Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-13Bitstream added on 2014-06-13T21:02:24Z : No. of bitstreams: 1 saito_me_dr_botfmvz.pdf: 234612 bytes, checksum: f305f4a0cc1a03361d24663bf833ca32 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A alteração biológica mais evidente observada durante o exercício físico é o aumento da taxa metabólica, com elevada demanda de oxigênio, que pode aumentar a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) potencialmente danosas ao organismo, ocorrendo lipoperoxidação como conseqüência. Foi desenvolvido um método de isolamento simultâneo de células mononucleares e polimorfonucleares de sangue periférico eqüino, utilizando gradiente descontínuo de ficoll-hipaque d=1,077 e d=1,119. A separação de ambos os tipos celulares resultou em alto grau de pureza e viabilidade. Foram avaliadas funções de monócitos e polimorfonucleares em eqüinos da raça Árabe suplementados com vitamina E comparando-se com um grupo controle em duas provas de exercício progressivo em esteira de alta velocidade antes e depois de serem submetidos a um protocolo de treinamento. Os resultados indicam que o treinamento e a suplementação com vitamina E preservaram as funções dos monócitos eqüinos quanto à geração de anion superóxido (O2 -), peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) ao mesmo tempo em que preveniram a produção exacerbada dessas substâncias. Enquanto as produções de H2O2 e O2 - por polimorfonucleares pelo grupo de animais suplementados foram mais elevadas. Isso indica a exacerbação desta função dos polimorfonucleares dos eqüinos pela vitamina E antes e após a prova de exercício físico em esteira de alta velocidade. A vitamina E suplementar na dieta promoveu menor formação de malondialdeído (MDA), ou seja, ocorreu atenuação da lesão oxidativa. / The clearest biological alteration observed during physical exercise is the increase of metabolic rate, with a high oxygen demand. It can increase the reactive oxygen species (ROS) formation potentially harmful to the organism, occurring lipoperoxidation as a result. It was developed a method of simultaneous separation of peripheral blood mononuclear and polymorphonuclear cells in horse utilizing discontinuous Ficoll-Hypaque gradients d=1,077 and d=1,119. Both cells types isolation resulted in high purity and viability degree. It was evaluated functions in monocytes and polymorphonuclear cells in Arabian horses supplemented with vitamin E by comparing a control group in two incremental treadmill exercises before and after been submitted to a training protocol. Results indicated that training and vitamin E supplementation preserved the monocyte functions regarding superoxide anion generation (O2 -), hydrogen peroxide (H2O2), nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor alpha (TNF-a) at the same time that they prevented an excessive production of those substances. Whereas H2O2 e O2 - productions by polymorphonuclear cells in supplemented animals group were higher. It indicates an exacerbation of that horse polymorphonuclear cells function by vitamin E before and after incremental treadmill exercises. Supplementary vitamin E in the diet promoted a lower malondialdeide (MDA) formation, namely occurred attenuation in oxidative stress.

Orientador: Prof. Dr. Ronaldo da R.L. Bueno / Co-orientador : Prof. Dr. Rogério de Fraga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 13/02/2015 / Inclui referências / Resumo: Introdução: Diversas teorias já foram propostas para tentar explicar o envelhecimento, mas ainda não temos pleno conhecimento sobre os fatores que afetam esse complexo processo. Entre as teorias elaboradas uma das mais estudadas é a de que o envelhecimento se dá pelo acúmulo de dano oxidativo com o tempo. E um dos órgãos mais afetados por esse tipo de dano é o coração. Objetivos: Esse estudo avaliou os principais marcadores de dano oxidativo, no coração de animais em diferentes idades. Métodos: 72 ratos Wistar foram divididos em 6 grupos de 12 animais cada, cada grupo foi sacrificado em uma idade diferente: 3, 6, 9, 12, 18 e 24 meses. Após a eutanásia o coração dos animais foi removido e foi realizada a dosagem de peroxidação lipídica, carbonilação proteica, tióis não proteicos, atividade de superóxido dismutase e catalase no tecido miocárdico. Resultados: Para a peroxidação lipídica encontramos uma redução no grupo mais velho comparado ao mais jovem, com significância estatística, bem como para a atividade de superóxido dismutase e catalase. Para a carbonilação proteica foi encontrado um pico no grupo de 12 meses seguido de queda nos mais velhos, sendo também estatisticamente significativo. Os níveis de tióis não proteicos apresentaram uma discreta ascensão no grupo 12 meses que se manteve nos grupos mais velhos, com significância estatística. Conclusão: Os resultados não nos permitem afirmar que o estresse oxidativo seja a causa do envelhecimento, no entanto sugerem que algumas das alterações encontradas podem ajudar a explicar o que acontece no organismo durante esse processo. Palavras-chave: Envelhecimento, Ratos, Espécies Reativas de Oxigênio, Superóxido Dismutase, Catalase, Peroxidação Lipídica, Carbonilação Proteica, Glutationa, Coração. / Abstract: Introduction: Several theories have been proposed to explain ‘aging’, but the factors that affect this complex process are still poorly understood. Among those theories, the accumulation of oxidative damage over time is one of the most accepted. Particularly, the heart is one of the most affected organs by oxidative stress. Objectives: The current study, therefore, aims to investigate oxidative stress markers in myocardial tissue of rats at different ages Methods: 72 rats were distributed into 6 groups of 12 animals each and maintained during 3, 6, 9, 12, 18 and 24 months. After euthanasia, the heart was removed and the levels of non-protein thiols, lipid peroxidation and protein carbonylation as well as superoxide dismutase and catalase activities were determined. Results: For superoxide dismutase, catalase and lipid peroxidation were found reductions, statistically signficant, in the older groups when compared with the younger group differently for protein carbonylation. In this case, a peak in the 12-month group was observed followed by a decrease in the older group. The levels of non-protein thiols increased at 12-month with statistical significance. Conclusion: The results do not allow us to claim that oxidative stress is a cause of aging. However, we found some changes that may help to explain what happens in the organism during this process. Key Words: Aging, Rat, ROS, Superoxide Dismutase, Catalase, Lipid Peroxidation, Protein Carbonylation, Glutathione, Heart.

Orientador: Prof. Dr. José Miguel Amenábar Céspedes / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Defesa: Curitiba, 2016 / Inclui referências : f. 28-30;32-36 / Resumo: A doenca celiaca (DC) e uma enteropatia sensivel ao gluten, com manifestacoes sistemicas e bucais que leva ao desequilibrio entre oxidantes e antioxidantes. Diversos estudos avaliaram o estresse oxidativo em individuos com DC em tecidos e plasma, no entanto, nao ha relatos desta avaliacao na saliva. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi analisar o estado oxidativo da saliva em individuos com DC. Foi avaliada a saliva de 30 individuos de faixa etaria entre 05 e 33 anos com DC confirmada atraves de biopsia endoscopica do intestino delgado. Foi comparada com individuos sem DC com idade e sexo pareados. As amostras foram analisadas por meio de metodos colorimetricos para a determinacao do Estado Oxidante Total (EOT), Capacidade Antioxidante Total (CAT) e Indice do Estresse Oxidativo (IEO). Os dados obtidos foram tabulados e submetidos ao teste de Mann Whitney, considerando significancia quando p<0,05. A CAT (0,002}0,001 mM) e o IEO (0,154}0,304) no grupo de celiacos apresentaram diferencas significativas quando comparados aos controles (0,007}0,001 mM e 0,012}0,013, respectivamente). Ja o valor do EOT foi semelhante em ambos os grupos, sendo os valores do grupo com DC de 2,524}0,268 ƒÊM e do controle 2,492}0,284 ƒÊM. Dentro dos limites do presente estudo pode ser concluido que os individuos com DC apresentam o estado oxidativo salivar aumentado decorrente de uma menor capacidade antioxidante. Palavras-chave: Doenca celiaca. Oxidantes. Antioxidantes. Estresse Oxidativo. Saliva. / Abstract: Celiac disease (CD) is a sensitive enteropathy to gluten, with systemic and oral manifestations that lead to an imbalance between oxidants and antioxidants. Several studies have assessed oxidative stress in individuals with DC in tissues and plasma but not yet in saliva. Thus, the aim of this study was to analyze the salivary oxidative status in individuals with CD. Saliva was evaluated in 30 subjects between 05 and 33 years with CD confirmed by endoscopic biopsy from the small intestine. They were compared with individuals without DC with age and sex matched.The specimens were analyzed by means of colorimetric methods to determine the Total Oxidant State (TOS), Total Antioxidant Capacity (TAC) and Oxidative Stress Index (OSI). Data obtained were tabulated and submitted the Mann Whitney test, a level of p < 0.05 was considered statistically significant. The TAC (0.002 ± 0.001 mM) and OSI (0154 ± 0304) in the celiac group showed significant differences compared to control group (0.007 ± 0.001 mM and 0.012 ± 0.013, respectively). The value of the TOS was virtually the same in both groups, group values with CD were 2524 ± 0268 ?M and control group 2.492 ± 0.284 ?M. Within the limits of the present study can be concluded that individuals with celiac disease have salivary oxidative state altered due to a decreased antioxidant capacity. Key-words: Celiac disease. Oxidants. Antioxidants. Oxidative Stress. Saliva.

A criopreservação de sêmen é um processo de grande estresse celular, que impõe aos espermatozóides condições extremamente desfavoráveis à manutenção de sua viabilidade. Diversos estudos propõem que a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio e a perda da capacidade antioxidante do sêmen potencializam os efeitos prejudiciais dessa biotécnica. O objetivo do presente estudo foi avaliar as atividades antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas e a concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), como indicador de lipoperoxidação do sêmen eqüino, durante a criopreservação. Quinze ejaculados de seis garanhões comprovadamente férteis da raça Crioula, foram submetidos a criopreservação, utilizando-se diluente comercial à base de citrato-Hepes, gema de ovo e leite. Foram avaliadas as atividades das enzimas catalase, glutationa peroxidase e superóxido dismutase; o potencial antioxidante total e a concentração de TBARS no sêmen fresco, diluído e congelado. Uma maior atividade das três enzimas estudadas foi observada no sêmen fresco em relação ao sêmen diluído e congelado (p<0,0001), não havendo diferença entre os dois últimos (p>0,05). Não houve diferença na atividade antioxidante não enzimática nas três fases estudadas (p>0,05). Não foi observada nenhuma associação tanto das defesas antioxidantes enzimáticas como das não enzimáticas com a qualidade do sêmen congelado. A queda na motilidade do sêmen congelado pode ser parcialmente explicada pelo aumento da peroxidação dos lipídios do sêmen. / Semen cryopreservation is a stressful procedure which exposes spermatozoa to harmful conditions leading to reduced cell viability. Several studies propose that reactive oxygen species overproduction and decreased antioxidant capacity of semen may increase the damaging effects of the technique. The aim of this work was to evaluate the enzymatic and nonenzymatic antioxidant activity, as well as the concentration of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS) as and indicator of lipid peroxidation on equine semen during cryopreservation. Fifteen ejaculates from six fertile Criollo stallions were cryopreserved using a commercial extender (citrate-Hepes, egg yolk and skim milk). Activity of catalase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase; the total radical-trapping antioxidant potential and TBA-RS content was assessed in native semen, semen diluted in semen extender and thawed semen. All three enzymes showed higher activities in native semen than in diluted and thawed semen (p<0,0001). No difference was observed between diluted and thawed semen (p>0,05). The non-enzymatic defenses did not differ along cryopreservation process (p>0,05). There was not any association between semen quality and both enzymatics and non-enzymatics antioxidant defenses. The decreasing of spermatozoa motility might be partially explained by the increase in semen lipoperoxidation.

A doença renal crônica é acompanhada por um complexo de patologias que podem estar associadas à hiperprodução de radicais livres. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da suplementação de ferro utilizado no tratamento da anemia renal sobre marcadores periféricos de estresse oxidativo de pacientes renais crônicos que realizam hemodiálise. Em adição, avaliar o efeito do uso da vitamina E, como antioxidante no estresse oxidativo desses pacientes. No plasma, avaliaram-se os níveis de carbonilas, nitritos e nitratos, e nos eritrócitos, lipoperoxidação por quimiluminescência (QL) e atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase (SOD), catalase(CAT) e glutationa peroxidase(GPx). Foram conduzidas avaliações em cinco sessões de hemodiálise (HD). Na primeira sessão, avaliaram-se os efeitos da HD, e o paciente não recebeu nenhum tipo de intervenção com ferro ou vitamina E. Na sessão subseqüente, foram avaliados os efeitos do ferro, e os pacientes receberam uma dose de sacarato de hidróxido de ferro III (100mg). Nas demais avaliações, foram observados os efeitos da vitamina E (400mg e 800mg), associados aos do ferro. Os dados obtidos neste trabalho mostram que uma sessão de HD não modifica os níveis de dano oxidativo a lipídios (17144±772cps/mg Hb) e proteínas (11,6±0,66 nmol/mg prot). A atividade da CAT (7,30±0,77 Pmoles/mg prot) e a atividade da GPx (4,8±0,42) não apresentaram variação significativa por até 48h após sessão de HD. A SOD apresentou um aumento significativo imediatamente após HD (Pré HD 2,1±0,44; Pós HD 4,4±0,46 U/mg prot) (p<0,0001) e estes valores retornavam aos observados antes da HD na avaliação realizada 48h após o procedimento (2,9±0,26 U/mg prot). Os níveis de nitratos não apresentaram variação significativa até 48h após HD(1,39±0,26μM), já os níveis de nitritos apresentaram aumento significativo imediatamente após HD (pré HD 0,072±0,02; Pós HD 0,172±0,04 μM)(p=0,0033), retornando aos valores iniciais na avaliação realizada 48h após HD(0,059±0,008μM). A suplementação com 100 mg de hidróxido de ferro III não modificou os níveis de dano oxidativo a lipídios e proteínas observados nesses pacientes. A vitamina E, administrada por via oral, é uma opção eficaz na redução do estresse oxidativo dos pacientes em hemodiálise. Independente da dose utilizada, a vitamina E reduziu significativamente os níveis de oxidação de lipídios (Pré HD Controle 17144±772; Pré HD VitE dose única 800mg 10997±679; Pré HD VitE 400mg/dia 12936±1008; Pré HDVit E 800mg/dia 8239±275 cps/mg Hb)(p<0,0001) e proteínas (Pré HD Controle 11,58±0,66; Pré HD VitE dose única 800mg 10,33±0,68; Pré HD VitE 400mg/dia 10,11±0,50; Pré HD VitE 800mg/dia 5,74±0,41 nmol/mg prot)(p<0,0001), sendo o uso contínuo de 800 mg/dia, por trinta dias, mais efetivo. Portanto, a adição da vitamina E, devido a sua capacidade antioxidante, foi eficiente na redução do dano oxidativo nos doentes renais crônicos em fase final da doença. / Chronic renal failure is accompanied by a complex of pathologies which may be associated to hyperproduction of free radicals. This study aimed to evaluate de effect of iron supplementation used to treat renal anemia on peripherical oxidative stress markers in chronic renal failure patients under hemodialysis. In addition, it also aimed to evaluate the effect of vitamin E as an antioxidant in the oxidative stress of these patients. In the plasma, the levels of carbonyls, nitrite and nitrate were evaluated, and in the erythrocytes, lipoperoxidation for cheminulescence (QL) and antioxidant enzyme activivites, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). Evaluations were carried out on five hemodialysis sessions (HD). The first session evaluated the effects of HD and the patient did not receive any iron or vitamin E intervention. The subsequent session evaluated the effect of iron and the patients received an iron hydroxide saccharate III dosis (100mg). The effects of vitamin E (400mg and 800mg), associated with iron, were evaluated in the following sessions. Data obtained in this research work show that a single HD session does not modify the levels of oxidative damage to lipids (17144±772cps/mg Hb) and proteins (11.6±0.66 nmol/mg prot). CAT activity (7.30±0.77 Pmoles/mg prot) and GPx activity (4.8±0.42) did not show any significant variation until 48h after the HD session. SOD showed a significant increase immediately after HD (Pre HD 2.1±0.44; Pos HD 4.4±0.46 U/mg prot)(p<0,0001) and these values returned to those obtained before HD in the evaluation performed 48h after the procedure (2.9±0.26 U/mg prot) . Nitrate levels did not show any significant variation until 48h after HD (1.39±0.26μM), but nitrite levels showed a significant increase immediately after HD (pre HD 0.072±0.02; pos HD 0.172±0.04μM) (p=0,0033), returning to initial values when evaluated 48h after HD (0.059±0.008μM). Supplementation with 100mg iron hydroxide III did not modify the levels of oxidative damage to lipids and proteins in the patients. Vitamin E orally administered is an efficient option to reduce oxidative stress in patients under HD. Independently of the dosis used, vitamin E significantly reduced lipids oxidative levels (pre HD Control 17144±772; Pre HD VitE single dosis 800mg 10997±679; Pre HD VitE 400mg/day 12936±1008; Pre HD VitE 800mg/day 8239±275 cps/mg Hb)(p<0.0001) and proteins (pre HD Control 11.58±0.66; Pre HD VitE single dosis 800mg 10.33±0.68; Pre HD VitE 400mg/day 10.11±0.50; Pre HD VitE 800mg/day 5.74±0.41 nmol/mg prot)(p<0.0001), the use of 800mg/day continuously for a thirty-day period being more effective. Thus, the addition of vitamin E, due to its antioxidant capacity, was efficient to reduce oxidative stress in end-stage renal disease patients.

O estresse oxidativo tem um papel importante no desenvolvimento de diferentes doenças inflamatórias agudas, mas intervenções que diminuem a geração ou os efeitos das espécies reativas de oxigênio têm papel controvérsio em modelos animais e humanos. Neste trabalho avaliamos os efeitos de uma combinação de antioxidantes (N-acetilcisteína e deferoxamina) em diferentes modelos animais de doenças inflamatórias agudas: sepse induzida por ligação cecal e perfuração (CLP), insuficiência hepática aguda e lesão pulmonar aguda. No modelo de CLP os ratos tratados com antioxidantes apresentaram uma significativa redução na atividade de mieloperoxidase (como marcador de infiltração neutrofílica) e uma menor quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico em diferentes órgãos envolvidos na resposta à sepse.A produção mitocondrial de superóxido foi significativamente diminuída pelo tratamento antixodante. Além disto o tratamento melhora o equilíbrio entre superóxido dismutase e catalase e melhora a sobrevida dos animais submetidos a CLP. No modelo de insuficiência hepática aguda o tratamento com antioxidantes significativamente diminui o dano oxidativo hepático e no sistema nervoso central, atenua marcadores de insuficiência hepática e melhora a sobrevida dos animais. No modelo de lesão pulmonar aguda o tratamento com N-acetilcisteína e deferoxamina diminui o conteúdo de proteínas do lavado bronco-alveolar, assim como o influxo de células inflamatórias, marcadores de dano oxidativo e citocinas inflamatórias.Em conclusão, nossos dados demonstram pela primeira vez que o tratamento com N-acetilcisteína e deferoxamina é superior ao uso isolado destes antioxidantes em diferentes modelos animais de doenças inflamatórias agudas. Este efeitos é parcialmentesecundário a uma diminuição do estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e resposta inflamatória no rato. / Oxidative stress plays an important role in the development of acute inflammatory diseases, but interventions that reduce the generation or the effects of reactive oxygen species exert controversial effects in animal models and in humans. Here we have evaluated the effects of a combination of antioxidants (N-acetylcysteine plus deferoxamine) in a murine model of polymicrobial sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), in a murine model of acute hepatic failure and in a murine model of acute lung injury. In the CLP model of sepsis rats treated with antioxidants had significantly lower myeloperoxidase activity (as an index of neutrophil infiltration) and thiobarbituric acid reactive species formation in several organs involved in septic response. Mitochondrial superoxide production was significantly reduced by antioxidant treatment. Furthermore, antioxidants significantly improved the balance between catalase and superoxide dismutase activities, and improved survival to 66%. In the acute hepatic failure model, N-acetylcysteine plus deferoxamine treatment significantly attenuated hepatic and central nervous system oxidative damage, attenuated markers of hepatic failure and improves survival to 80%. In the acute lung injury model, N-acetylcysteine plus deferoxamine decreased bronchoalveolar lavage fluid protein, inflammatory cells, oxidative damage variables, and proinflammatory cytokines. In conclusion, our data provide the first experimental demonstration that N-acetylcysteine plus deferoxamine is superior to each antioxidant used alone in different animal models of acute inflammatory diseases. This effect is partially secondary to a decrease in oxidative stress, mitochondrial dysfunction and inflammatory response in the rat.

O antioxidante resveratrol, uma fitoalexina encontrada, principalmente em uvas e também em quantidades significativas em vários tipos de vinho tinto, é um promissor produto natural, com atividades antitumoral, cardioprotetora e neuroprotetora. O objetivo do presente estudo foi investigar em células de glioma C6 o efeito do resveratrol sobre proliferação celular e alguns parâmetros específicos relacionados a astrócitos (captação de glutamato, glutamina sintetase e secreção de S100B), comumente associados com o papel protetor dessas células. Além disso, foi investigado o efeito genoprotetor do resveratrol em condições de estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio (H2O2) em células C6. A proliferação celular foi significativamente reduzida após tratamento com 100 e 250 μM de resveratrol. Uma rápida incubação com resveratrol (1 h) induziu um aumento linear na captação de glutamato e na atividade da glutamina sintetase. O dano ao DNA foi medido pelo ensaio Cometa. Para investigar os efeitos do resveratrol sobre o dano ao DNA induzido por H2O2 utilizou-se dois modelos de indução de estresse oxidativo. A mudança de parâmetros gliais pode contribuir para o papel protetor de astrócitos em condições de injúria cerebral, reforçando o uso deste composto no arsenal terapêutico contra doenças neurodegenerativas e desordens isquêmicas. Resveratrol também foi capaz de prevenir o dano oxidativo ao DNA celular, provavelmente, devido a suas propriedades antioxidantes, isto pode ser importante para proteger o DNA em doenças relacionadas com estresse oxidativo. / The antioxidant resveratrol, a phytoalexin found mainly in grapes and also substantial amounts in several types of red wine, is a promising natural product with anticancer, cardio-protective and neuroprotective activities. The objective of the present study was to investigate in C6 glioma cells, the effect of resveratrol on cell proliferation, cell death and some specific parameters of astrocyte activity (glutamate uptake, glutamine synthetase and secretion of S100B) commonly associated with the protective role of these cells. Furthermore, it was investigated the genoprotective effects of resveratrol under conditions of oxidative stress induced by hydrogen peroxide (H2O2) in C6 cells. Cell proliferation was significantly decreased following treatment with 100 and 250 μM resveratrol. Short-term (1 h) of resveratrol exposure induced a linear increase in glutamate uptake and in glutamine synthetase activity. DNA damage was assessed by the comet assay. For investigate the effects of resveratrol against oxidative stress induced by H2O2 on DNA damage, two models of oxidative stress induction were used. Changes in glial activities can contribute to the protective role of astrocytes in brain injury conditions, reinforcing the use of this compound in the therapeutic arsenal against neurodegenerative diseases and ischemic disorders. Resveratrol was able to prevent oxidative damage to cellular DNA, probably, due to its antioxidant properties, it may be important in diseases for protecting against DNA damage through oxidative stress.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

As anormalidades hemostáticas são comumente encontradas em pacientes com doença renal. Ambos, sangramento e estados pró-trombóticos, podem ser observados em pacientes com doença renal crônica (DRC). O principal papel das plaquetas é assegurar a hemostasia primária, a manutenção da integridade do vaso e cessar o sangramento após uma injúria. As plaquetas também estão envolvidas na trombose arterial aguda, na inflamação, na aterosclerose, e na angiogênese. Quando as plaquetas são ativadas elas se aderem à matrix endotelial onde ocorre a ativação e a liberação de agonistas secundários tais como o ATP, ADP, tromboxano A2, serotonina e outras substâncias biologicamente ativas. O ADP possui um papel crucial na ativação plaquetária, atuando em receptores P2. Está liberação pode ser responsável pela ativação, recrutamento e indução da agregação adicional de plaquetas no microambiente de lesão no vaso. Assim, o metabolismo do ADP no sangue é um importante mecanismo de regulação da função plaquetária. A NTPDase (ecto-CD39) hidrolisa o ATP e ADP extracelulares formando monofosfato de adenosina (AMP), que é subseqüentemente convertido para adenosina pela ação da enzima 5’- nucleotidase (CD73). O objetivo deste estudo foi explorar a relação entre a disfunção plaquetária na uremia com as anormalidades hemostáticas e a severidade na doença renal em pacientes com insuficiência renal crônica sob tratamento conservador ND (pacientes que não realizam hemodiálise) e HD (pacientes que realizam hemodiálise) comparando com indivíduos normais de mesma faixa etária. Os resultados demonstraram um aumento na atividade da NTPDase em plaquetas de pacientes HD (52,88%) com o substrato ATP. A hidrólise do ADP apresentou-se diminuída (33,68% e 39,75%) em HD e ND pacientes, respectivamente. Além disso, a atividade da 5’-nucleotidase mostrou-se elevada em HD (160%) e ND (81,49%) quando comparado com o grupo controle. Correlações significativas foram encontradas entre a hidrólise do ATP, ADP e AMP e os níveis plasmáticos de creatinina e uréia. Foram realizadas comparações entre o tempo de hemodiálise a que os pacientes estavam submetido e a alterações na hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Encontrou-se aumento na atividade da NTPDase com substrato ATP, diminuição com o substrato ADP e aumento da atividade da 5´-nucleotídase entre 49 e 72 meses em paciente HD. Os resultados sugeriram que as alterações na hidrólise dos nucleotídeos em plaquetas podem contribuir para anormalidades hemostáticas em pacientes com DRC, podendo realçar o risco de complicações tromboembólicas e aterosclerose acelerada em pacientes com DRC. Podemos inferir que tanto a uremia como a hemodiálise têm influência nas desordens hemostáticas apresentadas nesses pacientes, e descritas nesse trabalho. Os conhecimentos sobre estresse oxidativo e seu papel como importante cofator contribuindo para disfunção endotelial, inflamação, aterosclerose e glomeruloesclerose têm substancialmente aumentado nos últimos anos. A doença cardiovascular (DCV) é a maior causa de morte em pacientes com insuficiência renal, sendo que cerca de 50% de todas as mortes em pacientes com terapia substitutiva e que receberam transplante renal estão relacionadas a DCV. A mortalidade por DCV em pacientes com insuficiência renal é aproximadamente 9% por ano, o que chega a ser 30 vezes maior do que da população em geral. O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e os mecanismos de defesa antioxidante. Nos últimos anos, foi estudado o efeito biológico das ROS, e, em estudos clínicos e experimentais recentes, foram notados sinais de estresse oxidativo em pacientes renais. No entanto, a influência da uremia e do procedimento de hemodiálise não foi elucidada. Nesse estudo, avaliou-se a influência da uremia e da hemodiálise sobre o estresse oxidativo e a atividade da enzima delta aminolevulinato deidratase (δ- ALA-D) em pacientes com DRC em HD e ND comparando com o grupo controle. Observou-se um aumento na peroxidação lipídica em soro de pacientes HD e ND. O nível de TBARS em hemácias foi elevado somente em pacientes HD. A atividade da catalase mostrou-se aumentada (83,56% e 61,23%) em pacientes HD e ND, respectivamente. Neste estudo, demonstrou-se a inibição da atividade da δ- ALA-D em pacientes HD e ND quando comparado ao grupo controle. Observouse, uma correlação positiva entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT com a quantidade de hemoglobina (r= 0.55, r= 0.42), respectivamente, e também observou-se uma correlação entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT e o nível de TBARS em eritrócitos (r= - 0.54, r= -0.51), respectivamente. Além disso, uma correlação negativa foi encontrada entre δ-ALA-D ou δ-ALA-D/DTT e a atividade da enzima CAT (r= - 0.63, r= -0.5), respectivamente. Nesse trabalho, demonstrou-se que a uréia pode ser o principal fator na geração de estresse oxidativo em pacientes com DRC. Além disso, a inibição da atividade d-ALA-D foi positivamente correlacionada com níveis de hemoglobina, demonstrando o papel fundamental da enzima d-ALA-D na biossíntese do heme e no desenvolvimento de anemia em pacientes com CRF. Estudos descreveram que o acúmulo de d-ALA pode levar ao aumento do estresse oxidativo, e a diminuição da eficiência nos mecanismos de defesa celular contra as espécies reativas de oxigênio pode levar a peroxidação lipídica e também a inibição da atividade da d- ALA-D, com concomitante alteração na síntese do heme, formando assim um ciclo de destruição. Esse estudo demonstrou várias alterações em pacientes com insuficiência renal crônica, sendo que muitas delas ajudam a explicar a tendência a desenvolver doença cardiovascular precoce nesses pacientes. / Hemostatic abnormalities are commonly found in patients with renal failure. Both a bleeding diathesis and the uremic prothrombotic state may be caused by renal disease. The main role of blood platelets is to ensure primary hemostasis, which is the maintenance of vessel integrity and cessation of bleeding upon injury. While playing a major part in acute arterial thrombosis, platelets are also involved in inflammation, atherosclerosis, and angiogenesis. When platelets are undergo activation first adhere to the subendothelial matrix where they become activated and release secondary agonists such as ATP, ADP, thromboxane A2, serotonin and several other biologically active substances. ADP and ATP play a crucial role in platelet activation, acting through P2 receptors. This release may be responsible for the activation, recruitment, and induction of aggregation of additional platelets in the microenvironment. Thus, the metabolism of ADP in the blood is important for the regulation of platelet functions. NTPDase (ecto-CD39) is that hydrolyzes extracellular adenosine tri- and diphosphate (ATP, ADP) to adenosine monophosphate (AMP), which is subsequently converted into adenosine by 5’- nucleotidase (CD73). The objectives of this study were to explore the relations between platelet dysfunction in uremia with hemostatic abnormalities and the severity of kidney disease in patients with CRF under conservative treatment (nondialysed - ND) and hemodialysis (HD) treatment companing to heathy subjects with the same age. The activities of the enzymes NTPDase and 5´-nucleotidase were analyzed in platelets from patients with chronic renal failure (CRF), both undergoing hemodialysis treatment (HD) and not undergoing hemodialysis (ND), as well as from a control group. The results showed an increase in platelet NTPDase activity in CRF patients on HD treatment (52.88%) with ATP as substrate. ADP hydrolysis was decreased (33.68% and 39.75%) in HD and ND patients, respectively. In addition, 5’-nucleotidase activity was elevated in the HD (160%) and ND (81.49%) groups when compared to the control group. Significant correlation was found among ATP, ADP and AMP hydrolysis and plasma creatinine and urea levels. Patients were compared statistically according the time of hemodialysis treatment. We found enhanced NTPDase with ATP substrate and decrease with ADP substrate, and increase in 5’-nucleotidase activity between 49 and 72 months on HD patients. Our results suggest the existence of alterations in nucleotide hydrolysis in platelets, which might contribute to abnormal homeostasis in renal failure patients, thus and the enhanced risk of thromboembolic complication and accelerated atherosclerosis in patients with renal failure. Our knowledge about stimuli and sources of oxidative stress, and about its role as an important cofactor contributing to endothelial dysfunction, inflammation, atherosclerosis and glomerulosclerosis has substantially increase over the last years. Cardiovascular disease (CVD) is the major cause of death in patients with renal insufficiency, accounting for 50% of all deaths in renal replacement therapy patients and in recipients of renal transplants. Mortality from CVD in patients with renal insufficiency is approximately 9% per year, which is about 30 times the risk in the general population. Oxidative stress defines an imbalance between formation of reactive oxygen species (ROS) and antioxidative defense mechanisms. In view of the profound biological effects of ROS, in recent years numerous clinical and experimental studies focused on detection of signs of oxidative stress in renal patients. However, the influence of uremia and the hemodialysis procedure, respectively, has not been elucidated. Oxidative stress has been implicated in long-term complications including anemia, amyloidosis, accelerated atherosclerosis, and malnutrition. In this study, we studied the influence of uremia and hemodialysis on oxidative stress and δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) activity in patients with CRF on HD treatment, in patients ND and in a control group. An increased lipid peroxidation was observed in the serum of HD and ND patients, as measured by TBARS serum levels. However, erythrocytic TBARS was only elevated in HD patients. The activity of catalase was increased (83.56%, 61.23%) in HD and ND groups, respectively. This study also showed an inhibition Blood δ--ALA-D activity of HD and ND patients was significantly lower when compared with the control group. A positive correlation was also observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT with hemoglobin (r=0.55, r=0.42), respectively, and a negative correlated were observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT with TBARS level in erythrocytes (r= - 0.54, r=-0.51), respectively. Furthermore, a negative correlation was found between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT and CAT activity (r= -0.63, r= -0.5), respectively. In this study, it was shown that uremia itself could be the principal factor in generating oxidative stress in CRF patients. Furthermore, the inhibition of d-ALA-D activity was positively correlated with hemoglobin levels, showing the fundamental role of this enzyme in heme biosynthesis and the development of anemia in patients with CRF. Studies reported that the accumulation of d-ALA may lead to increased oxidative stress. In addition an existence of a decreased efficiency in the mechanisms of cellular defense against reactive oxygen species can lead to lipid peroxidation and inhibition of the activity of d-ALA-D with concomitant change in the synthesis of heme, thus forming a cycle of destruction. This study showed several changes in patients with chronic renal failure, which may to explain the tendency to develop cardiovascular disease in these patients early.

ERO são produzidas continuamente por organismos aeróbicos. Em situações de estresse, a produção de ERO é aumentada, podendo causar a morte celular. Para manter uma concentração ideal de ERO dentro da célula, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante para proteção das membranas celulares e organelas contra os efeitos danosos causados pela ação dessas ERO sobre os tecidos vegetais. A ascorbato peroxidase (APx) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de ERO nas plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água, usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APx. As diferentes isoformas são classificadas de acordo com a localização subcelular em citosólicas (APx1 e APx2), peroxissomais (APx3 e APx4), mitocondriais (APx5 e APx6) e cloroplastídicas (APx7 e APx8). O desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente os genes de APx em arroz (Oryza sativa) com o intuito de identificar a função dos diferentes membros dessa família no controle dos níveis de ERO na planta. Foi analisado o padrão de expressão dos genes que codificam as diferentes isoformas de APx em arroz cultivado sob condições de estresses abióticos tais como o tratamento com concentrações tóxicas de alumínio, frio, seca e exposição ao peróxido de hidrogênio exógeno. Utilizando a estratégia de silenciamento por RNA de interferência (RNAi), foram produzidas construções para o silenciamento simultâneo dos genes OsAPx5 e OsAPx6 e, também, para os genes OsAPx7 e OsAPx8. Adicionalmente, foram ainda geradas construções gênicas para o silenciamento individual dos genes OsAPx7 e OsAPx8. Linhagens de arroz contendo construções RNAi para o silenciamento individual de OsAPx7 e OsAPx8 apresentaram redução de cerca de 90% na expressão relativa destes genes quando comparadas com plantas nãotransformadas. Os oito membros da família gênica APx em arroz mostraram padrão de expressão diferencial frente às condições de estresse testadas, indicando um complexo modo de regulação desses genes. / Aerobic organisms continuously produce Reactive Oxygen Species (ROS). Under stress conditions ROS production is increased and can lead to cellular death. To keep the ideal concentration of ROS inside the cells, plants developed a complex antioxidant system to protect cellular membranes and organelles against harmful effects produced by the action of these ROS. Ascorbate peroxidase (APx) is a major enzyme of the ROS detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice (Oryza sativa), eight genes encode APx. The different isoforms are classified according to their subcellular localization in cytosolic (APx1 and APx2), peroxisomal (APx3 and APx4), mitochondrial (APx5 and APx6) or chloroplastidic (APx7 and APx8). The general aim when developing the present work was to functionally characterize the APx genes in rice in order to identify the function of different members of this family in the control of ROS levels in the plant cell. The expression pattern of genes encoding different isoforms of APx in rice was analyzed when plants were grown under abiotic stress conditions such as under the treatment with toxic concentrations of aluminum, cold, drought and exposition to exogenous hydrogen peroxide. Using the strategy of gene silencing by interference RNA (RNAi), were produced RNAi constructs to simultaneously silence the OsAPx5 and OsAPx6 genes, and also the OsAPx7 and OsAPx8 genes. In addition, it was produced constructs to individually silence the OsAPx7 and OsAPx8 genes. Rice lines carrying RNAi to silence OsAPx7 and OsAPx8 individually presented reduction of gene expression of about 90% when compared to the expression assayed in non-transformed plants. The eight genes coding APx presented different expression patterns in response to the stress conditions tested, indicating that these genes are under a complex mode of regulation.