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Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.

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Gegenstand der Arbeit sind Zusammenhänge zwischen physikochemischen Eigenschaften und Funktionen der Exine bei Ausbreitung, Bestäubung und Befruchtung. Dabei bewährte sich der Einsatz der 3-kammrigen Sporopolleninkapseln (Zentralkapsel und Sacci) in der Permeationschromatographie. Sowohl kinetisch bedingte chromatographische Dispersion kleiner Moleküle als auch Konzentrationsänderungen von Zuckern und Dextranmolekülen im Medium wurden zur Bestimmung von Permeabilitätskoeffizienten der Nexine genutzt. Die Wasserabsorptionskapazität von Exinefragmenten und die hydraulische Leitfähigkeit der Nexine wurden anhand von Konzentrationsänderungen ausgeschlossener Dextranmoleküle ermittelt. Das Tectum der saccalen Sexine ist eine Mikrofiltermembran mit scharfer Trenngrenze im Submikrometerbereich; daher werden an den Sacci nur Hydrokolloide mit Stokes''schen Radius über 100 nm (z.B. aus nativem Dextran) ausgeschlossen. Die Nexine ist eine nicht-ideale Umkehrosmose-Membran, die in Zucker- und Salzlösungen hohe Reflexionskoeffizienten zeigt; zusätzlich besitzt sie wenige große Poren, die den Austausch von Zuckern und selbst kleinen Polymermolekülen ermöglichen. Die hydraulische Leitfähigkeit der Nexine liegt im Größenbereich derjenigen von Plasmamembranen (0,39-0,48 µm s-1 MPa-1); die Ergebnisse zeigen, dass die Exine weder die Nährstoffaufnahme des Sporoplasten aus der lokulären Flüssigkeit noch dessen rasche Rehydratation in der Mikropyle behindert. Die Einfaltungen der distalen Nexine (oberhalb der Sacci) und die Omega-Faltung der Exine zwischen den Sacci (Leptom) bieten beim Quellvorgang Schutz vor zu schneller Flächenausdehnung der Plasmamembran. Der Corpus kann mit konzentrierten Elektrolytlösungen beladen werden. Beim anschließenden osmotischen Schwellen in Wasser reißt die Exine, und der Sporoplast wird mit anhaftender Intine ausgeschleudert. Wasser und andere polare Flüssigkeiten adhärieren stärker als hydrophobe Flüssigkeiten an Sporopollenin. Die Sporopolleninmatrix weist eine hohe Feststoffdichte auf, ist wenig quellfähig (0,18 mL g-1 TM) und deformationsstabil. Dies ermöglicht die Pulverbildung beim Trocknen. / Subject of this thesis are relationships between physicochemical properties and functions of the exine concerning propagation, pollination and fecundation. Here the application of the 3-chambered sporopollenin-microcapsules (central capsule and sacci) in permeation chromatography proved of value. Both the kinetically dependent dispersion of small molecules and changes in concentration of sugars and dextran molecules in the medium were analysed to determine permeability coefficients of the nexine. The water absorption capacity of exine fragments and the hydraulic conductance of the nexine were calculated by means of changes in concentrations of excluded dextran molecules. The tectum of the saccal sexine is a microfiltration membrane with a sharp cut off in the submicrometer range; thus hydrocolloids with Stokes´radii over 100 nm (e.g. from native dextran) are excluded from the sacci. The nexine is a non-ideal reverse osmosis membrane having high reflexion coefficients in sugar and salt solutions; in addition few large pores allow the exchange of sugars and even of small polymers. The hydraulic conductance of the nexine is in the range typically for plasmamembranes (0.39-0.48 µm s-1 MPa-1); the results indicate that the exine does neither obstruct the uptake of nutrients by the sporoplast from the locular fluid nor hinder the rapid rehydration in the micropyle. When rehydrating, the distal foldings of the nexine (above the sacci) and the omega-like folding of the exine between the sacci (leptom), provide protection for the plasmamembrane when its surface area has to increase too rapidly. The corpus can be loaded with a concentrated electrolyte solution. When subsequently transferred into water the exine rupture and the sporoplast along with the intact intine is ejected. Water and other polar liquids adhere stronger to sporopollenin than hydrophobic ones. The matrix of sporopollenin show a high density in its solid content, water absorption capacity is low (0.18 mL g-1 DM) and it is resistant to deformation. This enable the formation of powder while dehydrating.