Gangliosídios são glicoesfingolipídios que possuem pelo menos um resíduo de ácido siálico em sua estrutura. Localizam-se principalmente na membrana plasmática, podendo ser encontrados em microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e glicoesfingolipídios, chamados rafts - estruturas de membrana dinâmicas consideradas como plataformas de sinalização. Gangliosídios têm sido amplamente descritos por estarem envolvidos em processos de proliferação em diversos tipos celulares através da modulação de receptores de fatores de crescimento e suas rotas de sinalização. O GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) é uma das principais citocinas que controlam os eventos da cascata mielopoiética. Seu receptor (GMR) é um heterodímero composto de uma sub-unidade alfa (GMRα) específica para o ligante e uma sub-unidade beta (βc) responsável pela transdução dos sinais de sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. O objetivo deste trabalho é estudar a modulação dos gangliosídios na resposta proliferativa induzida por GM-CSF em uma linhagem mielóide murina, FDC-P1. Para isto, utilizamos abordagens complementares de adição exógena de gangliosídios purificados e/ou depleção endógena através de um inibidor da enzima glicosilceramida sintase (D-PDMP). Além disso, avaliamos se a modulação observada na resposta ao GMCSF se dá via ativação do receptor e cascata downstream, expressão gênica do GMR e fator de transcrição C/EBPα, distribuição na membrana e da formação de complexos macromoleculares com gangliosídios. Em resumo, os resultados demonstram que alterações no conteúdo de gangliosídios celulares podem modular a proliferação induzida por GM-CSF através da modulação de vias de sinalização incluindo eventos de transcrição gênica. Além disso, a caracterização e quantificação diferencial da expressão das isoformas tmGMRα e solGMRα na linhagem FDC-P1, constitui uma interessante ferramenta para análise da modulação da expressão gênica deste receptor em diferentes estudos envolvendo a sinalização via GM-CSF. / Gangliosides are glycosphingolipids with at least one residue of siálico acid. They localize mainly at plasma membrane, frequently in microdomains enriched in cholesterol and glycosphingolipids, called rafts – dynamic membrane structures related to signaling processes. Gangliosides have been extensively reported to be involved in proliferation in several cell types through the modulation of growth factor receptors and signaling cascades. GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) is one of the major cytokines that regulate myelopoiesis. Its receptor is a heterodimer composed of a specific ligandbinding alpha subunit (GMRα) and a beta subunit (βc) responsible for signal transduction. This work aimed to study the modulation of ganglioside in the GM-CSF-induced proliferation in a murine myeloid lineage, FDC-P1. For that, we used complementary approaches of ganglioside exogenous addition and/or endogenous depletion by the use of a glucosylceramide synthase inhibitor (D-PDMP). Moreover, we studied if the observed proliferative modulation was through modulation of GMR downstream signaling, GMR and C/EBPα gene expression, membrane distribution and receptor complex formation with gangliosides. Taken together, these results indicate that gangliosides (either those arising from extra cellular media or endogenously expressed) modulate GM-CSF-mediated proliferative response through modulation of signaling cascade and gene transcription. Moreover, the characterization of and differential quantification of GMRα isoformas (tmGMRα e solGMRα) in FDC-P1 cell lineage constitute a useful tool to study GMRα gene expression modulation.

Gangliosídios são glicoesfingolipídios que possuem pelo menos um resíduo de ácido siálico em sua estrutura. Localizam-se principalmente na membrana plasmática, podendo ser encontrados em microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e glicoesfingolipídios, chamados rafts - estruturas de membrana dinâmicas consideradas como plataformas de sinalização. Gangliosídios têm sido amplamente descritos por estarem envolvidos em processos de proliferação em diversos tipos celulares através da modulação de receptores de fatores de crescimento e suas rotas de sinalização. O GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) é uma das principais citocinas que controlam os eventos da cascata mielopoiética. Seu receptor (GMR) é um heterodímero composto de uma sub-unidade alfa (GMRα) específica para o ligante e uma sub-unidade beta (βc) responsável pela transdução dos sinais de sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. O objetivo deste trabalho é estudar a modulação dos gangliosídios na resposta proliferativa induzida por GM-CSF em uma linhagem mielóide murina, FDC-P1. Para isto, utilizamos abordagens complementares de adição exógena de gangliosídios purificados e/ou depleção endógena através de um inibidor da enzima glicosilceramida sintase (D-PDMP). Além disso, avaliamos se a modulação observada na resposta ao GMCSF se dá via ativação do receptor e cascata downstream, expressão gênica do GMR e fator de transcrição C/EBPα, distribuição na membrana e da formação de complexos macromoleculares com gangliosídios. Em resumo, os resultados demonstram que alterações no conteúdo de gangliosídios celulares podem modular a proliferação induzida por GM-CSF através da modulação de vias de sinalização incluindo eventos de transcrição gênica. Além disso, a caracterização e quantificação diferencial da expressão das isoformas tmGMRα e solGMRα na linhagem FDC-P1, constitui uma interessante ferramenta para análise da modulação da expressão gênica deste receptor em diferentes estudos envolvendo a sinalização via GM-CSF. / Gangliosides are glycosphingolipids with at least one residue of siálico acid. They localize mainly at plasma membrane, frequently in microdomains enriched in cholesterol and glycosphingolipids, called rafts – dynamic membrane structures related to signaling processes. Gangliosides have been extensively reported to be involved in proliferation in several cell types through the modulation of growth factor receptors and signaling cascades. GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) is one of the major cytokines that regulate myelopoiesis. Its receptor is a heterodimer composed of a specific ligandbinding alpha subunit (GMRα) and a beta subunit (βc) responsible for signal transduction. This work aimed to study the modulation of ganglioside in the GM-CSF-induced proliferation in a murine myeloid lineage, FDC-P1. For that, we used complementary approaches of ganglioside exogenous addition and/or endogenous depletion by the use of a glucosylceramide synthase inhibitor (D-PDMP). Moreover, we studied if the observed proliferative modulation was through modulation of GMR downstream signaling, GMR and C/EBPα gene expression, membrane distribution and receptor complex formation with gangliosides. Taken together, these results indicate that gangliosides (either those arising from extra cellular media or endogenously expressed) modulate GM-CSF-mediated proliferative response through modulation of signaling cascade and gene transcription. Moreover, the characterization of and differential quantification of GMRα isoformas (tmGMRα e solGMRα) in FDC-P1 cell lineage constitute a useful tool to study GMRα gene expression modulation.

Gangliosídios são glicoesfingolipídios que possuem pelo menos um resíduo de ácido siálico em sua estrutura. Localizam-se principalmente na membrana plasmática, podendo ser encontrados em microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e glicoesfingolipídios, chamados rafts - estruturas de membrana dinâmicas consideradas como plataformas de sinalização. Gangliosídios têm sido amplamente descritos por estarem envolvidos em processos de proliferação em diversos tipos celulares através da modulação de receptores de fatores de crescimento e suas rotas de sinalização. O GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) é uma das principais citocinas que controlam os eventos da cascata mielopoiética. Seu receptor (GMR) é um heterodímero composto de uma sub-unidade alfa (GMRα) específica para o ligante e uma sub-unidade beta (βc) responsável pela transdução dos sinais de sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. O objetivo deste trabalho é estudar a modulação dos gangliosídios na resposta proliferativa induzida por GM-CSF em uma linhagem mielóide murina, FDC-P1. Para isto, utilizamos abordagens complementares de adição exógena de gangliosídios purificados e/ou depleção endógena através de um inibidor da enzima glicosilceramida sintase (D-PDMP). Além disso, avaliamos se a modulação observada na resposta ao GMCSF se dá via ativação do receptor e cascata downstream, expressão gênica do GMR e fator de transcrição C/EBPα, distribuição na membrana e da formação de complexos macromoleculares com gangliosídios. Em resumo, os resultados demonstram que alterações no conteúdo de gangliosídios celulares podem modular a proliferação induzida por GM-CSF através da modulação de vias de sinalização incluindo eventos de transcrição gênica. Além disso, a caracterização e quantificação diferencial da expressão das isoformas tmGMRα e solGMRα na linhagem FDC-P1, constitui uma interessante ferramenta para análise da modulação da expressão gênica deste receptor em diferentes estudos envolvendo a sinalização via GM-CSF. / Gangliosides are glycosphingolipids with at least one residue of siálico acid. They localize mainly at plasma membrane, frequently in microdomains enriched in cholesterol and glycosphingolipids, called rafts – dynamic membrane structures related to signaling processes. Gangliosides have been extensively reported to be involved in proliferation in several cell types through the modulation of growth factor receptors and signaling cascades. GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) is one of the major cytokines that regulate myelopoiesis. Its receptor is a heterodimer composed of a specific ligandbinding alpha subunit (GMRα) and a beta subunit (βc) responsible for signal transduction. This work aimed to study the modulation of ganglioside in the GM-CSF-induced proliferation in a murine myeloid lineage, FDC-P1. For that, we used complementary approaches of ganglioside exogenous addition and/or endogenous depletion by the use of a glucosylceramide synthase inhibitor (D-PDMP). Moreover, we studied if the observed proliferative modulation was through modulation of GMR downstream signaling, GMR and C/EBPα gene expression, membrane distribution and receptor complex formation with gangliosides. Taken together, these results indicate that gangliosides (either those arising from extra cellular media or endogenously expressed) modulate GM-CSF-mediated proliferative response through modulation of signaling cascade and gene transcription. Moreover, the characterization of and differential quantification of GMRα isoformas (tmGMRα e solGMRα) in FDC-P1 cell lineage constitute a useful tool to study GMRα gene expression modulation.

Objetivos: Avaliar a eficácia do uso do rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros bem como a resposta das citocinas hematopoéticas e do sistema hematológico. Material e Métodos: Foi realizado um estudo randomizado duplo-cego. Foram incluídos recém-nascidos prematuros com menos de 5 dias de vida com diagnóstico de sepse clínica. O grupo tratamento (GT) recebeu 10 J.tg/kg/d de rhG-CSF, por via intravenosa, uma vez ao dia, por 3 dias consecutivos, e o grupo placebo (GB) recebeu o mesmo volume de placebo, também por via intravenosa, por 3 dias consecutivos. Todos os recém-nascidos foram acompanhados até o óbito ou alta hospitalar. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, contagem de leucócitos (CL), contagem absoluta de neutrófilos (ANC), relação neutrófilos imaturos/neutrófilos totais (I/T), contagem de plaquetas (CP) e concentração de hemoglobina (Hb) foram estudadas inicialmente antes da administração da primeira dose, 24 horas, 72 horas e 1 O dias após a primeira dose do tratamento e do placebo. Foi feita aspiração da medula óssea 7 dias após a primeira dose. A relação NSP /NPP (NSP = estoque de reserva medular de neutrófilos; NPP = estoque proliferativo medular de neutrófilos) e NSP foram avaliados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e foi obtido consentimento escrito dos pais dos pacientes. Resultados: Quarenta e quatro recém-nascidos prematuros foram incluídos no estudo, 22 em cada grupo. Não houve diferenças entre ambos os grupos em relação a: idade gestacional média (GT: 29,4 ± 3, 1; GP: 30,7 ± 2,9 semanas); média do peso ao nascer (GT: 1376 ± 491 ; GP: 1404 ± 508 g); mediana do escore de Apgar no quinto minuto de vida; mediana do escore SNAP (escore fisiológico agudo neonatal) nas primeiras 24 horas de vida (GT: 8, variação: 3 - 28; GP: 9,5, variação: O - 23); média do tempo de hospitalização (GT: 40; GP: 35 dias); mediana dos níveis de TNF-u, IL-6, GM-CSF, IIT, CP e Hb em todos os momentos estudados. Apesar da taxa de mortalidade nos primeiros 7 dias de vida ter sido 13,6% menor no GT (mortalidade nos primeiros 7 dias de vida= GT: O; GP: 3) (mortalidade dos 8 aos 28 dias de vida GT: 5; GP: 3 ), não houve diferenças estatisticamente significativa. A incidência de infecção hospitalar durante todo o tempo de internação foi significativamente menor no GT do que no GP (GT: 2; GP: 9; p < 0,03). As medianas dos níveis de G-CSF, CL e ANC foram significativamente maiores no GT do que no GP com 24 horas (GCS = GT: 2568 pg/ml; GP: 56 pg/ml, p < 0,0001; CL = GT: 15200 mm3 ; GP: 8100 mm3 p < 0,005; ANC = GT: 9522 mm3 ; GP: 4526 mm3 p < 0,005) e 72 horas após o início do tratamento (G-CSF = GT: 129 pg/ml; GP: 37,5 pg/ml p < 0,007; CL = GT: 23100 mm3 ; GP: 9250 mm3 p < 0,00002; ANC = GT: 16843 mm3 ; GP: 4703 mm3 p < 0,00002). A média NSP e a relação NSP/NPP foi significativamente maior no GT do que no GP (NSP = GT: 58,4 ± 8%; GP: 47,8 ± 11,2% p < 0,003; NSPINPP = GT: 4,2 ± 2,5; GP: 2,6 ± 1,2 p < 0,05). Conclusões: A administração de rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros pode reduzir a mortalidade nos primeiros 7 dias de vida e principalmente, a incidência de infecção hospitalar. Provoca ainda um aumento na contagem de leucócitos e na contagem absoluta de neutrófilos 24 e 72 horas após o início do tratamento, e um aumento na NSP e na relação NSPINPP 7 dias após o início do tratamento. / Objectives: To evaluate the efficacy o f the use of rhG-CSF in the treatment of early neonatal sepsis in premature infants and to asses cytokine and hematologic values in septic premature newborn infants after treatment with rhG-CSF Methods: A double blind randomized study was performed. Premature newborn infants were included in the study if they had a clinicai diagnosis of sepsis in the first 5 days of life. Treatment group (TG) received 10 j..tg/kg/day ofthe rhG-CSF IV once a day for 3 consecutive days, and the placebo group (PG) received the same volume of placebo IV as the TG for 3 consecutive days. Ali the included newboms were followed up to death or hospital discharge. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, leucocyte count (LC), absolute neutrophil count (ANC), immature/total neutrophil ratio (I/T), platelet count (PC), and hemoglobin concentration (Hb) were studied just before administration o f the first dose, 24 hours, 72 hours and 1 O days after the first dose o f treatment. Bone marrow aspiration was performed 7 days after the first dose oftreatment. NSP (neutrophil storage pool) and NSPINPP (neutrophil proliferative pool) ratio were evaluated. The study was approved by the ethics committee of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre and informed consent o f the parents were obatined. Results: Forty-four premature newborn infants were included in the study, twenty two in each group. Mean gestational ages (TG: 29.4 ± 3.1; PG: 30.7 ± 2.9 weeks), mean birth weights (TG: 1376 ± 491; PG: 1404 ± 508 grams), median Apgar scores in the fifth minutes of life, median SNAP (score for neonatal acute physiology) scores in the first 24 hours oflife (TG: 8, range: 3-28; PG: 9.5, range: O- 23), and mean lenght of hospital stay (TG: 40; PG: 35) were similar in both groups. Median TNF-u, IL-6, GM-CSF, I!f ratio, PC and Hb in all studied moments were similar in both groups. Although the survival rate in the first 7 days o f li f e was 13.6% higher in the TG than in the PG, there was no significant statistical difference (mortality in the first 7 days oflife TG =O; PG: 3), (mortality from 8 to 28 days oflife TG: 5; PG: 3 ). The occurrence o f nosocomial infection during the whole hospital stay was significant lower in the TGthan in the PG (TG: 2; PG: 9, p < 0.03). Median G-CSF leveis, LC, and ANC were significantly higher in the TG than in PG at 24 hours (G-CSF = TG: 2568 pg/ml; PG: 56 pg/ml, p < 0.00001; LC = TG: 15200 mm3 ; PG:8100 mm3 , p < 0.005; ANC = TG: 9522; PG: 4526, p < O. 005) and 72 hours after onset o f treatment (G-CSF = TG: 129 pg/ml; PG: 37.5, p < 0.007; LC = TG: 23100 mm3 ; PG: 9250 mm3 , p < 0.00002; ANC = TG: 16843 mm3 ; PG: 4703 mm3 , p < 0.00002). Mean NSP and NSP/NPP ratio were significantly higher in TG than in PG (NSP = TG: 58.4% ± 8%; PG: 47.8 ± 11.2%, p < 0.003; NSP/NPP ratio = TG: 4.2 ± 2.5; PG: 2.6 ± 1.2, p < 0.05). Condusions: Administration of rhG-CSF to a septic premature newborn infants may decrease the mortality in the first 7 days of life, and mainly the incidence of nosocomial infection. Also rhG-CSF administration causes an increase o f LC and ANC 24 and 72 hours after onset o f treatment, and an increase in NSP and NSP /NPP ratio 7 days after treatment.

Objetivos: Avaliar a eficácia do uso do rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros bem como a resposta das citocinas hematopoéticas e do sistema hematológico. Material e Métodos: Foi realizado um estudo randomizado duplo-cego. Foram incluídos recém-nascidos prematuros com menos de 5 dias de vida com diagnóstico de sepse clínica. O grupo tratamento (GT) recebeu 10 J.tg/kg/d de rhG-CSF, por via intravenosa, uma vez ao dia, por 3 dias consecutivos, e o grupo placebo (GB) recebeu o mesmo volume de placebo, também por via intravenosa, por 3 dias consecutivos. Todos os recém-nascidos foram acompanhados até o óbito ou alta hospitalar. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, contagem de leucócitos (CL), contagem absoluta de neutrófilos (ANC), relação neutrófilos imaturos/neutrófilos totais (I/T), contagem de plaquetas (CP) e concentração de hemoglobina (Hb) foram estudadas inicialmente antes da administração da primeira dose, 24 horas, 72 horas e 1 O dias após a primeira dose do tratamento e do placebo. Foi feita aspiração da medula óssea 7 dias após a primeira dose. A relação NSP /NPP (NSP = estoque de reserva medular de neutrófilos; NPP = estoque proliferativo medular de neutrófilos) e NSP foram avaliados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e foi obtido consentimento escrito dos pais dos pacientes. Resultados: Quarenta e quatro recém-nascidos prematuros foram incluídos no estudo, 22 em cada grupo. Não houve diferenças entre ambos os grupos em relação a: idade gestacional média (GT: 29,4 ± 3, 1; GP: 30,7 ± 2,9 semanas); média do peso ao nascer (GT: 1376 ± 491 ; GP: 1404 ± 508 g); mediana do escore de Apgar no quinto minuto de vida; mediana do escore SNAP (escore fisiológico agudo neonatal) nas primeiras 24 horas de vida (GT: 8, variação: 3 - 28; GP: 9,5, variação: O - 23); média do tempo de hospitalização (GT: 40; GP: 35 dias); mediana dos níveis de TNF-u, IL-6, GM-CSF, IIT, CP e Hb em todos os momentos estudados. Apesar da taxa de mortalidade nos primeiros 7 dias de vida ter sido 13,6% menor no GT (mortalidade nos primeiros 7 dias de vida= GT: O; GP: 3) (mortalidade dos 8 aos 28 dias de vida GT: 5; GP: 3 ), não houve diferenças estatisticamente significativa. A incidência de infecção hospitalar durante todo o tempo de internação foi significativamente menor no GT do que no GP (GT: 2; GP: 9; p < 0,03). As medianas dos níveis de G-CSF, CL e ANC foram significativamente maiores no GT do que no GP com 24 horas (GCS = GT: 2568 pg/ml; GP: 56 pg/ml, p < 0,0001; CL = GT: 15200 mm3 ; GP: 8100 mm3 p < 0,005; ANC = GT: 9522 mm3 ; GP: 4526 mm3 p < 0,005) e 72 horas após o início do tratamento (G-CSF = GT: 129 pg/ml; GP: 37,5 pg/ml p < 0,007; CL = GT: 23100 mm3 ; GP: 9250 mm3 p < 0,00002; ANC = GT: 16843 mm3 ; GP: 4703 mm3 p < 0,00002). A média NSP e a relação NSP/NPP foi significativamente maior no GT do que no GP (NSP = GT: 58,4 ± 8%; GP: 47,8 ± 11,2% p < 0,003; NSPINPP = GT: 4,2 ± 2,5; GP: 2,6 ± 1,2 p < 0,05). Conclusões: A administração de rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros pode reduzir a mortalidade nos primeiros 7 dias de vida e principalmente, a incidência de infecção hospitalar. Provoca ainda um aumento na contagem de leucócitos e na contagem absoluta de neutrófilos 24 e 72 horas após o início do tratamento, e um aumento na NSP e na relação NSPINPP 7 dias após o início do tratamento. / Objectives: To evaluate the efficacy o f the use of rhG-CSF in the treatment of early neonatal sepsis in premature infants and to asses cytokine and hematologic values in septic premature newborn infants after treatment with rhG-CSF Methods: A double blind randomized study was performed. Premature newborn infants were included in the study if they had a clinicai diagnosis of sepsis in the first 5 days of life. Treatment group (TG) received 10 j..tg/kg/day ofthe rhG-CSF IV once a day for 3 consecutive days, and the placebo group (PG) received the same volume of placebo IV as the TG for 3 consecutive days. Ali the included newboms were followed up to death or hospital discharge. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, leucocyte count (LC), absolute neutrophil count (ANC), immature/total neutrophil ratio (I/T), platelet count (PC), and hemoglobin concentration (Hb) were studied just before administration o f the first dose, 24 hours, 72 hours and 1 O days after the first dose o f treatment. Bone marrow aspiration was performed 7 days after the first dose oftreatment. NSP (neutrophil storage pool) and NSPINPP (neutrophil proliferative pool) ratio were evaluated. The study was approved by the ethics committee of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre and informed consent o f the parents were obatined. Results: Forty-four premature newborn infants were included in the study, twenty two in each group. Mean gestational ages (TG: 29.4 ± 3.1; PG: 30.7 ± 2.9 weeks), mean birth weights (TG: 1376 ± 491; PG: 1404 ± 508 grams), median Apgar scores in the fifth minutes of life, median SNAP (score for neonatal acute physiology) scores in the first 24 hours oflife (TG: 8, range: 3-28; PG: 9.5, range: O- 23), and mean lenght of hospital stay (TG: 40; PG: 35) were similar in both groups. Median TNF-u, IL-6, GM-CSF, I!f ratio, PC and Hb in all studied moments were similar in both groups. Although the survival rate in the first 7 days o f li f e was 13.6% higher in the TG than in the PG, there was no significant statistical difference (mortality in the first 7 days oflife TG =O; PG: 3), (mortality from 8 to 28 days oflife TG: 5; PG: 3 ). The occurrence o f nosocomial infection during the whole hospital stay was significant lower in the TGthan in the PG (TG: 2; PG: 9, p < 0.03). Median G-CSF leveis, LC, and ANC were significantly higher in the TG than in PG at 24 hours (G-CSF = TG: 2568 pg/ml; PG: 56 pg/ml, p < 0.00001; LC = TG: 15200 mm3 ; PG:8100 mm3 , p < 0.005; ANC = TG: 9522; PG: 4526, p < O. 005) and 72 hours after onset o f treatment (G-CSF = TG: 129 pg/ml; PG: 37.5, p < 0.007; LC = TG: 23100 mm3 ; PG: 9250 mm3 , p < 0.00002; ANC = TG: 16843 mm3 ; PG: 4703 mm3 , p < 0.00002). Mean NSP and NSP/NPP ratio were significantly higher in TG than in PG (NSP = TG: 58.4% ± 8%; PG: 47.8 ± 11.2%, p < 0.003; NSP/NPP ratio = TG: 4.2 ± 2.5; PG: 2.6 ± 1.2, p < 0.05). Condusions: Administration of rhG-CSF to a septic premature newborn infants may decrease the mortality in the first 7 days of life, and mainly the incidence of nosocomial infection. Also rhG-CSF administration causes an increase o f LC and ANC 24 and 72 hours after onset o f treatment, and an increase in NSP and NSP /NPP ratio 7 days after treatment.

Objetivos: Avaliar a eficácia do uso do rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros bem como a resposta das citocinas hematopoéticas e do sistema hematológico. Material e Métodos: Foi realizado um estudo randomizado duplo-cego. Foram incluídos recém-nascidos prematuros com menos de 5 dias de vida com diagnóstico de sepse clínica. O grupo tratamento (GT) recebeu 10 J.tg/kg/d de rhG-CSF, por via intravenosa, uma vez ao dia, por 3 dias consecutivos, e o grupo placebo (GB) recebeu o mesmo volume de placebo, também por via intravenosa, por 3 dias consecutivos. Todos os recém-nascidos foram acompanhados até o óbito ou alta hospitalar. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, contagem de leucócitos (CL), contagem absoluta de neutrófilos (ANC), relação neutrófilos imaturos/neutrófilos totais (I/T), contagem de plaquetas (CP) e concentração de hemoglobina (Hb) foram estudadas inicialmente antes da administração da primeira dose, 24 horas, 72 horas e 1 O dias após a primeira dose do tratamento e do placebo. Foi feita aspiração da medula óssea 7 dias após a primeira dose. A relação NSP /NPP (NSP = estoque de reserva medular de neutrófilos; NPP = estoque proliferativo medular de neutrófilos) e NSP foram avaliados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e foi obtido consentimento escrito dos pais dos pacientes. Resultados: Quarenta e quatro recém-nascidos prematuros foram incluídos no estudo, 22 em cada grupo. Não houve diferenças entre ambos os grupos em relação a: idade gestacional média (GT: 29,4 ± 3, 1; GP: 30,7 ± 2,9 semanas); média do peso ao nascer (GT: 1376 ± 491 ; GP: 1404 ± 508 g); mediana do escore de Apgar no quinto minuto de vida; mediana do escore SNAP (escore fisiológico agudo neonatal) nas primeiras 24 horas de vida (GT: 8, variação: 3 - 28; GP: 9,5, variação: O - 23); média do tempo de hospitalização (GT: 40; GP: 35 dias); mediana dos níveis de TNF-u, IL-6, GM-CSF, IIT, CP e Hb em todos os momentos estudados. Apesar da taxa de mortalidade nos primeiros 7 dias de vida ter sido 13,6% menor no GT (mortalidade nos primeiros 7 dias de vida= GT: O; GP: 3) (mortalidade dos 8 aos 28 dias de vida GT: 5; GP: 3 ), não houve diferenças estatisticamente significativa. A incidência de infecção hospitalar durante todo o tempo de internação foi significativamente menor no GT do que no GP (GT: 2; GP: 9; p < 0,03). As medianas dos níveis de G-CSF, CL e ANC foram significativamente maiores no GT do que no GP com 24 horas (GCS = GT: 2568 pg/ml; GP: 56 pg/ml, p < 0,0001; CL = GT: 15200 mm3 ; GP: 8100 mm3 p < 0,005; ANC = GT: 9522 mm3 ; GP: 4526 mm3 p < 0,005) e 72 horas após o início do tratamento (G-CSF = GT: 129 pg/ml; GP: 37,5 pg/ml p < 0,007; CL = GT: 23100 mm3 ; GP: 9250 mm3 p < 0,00002; ANC = GT: 16843 mm3 ; GP: 4703 mm3 p < 0,00002). A média NSP e a relação NSP/NPP foi significativamente maior no GT do que no GP (NSP = GT: 58,4 ± 8%; GP: 47,8 ± 11,2% p < 0,003; NSPINPP = GT: 4,2 ± 2,5; GP: 2,6 ± 1,2 p < 0,05). Conclusões: A administração de rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros pode reduzir a mortalidade nos primeiros 7 dias de vida e principalmente, a incidência de infecção hospitalar. Provoca ainda um aumento na contagem de leucócitos e na contagem absoluta de neutrófilos 24 e 72 horas após o início do tratamento, e um aumento na NSP e na relação NSPINPP 7 dias após o início do tratamento. / Objectives: To evaluate the efficacy o f the use of rhG-CSF in the treatment of early neonatal sepsis in premature infants and to asses cytokine and hematologic values in septic premature newborn infants after treatment with rhG-CSF Methods: A double blind randomized study was performed. Premature newborn infants were included in the study if they had a clinicai diagnosis of sepsis in the first 5 days of life. Treatment group (TG) received 10 j..tg/kg/day ofthe rhG-CSF IV once a day for 3 consecutive days, and the placebo group (PG) received the same volume of placebo IV as the TG for 3 consecutive days. Ali the included newboms were followed up to death or hospital discharge. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, leucocyte count (LC), absolute neutrophil count (ANC), immature/total neutrophil ratio (I/T), platelet count (PC), and hemoglobin concentration (Hb) were studied just before administration o f the first dose, 24 hours, 72 hours and 1 O days after the first dose o f treatment. Bone marrow aspiration was performed 7 days after the first dose oftreatment. NSP (neutrophil storage pool) and NSPINPP (neutrophil proliferative pool) ratio were evaluated. The study was approved by the ethics committee of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre and informed consent o f the parents were obatined. Results: Forty-four premature newborn infants were included in the study, twenty two in each group. Mean gestational ages (TG: 29.4 ± 3.1; PG: 30.7 ± 2.9 weeks), mean birth weights (TG: 1376 ± 491; PG: 1404 ± 508 grams), median Apgar scores in the fifth minutes of life, median SNAP (score for neonatal acute physiology) scores in the first 24 hours oflife (TG: 8, range: 3-28; PG: 9.5, range: O- 23), and mean lenght of hospital stay (TG: 40; PG: 35) were similar in both groups. Median TNF-u, IL-6, GM-CSF, I!f ratio, PC and Hb in all studied moments were similar in both groups. Although the survival rate in the first 7 days o f li f e was 13.6% higher in the TG than in the PG, there was no significant statistical difference (mortality in the first 7 days oflife TG =O; PG: 3), (mortality from 8 to 28 days oflife TG: 5; PG: 3 ). The occurrence o f nosocomial infection during the whole hospital stay was significant lower in the TGthan in the PG (TG: 2; PG: 9, p < 0.03). Median G-CSF leveis, LC, and ANC were significantly higher in the TG than in PG at 24 hours (G-CSF = TG: 2568 pg/ml; PG: 56 pg/ml, p < 0.00001; LC = TG: 15200 mm3 ; PG:8100 mm3 , p < 0.005; ANC = TG: 9522; PG: 4526, p < O. 005) and 72 hours after onset o f treatment (G-CSF = TG: 129 pg/ml; PG: 37.5, p < 0.007; LC = TG: 23100 mm3 ; PG: 9250 mm3 , p < 0.00002; ANC = TG: 16843 mm3 ; PG: 4703 mm3 , p < 0.00002). Mean NSP and NSP/NPP ratio were significantly higher in TG than in PG (NSP = TG: 58.4% ± 8%; PG: 47.8 ± 11.2%, p < 0.003; NSP/NPP ratio = TG: 4.2 ± 2.5; PG: 2.6 ± 1.2, p < 0.05). Condusions: Administration of rhG-CSF to a septic premature newborn infants may decrease the mortality in the first 7 days of life, and mainly the incidence of nosocomial infection. Also rhG-CSF administration causes an increase o f LC and ANC 24 and 72 hours after onset o f treatment, and an increase in NSP and NSP /NPP ratio 7 days after treatment.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-03-22T14:03:31Z No. of bitstreams: 1 Tulio_Queto.pdf: 43727261 bytes, checksum: 24d32a6a536f42194f28e8e2b42a6fe1 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-22T14:03:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tulio_Queto.pdf: 43727261 bytes, checksum: 24d32a6a536f42194f28e8e2b42a6fe1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A provocação por via respiratória com ovalbumina (OVA) em camundongos sensibilizados promove, na medula óssea (MO), eosinopoiese, resposta exacerbada à Interleucina(IL)-5, e mudanças no padrão de resposta em cultura à eotaxina, à IL- 13 e aos antiinflamatórios não esteroidais (NSAIDs). Em cultura de MO, a Prostaglandina (PG) E2 induz apoptose de eosinófilos, por via dependente de NO sintase indutível (iNOS) e ligante de CD95 (CD95L), enquanto a dexametasona (DEXA) promove eosinopoiese, gerando eosinófilos agregados e morfológicamente imaturos e protege contra da apoptose induzida por PGE2, provavelmente por mecanismos que regulem a expressão ou ativação de integrinas. No presente trabalho avaliamos se: a) in vitro, os efeitos dos NSAIDs, da IL-13 e da eotaxina dependem da produção de cisteinil-leucotrienos (CisLT) e da sinalização via receptor 1 de CisLT (CysLT1R); b) in vitro, a DEXA regula expressão de VLA-4, que promoveria a agregação e imaturidade dos eosinófilos, e se PGE2 contrapõe a ação da DEXA; c) in vivo, G-CSF e dietilcarbamazina (DEC) promoveriam eosinopenia medular e sistemica e se inibiriam a inflamação pulmonar alérgica. Resultados: a) NSAIDs, eotaxina e IL-13 potencializam a eosinopoiese via produção de CisLT e sinalização via CysLT1R. Os NSAIDs ainda protegem os eosinófilos da apoptose induzida por PGE2 exógena. b) A interação farmacológica entre PGE2 e DEXA modificam a ação de ambas, de forma estreitamente relacionada sobre a expressão de VLA-4 e, em condições específicas, esses agentes sinergizam gerando quantidades aumentadas de eosinófilos maduros. c) A DEC, inibidor da síntese de LTs, que na filariose experimental possivelmente atua via iNOS, inibe a eosinopoiese e os efeitos da provocação sobre o pulmão e a MO, através da via iNOS-CD95L. O Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos (G-CSF), estimulante da neutropoiese, igualmente inibiu a inflamação pulmonar alérgica através da inibição da eosinopoiese. Este trabalho é parte do projeto intitulado "Eosinofilia na Asma Experimental", licenciado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Fiocruz, sob nos L010/04 e L002/09. / Our laboratory has previously shown that airway allergen challenge in ovalbumin-sensitized mice rapidly induces an increase in bone-marrow (BM) eosinophil production (eosinopoiesis), along with an increased response to Interleukin(IL)-5 in BM culture, changes in the ex vivo responses to cytokines and immunomodulators, including nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and cysteinyl-leukotrienes (CysLT), and colonization of the lungs by eosinophil progenitors. Early in the course of IL-5-induced eosinophil differentiation in BM culture, Prostaglandin E2 (PGE2) induces apoptosis, through a pathway dependent on the inducible isoform of NO synthase (iNOS) and the ligand for CD95 (CD95L). NSAIDs enhance eosinopoiesis and protect eosinophils in this critical period from exogenous PGE2, through a novel mechanism of action at the celular level. In this study, we show that indomethacin and aspirin act through endogenously synthesized CysLT, by establishing the essential roles of 5-lipoxygenase, LTC4 synthase and CysLT1R receptors, as well as the cytoprotective effect of CysLT against exogenous PGE2. The similarity between the effects of NSAIDs and those of eotaxin and IL-13 prompted us to reevaluate the contribution of endogenous CysLT to the effects of these cytokines. We confirmed that eotaxin and IL-13 act through this mechanism, and expand therefore the list of agents that, through CysLT, enhance eosinopoiesis, protecting immature eosinophils from apoptosis induced through the iNOS-CD95L pathway. Dexamethasone promotes BM eosinopoiesis, generating aggregated, cytologically immature eosinophils, which are nevertheless protected from PGE2- induced apoptosis. We examined therefore the possibility that dexamethasone upregulates integrin expression/activation, thereby maintaining an immature celular phenotype in cultured eosinophils, while PGE2 would have opposite effects on both integrin function and cytological maturation. We show that the proapoptotic effects of PGE2 are profoundly modified by its pharmacological interaction with dexamethasone, paralleling the effects of both drugs on integrins, and leading to a synergic generation of increased numbers of mature eosinophils, in very specific experimental conditions. Diethylcarbamazine (DEC) is an antihelminthic drug that blocks leukotriene synthesis, and possibly acts in experimental filarial infection through iNOS. We have examined, for the first time, the effects of DEC in a model of allergic pulmonary inflammation, showing that DEC is very effective in preventing the impact of airway allergen challenge on BM and lungs, through the in vivo operation of the iNOS-CD95L pathway. Granulocyte Colony-stimulating Factor (G-CSF), which stimulates neutropoiesis, mobilizes CD34+ hemopoietic progenitors from BM, and exerts complex immunoregulatory effects, was shown in our study to have a strong impact in a murine model of allergic pulmonary inflammation. Like DEC, G-CSF suppressed BM eosinopoiesis, although through a different mechanism, since DEC suppressed neutrophilia in the lungs with no effect on BM neutrophilia/neutropoiesis, while G-CSF promoted neutropoiesis and induced blood neutrophilia, even though it suppressed eosinopoiesis. This work was part of the Research Project “Eosinophilia in Experimental Asthma”, licensed by the Committee on the Ethical Use of Laboratory Animals (CEUA) at FIOCRUZ, under numbers L010/04 and L002/09.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2014-12-18T19:01:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação.Isabela Bastos Binotti Abreu.pdf: 2016865 bytes, checksum: ca0ed256308cfb660d25a867930edd7e (MD5) / O rim demonstra uma capacidade singular em reparar-se após danos locais, no entanto, depois de acometido, as chances de desenvolvimento de lesões renais elevam-se. A patofisiologia da isquemia/reperfusão (IR) é complexa porque há ocorrência simultânea de danos celulares e inflamação. O decréscimo na quantidade de oxigênio requer um sistema capaz de evitar seus efeitos prejudiciais e uma maquinaria molecular HIF (Hypoxia Inducible Factor), um complexo, atua como fator de transcrição de diversos genes desde os da regulação da proliferação celular e apoptose até a sinalização para angiogênese. O Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos (G-CSF) é uma glicoproteína conhecida pela sua capacidade de promover a sobrevivência, proliferação e diferenciação de células estimulando a recuperação aos efeitos advindos da IR. Com o intuito de observar as influências dessas proteínas foi realizada uma análise semi-quantitativa de amostras renais submetidas ou não à IR, usando-se descrições microscópicas morfológicas e imunohistoquímicas, com os cálculos e gráficos estatísticos foram feitos no software GraphPad Prism®. Das análises morfológicas, constatou-se que as lesões características de IR foram observadas em espécimes não tratados: bolhas em epitélio tubular; vacuolização citoplasmática, distalização tubular e congestão luminal. De forma análoga, foi encontrada nos tratados, contudo em estágios menos avançados e em animais controle, não foi houve esta diferença tissular. As análises de microscopia eletrônica demonstraram alteração na barreira filtrante com concomitante perda de outras características glomerulares. Aos animais controle foi observada a arquitetura típica, ao passo que para os animais tratados notou-se conservação da barreira. A presença de HIF-1α nos rins contralaterais demonstrouse significante quando comparadas às amostras isquêmicas e tratadas (p<0,05). Já a ocorrência da mesma proteína em rins isquêmicos não apresentou qualquer diferença. Analisando-se a proteína VEGF foi comprovado que em rins contralaterais não há diferença estatística, contudo nos rins esquerdos há significância entre os três grupos (p<0,05). Já a correlação entre estas duas proteínas não se mostrou estatisticamente significante. Em relação às atividades de proliferação e morte celulares, todos os três grupos foram significantes entre si (p<0,05). Ao que concerne o tratamento, foi demonstrada a atividade protetora do medicamento e uma possível interação molecular com a HIF, enquanto que a ativação desta proteína corrobora sua rota metabólica já previamente descrita. / The kidney demonstrates a natural ability to repair itself after damage locations, however, after affected the chances of developing kidney damage increases. The pathophysiology of ischemia/reperfusion (IR) is complex because there are simultaneous occurrence of cell damage and inflammation. The decrease in amount of oxygen requires a system capable of avoiding its adverse effects and molecular machinery HIF (Hypoxia Inducible Factor), a complex, acts as a transcription factor for a number of genes since the regulation of cell proliferation and apoptosis by signaling to angiogenesis. The Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF) is a glycoprotein known for its ability to promote the survival, proliferation and differentiation of cells stimulating the recovery effects resulting from the IR. In order to observe the influence of these proteins a semi-quantitative analysis of kidneys samples submitted or not to IR was performed using morphological microscopic descriptions and immunohistochemical, with statistical calculations and graphics were done in GraphPad Prism® software. Morphological analysis demonstrated characteristic IR lesions in untreated specimens: bubbles in tubular epithelium; vacuolization, tubular distalization and distal luminal congestion. Similarly, it was found in treaties, but in less advanced stages and in control animals, there were no tissue differences. Analyses of electron microscopy showed changes in the filtering barrier with concomitant loss of glomerular other features. In control animals the typical architecture was observed, while for the treated animals was noted preservation of barrier. The presence of HIF-1α in the contralateral kidneys showed significant when compared with ischemic and treated samples (p<0.05). The incidence of the same protein in ischemic kidneys showed no difference. Analyzing the VEGF protein was proven that in contralateral kidneys no statistical difference, however, in the ischemic kidney there is significance within the three groups (p<0.05). The correlation between these two proteins was not statistically significant. In relation to cell proliferation, cell death activity, all three groups were statistically significant (p<0.05). As regard the treatment was demonstrated the protective activity of the drug and possible molecular interaction with HIF, while activation of this protein confirms its metabolic pathway previously described.

[pt] A estimulação magnética transcraniana (EMT) é uma técnica não-invasiva utilizada no tratamento de distúrbios de origem neuropsiquiátrica, como transtornos de humor e alucinações auditivas. Por meio de uma técnica conhecida como neuromodulação, a atividade bioelétrica cerebral é estimulada a partir de correntes elétricas induzidas pela emissão de campo magnético alternado, em região anatômica cerebral previamente estabelecida segundo protocolos terapêuticos definidos, utilizando bobinas eletromagnéticas acopladas ao EMT, com modelos em forma de anel (ring), forma de oito (figure-of-eight), duplo cone (double cone), entre outros. A garantia da eficácia do tratamento e da segurança tanto dos pacientes quanto dos operadores do dispositivo depende da distribuição espacial da densidade de fluxo magnético emitida nas proximidades do equipamento de EMT, de acordo com o projeto da bobina de indução empregada. Um sistema multicanal de medição magnética (SMM) foi desenvolvido para avaliar a configuração da densidade de fluxo magnético gerada por dispositivos de estimulação magnética e em suas proximidades. Com o SMM é realizado o mapeamento magnético ao longo de um plano XY, sob as bobinas de modelos figure-of-eight e double cone, que inclui estudo de respostas, quando estimuladas com diferentes intensidades de saída e distâncias. Os resultados permitem caracterizar o decaimento da magnitude do campo, para os modelos de bobina figure-of-eight e double cone, em direção à região mais próxima da posição da mão do operador; e identificar, de forma preliminar, a distribuição da densidade de fluxo magnético em regiões mais superfíciais e o alcançe da penetração do estímulo destinado ao efeito terapêutico. / [en] Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a noninvasive technique used in the treatment of disorders of neuropsychiatric origin, such as mood disorders and auditory hallucinations. By means of a technique known as neuromodulation, cerebral bioelectrical activity is stimulated from electrical currents induced by the emission of an alternating magnetic field, in an anatomical region previously established according to defined therapeutic protocols, using electromagnetic coils coupled to EMT, with models in the form of ring, figure-of-eight, double cone, among others. The assurance of treatment and safety efficacy for both the patients and the device operators depends on the spatial distribution of the magnetic flux density emitted in the vicinity of the EMT equipment, according to the design of the induction coil employed. A multichannel magnetic measurement system (SMM) has been developed in order to evaluate the configuration of magnetic flux density generated by and around magnetic stimulation devices. With the SMM the magnetic mapping along an XY plane was performed under the coils of figure-of-eight and double cone models, which includes study of responses, when stimulated with varying output intensities and distances. The results allow to characterize the decay of the magnitude of the field for the figure-of-eight and double cone coil models towards the region closest to the position of the operator s hand and to identify, in a preliminary way, the distribution of the flux density magnetic properties in more superficial regions and the extent of penetration of the stimulus intended for the therapeutic effect.

Submitted by JORGE ESTEBAN BLANCO RODRIGUEZ null (lobogris87@msn.com) on 2016-06-01T14:53:04Z No. of bitstreams: 1 Jorge Esteban Blanco Rodriguez.pdf: 3365866 bytes, checksum: edf247c26e3f44cc20ef44607e947f0e (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: O mês informado na capa do documento está diferente da data de defesa que consta na folha de aprovação. Corrija esta informação no arquivo PDF e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-06-02T13:45:11Z (GMT) / Submitted by JORGE ESTEBAN BLANCO RODRIGUEZ null (lobogris87@msn.com) on 2016-06-02T14:37:35Z No. of bitstreams: 1 Jorge Esteban Blanco Rodriguez 30-03-2016.pdf: 2668564 bytes, checksum: 75234917c13bea3285297fb6aeb7f0ec (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-02T16:43:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 blancorodriguez_je_me_ilha.pdf: 2668564 bytes, checksum: 75234917c13bea3285297fb6aeb7f0ec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T16:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 blancorodriguez_je_me_ilha.pdf: 2668564 bytes, checksum: 75234917c13bea3285297fb6aeb7f0ec (MD5) Previous issue date: 2016-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Implementou-se um estimulador elétrico funcional para uso na reabilitação de pacientes hígidos e paraplégicos e que não necessita de alimentação simétrica. O equipamento é constituído por dois estágios, o formador de onda, no qual se define os parâmetros do sinal de estimulação, e o de potência. No formador de onda foi utilizado uma placa Raspberry pi e uma interface de usuário, desenvolvida em Python. O estágio de potência é composto por um espelho de corrente que possibilita a utilização de transistores não casados, e uma estrutura em ponte H, para formar o sinal de eletroestimulação bifásico, sem a necessidade de fonte simétrica, diminuindo assim pela metade a diferença de potencial aplicada na alimentação do circuito. Com o estimulador implementado gerou-se correntes com forma de onda retangular, amplitude de até 120 mA e características adequadas para utilização na reabilitação dos membros inferiores e superiores de pacientes. / A functional electrical stimulator for use in the rehabilitation of paraplegic and healthy patients was implemented. It does not need symmetrical power supply. The equipment consists of two stages, the wave generator, which defines the stimulation signal parameters, and the power stage. In the wave generator we have used a Raspberry Pi board and a user interface, developed in Python. In the power stage we have used a current mirror which enables the use of unmarried transistors and a H-bridge circuit to generate a biphasic signal. With the implemented stimulator, currents with rectangular waveform, range of up to 120 mA, and suitable characteristics for using in rehabilitation of the lower and upper limbs of patients were generated.