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o efeito na inibição de biofilmes bacterianos de uma lectina isolada da esponja marinha Aaptos sp. A nova lectina (AL – Aaptos Lectin) foi isolada a partir da combinação das cromatografias de afinidade em matriz goma de Guar seguida por cromatografia de exclusão molecular em sistema UPLC. AL foi capaz de aglutinar eritrócitos de coelho nativos e tratados enzimaticamente, sendo inibida por galactosídeos. A proteína é estável em pH neutro a alcalino e perde a atividade a partir de 40ºC. A massa molecular determinada por espectrometria de massas foi de 13.655 +/- 2 Da. Análises de dicroísmo circular sugerem que a lectina é constituída de 28% de α-hélice, 26% de folha-β, e de 46% de região randômica. AL não foi tóxica contra náuplios de artemia e não foi capaz de reduzir a biomassa dos biofilmes bacterianos, mas foi capaz de reduzir o número de células viáveis da bactéria E. coli. Estudos posteriores serão necessários para elucidação da estrutura da lectina e para se descobrir possíveis aplicações biotecnológicas da nova proteína.

A bioquímica farmacológica dos organismos marinhos tem emergido como uma interessante área a ser pesquisada. O Brasil com 8.000 km de litoral rico em espécies de esponjas representa um grande potencial de investigação de metabólitos secundários ativos. O screening de extratos de esponjas e de outros organismos marinhos é uma prática comum para identificar compostos de importância biomédica e reflete o comportamento do conjunto de compostos presentes numa dada espécie. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar um screening de propriedades redox-ativas em vinte extratos de esponjas marinhas coletadas no litoral dos estados de Santa Catarina, Pernambuco e Paraíba. Os extratos foram avaliados através dos ensaios: TRAP, degradação da 2-deoxirribose via radical •OH, produção de nitritos via •NO, auto-oxidação da adrenalina por O2 •-, redução do NBT via O2 •- e lipoperoxidação induzida por AAPH, Fe2+ e H2O2 pela técnica de TBARS. Este trabalho mostrou que extratos de esponjas marinhas possuem atividades de scavenger de •NO, H2O2 e ROO• e de proteção de peroxidação lipídica induzida por H2O2, ROO• e Fe2+. Dada a importância e o envolvimento destas espécies reativas em várias patologias, os mecanismos bem como as moléculas responsáveis pelas ações antioxidantes observadas nestes extratos de esponjas marinhas merecem ser melhor entendidos. Este trabalho apresentou uma metodologia plausível para determinar potenciais redox-ativos de importância fisiopatológica em extratos de esponjas marinhas e forneceu dados estimulantes para o prosseguimento da pesquisa por moléculas antioxidantes nestes organismos. Conforme já descrito para outras bioatividades, é possível que as características redox destes extratos sejam reflexo da biologia e ecologia das esponjas marinhas. / The biochemistry of marine organisms is emerging as a promising research area. Brazil has a 8,000 km coastline and presents diversity of sponge species, which indicates a great potential of investigation of pharmacologically active secondary metabolites. Screening of crude extracts from marine sponge and other organisms is a powerfull tool to search for biomedical relevant compounds and also reflects the behavior of the metabolites mixture presented in a species. Hence, the aim of this study was perform a redox-activity screening of twenty marine sponge extracts collected off Santa Catarina, Pernambuco, and Paraíba States. Extracts were evaluated by: TRAP, 2-deoxiribose oxidative degradation by •OH radical, •NO production of nitrites, SOD-like activity, NBT reduction via O2 •- and AAPH-, Fe2+- and H2O2-induced lipid peroxidation by TBARS. It was observed that marine sponge extracts possess scavenging activity of •NO, H2O2 and ROO•, and are able to prevent lipid peroxidation induced by H2O2, ROO• and Fe2+. In the knowledge of the involvement of reactive species in relevant dysfunctions, the mechanisms and the molecules related to the antioxidant potentials observed in these marine sponge extracts must be better studied. This work presented a feasible approach to evaluate redox-active properties against reactive nitrogen and oxygen species of physiological and pathological relevance in marine sponge extracts. Furthermore, the data obtained estimulate the research for novel antioxidant prototypes in sponge extracts. It is possible that the redox features here observed be related to the biology and ecology of marine sponges, such it is for other bioactivities.

A bioquímica farmacológica dos organismos marinhos tem emergido como uma interessante área a ser pesquisada. O Brasil com 8.000 km de litoral rico em espécies de esponjas representa um grande potencial de investigação de metabólitos secundários ativos. O screening de extratos de esponjas e de outros organismos marinhos é uma prática comum para identificar compostos de importância biomédica e reflete o comportamento do conjunto de compostos presentes numa dada espécie. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar um screening de propriedades redox-ativas em vinte extratos de esponjas marinhas coletadas no litoral dos estados de Santa Catarina, Pernambuco e Paraíba. Os extratos foram avaliados através dos ensaios: TRAP, degradação da 2-deoxirribose via radical •OH, produção de nitritos via •NO, auto-oxidação da adrenalina por O2 •-, redução do NBT via O2 •- e lipoperoxidação induzida por AAPH, Fe2+ e H2O2 pela técnica de TBARS. Este trabalho mostrou que extratos de esponjas marinhas possuem atividades de scavenger de •NO, H2O2 e ROO• e de proteção de peroxidação lipídica induzida por H2O2, ROO• e Fe2+. Dada a importância e o envolvimento destas espécies reativas em várias patologias, os mecanismos bem como as moléculas responsáveis pelas ações antioxidantes observadas nestes extratos de esponjas marinhas merecem ser melhor entendidos. Este trabalho apresentou uma metodologia plausível para determinar potenciais redox-ativos de importância fisiopatológica em extratos de esponjas marinhas e forneceu dados estimulantes para o prosseguimento da pesquisa por moléculas antioxidantes nestes organismos. Conforme já descrito para outras bioatividades, é possível que as características redox destes extratos sejam reflexo da biologia e ecologia das esponjas marinhas. / The biochemistry of marine organisms is emerging as a promising research area. Brazil has a 8,000 km coastline and presents diversity of sponge species, which indicates a great potential of investigation of pharmacologically active secondary metabolites. Screening of crude extracts from marine sponge and other organisms is a powerfull tool to search for biomedical relevant compounds and also reflects the behavior of the metabolites mixture presented in a species. Hence, the aim of this study was perform a redox-activity screening of twenty marine sponge extracts collected off Santa Catarina, Pernambuco, and Paraíba States. Extracts were evaluated by: TRAP, 2-deoxiribose oxidative degradation by •OH radical, •NO production of nitrites, SOD-like activity, NBT reduction via O2 •- and AAPH-, Fe2+- and H2O2-induced lipid peroxidation by TBARS. It was observed that marine sponge extracts possess scavenging activity of •NO, H2O2 and ROO•, and are able to prevent lipid peroxidation induced by H2O2, ROO• and Fe2+. In the knowledge of the involvement of reactive species in relevant dysfunctions, the mechanisms and the molecules related to the antioxidant potentials observed in these marine sponge extracts must be better studied. This work presented a feasible approach to evaluate redox-active properties against reactive nitrogen and oxygen species of physiological and pathological relevance in marine sponge extracts. Furthermore, the data obtained estimulate the research for novel antioxidant prototypes in sponge extracts. It is possible that the redox features here observed be related to the biology and ecology of marine sponges, such it is for other bioactivities.

A bioquímica farmacológica dos organismos marinhos tem emergido como uma interessante área a ser pesquisada. O Brasil com 8.000 km de litoral rico em espécies de esponjas representa um grande potencial de investigação de metabólitos secundários ativos. O screening de extratos de esponjas e de outros organismos marinhos é uma prática comum para identificar compostos de importância biomédica e reflete o comportamento do conjunto de compostos presentes numa dada espécie. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar um screening de propriedades redox-ativas em vinte extratos de esponjas marinhas coletadas no litoral dos estados de Santa Catarina, Pernambuco e Paraíba. Os extratos foram avaliados através dos ensaios: TRAP, degradação da 2-deoxirribose via radical •OH, produção de nitritos via •NO, auto-oxidação da adrenalina por O2 •-, redução do NBT via O2 •- e lipoperoxidação induzida por AAPH, Fe2+ e H2O2 pela técnica de TBARS. Este trabalho mostrou que extratos de esponjas marinhas possuem atividades de scavenger de •NO, H2O2 e ROO• e de proteção de peroxidação lipídica induzida por H2O2, ROO• e Fe2+. Dada a importância e o envolvimento destas espécies reativas em várias patologias, os mecanismos bem como as moléculas responsáveis pelas ações antioxidantes observadas nestes extratos de esponjas marinhas merecem ser melhor entendidos. Este trabalho apresentou uma metodologia plausível para determinar potenciais redox-ativos de importância fisiopatológica em extratos de esponjas marinhas e forneceu dados estimulantes para o prosseguimento da pesquisa por moléculas antioxidantes nestes organismos. Conforme já descrito para outras bioatividades, é possível que as características redox destes extratos sejam reflexo da biologia e ecologia das esponjas marinhas. / The biochemistry of marine organisms is emerging as a promising research area. Brazil has a 8,000 km coastline and presents diversity of sponge species, which indicates a great potential of investigation of pharmacologically active secondary metabolites. Screening of crude extracts from marine sponge and other organisms is a powerfull tool to search for biomedical relevant compounds and also reflects the behavior of the metabolites mixture presented in a species. Hence, the aim of this study was perform a redox-activity screening of twenty marine sponge extracts collected off Santa Catarina, Pernambuco, and Paraíba States. Extracts were evaluated by: TRAP, 2-deoxiribose oxidative degradation by •OH radical, •NO production of nitrites, SOD-like activity, NBT reduction via O2 •- and AAPH-, Fe2+- and H2O2-induced lipid peroxidation by TBARS. It was observed that marine sponge extracts possess scavenging activity of •NO, H2O2 and ROO•, and are able to prevent lipid peroxidation induced by H2O2, ROO• and Fe2+. In the knowledge of the involvement of reactive species in relevant dysfunctions, the mechanisms and the molecules related to the antioxidant potentials observed in these marine sponge extracts must be better studied. This work presented a feasible approach to evaluate redox-active properties against reactive nitrogen and oxygen species of physiological and pathological relevance in marine sponge extracts. Furthermore, the data obtained estimulate the research for novel antioxidant prototypes in sponge extracts. It is possible that the redox features here observed be related to the biology and ecology of marine sponges, such it is for other bioactivities.

Neste trabalho descreve-se o estudo química dos extratos de quatro esponjas e dois fungos de origem marinha oriundos da costa do Brasil. Os extratos de três esponjas (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites e Callyspongia sp.) apresentaram atividade inibitória à enzima adenosina fosforribosil transferase de Leishmania tarentolae. A partir desses extratos foram isolados 4 compostos. O trissulafato de halistanol, isolado das esponjas P. ciocalyptoides e T. ophiraphidites, e o ilhabelanol, ilhabreno e isoakaterpina, isolados da esponja Callyspongia sp. A partir do extrato bruto da esponja Axinella cf corrugata foram isolados dois derivados cumarínicos, provavelmente artefatos de isolamento do ácido 4-esculetínico, o qual é inédito como produto natural. O extrato bruto da esponja Axinella cf. corrugata apresentou atividade citotóxica, mas os compostos puros não apresentaram esta atividade. Os dois compostos puros foram testados ainda quanto sua atividade contra o vírus da SARS, na qual o éster etílico do ácido 4-esculetínico se apresentou ativo. A partir de dois extratos oriundos do fungo Beauveria felina, isolado da alga marinha Caulerpa sp, foram isoladas 17 frações puras que após diversas análises foram agrupadas em seis compostos conhecidos na literatura: a (Phe3, N-Val5) destruxina B, a cloroidrina da destruxina E, a roseotoxina B, a roseocardina, a isariina e a isariina B. Além disso, foram isolados dois compostos inéditos, a pseudodestruxina C e a cloloidrina Beta-Me-Pro da destruxina E. Os extratos brutos de Beauveria felina apresentaram atividades em bioensaios de atividade antituberculose e de citotoxicidade em linhagem de células de câncer. Os compostos puros avaliados no bioensaio antituberculose não foram ativos. Somente o composto roseotoxina B apresentou atividade citotóxica in vitro para quatro linhagens de células: mama, cólon, sistema nervoso e leucemia. / In this work we report the chemical investigation of bioactive crude extracts obtained from four sponges and two fungal strains of marine origin. The crude extracts of three sponges species (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites and Callyspongia sp.) displayed inhibitory activity towards the enzyme adenine fosforribosyl transferase of Leishmania tarentolae (L-APRT). Four compounds have been isolated from these extracts: the known halistanol sulfate was isolated of sponges P. ciocalyptoides and T. ophiraphidites, while the novel ilhabelanol, ilhabrene and isoakaterpin have been isolated from the sponge Callyspongia sp. All compounds exhibited inhibition of L-APRT at micro M concentrations. Two coumarin derivatives have been isolated from the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata, probably as artifacts of isolation: esculetin-4-carboxylic acid methyl ester and esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester. While the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata presented cytotoxic activity, the pure compounds were inactive in these assays. The esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester was found to be an in vitro inhibitor of SARS virus. The crude extract obtained of a marine-derived Beauveria felina strain, isolated from the alga Caulerpa sp., displayed antituberculosis activity against Mycobacterium tuberculosis H37Rv and cytotoxic activity against MCF-7 (breast), HCT-8 (colon) and B16 (murine melanoma) cancer cell lines. Chemical fractionation of the crude extract led to the isolation of two new cyclodepsipeptides pseudodestruxin C and [Beta-Me-Pro] destruxin E chlorohydrin, and of the known destruxin E chlorohydrin, [Phe3, N-Me-Val5] destruxin B, roseotoxin B, roseocardin, isariin and isariin B. The depsipeptides [Phe3, NMe- Val5] destruxin B and rosetoxin B, have been tested against M. tuberculosis H37 Rv and in cytotoxicity bioassays against SF 295 (human CNS) MDA-MB435 (human breast) HCT8 (colon) and HL60 (leukemia) cancer cell lines. Only roseotoxin B displayed moderate cytotoxicity against the cancer cell lines.

Neste trabalho descreve-se o estudo química dos extratos de quatro esponjas e dois fungos de origem marinha oriundos da costa do Brasil. Os extratos de três esponjas (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites e Callyspongia sp.) apresentaram atividade inibitória à enzima adenosina fosforribosil transferase de Leishmania tarentolae. A partir desses extratos foram isolados 4 compostos. O trissulafato de halistanol, isolado das esponjas P. ciocalyptoides e T. ophiraphidites, e o ilhabelanol, ilhabreno e isoakaterpina, isolados da esponja Callyspongia sp. A partir do extrato bruto da esponja Axinella cf corrugata foram isolados dois derivados cumarínicos, provavelmente artefatos de isolamento do ácido 4-esculetínico, o qual é inédito como produto natural. O extrato bruto da esponja Axinella cf. corrugata apresentou atividade citotóxica, mas os compostos puros não apresentaram esta atividade. Os dois compostos puros foram testados ainda quanto sua atividade contra o vírus da SARS, na qual o éster etílico do ácido 4-esculetínico se apresentou ativo. A partir de dois extratos oriundos do fungo Beauveria felina, isolado da alga marinha Caulerpa sp, foram isoladas 17 frações puras que após diversas análises foram agrupadas em seis compostos conhecidos na literatura: a (Phe3, N-Val5) destruxina B, a cloroidrina da destruxina E, a roseotoxina B, a roseocardina, a isariina e a isariina B. Além disso, foram isolados dois compostos inéditos, a pseudodestruxina C e a cloloidrina Beta-Me-Pro da destruxina E. Os extratos brutos de Beauveria felina apresentaram atividades em bioensaios de atividade antituberculose e de citotoxicidade em linhagem de células de câncer. Os compostos puros avaliados no bioensaio antituberculose não foram ativos. Somente o composto roseotoxina B apresentou atividade citotóxica in vitro para quatro linhagens de células: mama, cólon, sistema nervoso e leucemia. / In this work we report the chemical investigation of bioactive crude extracts obtained from four sponges and two fungal strains of marine origin. The crude extracts of three sponges species (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites and Callyspongia sp.) displayed inhibitory activity towards the enzyme adenine fosforribosyl transferase of Leishmania tarentolae (L-APRT). Four compounds have been isolated from these extracts: the known halistanol sulfate was isolated of sponges P. ciocalyptoides and T. ophiraphidites, while the novel ilhabelanol, ilhabrene and isoakaterpin have been isolated from the sponge Callyspongia sp. All compounds exhibited inhibition of L-APRT at micro M concentrations. Two coumarin derivatives have been isolated from the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata, probably as artifacts of isolation: esculetin-4-carboxylic acid methyl ester and esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester. While the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata presented cytotoxic activity, the pure compounds were inactive in these assays. The esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester was found to be an in vitro inhibitor of SARS virus. The crude extract obtained of a marine-derived Beauveria felina strain, isolated from the alga Caulerpa sp., displayed antituberculosis activity against Mycobacterium tuberculosis H37Rv and cytotoxic activity against MCF-7 (breast), HCT-8 (colon) and B16 (murine melanoma) cancer cell lines. Chemical fractionation of the crude extract led to the isolation of two new cyclodepsipeptides pseudodestruxin C and [Beta-Me-Pro] destruxin E chlorohydrin, and of the known destruxin E chlorohydrin, [Phe3, N-Me-Val5] destruxin B, roseotoxin B, roseocardin, isariin and isariin B. The depsipeptides [Phe3, NMe- Val5] destruxin B and rosetoxin B, have been tested against M. tuberculosis H37 Rv and in cytotoxicity bioassays against SF 295 (human CNS) MDA-MB435 (human breast) HCT8 (colon) and HL60 (leukemia) cancer cell lines. Only roseotoxin B displayed moderate cytotoxicity against the cancer cell lines.

A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga. / Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.

A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga. / Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.

A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga. / Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.

A descoberta de fármacos a partir de produtos isolados de organismos marinhos tem apresentado um grande crescimento nos últimos anos, principalmente devido aos avanços tecnológicos analíticos, síntese química e biotecnologia. Dentre estes, as esponjas representam uma das principais fontes de metabólitos protótipos para diversas atividades, destacando-se os efeitos antitumorais. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a investigação química e biológica de três esponjas coletadas na costa sul-brasileira: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis e Scopalina ruetzleri. Considerando a correlação entre câncer, distúrbios da coagulação e desbalanço de espécies reativas de oxigênio (EROs), foram realizados ensaios visando a aquisição destas atividades e a identificação de substâncias bioativas. Para a esponja H. tubifera foram observados interessantes efeitos antitumorais em células de glioma e neuroblastoma humano (IC50 < 20 μg/ml), além das atividades antioxidante e anticoagulante para a fração acetato de etila. O composto majoritário desta fração foi isolado como um derivado N-Boc e sua configuração foi estabelecida utilizando um novo protocolo de dicroísmo circular e semissíntese de derivados. Assim, este esfingosídeo de cadeia longa isolado (2R,3R,6R,7Z)-2-amino-7-octadecene-1,3,6-triol, foi denominado halisphingosine A. Um novo composto minoritário, halisphingosine B foi obtido usando técnicas de isolamento em escala nanomolar. Sua configuração absoluta foi estabelecida por comparação com o composto A. Da mesma forma, para a esponja S. ruetzleri, a fração acetato de etila demonstrou os resultados mais promissores. Um potencial efeito anticâncer e de inibição dos radicais peroxila foi observado. Além disso, um efeito modulador da peroxidação lipídica foi evidenciado em ensaio ex vivo de dienos conjugados. Através da análise por RMN de 1H, verificou-se que a fração era majoritariamente constituída por ácidos graxos, os quais foram derivatizados para caracterização por Cromatografia Gasosa (GC/FID). Foram identificados 32 ácidos graxos principalmente poli-insaturados (53%). Ácidos graxos minoritários não usuais para o ambiente marinho também foram caracterizados. A esponja P. janeirensis apresentou os efeitos citotóxicos mais promissores em células de glioma e neuroblastoma humano, com um IC50 < 1,0 μg/ml para o extrato aquoso (pH 6,8), sendo este efeito pH-dependente, uma vez que o extrato (pH 5,8) não alterou a viabilidade celular. Para P. janeirensis, foi também investigado seu potencial de defesa química em modelo de Zebrafish. Foi observado que o extrato aquoso desencadeia um efeito de fuga, alterando significativamente o comportamento espaço-temporal de peixes Danio rerio. Analisando em conjunto, os dados do presente trabalho representam uma nova contribuição para o estudo químico e biológico de espécies de esponjas marinhas da costa sul-brasileira e apontam as potencialidades destas esponjas na busca de moléculas protótipos para fármacos, especialmente relacionados à terapia do câncer. / Drug discovery from marine natural products has increased in the past few years, mainly due to technological advances in spectroscopy, chemical synthesis and biotechnology. Among all marine animals, sponges represent one of the major sources of prototype metabolites for several biological activities, highlighting the antitumor effects. In this context, this study carried out chemical and biological investigation of three sponges collected on the South Brazilian coastline: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis and Scopalina ruetzleri. Considering the correlation between cancer, clotting disorders and imbalance of reactive oxygen species (ROS), experiments were conducted for acquisition of these activities and identification of bioactive compounds. H. tubifera showed an interesting cytotoxic effect in human neuroblastoma and glioma cell lines (IC50 <20 μg/ml), antioxidant and anticoagulant effect for ethyl acetate (EtOAc) fraction. The major compound of EtOAc fraction was isolated as an N-Boc derivative and its configuration was established using a new circular dichroism protocol with the production of semi-synthetic derivatives. This long chain sphingoid base (2R,3R,6R,Z)-2-aminooctadec-7-ene-1,3,6-triol was named as halisphingosine A. A new minor compound, halisphingosine B was obtained using nanomol scale techniques and their absolute configuration was established by comparison with compound A. Likewise, for the sponge S. ruetzleri, the EtOAc fraction showed the most promising results. A potential anticancer effect, inhibition of peroxyl radicals and modulation effect of lipid peroxidation was observed. Fingerprint 1H NMR analysis showed that this fraction is mainly constituted of fatty acids. Through Fatty Acid Methyl Ester (FAMEs) analysis by GC/FID, it was possible to identify 32 fatty acids, of which around 50% were Polyunsaturated Fatty Acids (PUFAs). In addition, some minor unusual fatty acids for the marine biosphere were identified. It was observed for P. janeirensis the most promising cytotoxic effects on human glioma and neuroblastoma cells, with an IC50 <1.0 μg/ml to aqueous extract (pH 6.8), being this effect pH-dependent, since the extract (pH 5.8) did not affect the cell viability. Moreover, P. janeirensis was investigated along their potential chemical defense in Zebrafish model. Aqueous extract trigged an escape effect, significantly altering the spatio-temporal swimming activity of animals. Taken together, the data presented from this study represent a new contribution to chemical and biological research of marine sponge species from South Brazilian coastline, and point the potentialities of sponges to search chemical prototypes for drugs, especially related to cancer therapy.