El distrès oxidatiu és un desequilibri entre els sistemes oxidants i antioxidants. Aquests es poden alterar en diferents situacions fisiològiques i patològiques degut als RL. En aquest treball s'han estudiat: la insuficiència renal i el tractament amb eritropoetina, la malaltia pulmonar obstructiva crònica, la sèpsia i l'infart agut de miocardi. També l'embaràs i el tractament preventiu de l'anèmia amb ferro, l'envelliment, el gènere i l'estrès psicològic que provoca el període d'exàmens universitaris, juntament amb l'efecte de l'estil de vida en l'estrès oxidatiu.El distrès oxidatiu es quantifica amb la PDO (puntuació del distrès oxidatiu) i inclou la quantificació en sang dels següents biomarcadors: antioxidants de baix pes molecular [glutatió reduït (GSH)], enzims antioxidants [superòxid dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatió peroxidasa (GPx), glutatió reductasa (GR) i glutatió s-transferasa total, termoestable i % residual (T-GST, TS-GST i RGST)], productes de la peroxidació lipídica [substancies reactives a l'àcid tiobarbitúric (TBARS)], productes de la peroxidació proteica [glutatió oxidat (GSSG)] i marcadors de la susceptibilitat d'oxidació [hemòlisi].Hipòtesi: un model de puntuació global basat en biomarcadors indirectes és capaç de valorar el desequilibri entre els sistemes prooxidants i antioxidants tant en situacions de malaltia com fisiològiques, i permet detectar a què és degut el desequilibri en cada una de les situacions fisiopatològiques estudiades: a una major producció de RLO, a una disminució en la disponibilitat dels antioxidants, o a ambdues.Objectius: Definir, en la població sana, els rangs de normalitat pels biomarcadors sistèmics.Establir el pes dels biomarcadors estudiats en el model de puntuació global que ens ha de permetre valorar el grau de distrès oxidatiu en diferents situacions fisiològiques i patològiques. Aplicar el model de puntuació en diferents situacions fisiològiques i patològiques en desequilibri oxidatiu. I comparar la PDO amb un model estadístic de puntuació de discriminants.En individus control, la PDO es situa al voltant de zero punts, i en individus amb estrès oxidatiu, la PDO és superior a zero. Segons la PDO, els pacients amb IR no sotmesos a diàlisi tenen estrès oxidatiu, i aquest estrès es manté després de sis mesos de tractament amb EPO. També en tenen els pacients amb MPOC. En la sèpsia i l'IAM l'estrès oxidatiu apareix en el moment de l'ingrés hospitalari però no a les 24 i 48 hores, ni en el moment de l'alta. La PDO es manté als zero punts en homes i dones sans de tots els rangs d'edat. Les dones embarassades que prenen ferro tenen estrès oxidatiu a les 26 setmanes de gestació, i aquest és més elevat en les que no tenen anèmia. Els estudiants universitaris obtenen una PDO superior a zero abans i després dels exàmens universitaris, però l'estrès oxidatiu després és superior en els que no tenen hàbits de vida saludables.El test dels discriminants separara correctament els individus en grups utilitzant els paràmetres lligats al distrès oxidatiu i ens diu els biomarcadors que més s'alteren en cada situació estudiada. No obstant, ni indica quin dels grups té més estrès oxidatiu i quin és el grau d'estrès en cada individu, ni obté en un moment concret la puntuació d'estrès oxidatiu d'un sol individu.La PDO és un possible paràmetre clínic a tenir en compte a l'hora d'avaluar l'estrès oxidatiu de manera rutinària i individual, la seva aplicació és possible tant en el context de la malaltia com per al control d'altres situacions, com ara els efectes d'una vida no saludable. En tots dos casos, la informació que ens aporta el nostre mètode obre la porta a una possible prescripció de teràpia antioxidant, ja sigui de tipus farmacològica o dietètica. / Numerous factors are related to oxidative stress (OS) in humans, which is particularly common in individuals with psychological or health problems. The following blood biomarkers were used to determine the oxidative status of healthy individuals: antioxidant enzymes [glutathione Stransferase (GST), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR)], peptide peroxidation products and low molecular weight antioxidants [reduced and oxidized glutathione (GSH, GSSG), GSSG/GSH ratio], lipid peroxidation products [thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)] and oxidizability measurements [haemolysis test]. The relationships between biomarkers were studied in a healthy group of individuals, and used to create a score of oxidative stress (SOS). SOS was clinically validated by applying it to a group of patients with chronic renal insufficiency (CRI), chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, and acute myocardium infarction. SOS was also applyed in a various groups of healthy individuals and we studied the effect of sex, age, pregnancy, and lifestyle on oxidative stress. SOS was statistically validated with discriminating test. In conclusion, OS biomarkers were strongly related, and SOS was a useful clinical parameter for evaluating the effect of OS on the illness. This may be important in the future for preventing and treating OS with antioxidants.

La via d'integritat cel·lular o via Pkc1-MAP quinasa de Saccharomyces cerevisiae té un paper central en els mecanismes de resposta cel·lular enfront de diferents estressos ambientals, com són: l'estrès tèrmic, l'estrès hipoosmòtic o qualsevol estrès que afecti a la paret cel·lular. En aquest treball de tesi doctoral es demostra que aquesta via de transducció de senyal també està implicada en la supervivència iadaptació enfront els efectes de l'estrès oxidatiu.Hem observat que les proteïnes Pkc1 i Rom2 són essencials per a la supervivència cel·lular enfront de l'estrès oxidatiu generat per dos agents (peròxid d'hidrogen i diamida). A més, el citoesquelet d'actina és una de les dianes d'acció del peròxid d'hidrogen i de la diamida; aquests dos agents provoquen una despolarització del citoesquelet d'actina amb el conseqüent efecte en morfogènesi i viabilitat. Aquest fenomen succeeix de forma independent de les proteïnes de la via d'integritat cel·lular.Per altra banda, perquè el citoesquelet d'actina es repolaritzi com a resposta d'agents oxidants, són necessàries les proteïnes Mtl1, Rom2 i Pkc1, totes elles són elements que constitueixen la via d'integritat cel·lular.La diamida indueix la formació de ponts disulfur a les proteïnes de la superfície cel·lular. Aquest fet provoca canvis estructurals en la cèl·lula que, en darrer terme,causen l'activació de la via d'integritat cel·lular. Els nostres estudis han permès assignar una funció al receptor de la paret cel·lular Mtl1, com un sensor d'estrès oxidatiu en superfície i part integrant de la via Pkc1-MAP quinasa.El peròxid d'hidrogen afecta essencialment una funció cel·lular relacionada amb els últims estadis de secreció i la morfogènesi cel·lular. A més, observem dos funcions essencials de la proteïna Pkc1 com a resposta al tractament amb peròxid d'hidrogen: i)Pkc1 regula la biogènesi de ribosomes com a resposta als problemes en secreció que provoca l'agent oxidant. Així mateix, la inhibició de la transcripció de gens ribosomals es du a terme depenent d'un citoesquelet en polimerització activa, ii) Pkc1 indueix la restauració dels cables d'actina i també de la morfogènesi i polaritat cel·lular a través de l'activació de la profilina Pfy1. / La vía de integridad celular o vía Pkc1-MAP quinasa de Saccharomyces cerevisiae posee un papel central en los mecanismos de respuesta celular frente a diferentes estreses ambientales, como son: el estrés térmico, el estrés hipoosmótico o cualquier estrés que afecte a la pared celular. En esta tesis doctoral se demuestra que esta vía de transducción de señal también está implicada en la supervivencia y adaptación frente a los efectos del estrés oxidativo.Hemos observado que las proteínas Pkc1 y Rom2 son esenciales para la supervivencia celular frente al estrés oxidativo mediado por dos agentes (peróxido de hidrógeno y diamida). Además, el citoesqueleto de actina es una de las dianas de acción del peróxido de hidrógeno y de la diamida, ambos agentes median la despolarización del citoesqueleto de actina con el consecuente efecto en morfogénesis y viabilidad. Este fenómeno ocurre de manera independiente de las proteínas de la vía de integridad celular. Sin embargo, para que el citoesqueleto de actina repolarice en respuesta a agentes oxidantes se requieren las proteínas Mtl1, Rom2 y Pkc1, todas ellas elementosconstituyentes de la vía de integridad celular.La diamida induce la formación de puentes disulfuro en las proteínas de la superficie celular, lo que provoca cambios estructurales en la misma, que en última instancia, causan la activación de la vía de integridad celular. Nuestros estudios han permitido asignar una función al receptor de pared celular Mtl1, como sensor de estrés oxidativo en superficie, y parte integrante de la vía Pkc1-MAP quinasa.El peróxido de hidrógeno afecta esencialmente a una función celular relacionada con los últimos estadios de secreción y con la morfogénesis celular. Además observamos dos funciones esenciales de la proteína Pkc1 en respuesta al tratamiento con peróxido de hidrógeno: i) Pkc1 regula la biogénesis de ribosomas en respuesta a los problemas en secreción provocado por el agente oxidante. Además, la inhibición de latrascripción de genes ribosomales se lleva a cabo dependiendo de un citoesqueleto en polimerización activa, ii) Pkc1 induce la restauración de los cables de actina y con ello de la morfogénesis y polaridad celular a través de la activación de la profilina Pfy1. / The cell integrity pathway or Pkc1-MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae plays a central role in the cellular responses against different environmental stresses, such as: heat shock, hipoosmotic shock, starvation stresses, all of them affect the cell wall. This study shows that this transductional pathway is also involved in the survival and the adaptation of the cell against the affects of oxidative stress.We have observed that the proteins Pkc1 and Rom2 are essential for cell survival against oxidative stress caused by two agents: hydrogen peroxide and diamide. In addition, the actin cytoskeleton is one of the targets of both hydrogen peroxide and diamide, these agents cause depolarization of the actin cytoskeleton with a detrimental effect in cell morphogenesis and viability. This occurs independently on the cell integrity pathway proteins. However, for the actin cytoskeleton to repolarize in response to oxidant agents, the cells need the proteins Mtl1, Rom2 and Pkc1, all of them constitute the cell integrity pathway.Diamide causes the formation of disulphide bridges in the cell surface proteins, which provokes structural changes in the cell surface, and which finally induces the activation of the cell integrity pathway. In our investigation we have been able to assign a function to the cell wall receptor Mtl1, as a sensor of surface oxidative stress and an integral part of the Pkc1-MAP kinase pathway.Hydrogen peroxide affects primarily a cellular function related to the last stages of vesicular secretion. We also observe two essential functions of the protein Pkc1 in response to the treatment with hydrogen peroxide: i) Pkc1 regulates ribosomal biogenesis in response to problems in secretion, caused by the oxidant agent. The occurrence of the inhibition of ribosomal genes transcription is dependent on the active polymerization of the actin cytoskeleton, ii) Pkc1 induces the restoration of actin cables then promoting the restauration of cellular polarity and morphogenetic mechanisms through the activation of Pfy1 profilin.

Les cèl·lules reaccionen front els estressos ambientals a través de respostes múltiples que ocorren anivell transcripcional i posttranscripcional, per tal d'adaptar-se a les noves condicions i contrarestar elspossibles danys causats per l'estrès. En aquest treball s'analitzen les respostes a estrès tèrmic i oxidatiu deSaccharomyces cerevisiae mitjançant la determinació en paral·lel dels nivells d'mRNA (RA) i de les taxesde transcripció (TR) mitjançant la tècnica de Genomic Run-On (GRO) per a cada gen individual a escalagenòmica. A més, s'utilitza un algoritme matemàtic adaptat a situacions dinàmiques, com és la resposta aestrès, per a calcular les taxes de degradació teòrica dels mRNAs (TD) a partir de les dades experimentalsde TR i RA. Els gens del llevat han estat classificats en diferents grups per homologies de perfils de lescinètiques de TR i RA, resultant distribuïts en 16 i 25 grups en resposta a xoc per calor i a estrès oxidatiu,respectivament. A més, es calcula la mitjana de TD per a cada grup. Aquestes dades prediuen modulacionscausades per la contribució de la TD en els patrons d'expressió de la majoria dels trànscrits. Els resultatsobtinguts mostren dues tendències oposades: una desestabilització general dels mRNA en la resposta aestrès oxidatiu i una estabilització global durant la resposta a l'estrès tèrmic. Malgrat això, en ambdósestressos, un 25% dels gens induïts transcripcionalment no augmenten els seus nivells d'mRNA. Aquestamanca de paral·lelisme prediu canvis importants en l'estabilitat de l'mRNA. Una resposta comuna és larepressió i la forta desestabilització predita en els mRNAs codificants per proteïnes ribosomals i enzimsprocessadors d'rRNA. D'altra banda, la majoria dels mRNAs del proteosoma s'indueixen en els dosestressos i, tot i que aquests s'estabilitzen arran de l'estrès per calor, no ho fan en resposta a l'oxidatiu, fetque suggereix que els canvis en la TD dels mRNAs en resposta a un estrès provoquen diferentsmodulacions específiques sobre l'RA d'aquest grup de gens. Hem confirmat les prediccions matemàtiquesper a alguns gens de diversos grups determinant experimentalment les TDs dels mRNAs emprant elpromotor regulable tetO. Aquest estudi indica que les respostes a estrès en cèl·lules de llevat estancondicionades no només per la transcripció dels gens, sinó també per la dinàmica de la TD dels mRNAs.Les nostres anàlisis GRO permeten observar que, arran d'un estrès oxidatiu, els gens del sistemad'alta afinitat d'adquisició de ferro controlat pel transactivador Aft1 s'indueixen transcripcionalment. Deforma paral·lela, es demostra que Aft1 s'internalitza transitòriament al nucli. En aquestes condicions, elsnivells d'mRNA dels gens de la via no reductiva augmenten, mentre que els trànscrits de la via reductivamediada pel complex Ftr1/Fet3 es mantenen baixos, a causa de la desestabilització del seu mRNA. Enconseqüència, els seus nivells de proteïna també són baixos. La degradació d'aquests mRNAs ocorre per lavia general 5'-3' i és independent de la proteïna d'unió a RNA Cth2. En concordança, les cèl·lules de llevatsón hipersensibles als peròxids quan l'única via funcional d'assimilació de ferro és la via reductiva. Percontra, el peròxid no afecta el creixement quan l'adquisició de ferro es produeix exclusivament a través dela via no reductiva. Això reforça la idea que, en estrès oxidatiu, les cèl·lules d'S. cerevisiae redirigeixenl'assimilació de ferro a través de la via no reductiva per minimitzar el dany oxidatiu dels ions ferrosos. / Las células reaccionan frente estreses ambientales a través de respuestas múltiples que ocurren anivel transcripcional y post-transcripcional para adaptarse a las nuevas condiciones y contrarrestar losposibles daños causados por el estrés. En este trabajo se analizan las respuestas a estrés térmico y oxidativode Saccharomyces cerevisiae mediante la determinación en paralelo de los niveles de mRNA (RA) y latasas de transcripción (TR) usando la técnica de Genomic Run-On (GRO) para cada gen individual a escalagenómica. Además, se utiliza un algoritmo matemático adaptado a situaciones dinámicas, como es larespuesta a estrés, para calcular las tasas de degradación teórica de los mRNAs (TD) a partir de los datosexperimentales de TR y RA. Los genes de la levadura han sido clasificados en diferentes grupos según lashomologías de los perfiles de las cinéticas de TR y RA. De este modo, los genes se distribuyen en 16 y 25grupos en respuesta a estrés térmico y oxidativo, respectivamente. Además, se calcula la media de TD paracada grupo. Estos datos predicen modulaciones causadas por la contribución de la TD, en los patrones deexpresión de la mayoría de los tránscritos. Los resultados obtenidos muestran dos tendencias opuestas: unadesestabilización general del mRNA en la respuesta al estrés oxidativo y una estabilización global en larespuesta al choque térmico. Sin embargo, en ambos estreses, alrededor del 25% de los genes inducidostranscripcionalmente no aumentan sus niveles de mRNA. Estas diferencias predicen cambios importantesen la estabilidad del mRNA, así como en la respuesta transcripcional al estrés. Una respuesta común es larepresión y la desestabilización predicha en los mRNAs codificantes para proteínas ribosomales y enzimasprocesadoras de rRNA. Contrariamente, la mayoría de los mRNAs del proteasoma se inducen en los dosestreses y, aunque estos se estabilizan después del estrés por calor, no lo hacen en respuesta al estrésoxidativo, sugiriendo que cambios en la TD de los mRNAs en respuesta a estrés provocan modulacionesespecíficas sobre el RA. Hemos confirmado las predicciones matemáticas para algunos genes de diversosgrupos determinando experimentalmente las TDs de los mRNAs utilizando el promotor regulable tetO. Esteestudio indica que las respuestas a estrés en células de levadura están condicionadas no sólo por latranscripción de los genes, sino también por la dinámica de la TD de los mRNAs.Nuestros análisis GRO permiten observar que en respuesta a estrés oxidativo los genes del sistemade alta afinidad de adquisición de hierro controlado por el transactivador Aft1 se inducentranscripcionalmente. De forma paralela, se demuestra que Aft1 se internaliza transitoriamente en el núcleo.En estas condiciones, los niveles de mRNA de los genes de la vía no reductiva aumentan. Sin embargo, lostranscritos de la vía reductiva mediada por el complejo Ftr1/Fet3 se mantienen bajos, debido a ladesestabilización de su mRNA. En consecuencia, sus niveles de proteína también son bajos. La degradaciónde estos mRNAs ocurre por la vía general 5'-3' y es independiente de la proteína de unión a RNA Cth2. Enconcordancia, las células de levadura son hipersensibles a los peróxidos cuando la única vía funcional deasimilación de hierro es la vía reductiva. Por el contrario, el peróxido no afecta el crecimiento cuando laadquisición de hierro se produce exclusivamente a través de la vía no reductiva. Esto refuerza la idea que, en respuesta a estrés oxidativo, las células de S. cerevisiae redirigen la asimilación de hierro a través de lavía no reductiva para minimizar el daño oxidativo provocado por los iones ferrosos. / Cells react against environmental stresses through multiple responses occurring at transcriptionaland posttranscriptional levels, in order to adapt themselves to the new conditions and counteract thepossible damage caused by stress. In this work the heat and the oxidative stress responses have beenanalyzed in Saccharomyces cerevisiae by parallel determination of mRNA levels (RA) and transcriptionrates (TR) using the Genomic Run-On (GRO) methodology for each individual gene at a genomic scale.Moreover, a mathematical algorithm has been adapted for dynamic situations, such as the response to stress,to calculate theoretical mRNA decay rates (TD) from the experimental TR and RA data. Yeast genes havebeen grouped into different clusters, according to homologies of theirs RA and TR kinetics. In that way,genes are distributed in 16 and 25 clusters upon heat and oxidative stress, respectively. Moreover, the TDaverage has been calculated for each cluster. These data predict modulations in the RA profiles caused bythe TD contribution for most of the transcripts. Two opposite tendencies are observed in response to suchstresses: a global trend on mRNA destabilization is shown upon oxidative stress response whereas a generalmRNA stabilization occurs during thermal stress response. However, in both stresses, around the 25% ofthe transcriptionally induced genes do not increase their mRNA levels. This lack of parallelism predictsimportant changes in mRNA stability as well as in the transcriptional stress response. As a commonresponse, genes for ribosomal proteins and rRNA processing enzymes are abundant among those whosemRNAs are predicted to destabilize. Most of proteasomal genes are upregulated in both stresses. However,these become stabilized among the heat shock, although not in response to oxidative stress, suggesting thatchanges on the mRNA decay rates in response to one specific stress provoke different responses on themRNA amount. We have confirmed the mathematical predictions for several genes from different clustersby experimentally determining mRNA decay rates using the regulable tetO promoter. This study indicatesthat stress responses in yeast cells are not only conditioned by gene transcription but also by the mRNAdecay dynamics.Our GRO analyses allow the observation that, upon oxidative stress, genes of the high-affinitysystem iron acquisition controlled by the Aft1 transactivator are highly transcribed. In parallel, wedemonstrate that Aft1 is transitorily internalized into the nucleus. In these conditions, the mRNA levels ofthe non-reductive pathway genes become increased. However, transcripts of the Ftr1/Fet3-mediatedreductive pathway remain low due to destabilization of the mRNAs. Consequently, the respective proteinlevels also remain low. Such mRNA destabilization is mediated by the general 5'-3'-mRNA decay pathwayand is independent of the RNA-binding protein Cth2. According with that, yeast cells are hypersensitive toperoxides in growth conditions where only the high-affinity reductive pathway is functional for ironassimilation. On the contrary, peroxide does not affect growth when iron uptake occurs exclusively throughthe non-reductive pathway. This reinforces the idea that upon oxidative stress S. cerevisiae cells redirectiron assimilation through the non-reductive pathway to minimize oxidative damage by the ferrous ions.

No description available.

L'alumini és un metall amb un ampli ús industrial, que es troba àmpliament distribuïtpel medi ambient, i amb un elevat ús dins la nostre vida quotidiana. Tot i així, l'aluminino és un metall essencial i no té propietats biològiques importants conegudes.Diversos estudis ambientals i experimentals han mostrat que l'alumini és un potenttòxic i neurotòxic amb importants riscs per la salut humana. L'alumini s'ha relacionatamb diverses malalties neurodegeneratives, incluïda la malaltia d'Alzheimer (MA).S'han proposat diversos mecanismes mitjançant els quals l'alumini podria exercir elsseus efectes neurotòxics, però sobretot s'ha estudiat el seu paper com a agentprooxidant.Per altre banda, la melatonina és un conegut agent antioxidant, que pot actuar deforma directa neutralitzant els radicals lliures, i de forma indirecta al induir l'expressiógènica d'alguns gens relacionats amb la defensa antioxidant. Així mateix, ladesferoxamina (DFO) és un conegut agent quelant del ferro i l'alumini.En aquest estudi es van avaluar els efectes neurotòxics d'una exposició oral a aluminisobre el sistema antioxidant cel·lular en un model animal per a la MA (Tg2576APPswe), a més de valorar els canvis cognitius i conductuals produïts i determinar elsnivells d'alumini i d'altres metalls relacionats amb la MA en diferents teixits i regionscerebrals. Per altre banda, es va estudiar el possible efecte protector de la melatonina ide la DFO.Els nostres resultats han mostrat que dels tres teixits cerebrals estudiats l'aluminis'acumula majoritàriament a l'hipocamp dels animals.En general, l'anàlisi dels sistemes antioxidants enzimàtics i no enzimàtics i els resultatsde l'expressió dels nivells d'mRNA dels enzims CAT, SOD i GR, han mostrat quel'alumini podria actuar com a un possible agent prooxidant, Altrament, els resultats hanmostrat que la melatonina actuaria com a un agent antioxidant, mentre que la DFO noexerciria cap acció antioxidant clara. Per altre banda ni la melatonina ni la DFO hanmostrat capacitat per detoxificar l'alumini del cervell dels animals. / Aluminum is an abundant element in the environment, which has a considerable number of usesand industrial applications. However, aluminum is a non essential metal, with no importantbiological propierties. Environmental and experimental studies has shown that aluminum is apotential toxic and neurotoxic metal with important risks to human health.Aluminum has been implicated in various neurodegenerative disorders including Alzheimer'sdisease (AD). Various mechanisms have been proposed for Al-induced neurotoxicity, including freeradical damage via enhanced lipid peroxidation, impaired glucose metabolism, effects on signaltransduction and protein modification, alterations on the axonal transport, and alteration ofphosphorylation levels of neurofilaments, as well as, neuronal death.On the other hand, melatonin is a known antioxidant, which can directly act as free radicalscavenger, or indirectly by inducing the expression of some genes linked to the antioxidantdefense. Also, desferoxamine (DFO) is an effective iron and aluminum chelator that has beenwidely used to facilitate aluminum removal in chronic aluminum overload in patients with end-stagerenal failure under long-term dialysis.The aim of these study was to evaluate neurotoxics effects of oral aluminum exposure oncognitive, oxidative stress parameters and metal levels in a mice model for Alzheimer's disease(Tg2576 APPswe mice) and to evaluate the possible protective role of melatonin and DFO.Results showed that aluminum accumulates in predominance in hippocampus of mice aftertreatment.In general terms, the biochemical changes observed in hipocamppus, cortex and cerebellum ofTg2576 and wild mice suggest that aluminum acts as a pro-oxidant agent while melatonin exertsan antioxidant action independent of the animal model. In contrast, DFO administration would nothelp in preventing these deleterious effects.

El estrés oxidativo, el desequilibrio que se produce en el organismo entre sustancias oxidantes, principalmente especies reactivas del oxígeno (ROS), y antioxidantes, puede producir daños celulares que desencadenen diversos procesos patológicos. De ahí el creciente interés de la ciencia y la industria por obtener sustancias de origen natural (principalmente procedentes de residuos agrarios y de productos de desecho naturales) encaminadas a la prevención y tratamiento de estas alteraciones producidas por los ROS. Entre estas sustancias destacan los polifenoles y entre ellos, los flavonoides, con reconocidas propiedades antioxidantes y posible papel en la prevención de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y cáncer.Se ha evaluado la citotoxicidad sobre células normales (no tumorales) y se ha caracterizado la actividad antioxidante de toda una serie de compuestos de naturaleza polifenólica obtenidos de diferentes fuentes naturales. Una primera serie de compuestos se obtuvo a partir de la despolimerización de flavanoles (catequinas) poliméricos procedentes de extractos vegetales, principalmente bagazo de uva, en presencia de cisteína y cisteamina. La segunda colección de compuestos está formada de fracciones polifenólicas (proantocianidinas) extraídas de bagazo de uva, de corteza de pino y de corteza del arbusto hamamelis; las diferencias estructurales de estas fracciones vienen dadas principalmente por el diferente grado de polimerización y diferente porcentaje de grupos galato que presentan.Se han planteado los siguientes objetivos y se han extraído las siguientes conclusiones de ellos: 1) El potencial efecto antioxidante de los derivados flavanólicos y los extractos de proantocianidinas se ha evaluado mediante su efecto protector frente a la hemólisis y la peroxidación lipídica inducida por radicales libres en eritrocitos y mediante la protección ejercida frente a la citotoxicidad por peróxido de hidrógeno en líneas celulares no tumorales. Tanto los derivados semisintéticos de epicatequina como los extractos de procianidinas, han mostrado, con diferente eficacia, una buena actividad antioxidante en los diferentes modelos celulares; en general, los grupos galato y el grupo no fenólico en el caso de los conjugados con aminoácidos y el grado de polimerización y porcentaje de galoización en el caso de las fracciones, son las principales características estructurales que determinan la actividad de estos compuestos. 2) La toxicidad se ha evaluado mediante ensayos de citotoxicidad utilizando el ensayo de viabilidad de captación del Rojo Neutro en fibroblastos 3T3 y en queratinocitos HaCaT y se ha caracterizando el potencial efecto genotóxico con la técnica del Comet. La presencia de galatos incrementa el efecto citotóxico de los compuestos y, en general, los compuestos más potentes como antioxidantes son también los más citotóxicos, debido al efecto prooxidante de los grupos galato; las concentraciones antioxidantes efectivas fueron inferiores a las concentraciones citotóxicas garantizando así la seguridad de estos productos. Los estudios previos de genotoxicidad muestran que los compuestos estudiados resultan genotóxicos para células no tumorales a concentraciones muy elevadas, alejadas de las concentraciones antioxidantes efectivas. 3) Finalmente, se ha iniciado la caracterización de la interacción de los derivados flavanólicos con la membrana eritrocitaria mediante estudios de morfología celular, de oxidación de proteínas y de fluidez de membrana. Los compuestos modificaron la fluidez de membrana y la morfología de los eritrocitos, pero no alteraron el patrón proteico ni se observó que revertieran los efectos nocivos de los oxidantes empleados.Así, se puede concluir que la galoización es una característica estructural fundamental para explicar los efectos de los compuestos de naturaleza polifenólica a nivel celular y que toda esta serie de sustancias polifenólicas procedente de diversas fuentes naturales, presenta actividad antioxidante en diversos modelos celulares en un rango de concentraciones seguro para células normales. / The imbalance between oxidant substances production, mainly reactive oxygen species (ROS), and antioxidants in the body, namely oxidative stress, is associated with several pathological processes. Therefore, there is an increasing interest in obtaining natural compounds (mainly from agricultural by‐products and other natural wastes) to deal with these ROS‐induced alterations. Among these substances, polyphenolic compounds and specially flavonoids, are recognized by their antioxidant properties and putative role in cardiovascular, neurodegenerative diseases and cancer prevention.We have evaluated the cytotoxicity on non tumoral cells and the antioxidant activity of a serie of flavanol cojugates (catechins), obtained from vegetable extracts through depolimerisation with cysteine derivatives, and several polyphenolic fractions extracted from grape pomace, pine bark and witch hazel ("Hamamelis virginiana") bark. 1) Antioxidant activity was studied by induction of oxidative stress in different cell models by radicals. All compounds showed antioxidant activity and the galloylated compounds were the most effective. 2) Cytotoxicity was evaluated using Neutral Red Uptake assay in fibroblast 3T3 and keratinocytes HaCaT. The strongest antioxidant products were also the most cytotoxic, especially due to the antioxidant power of the gallate group molecules, which is also responsible for the increase in their cytotoxicity.Compounds showed high antioxidant capacity in a concentration range that is not harmful to normal cells. Genotoxicity studies by Comet assay indicated that flavanic conjugates had genotoxic activity at high concentrations. 3) The characterization of the erythrocyte membrane interaction (by means of SEM, SDS‐Page electrophoresis and fluidity assays) showed that these compounds modified membrane fluidity and erythrocyte morphology but not their protein pattern.We can conclude that the flavanic conjugates with cystein derivatives and polyphenolic fractions from natural sources, presented antioxidant activity in several cellular models in a concentration range safe for normal cells. The compound structures mainly responsible for their activity were gallate groups and non phenolic moiety to flavanol conjugates, whereas percentage of galloylation and degree of polymerization were important in the case of polyphenolic fractions.

La base de esta tesis ha sido estudiar el efecto de dos noxas, la hiperglucemia y el consumo de tabaco, sobre las concentraciones de isoprostanos (F2-IsoPs), como expresión de estrés oxidativo (EO) y del factor transformador de crecimiento beta-1 (TGF-beta-1), como marcador de fibrogénesis, que son dos vías metabólicas estrechamente asociadas al desarrollo de las complicaciones crónicas de la diabetes mellitus (DM). Durante el diseño de esta tesis, la información que existía respecto a la modulación de ambas vías patogénicas era escasa y se centraba en fases avanzadas de la enfermedad. Valorar el EO y la fibrogénesis al inicio de la DM nos permitía analizar de forma específica el papel de la hiperglucemia, pero también nos posibilitaba describir su actividad en una fase de la enfermedad hasta ahora no estudiada. El consumo de tabaco es otro factor de riesgo definido para el desarrollo de las complicaciones crónicas de la DM de creciente interés clínico y del cual no existe información en pacientes con DM respecto a su posible efecto sobre los factores analizados en este trabajo. Los resultados de este estudio demuestran que al inicio clínico de la DM1, las concentraciones de F2-IsoPs y de TGF-beta-1 ya están aumentadas. Observamos además que en el caso del EO ésta elevación es dependiente de la hiperglucemia, tal como lo indica el hecho de que sus valores disminuyen un 27% a las 12 semanas de iniciar el tratamiento con insulina y de mejorar el control metabólico. Cuando evaluamos el efecto del control glucémico sobre los niveles de TGF-beta-1, observamos que a pesar de la importante mejoría del control glucémico obtenida en este estudio tras el inicio del tratamiento con insulina, estos niveles no se modificaron en ningún momento a lo largo del estudio. Este hecho nos sorprendió, debido a las evidencias existentes de que la hiperglucemia incrementa la actividad del TGF-beta-1, y, por tanto, era de esperar que la mejoría del control glucémico disminuyera su actividad. Esto nos hizo hipotetizar que en está fase de la DM1, la producción de TGF-beta-1 no está exclusivamente asociada al efecto estimulante de la hiperglucemia. El reciente conocimiento del papel de esta citocina en la modulación de la función celular inmune, permite plantear que estos niveles elevados de TGF-beta-1 probablemente estén relacionados con la actividad del proceso inmune implicado en la patogénesis de la enfermedad. Por lo que, el modelo clínico utilizado para valorar el efecto de la hiperglucemia sobre la fibrogénesis no nos permitió extraer conclusiones definitivas.Por otra parte, se confirmó que el consumo de tabaco estimula directamente la actividad de ambas vías patogénicas implicadas en la patogénesis de las complicaciones crónicas. Explicando así, las numerosas evidencias epidemiológicas de la asociación entre el consumo de tabaco, el desarrollo y la progresión acelerada, con un peor pronóstico de las complicaciones crónicas en los sujetos con DM1 fumadores. Este resultado es de relevancia clínica ya que aporta más argumentos para insistir a los sujetos con DM1 fumadores a abandonar este hábito perjudicial. / "Oxidative stress and fibrogenesis in Type 1 diabetes mellitus: Effect of glycemic control and cigarette smoking" The aim of this thesis was to study the effects of hyperglycemia and smoking on isoprostane concentrations (F2-IsoPs) which express oxidative stress (OS) and the transforming growth factor beta 1 (TGFb1) a marker of fibrogenesis. These two metabolic pathways are closely associated with the development of chronic complications in diabetes mellitus (DM).Prior to this thesis information on the modulation of both pathogenic pathways was scarce and was focus on advanced phases of the disease. Evaluation of OS and fibrogenesis at the onset of DM allows the role of hyperglycemia to be specifically analysed and also makes it possible to describe its activity in a phase of the disease which, to date, has not been studied. Smoking is another risk factor for the development of chronic complications in DM which has gained increasing clinical interest. Moreover, no study has been performed in patients with DM concerning the possible effects on the factor analysed in this thesis.The findings of this study demonstrate the both OS and fibrogenesis are already increased in early phases of DM and there is a direct relationship between hyperglycemia and OS. At the onset of type 1 DM we found the F2-IsoPs was already raised and this elevation was dependent on hyperglycemia shown by a 27 % decrease in the initial values 12 weeks after initiating insulin treatment and improving metabolic control. When we evaluated the effect of glycemic control on TGFb1 level we found that despite an important improvement in glycemic control following the initiation of insulin treatment these levels were not modified at any time during the study. This finding was unexpected due to reports showing that hyperglycemia increases the activity of TGFb1 and thus we expected an improvement in glycemic control to reduce its activity. We therefore, hypothesized the in this phase of type 1 DM the production of TGFb1 is not exclusively associated with the stimulating effect of hyperglycemia. The recent description of the role of this cytokine in the modulation of immune cell function suggests that these elevated levels of TGFb1 are probably related to the activity of the immune process involved in the pathogenesis of this disease. Thus, the clinical model used to evaluate the effect of hyperglycemia on fibrogenesis has not allowed definitive conclusions to be drawn.On the other hand, tobacco consumption has also been found to directly stimulate the activity of both pathogenic routes involved in the pathogenesis of chronic complications, thereby explaining the numerous epidemiological evidence regarding the association between smoking, the development and accelerated progression, and the worse prognosis of the chronic complications in smokers with type 1 DM. This is of clinical relevance because of the additional arguments it provides for persuading type 1 DM smokers to give up this harmful habit.

L'objectiu principal d'aquesta tesi fou aprofundir en el coneixement de la relació estrès hídric-estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu és una de les moltes respostes de les plantes al dèficit hídric. Mentre que l'estrès oxidatiu és la conseqüència d'un desequilibri entre les espècies actives de l'oxigen i les espècies antioxidants a favor de les primeres; el dèficit hídric es dóna quan l'absorció d'aigua per les arrels és menor que la pèrdua d'aigua deguda a la transpiració per les fulles. Entre les espècies actives de l'oxigen, el peròxid d'hidrogen està involucrat en: inducció de l'estrès oxidatiu; alleujament de cadenes de transport d'electrons sobrecarregades; mort cel·lular programada; enduriment de parets cel·lulars; formació de xilema i senyalització intra- i inter- cel·lular en les respostes de les plantes a molt tipus d'estrès.Per una altra banda existeix el que s'anomena regulació redox, que inclou l'equilibri entre les espècies actives de l'oxigen i les espècies antioxidants, així com l'equilibri entrte les diferents parelles redox, com són les formades per ascorbat/dehidroascorbat, NAD(P)H/NAD(P)+ i glutatió/diglutatió, entre d'altres. L'equilibri entre aquestes parelles redox influeix sobre la formació i la destrucció de ponts disulfur de gran nombre d'enzims, que al seu torn indueix canvis conformacionals i en regula l'activitat, de manera que la regulació redox és clau en el metaboisme cel·lular vegetal. En primer lloc es va incidir en conèixer en la funció del peròxid d'hidrogen en l'aclimatació al dèficit hídric d'una espècie arbustiva mediterrània resistent a la sequeraAmb aquest objectiu es va estudiar la funció del peròxid d'hidrogen en l'aclimatació al dèficit hídric de Cistus albidus L. en condicions de camp. C. albidus es pot fer servir com a model de planta mediterrània resistent a la sequera, doncs és una planta arbustiva escleròfila, semi-decídua amb una resposta molt característica i fàcil de caracteritzar. Resisteix continguts hídric molt baixos a les seves fulles durant períodes de temps llargs i no presenta exigència davant el tipus de sòl en el que creix. Els resultats obtinguts mostren que el peròxid d'hidrogen va augmentar en resposta al dèficit hídric i que contribueix a l'aclimatació de C. albidus a la sequera d'estiu. En primer lloc, es va comprovar que el peròxid d'hidrogen no provoca estrès oxidatiu, ans al contrari, doncs simultàniament va augmentar la concentració d'ascorbat i va disminuir la de MDA (marcador de peroxidació lipídica). Altres estudis complemetaris demostren que l'augment de peròxid d'hidrogen està involucrat en la formació d'esclerènquima (mort cel·lular programada i engruiximent de la paret); formació d'àcid ascòrbic via àcid abscísic; formació de xilema; i fins i tot podria estar involucrat en la síntesi de metil-jasmonat.En segon lloc, com a mesura directa de la relació estrès hídric estrès oxidatiu es van estudiar els canvis en l'estat redox del citoplasma de les cèl·lules foliars de plantes d'Arabidopsis thaliana transformades amb proteïnes c-roGFP1. Aquestes plantes expressen proteïnes amb fluorescència verda (Green Fluorescent Protein) que són sensibles a l'estat redox del citoplasma on s'expressen, en aquest cas el citoplasma. Els resultats obtinguts mostren que el dèficit hídric gradual incrementa l'estat redox del citoplasma, tot i que aquest canvi no és el primer que experimenten les plantes, doncs el primer paràmetre on es va observar el canvi fou a l'àrea foliar de les plantes estudiades. / The aim of this thesis was deepening into the knowledge of the relationship water stress-oxidative stress. Oxidative stress is one of the many responses of plants to water deficit. Whereas oxidative stress is the consequence of an imbalance between active oxygen species and antioxidant species, favouring the first; water deficit is produced when there is less absorption of water from the roots than the loss of water from the leaves (transpiration). Among active oxygen species, hydrogen peroxide is involved in oxidative stress induction, relieve of overreduced electron transport chains, programmed cell death, cell wall hardening, xylem formation and intra- and inter-cellular signalling.The first aim was to know the function of hydrogen peroxide in the acclimation of a drought-resistant Mediterranean shrub. The chosen plant species was Cistus albidus L. because it can be used as a model of Meditarrean drought-resistant plant. C. albidus is a schlerophyllous shrub, semi deciduous with a characteristic and easy to characterize response. It is able to resist very low water contents and it has no special necessities regarding to soil characteristics.The results obtained show that hydrogen peroxide increased in response to water deficit, and that contributes to the acclimation of C. albidus to summer drought. First of all it was shown that hydrogen did not induce oxidative stress. Complementary studies show that hydrogen peroxide increase is involved in sclerenchyma formation, ABA-induced ascorbate formation, xylem formation, and could even be involved in methyl jasmonate biosynthesis. The second aim, a direct measurement of the relationship water stress oxidative stress, was based on the changes in the redox state of the cytoplasm of the leaf cells of Arabidopsis thaliana plants transformed with c-roGFP1 protein. These plants express proteins with green fluorescence that are sensitive to the redox state of the compartment where they are espressed, in this case the cytoplasm. The results obtained show that gradual water deficit induces an increase in the redox state of the cytoplasm, even though this is not the first change experienced in these plants. Among the parameters studied, the first was the reduction of leaf area.

Cancer is one of the leading causes of death in countries throughout the world. Increase in the production of Reactive Oxygen Species (ROS) has been implicated in many human disease processes, including aging and carcinogenesis. Detoxification of ROS in the cell is provided by both enzymatic and non-enzymatic systems, which constitute the antioxidant defence systems and is crucial to the survival of organisms. The cancer inhibitory propierties of antioxidant compounds such as polyphenols have been well established in experimental and epidemiological studies, showing the intake of these antioxidants within our diet can carry out an effective protective action toward the oxidative stress created in the body by imbalance between ROS and its endogenous defence mechanism. However, the molecular mechanisms responsibles for these effects are not so well known and more studies are needed to provide clear evidence of their protective effects.The aim of this study is to determine and compare the posible antitumoral properties of several polyphenolic fractions, obtained from the extraction and fractionation of wine by-products consisting of grape skins, seeds and stems. These polyphenolic fractions have high antiradical potential and are mainly composed by flavanol monomers with or without gallate groups, glycosylated flavonols and mostly procyanidin oligomers. The effect of these fractions is analysed on cancer cells at cellular and metabolic levels. Moreover, as solar radiation in the UV range is the major source of adverse reactions in the skin and is one of the most efficient environmental carcinogen known, the possible capacity of these fractions to protect against cellular damage induced by ultraviolet radiation is evaluated and compared. The results obtained in this study let us to confirm the polyphenolic fractions studied are very specific antiproliferative agents with very low cytotoxicity to non-proliferative normal cells, such as peripherial blood lymphocites (PBLs). Moreover, treatment with these fractions results in intracellular metabolic changes, restricting the ability of tumoral cells to proliferate and inhibiting glycolysis, being higher for the fraction rich in ECG containing oligomeric flavanols.Like for the study of antitumoral effect at cellular and metabolic levels, the results obtained in the analysis of the protective capacity of these polyphenolic fractions against UV-induced damage, confirm them as potential natural chemopreventive agents. Briefly, the results obtained in this study let us to conclude the polyphenolic fractions rich in procyanidin oligomers and gallate esters are the most efficient as antitumoral agents, active at both cellular and metabolic levels with low cytotoxicity. Additionally, polymerization and percentge of galloylation are also important in the efficacy of the polyphenolic fractions as protectors against damage induced by ultraviolet radiation, suggesting they may be useful for the prevention and treatment of a variety of solar UV light-induced human skin disorders.

Els pacients amb malaltia renal crònica (MRC) ja siguin en tractament substitutiu renal o trasplantats, presenten un alt risc de mortalitat d'origen cardiovascular. La urèmia junt amb la dislipèmia són alguns dels mecanismes subjacents associats a la malaltia de base com la diabetis. A més, en aquests pacients existeix un augment de l'estrès oxidatiu manifestat en una disminució de la resistència a l'oxidació de les LDL-colesterol. La hipòtesi de la tesi va ser si el tractament amb substàncies hipolipemiants i antioxidants, podia millorar el perfil aterogènic i per tant, el risc cardiovascular mitjançant un augment de la resistència a l'oxidació. Els objectius varen ser: 1- Analitzar la dislipèmia en els pacients urèmics. 2- Estudiar la peroxidació lipídica en pacients en hemodiàlisi. 3- Analitzar el possible efecte beneficiós de fàrmacs hipolipemiants i antioxidants. 4- Analitzar l'efecte dels fàrmacs inmunosupressors en la dislipèmia dels trasplantats renals. La tesi es basa en tres articles publicats: 1article: "Dislipemia y riesgo cardiovascular en el paciente diabético tipo 2 con nefropatía diabética asociada". En aquest treball s'analitza l'evolució tant de la funció renal com del perfil lipídic de 98 pacients diabètics tipus 2 amb nefropatia diabètica establerta comparant aquells tractats amb fibrats o estatines, amb mesures higiènico-dietètiques i grup control o normocolesterolèmic. Als 5 anys de seguiment, els pacients amb hipertrigliceridèmia basal més severa (>3 mmol/L) presentaren major número d'events cardiovasculars. L'HDL colesterol no es va veure modificat als 5 anys en cap grup de tractament. No hi van haver diferències respecte a la microalbuminúria ni al filtrat glomerular als 5 anys a cap grup de tractament. La mortalitat tant cardiovascular com per altres causes al cap de 5 anys va ser superior als normocolesterolèmics que en aqueslls tractats amb estatines. 2on article: "Lipoperoxidation and hemodialysis". Es tracta d'un estudi prospectiu randomitzat sobre 34 pacients incidents en hemodiàlisi no diabètics ni dislipèmics que van ser randomitzats a tractament amb vitamina C oral vs placebo. Els resultats mostraren que en pacients amb un estat pro-oxidatiu com ho és la urèmia, el tractament dialític pot millorar el perfil lipídic. No varen existir diferències del perfil lipídic dels pacients tractats amb vitamina C respecte als de placebo. La discreta diferència de substàncies reactives a la oxidació (TBARs) als pacients tractats amb vitamina C no ens permet atribuir-li un efecte antioxidant. L' administració de vitamina C tampoc mostrà canvis respecte als paràmetres relacionats amb l'anèmia. 3er article: "Efecto de ciclosporina y tacrólimus sobre la oxidación de las lipoproteínas después del trasplante renal". S'analitza el perfil lipídic i bioquímic de 20 pacients trasplantat renals 62 ± 20 mesos abans i als 6 mesos de conversió de CsA neoral a tacròlimus. La conversió disminuí els nivells de colesterol total, c-LDL i apo B als 6 mesos. També millorar la resistència a l'oxidació de les LDL als 6 mesos de tractament amb tacròlimus a l'hora que s'aconseguí millorar la Pressió arterial tant sistòlica com diastòlica. Les conclusions són que: 1- El tractament adequat i intensiu de la dislipèmia contribueix a disminur les complicacions vasculars. 2- És obligat adoptar mesures precoces, combinades i multidisciplinàries per retardar el desenvolupament de la micro i macroangiopatia diabètica. 3- L'hemodiàlisi "per sé" sembla millorar el perfil lipídic en pacients amb un estat pro-oxidatiu previ com és la urèmia, probablement mitjançant la millora de la mateixa. 4- L'administració de suplements de vitamina C als pacients en hemodiàlisi no exerceix un clar efecte beneficiós respecte a l'oxidació lipídica 5- Tacròlimus presenta un millor perfil aterogènic, tant al perfil lipídic com a la resistència a la lipoperoxidació en pacients trasplantats renals tractats prèviament amb ciclosporina. / There is good evidence indicating that uraemia in general is associated with enhanced oxidative stress, and high incidence of premature atherosclerosis in pre-dialysis, dialysis or transplanted patients. Treatment with haemodialysis or peritoneal dialysis has been suggested to particularly contribute to oxidative stress and reduced antioxidant levels in these patients. The aim of the present study is to analyze the lipid and lipoprotein oxidation profile in these patients and the possible effect of haemodialysis "per se", antioxidants and statins. This doctoral thesis is based in three published articles. 1starticle: DYSLIPIDAEMIA AND CARDIOVASCULAR RISK IN TYPE 2 DIABETES MELLITUS PATIENTS WITH ASSOCIATED DIABETIC NEPHROPATHY. Results showed that at five-year cardiovascular mortality and all-cause mortality rate were significant higher in comparing normocholesterolemic versus statin-treated patients (p < 0,05). No changes in proteinuria or renal function were observed. 2ond article: "LIPOPEROXIDATION AND HEMODIALYSIS". The aim of this study was to evaluate the effect of hemodialysis by itself on lipid and lipoprotein oxidation profiles, and to analyze the effect of vitamin C supplementation in patients with end stage renal disease starting hemodialysis. Hemodialysis by itself seems to improve the lipid profile in patients with a previous pro-oxidative state such as uremia. Results failed to demonstrate significant differences between vitamin C-treated and untreated patients. 3rd article: EFFECT OF CYCLOSPORIN AND TACROLIMUS ON THE OXIDATION OF LIPOPROTEINS AFTER KIDNEY TRANSPLANTATION. After six month from cyclosporine to tacrolimus conversion, systolic and diastolic blood pressure (BP) decreased. Also total cholesterol, LDL-cholesterol and apolipoprotein B decreased. The oxidation of LDL improved after conversion. Conclusions: Since dyslipidaemia is closely related to the progression of cardiovascular disease and mortality, an aggressive lipid-lowering therapy is recommended. Hemodialysis "per se" can contribute to improve lipid profile but vitamin C doesn't show significant differences on it. Tacrolimus has a low atherogenic power compared with cyclosporine.