La exposición a estímulos estresantes de tipo emocional induce activación neuronal en muchas regiones del SNC que cursa en paralelo con una estimulación del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA). La activación neuronal suele valorarse mediante la inducción de genes de expre-sión temprana como c-fos, mientas que la activación del eje HPA se basa en la expresión del factor liberador de corticotropina (CRF) en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) y en la liberación de hormonas como la ACTH y los glucocorticoides. Numerosos estudios sugieren que la expresión de c-fos y CRF alcanza un máximo alrededor de los 15-30 min de iniciada la exposición al estrés, para disminuir posteriormente a pesar de la persistencia del estímulo estre-sante. Esta disminución de la respuesta podría obedecer a cambios en las señales estimuladoras y/o inhibidoras que llegan a la neurona como consecuencia de la exposición prolongada al mis-mo estímulo estresante, o bien a mecanismos de represión intracelular. Razonamos que si la hipótesis de los cambios en las señales es correcta, la expresión de dichos genes se restablecería en gran medida en respuesta a un nuevo estímulo estresante, en tanto que si la segunda hipótesis es la válida, la expresión debería estar bloqueada. Utilizando la rata como modelo, hemos estudiado en un primer experimento mediante hibrida-ción in situ (ISH), los cambios en la expresión de c-fos y CRF, y los cambios en los niveles plas-máticos de ACTH y corticosterona tras la exposición prolongada (unas 4 h) a una inmoviliza-ción en plancha (IMO) y cómo esta exposición a la IMO afecta a la respuesta a un nuevo estímu-lo estresante (nado forzado). Los resultados de expresión de c-fos indicaron que en la corteza prefrontal medial (mPFC), el septum lateral ventral (LSv) y la amígdala medial (MeA) la res-puesta al nado tras la IMO prolongada es capaz de restablecerse en gran medida, dando validez a la hipótesis de una reducción de las señales que llegan a las neuronas. Sin embargo, en el PVN la expresión de c-fos en respuesta al nado tras la IMO prolongada se encuentra en su mayor parte bloqueada, sugiriendo un bloqueo intracelular. En consonancia con los resultados de expresión de c-fos en el PVN, tanto la expresión de CRF como la secreción de ACTH en respuesta al nado se encuentran totalmente bloqueadas tras la IMO prolongada. Una interpretación correcta de estos primeros resultados, precisa conocer si las poblaciones neuronales activadas durante la IMO prolongada coinciden o no con las que responden al nado tras esta IMO. Al objetivo de identificar estas neuronas hemos realizado un nuevo experimento similar al anterior pero incluyendo un grupo de animales que fue liberado de la IMO prolonga-da y re-expuesto a una nueva IMO. La finalidad de este grupo era diferenciar la activación debi-da exclusivamente al nado de la que pudiera producirse por otros procesos como la simple ma-nipulación del animal o la propia liberación de la IMO. Para identificar las poblaciones neuro-nales que responden a la IMO prolongada y al nado, hemos realizado un doble marcaje de la proteína c-Fos y el mRNA que codifica para esta proteína mediante inmunofluorescencia e ISH fluorescente (IF-FISH). Basándonos en la dinámica de ambos marcadores, las neuronas que responden a la IMO prolongada mostrarían fundamentalmente proteína y poco o nulo mRNA, mientras que las que responden al nado aplicado tras esta IMO mostrarían fundamentalmente mRNA y nula proteína. Tras este análisis hemos observado que en regiones como el mPFC, el LSV y la MeA, la exposición al nado tras la IMO prolongada provocó la activación de nuevas neuronas sugiriendo cierta especificidad en la respuesta a ambos estímulos estresantes. Sin em-bargo, en el PVN con la exposición al nado tras la IMO prolongada no provocó activación de nuevas neuronas, confirmando la existencia de una sola población neuronal que responde indis- tintamente frente a estímulos estresantes de distinta naturaleza que es bloqueada tras una esti-mulación prolongada. Una gran parte de la activación neuronal observada en términos de expresión de c-fos en res-puesta a los distintos estímulos estresantes podría deberse a procesos de activación generalizada o de arousal que enmascararía aquellas neuronas que son realmente importantes en la respuesta al estrés. En un último experimento hemos pretendido disminuir la aportación del arousal, ad-ministrando a nivel sistémico DSP-4, una neurotoxina altamente selectiva para las terminales noradrenérgicas provenientes del LC. Una semana después de la administración de DSP-4, ex-pusimos a los animales a estímulos estresantes de diferente intensidad (ambiente nuevo, olor al depredador e IMO) para posteriormente analizar la expresión de c-fos mediante FISH en el mPFC, el LSv, la MeA y el PVN. El alcance de la lesión sobre las terminales noradrenérgicas del LC se valoró mediante inmunoflorescencia de la dopamina beta-hidroxilasa (DβH). En concor-dancia con datos de la literatura, sólo en el mPFC y la MeA se pudo apreciar una disminución en las terminales noradrenérgicas. La lesión con el DSP-4 no tuvo un impacto sobre la expresión de c-fos en respuesta a los distintos estímulos estresantes, salvo en la respuesta del LSv a la IMO donde se observó una disminución. En conjunto, los resultados sugieren que en la reducción de la expresión de c-fos observada tras la exposición prolongada a un estímulo emocional pueden intervenir tanto la familiarización con el estímulo y la consiguiente reducción de las señales estimuladoras como la represión in-tracelular de la expresión del gen. La contribución de cada uno de los mecanismos es marcada-mente dependiente del área estudiada. Por otro lado, parecen existir poblaciones de neuronas que responden específicamente a la IMO y al nado, aunque muchas de ellas pueden ser comunes a ambos. En la respuesta del eje HPA podrían añadirse bloqueos adicionales que probablemente contribuyen a reducir el posible impacto negativo de una liberación excesiva de glucocorticoi-des. El escaso impacto de la administración de DSP-4 podría explicarse por la existencia de me-canismos compensatorios y por lo tanto sería necesario valorar otras alternativas para disminuir la aportación del arousal a la respuesta de estrés. / Exposition to emotional stressful stimuli leads to neuronal activation of several regions of the Central Nervous System (CNS) that converge into the stimulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA). This neuronal activation can be measured by the induction of early expression genes (IEG) such as c-fos, while the activation of the HPA axis can be measured by the expression of the corticotrophin-releasing-factor (CRF) in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) and also by the release of hormones such as ACTH and glucocorti-coids. There are several studies that suggest the expression of c-fos and CRF to reach its maxi-mum around 15-30 min after initiation of the exposition to stress. A decline in these parameters is observed even with the persistence of the stressful stimuli. This decline could be due to chang-es in the stimulatory/inhibitory signals arriving to the neurons as a consequence of a prolonged exposition to the same stressful stimuli, or it could also be due to intracellular repression mech-anisms. If the former hypothesis is correct, the expression of such genes would be mostly reestablished in response to new stressful stimuli, however, if the second hypothesis is valid, the expression should be blocked. In a first experiment we studied changes in the expression of c-fos and CRF in the rat CNS and changes in plasma levels of ACTH and corticosterone after a prolonged exposure (4 h approx.) to immobilization (IMO). We then assessed how this exposure could affect the response to a new stressor (forced swim). The results of expression of c-fos indicated that in the medial pre-frontal cortex (mPFC), the ventral lateral septum (LSv) and the medial amygdala (MeA) the response after prolonged IMO can be greatly restored, validating the hypothesis of a reduction of signals arriving to the neurons. However, in the PVN, the c-fos expression in response to forced swimming after prolonged IMO is largely blocked, suggesting an intracellular repression. Corroborating the results of c-fos expression in the PVN, the expression of CRF and ACTH secretion in response to forced swim are completely blocked after prolonged IMO. A correct interpretation of these first results requires knowing whether the neuronal popula-tions activated during prolonged IMO are the same as those responding to the forced swim ap-plied after the prolonged IMO. In order to identify these neurons we performed a new experi-ment which was similar to the previous one but including a new group of animals that was re-exposed to a second IMO instead of the forced swim. The purpose of this group was to differen-tiate activation due exclusively to forced swim from the one that could be produced by other processes such as the simple manipulation of the animal or the release of IMO. To identify the neuronal populations that respond to prolonged IMO and forced swim, we have performed a double labeling of c-Fos protein and its mRNA. Given the dynamics of both markers, the neu-rons which respond to the prolonged IMO would show essentially protein and little or no mRNA, while those responding to forced swim applied after this IMO would show essentially mRNA and no protein. After this analysis we found that in regions such as the mPFC, LSV and MeA, exposure to forced swim after prolonged IMO triggered activation of new neurons sug-gesting some specificity in the response to both stressors. However, in the PVN exposure to forced swim after the prolonged IMO did not cause activation of new neurons, confirming the existence of a single neuronal population that responds similarly to different stressful stimuli, by which activation is inhibited after prolonged stimulation. A great part of the neuronal activation observed in terms of expression of c-fos in response to various stressful stimuli could be due to generalized activation or arousal processes. This activa- tion could mask those neurons that are really important in the stress response. In a final experi-ment we tried to decrease the contribution of arousal administrating DSP-4, a neurotoxin that is highly selective for LC noradrenergic terminals. One week after the administration of DSP-4, we exposed the animals to stressful stimuli differing in intensity (new enviroment, predator odor and IMO) and then we analyzed the expression of c-fos in the mPFC, LSV, MeA and PVN . The extent of the lesion on the noradrenergic terminals of LC was assessed by immunofluorescence of dopamine beta-hydroxylase (DβH). We observed only a decrease in noradrenergic terminals in the mPFC and MeA supporting data found in the bibliography. The DSP-4 lesion had no effect on the expression of c-fos in response to various stressors, except in the LSV in animals exposed to IMO where a decrease was observed. The results of this work suggest that the reduction of c-fos expression observed after prolonged exposure to an emotional stimulus may involve both familiarization with the stimulus, with the consequent reduction of stimulatory signals, as well as an intracellular repression of this gene. The contribution of each mechanism seems to be markedly dependent of each region con-cerned. On the other hand, it seems to exist neuronal populations that respond specifically to IMO and forced swim, although many of them may be common to both. The HPA axis response could probably include additional blockages that may help to reduce the negative impact of an excessive glucocorticoid release. The limited impact of the DSP-4 administration could be ex-plained by the existence of compensatory mechanisms, therefore other alternatives to reduce the contribution of arousal to stress response should be considered.

Las metalocarboxipeptidasas (MCP) de la familia M14 catalizan la hidrólisis de aminoácidos del C-terminal de proteínas y péptidos. Nuestro grupo describió la subfamilia M14D o carboxipeptidasas citosólicas (CCP) a partir de búsquedas genómicas de secuencias aminoacídicas similares a CCP1 o Nna1 (Nervous system nuclear protein induced by axotomy, por sus siglas en Inglés). Se identificaron CCPs en cerca de 100 bacterias Gram negativas, generalmente con una única copia del gen. Las CCPs bacterianas tiene una arquitectura de dominios más simple que consiste en el dominio amino terminal (N-dominio) y el dominio carboxipeptidasa (dominio CP). En humanos hay seis genes parálogos (CCP1-CCP6) y además de los dominios N- and CP- contienen extensiones adicionales en ambos extremos. Estas proteínas son muy complejas y difíciles de manipular experimentalmente. La principal función de las CCPs de Eucariotas parece ser el procesamiento de modificaciones postraduccionales en el C-terminal de las tubulinas como las cadenas laterales de ácidos poliglutámicos o el ácido glutámico codificado en la cadena principal. La CCP1 humana además procesa los C-terminales ácidos de otras proteínas. Estos segmentos participan en interacciones moleculares y por tanto la CCP1 podría regular estas interacciones. Estudios filogenéticos y de localización intracelular sugieren que las funciones de las CCPs de Eucariotas pudieran estar relacionadas con los cilios y los cuerpos basales aunque no se conocen bien muchos de los mecanismos moleculares involucrados. Las CCPs de Procariotas han sido muy poco caracterizadas desde el punto de vista bioquímico y funcional. El presente trabajo ha aportado más información de las características estructurales y funcionales de la familia M14D, utilizando como modelos la CCP de Pseudomonas aeruginosa (PaCCP) y la CCP6 humana (hCCP6). Se determinó la estructura cristalográfica de PaCCP que tiene un novedoso dominio N-terminal tipo β-sandwich y un dominio CP clásico tipo α/β-hidrolasa. La mayoría de los residuos del centro activo están bien posicionados, sin embargo no se detectó actividad enzimática utilizando diferentes sustratos. Esto sugiere que PaCCP pudiera estar en una forma inactiva o que la activación requiere la presencia de su sustrato(s) específico(s) y/o un regulador alostérico. La co-cristalización de PaCCP con inhibidores de MCPs sugiere que la enzima podría necesitar un reordenamiento estructural para ser activa. La estructura de PaCCP permitió modelar las CCPs de mamíferos que conservan el plegamiento global de los dominios N- y CP- y la posición de los residuos claves. Se caracterizó una cepa de P. aeruginosa deficiente en PaCCP (Δpaccp) para explorar posibles mecanismos funcionales. La producción de PaCCP fue dependiente de la densidad celular sugiriendo una relación con el “Quorum Sensing” (QS). La cepa Δpaccp mostró mayor actividad proteolítica extracelular y movilidad “swarming”, menor formación de biofilm y una pérdida total de la movilidad “twitching” (TM). Demostramos que la ausencia de TM se debió a bajos niveles intracelulares de PilA, la proteína estructural del pili. Se propone que PaCCP pudiera regular la expresión de pilA y posiblemente otros genes en la bacteria. La cepa Δpaccp resultó ser menos virulenta en el modelo “slow killing” de C. elegans, lo que apunta a un papel de PaCCP en la patogénesis de P. aeruginosa. hCCP6 mostró la misma actividad deglutamilasa de las tubulinas que el ortólogo en ratón. La proteína actuó específicamente sobre la α-tubulina lo que podría representar un mecanismo de regulación de las CCPs. hCCP6 hidrolizó los ácidos glutámicos en el C-terminal de la proteína TRAFD1, un sustrato de CCP1, aunque habría que determinar si es un sustrato natural. La actividad de hCCP6 es inhibida por agentes quelantes y no por inhibidores proteicos de CP. Estudios de interactómica permitieron identificar proteínas que potencialmente interactúan con PaCCP y hCCP6. Algunas se proponen para una futura validación lo que contribuirá a la mejor comprensión de las relaciones funcionales de estas enzimas. / Metallocarboxypeptidases (MCP) of M14 family catalyze the hydrolysis of C-terminal amino acid residues in protein and peptide substrates. Recently, our group described the M14D subfamily or cytosolic carboxypeptidases (CCPs) after genomic searching of aminoacidic sequences similar to CCP1 or Nna1 (nervous system nuclear protein induced by axotomy). CCPs were identified in around 100 Gram-negative bacteria that usually contain one gene copy. The domains architecture of bacterial CCPs is simpler, consisting in the amino-terminal (N-domain) and the carboxypeptidase domain (CP domain) both conserved in the subfamily. In humans there are six paralogous genes (CCP1-CCP6) and, besides the N- and CP-domains, they contain additional extensions at the N- and/or the C-terminus. At the protein level, they are quite complex, labile and difficult to express and handle experimentally. It has been proposed a primary function for eukaryotic CCPs in processing the C-terminal posttranslational modifications of tubulins, including the glutamates side chains and the encoded glutamate. Additionally, human CCP1 shortens acidic tails, implicated in molecular interactions, from other proteins; therefore it has been proposed a general function in the regulation of protein‐protein and protein‐DNA interactions. Recently, evidence from phylogenetic analysis and cellular localization suggests that eukaryotic CCPs functions could be related to cilia and basal bodies. Nevertheless, many of the molecular mechanisms underlying the proposed functions remain unclear. On the other hand, prokaryotic CCPs are poorly characterized from the biochemical and functional point of view. The present work aimed to provide more information on key structural and functional features of M14D subfamily using the CCP from Pseudomonas aeruginosa (PaCCP) and the human CCP6 (hCCP6) as models. The crystal 3D structure of recombinant PaCCP was solved showing a novel β-sandwich N-terminal domain followed by a well defined α/β-hydrolase CP domain. Although most residues seem to be well positioned in the active-site, no activity against a wide array of substrates was detected. This suggests that PaCCP is in an inactive form or requires a very specific substrate(s) and/or an alosteric molecule to display the CP activity. Co-crystallization experiments with inhibitors, traditionally used for M14Aand M14B MCPs, indicate that the enzyme might require structural rearrangements to be active. The structure of PaCCP provides a first detailed structural insight into mammalian CCPs evidencing a conserved global fold of the N- and CP-domains and the position of key residues. The functional processes involving PaCCP in P. aeruginosa were explored by characterizing a mutant strain deficient in the protein (Δpaccp). PaCCP production was dependent of cellular density suggesting a relation with Quorum Sensing (QS). Δpaccp strain showed increased extracellular proteolytic activity and swarming motility, decreased biofilm formation and a complete loss of twitching motility (TM). We have also demonstrated that intracellular low levels of pilin structural protein, PilA, prevented TM. It is proposed that PaCCP could be involved in the regulation of the expression of pilA and possibly other genes in P. aeruginosa. Decreased virulence of Δpaccp assayed in the C. elegans “slow killing” model pointed a role of PaCCP in P. aeruginosa pathogenesis. hCCP6 was produced in mammalian cells and showed the same deglutamylating activity on tubulins as a mouse ortholog. The protein acted specifically on α-tubulin what could represent a regulatory mechanism of CCPs activity. hCCP6 was able to hydrolyze the C-terminus glutamates stretch of TRAFD1, a substrate of CCP1, although it should be determined whether it is a natural substrate. The enzymatic activity of hCCP6 was inhibited by chelating agents but not by proteinaceus CP inhibitors. Interactomic assays have been performed and potential interacting partners of PaCCP and hCCP6 were identified. Some of them are proposed for further validation, which will contribute to a better understanding f the functional relationships of these enzymes.

La presente tesis doctoral versa sobre el transporte de calor llevado a cabo por los fonones en sólidos cristalinos semiconductores. La motivación de este trabajo es doble. En primer lugar, se pretende contribuir a entender mejor cómo funciona el transporte de calor a distintas escalas de tamaño: desde semiconductores con tamaño bulk (del orden de milímetros o mayores) hasta semiconductores nano-estructurados, como por ejemplo nanocables o láminas finas, cuyos tamaños característicos están en la escala nanométrica. La intención es describir dicho transporte de calor en estas escalas en un amplio rango de temperaturas, prestando especial atención a las colisiones entre fonones, pues son la causa intrínseca de la propagación del calor en los sólidos cristalinos semiconductores. En segundo lugar, se pretende mejorar la capacidad de predicción a la hora de describir el comportamiento de la conductividad térmica de los semiconductores más comunes por su implicación en procesos termoeléctricos, como son el silicio, el diamante, el germanio y el bismuto de telurio. Para lograr alcanzar estos objetivos, es necesario formular un nuevo modelo que nos permita superar las dificultades asociadas a los modelos ya existentes, con el objetivo de cumplir dos condiciones muy deseables. Por un lado, obtener una expresión general para la conductividad térmica válida para diferentes materiales, que pueda ser aplicada a muestras de dichos materiales con diferentes composiciones isotópicas, diferentes tamaños (desde la macro hasta la nano-escala) y con diferentes geometrías. Por otro lado, dicha expresión deberá tener el menor número posible de parámetros ajustables para asegurar la fiabilidad del modelo. La potencialidad de dicho modelo radicaría en servir como herramienta a la hora de guiar el diseño de dispositivos termoeléctricos más eficientes. La presente tesis se organiza en 8 capítulos ordenados de la siguiente manera: En el capítulo 1 se contextualiza el tema en el que está enmarcado el presente trabajo de investigación y se presentan los conceptos físicos necesarios para trabajar con el transporte fonónico. En el segundo capítulo se desarrolla la dinámica de la red para los distintos materiales que serán objeto de estudio en el presente trabajo, en particular se aplica el modelo Bond-charge para obtener las relaciones de dispersión y la densidad de estados de los semiconductores del grupo IV (silicio, germanio, diamante y estaño gris) y análogamente se aplica el modelo Rigid-ion sobre el bismuto de telurio para obtener sus relaciones de dispersión y densidad de estados. Los tiempos de relajación apropiados para dichos materiales se discutirán en detalle en el capítulo 3, proponiendo nuevas expresiones empíricas para describir las interacciones fonón-fonón. En el capítulo 4 se introducen y discuten los modelos de conductividad térmica más representativos de la literatura y a continuación se presenta un nuevo modelo para predecir la conductividad térmica: el modelo Kinetic-collective, cuya principal característica consiste en interpretar el transporte de calor en dos regímenes diferentes, el primero de ellos de tipo cinético donde los fonones son tratados como partículas libres y el segundo de tipo colectivo donde todos los fonones que participan en el transporte pierden su individualidad y se comportan como una colectividad de partículas. En el capítulo 5 el modelo Kinetic-collective se aplica a silicio bulk con diferentes composiciones isotópicas, y a varias muestras de silicio nanoestructuradas con diferentes geometrías y tamaños efectivos. Se obtienen predicciones de la conductividad térmica en un amplio intervalo de temperaturas que concuerdan satisfactoriamente con las medidas experimentales y se discuten diversos aspectos novedosos sobre el transporte fonónico. En el capítulo 6 el modelo Kinetic-collective se aplica al resto de materiales componentes del grupo IV de semiconductores y se obtiene una relación teórica que nos permite predecir los valores de los parámetros libres asociados a los tiempos de relajación de dichos materiales y así poder predecir sus conductividades térmicas sin la necesidad de añadir nuevos parámetros. En el capítulo 7 vamos un paso más allá y aplicamos el modelo a bismuto de telurio, obteniendo predicciones de la conductividad térmica para nanocables con diferentes diámetros y discutimos los resultados en vista a posibles aplicaciones termoeléctricas. Finalmente, el capítulo 8 está dedicado a recoger las principales conclusiones de este trabajo de investigación y a indicar posibles líneas futuras de trabajo surgidas a consecuencia de los resultados obtenidos. / The aim of this theoretical work is twofold. First, to contribute to a better understand- ing of phonon heat transport in bulk and nanostructured semiconductors, like thin-films or nanowires, in a wide range of temperatures, paying special attention to phonon-phonon col- lisions. Second, to improve the prediction capability of the thermal conductivity of the most common semiconductors. To achieve this, it becomes necessary the formulation of a new model allowing us to overcome the diculties associated to the existing models, with the aim to fulfill two desirable conditions: to provide a general expression for the thermal conduc- tivity, valid for several materials with di↵erent size-scales and geometries in a wide range of temperatures, and to have the smallest number of free adjustable parameters to assure the reliability of the model. The potentiality of such model would be to serve as a useful tool to design more ecient thermoelectric devices. The fruit of our study is the Kinetic-collective model which is developed in the framework of the Boltzmann transport equation as a natural generalization of the Guyer-Krumhansl model. Since phonon interactions are the source of thermal resistance, they deserve a special discussion in any thermal conductivity study. Precisely, the keystone in our work is the treatment of phonon-phonon collisions regarding their di↵erent nature. The prediction capability of the model need to be tested on several materials. In particular, we study five materials with thermoelectric interest. In first place, silicon, because it is an ideal test material due to the considerable amount of experimental data available in the literature, and because of its inherent scientific and technological importance. Secondly, we extend our study to other materials with the same lattice structure as silicon, that is the family of group IV element semiconductors (germanium, diamond, silicon and gray-tin), which also have been object of intense study, specially germanium, due to the recent and fast development of SiGe alloys and superlattices. Finally, we finish our study with a more complicated material regarding its lattice structure, bismuth telluride, which is known to be a very ecient thermoelectric material due to its high figure of merit. The Thesis is arranged in eight Chapters. The lay out is as follows: Chapter 1 con- textualizes the topic of the work and briefly introduces the basic physics related to phonon transport. In Chapter 2 the fundamental quantity necessary for considering any thermal property, the phonon dispersion relations, have been obtained for the materials under study. For this purpose, two lattice dynamics models are used: the Bond-charge model for group-IV semiconductors (silicon, germanium, diamond and gray-tin), and the Rigid-ion model for bismuth telluride (Bi2Te3). Along with their corresponding phonon dispersion relations, phonon density of states and specific heat results are also presented. The phonon relaxation times that suit these materials are discussed in Chapter 3, where new expressions to account for the phonon-phonon collisions are also presented. In the first part of Chapter 4 the most represen- tative thermal conductivity models to date are introduced and discussed, in the second part, a new model to predict the thermal conductivity, the Kinetic-collective model, is presented and its conceptual di↵erences and advantages with respect to previous similar models are discussed. In Chapter 5 the Kinetic-collective model is applied to silicon bulk samples with di↵erent isotopic composition and several nanostructured samples with di↵erent geometries (thin-films and nanowires) obtaining predictions for their thermal conductivity in a wide in- terval of temperatures. Some novel aspects of phonon transport arising from these results are discussed. In Chapter 6 the Kinetic-collective model is applied to the other group-IV materials using theoretical expressions to predict their relaxation times and, eventually, their thermal conductivity. Results for several samples with di↵erent isotopic compositions in a wide range of temperature are presented and discussed. In Chapter 7 the Kinetic-collective model is applied to Bi2Te3, providing thermal conductivity predictions for nanowires with several diameter values, and the results are discussed in view of possible applications in ther- moelectricity. Finally, in Chapter 8 the main conclusions of this Thesis are summarized and possible future lines of work stemming from its several results are discussed.

Una pila microbiana de combustible es un sistema bioelectroquímico en el cual las bacterias oxidan materia orgánica y transfieren los electrones a un electrodo produciendo electricidad. La eficiencia de este sistema depende de la actividad metabólica de los microorganismos creciendo en el ánodo, pero también de un gran número de factores relacionados con el diseño y la operación del sistema. El objetivo de esta tesis es contribuir al análisis y control de algunos de estos factores, así como ayudar a determinar el papel de los diferentes mecanismos de transferencia de electrones en el funcionamiento de estos dispositivos. En primer lugar, este trabajo analiza factores relacionados con el diseño que afectan al rendimiento de una pila microbiana. Así, se centra en el efecto de diferentes catalizadores abióticos así como en la relación entre las áreas del cátodo y ánodo necesarias para no afectar la potencia obtenida. Los resultados revelan que catalizadores solubles permiten potencias mucho mayores, y por tanto necesitan menor relación entre las áreas de cátodo y ánodo que en el caso de las pilas con cátodos de platino. No obstante, a largo plazo, las pilas con catalizadores solubles de hierro muestran un descenso progresivo del rendimiento de la celda de combustible que las hace poco adecuadas para aplicaciones que requieren operaciones de larga duración. Recientemente, la búsqueda de catalizadores adecuados para el cátodo ha llevado a los investigadores a explorar el posible uso de biocátodos. En esta tesis se demuestra la capacidad de Shewanella oneidensis MR-1 para catalizar la reacción del cátodo tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, siendo capaz de aceptar la corriente proporcionada por las bacterias presentes en el ánodo. El potencial de las bacterias que se encuentran en el ánodo para la producción de corriente no sólo depende de los niveles de actividad microbiana y de la supresión de las limitaciones producidas por el cátodo, sino que es afectada también por factores relacionados con el funcionamiento del sistema. Nosotros mostramos la importancia de una operación ininterrumpida como otro factor relevante para determinadas aplicaciones. Periodos de interrupción del circuito producen una alteración en los valores de corriente en forma de picos, que aparecen cuando el circuito es cerrado tras un periodo de interrupción y que caen lentamente hasta alcanzar valores normales de corriente. Mediante análisis más exhaustivos de este fenómeno se demuestra la capacidad de Shewanella oneidensis MR-1 para almacenar carga eléctrica en ausencia de aceptores de electrones. Finalmente, se estudió la contribución en la producción de corriente de los diferentes mecanismos de transferencia de electrones en pilas con comunidades microbianas complejas. La pila con el ánodo descubierto muestra que los mecanismos de transferencia directa son responsables de la mayor parte de la corriente generada. La comunidad microbiana formada se encuentra relacionada con la vía de transferencia de electrones disponible con especies microbianas como Shewanella, Aeromonas, Pseudomonas o Propionibacterium. Los mecanismos de transferencia mediante mediadores le siguen en importancia, siendo los responsables del 40% de la corriente producida. Esta pila cuya corriente depende de la producción de mediadores muestra una gran cantidad de especies redox en el anolito, algunas de ellas no relacionadas con mediadores ya descritos. Por último, en la pila con el electrodo cubierto de nafion, la única especie química capaz de llegar a la superficie del ánodo es el hidrógeno. En este caso, la producción de corriente es sostenida gracias a la relación entre algunos organismos como Comamonas, Alicycliphilus, Diaphorobacter o la archaea Methanosaeta y el ánodo. La oxidación de acetato mediante estos microorganismos resulta en la producción de hidrógeno, el cual es oxidado en la superficie del ánodo tras cruzar el nafion. / A Microbial Fuel Cell (MFC) is a bioelectrochemical system, in which bacteria oxidize organic matter and transfer the electrons through their electron transport chains onto an electrode surface producing electricity. The efficiency of the system depends on the metabolic activity of the microorganisms growing at the anode but also on a large number of factors related to the design and operation of the MFC. The purpose of this work is to contribute to the analysis and control of some of these factors as well as to throw some light on the role of different electron transfer mechanisms in MFC operation. To achieve this goal different experiments using the electrogenic bacterium Shewanella oneidensis MR-1 have been carried out. First of all, this works analyses the role of several design factors in MFC performance. This part of the research focuses on the effect of different abiotic catalysts as well as the cathode to anode ratio required for unhindered power output. The results indicate that soluble catalysts such as ferricyanide allow much higher power values, and therefore need smaller cathode/anode ratios than platinum-based cathodes. In the long term, however, MFCs containing soluble iron catalysts show a progressive degradation of fuel cell performance make them unfit for applications requiring extended operations. In recent years, the search for a suitable catalyst at the cathode has led researchers to explore the possible use of biocathodes. In this work, we demonstrate the capacity of Shewanella oneidensis MR-1 to catalyse the cathode reaction both under aerobic and anaerobic conditions, being able to sustain the current provided by bacteria present in the anode. The potential of anode bacteria for current production does not only depend on the levels of microbial activity and on the removal of cathodic limitations but seems to be also affected by factors related to the operation of the system. We have shown the importance of continuous MFC operation as another important factor to take into account for some applications. Periods of circuit interruption produce an alteration of the normal current output in the form of defined current peaks that appear when closing the circuit after a short period of current interruption and that decay slowly back to the original stable values. In depth analysis of this response demonstrates the capacity of Shewanella oneidensis MR-1 to store charge when no electron acceptors are present. Finally, we intended to determine the contribution of the different electron transfer mechanisms to current production in MFCs harbouring complex microbial communities. The MFC with a naked anode shows that direct electron transfer mechanisms are responsible for most of the current generated. The microbial community formed agrees with the electron transfer pathways available. So, this MFC presents species able of direct and mediated electron transfer as Shewanella, Aeromonas, Pseudomonas or Propionibacterium. The MFC sustained by shuttle-dependent electron transfer follows in importance being responsible for as much as 40% of current output. This reactor shows a great quantity of different redox species in the anolyte bulk, some of them not related to mediators currently described in the literature. Finally, in the MFC with a nafion-coated anode, the only chemical species able to diffuse to the anode surface is hydrogen. In this case, current production is sustained by the interaction between some organisms, such as Comamonas, Alicycliphilus, Diaphorobacter or the archaea Methanosaeta and the anode. Oxidation of acetate by these microorganisms results in hydrogen production that is therefore oxidised at the anode surface after crossing the nafion barrier. Current production by this mechanism would account for not more than 5% of the total current evolved in an unrestricted MFC.

En marzo de 2011, apliqué a una beca del CSC (Consejo de Becas de China), en cooperación con la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). Después de medio año, conseguí la beca y comencé mi tesis doctoral bajo la supervisión de la Dra. Anna Roig y la Dra. Anna Laromaine. Mi proyecto asignada era en celulosa bacteriana: su síntesis, caracterización y estudios de biocompatibilidad. La celulosa bacteriana es un polisacárido de fuentes renovables, y puede ser producida por algunos tipos de bacterias en la naturaleza. Presenta propiedades químicas y físicas notables, incluyendo una alta pureza química y cristalinidad, una red de nanofibras, porosa, alta capacidad de absorción de agua y resistencia mecánica. La celulosa bacteriana se utiliza para una amplia variedad de aplicaciones comerciales. Por otra parte, la celulosa bacteriana es biocompatible con afinidad biológica y biodegradabilidad, que suscita la atención de investigadores en el área de la biomedicina. El primer objetivo de mi tesis fue aprender a producir películas de celulosa bacteriana y encontrar estrategias para controlar sus propiedades. Un segundo objetivo fue el desarrollo de métodos para la fabricación de nanocompuestos basedos con celulosa bacteriana. El objetivo final estudia la biocompatibilidad de las capas de celulosa bacteriana que hemos producido y su utilidad como soportes tridimensionales para el crecimiento celular. Así se pretende establecer una plataforma para el estudio de la interacción de células y nanopartículas en un entorno 3D más realista. Durante el primer año, se realizó la puesta a punto en el laboratorio del sistema para producir capas de celulosa bacteriana a partir de dos cepas bacterianas y secarlas a partir de tres métodos de secado:a temperatura ambiente, secado por liofilización y secado supercrítico. Por otra parte, se realizó la caracterización completa de las capas de celulosa bacteriana: su porosidad, la transparencia, la capacidad de absorción de agua y las propiedades mecánicas que se podían controlar seleccionando la cepa bacteriana y el método de secado. En el segundo año, se sintetizó la celulosa bacteriana compuesta con nanopartículas por el método asistida por microondas como materiales de celulosa funcionales novedosos. Este método es eficiente y rápido, forma un recubrimiento de las capas de celulosa bacteriana por nanopartículas de forma homogénea y controlable. Secando las capas de celulosa utilizando diferentes rutas, se puede controlar la cantidad final del contenido de las nanopartículas en los materiales compuestos. Así capas con dominios hidrófobos / hidrófilos favorecían el anclaje de nanopartículas de forma selectiva para crear materiales de celulosa más complejos y funcionales. En este último año, se ha llevado a cabo el estudio de la biocompatibilidad de las capas de celulosa bacteriana in vitro. Aunque la celulosa bacteriana se considera generalmente un material no citotóxico, su biocompatibilidad es un requisito importante para su uso en aplicaciones biológicas y médicas y no ha sido evaluado completamente. Además se fabricó una estructura de celulosa bacteriana 3D mejorada. La tesis se estructura en seis capítulos. Capítulo 1 proporciona una introducción a la celulosa bacteriana. Capítulo 2 ofrece una descripción detallada de la fabricación de capas de celulosa bacteriana (BCF). Capítulo 3 se centra en la síntesis de compuestos de celulosa bacteriana funcionales que incorporan nanopartículas. Capítulo 4 presenta estudios de biocompatibilidad de la celulosa bacteriana como estructura 2D y 3D para estudios celulares in vitro. Capítulo 5 se enumeran las principales conclusiones derivadas de la presente tesis y algunas sugerencias para el trabajo futuro.Capítulo 6 recoge información sobre el autor y las publicaciones durante el doctorado. / In March 2011, I started the application of a scholarship from CSC (Chinese Scholarship Council), which cooperated with the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). After about half year, I secured the scholarship and began my doctoral thesis under the supervision of Dr. Anna Roig and Dr. Anna Laromaine. My project assignment was on bacterial cellulose: fabrication, characterization and biocompatibility studies. Bacterial cellulose is a renewable polysaccharide, which is produced by some types of bacteria in nature. It presents remarkable chemical and physical properties, including high chemical purity and crystallinity, nano-scale fibre network, porosity, high water absorption capacity and mechanical strength. Bacterial cellulose is being used for a wide variety of commercial applications, for example textiles, cosmetics, food products and other technical areas. Furthermore, bacterial cellulose is also biocompatible with excellent biological affinity and biodegradability, which is drawing immense attention from the bio and medical area researchers. The objective of my thesis was to learn how to produce bacterial cellulose films and find strategies to control their properties. A second objective was to developed methods to fabricate nanocomposites based on bacterial cellulose. The final objective was related to prove the biocompatibility of the in-house produced bacterial cellulose films and to be able to use them as three-dimensional scaffolds for cell in-growth. In this way setting up a platform that will allow us to study the interaction of cells and nanoparticles in a realistic 3D environment. During the first year, a lab set-up was successfully built to produce bacterial cellulose from two bacterial strains and three methods of drying were accessed to dry the thin films; at room temperature, freeze drying and supercritical drying. Moreover, the full characterization of bacterial cellulose films was accomplished: their porosity, transparency, water absorption capacity and mechanical properties were tuned by selecting the bacterial strain and the drying method. In the second year, bacterial cellulose composited with nanoparticles as novel functional cellulose materials were synthesized by microwave-assisted method. This method is efficient and fast to form a homogenous conformal and controllable coating of nanoparticles on the bacterial cellulose films. By drying the cellulose films using different routes, the final amount of the nanoparticles content in the composites can be controlled. Furthermore, those films were patterned with hydrophobic/hydrophilic domains and selectively anchored nanoparticles to create more complex and functional cellulose composites. During the last year, an investigation of the biocompatibility of the bacterial cellulose films in vitro was performed. Although bacterial cellulose is generally considered non-cytotoxic material, its biocompatibility as a major requirement for the use in biological and medical applications has not been fully evaluated. Furthermore, an improved 3D bacterial cellulose scaffold was fabricated. The thesis is organized into six chapters. Chapter 1 provides an introduction to bacterial cellulose. Chapter 2 describes a detailed description of the fabrication of bacterial cellulose films (BCFs). Chapter 3 focuses on the synthesis of functional bacterial cellulose composites incorporating nanoparticles. Chapter 4 presents the studies of bacterial cellulose biocompatibility as 2D and 3D scaffold for cell studies in vitro. Chapter 5 lists the main conclusions derived from the present thesis and some suggestions for the future work. Chapter 6 gathers information about the author and the publications during the Ph.D. studies.

Durante la ultima decada la creación de movimiento a la escala micro y nano ha evolucionado mucho y se ha convertido en un campo que connecta varias disciplinas de la ciencia. En su breve historia han sido la engeneria y la quimica las disciplinas leaderes, pero hoy en dia muchos impulsos vienen de la ciencia de materiales y la biotecnologia. Esta tesis comienca con un breve resumen de la base fisica, los diferentes tipos de motores y los mecanismos de propulsión y muy en seguida llega al uso de enzimas para generar movimiento. Como material para los motores nos hemos centrado en la silica, debido a sus propriedades unicas como la facilidad de modificarla, introducir funcionalidades y su toxicidad baja que facilita futures aplicaciones en ambitos biologicos. Por ello en el primer paso se sintetizaron diferentes tipos de particulas y se desarollaron hierramientas como la funcionalización de la superficie, la imobilización de materia catalitica (platino o enzimas) y la aplicación de moleculas como el ADN. Todo este conocimiento se combinó en el desarollo de una prueba de concepto de un sensor de ADN, baseado en la detección de movimiento. El motor que formó la base de este sensor se podia guardar durante un tiempo, pero al mismo momento se mostró muy sensible a temperaturas elevadas y un medio oxidante. Por ello optamos por mejorar el tiempo de vida de este tipo de motor baseado en enzimas, tal como su capacidad de ser reutilizado. Esto se conseguió encapsulando la catalasa y la evaluación de su performance demostró que la resistencia al peroxido, a temperaturas elevadas y (....) enzimas proteoliticas mejoraron drasticamente. Otro problema que intentamos solucionar en esta tesis es la direcionalidad de los micro motores y evaluando agentes direcionales se selecionó el magnetismo. En primer instante introducimos particulas de oxido de hierro, pero este metodo falló porque no se conseguió la asimitrización de los mismos. Por ello entramos en colaboración con Dr. Sanchez y aplicamos su metodo de fabricación de particulas Janus por evaporación de una multicapa magnetica. Las propriedades de esta multicapa nos capacitaron de guiar el movimiento de los motores aplicando campos magneticos. Para este tipo de motor direcionable sustituimos las enzimas por planito, un catalisador inorganico para la misma decomposición de peroxido. Esto crea un movimiento más uniforme, un porcentaje de particulas con catalizador más elevado y una incremento en la reproducibilidad de los experimentos. Todo esto nos facilitó el estudio del comportamiento de los motores Janus en diferentes ambitos, entre ello soluciones que contenian surfactantes. Adicionalmente se realizaron mediciones del potencial Zeta en las mismas soluciones y en presencia de surfactantes. Los resultados obtenidos pueden abrir el camino para un entendimiento mejor del mechanismo del movimiento por gradientes. Otro punto que aun es muy escarso en el campo son comparaciones entre diferentes tipos de micro motores. Asi siempre en colaboracion con el grupo de Sanchez comparamos estos resultados con resultados obtenidos por otro tipo de motor, los microjets. Comparando estos dos tipos de motores esperamos crear conecciones entre las varias areas del campo de micro motores para modularizar los conocimientos. Esto facilitará el traspaso del conocimiento de un tipo de motor y la aplicación a otros. La ultima parte de esta tesis surge de un proyecto a parte que nos capacitó de crear motores propulsados por luz. Se optimizó la precipitacion de AgCl particulas en forma de estrella y se caractizaron sus propriedades. Semejante a publicaciones de Sen et al. probamos el potencial de estas particulas como micro motores y vimos que luz ultravioleta es capaz de generar modificaciones en la superficie que liberan iones de cloro y causan movimientos propulsados por gradientes. El uso de estos micromotores nos llevó a la primer aplicación: limpieza de aguas de residuos por degradación de moleculas organicas y evaluamos las propriedades antibacteriales. Concluyendo se puede decir que hay optimismo que este trabajo aumenta el conocimiento sobre movimiento en la escala micro y será la base de futuros trabajos. / In the last decade the generation of movement at the microscale has evolved to a fascinating new field of that connects several fields of modern science. In its short history mainly engineering and chemistry were dominating the research in this area but lately many novel inputs were given by biotechnology or material science. This thesis starts with a short overview on physical basics, several different motor types and propulsion mechanisms and then comes to the use of enzymes to obtain motion. As basic material we focussed mainly on Silica particles due to its unique properties, for example easy shape-ability, modification and functionalization as well as its non-toxicity that enables future use in any kind of bio-applications. So in a first step different kinds of particles were synthesized and several tools are developed, for example surface functionalizations and immobilization of catalytically active material on the surface (enzymes or inorganic catalysts) and grafting of molecules as DNA. All this knowledge acquired here was combined in the development of a proof of concept motion based DNA sensor. The underlying micromotor assembly was storable but very sensitive to external influences as oxidizing media and elevated temperatures. Therefore improvement of the enzyme driven micromotors concerning their lifetime and reusability was achieved by introducing an encapsulation method for catalase. Evaluation of the particle endurance showed that the resistance to oxidation by peroxide, heat and proteolytic enzymes could be improved. Another problem that was tackled in this thesis is directionability of micromotors. After evaluation of different directing agents magnetism was selected as means of choice. First trials to introduce magnetic Fe2O3 particles in the micromotor assay failed because the asymmetrization could not be achieved. So in collaboration with the group of Dr. Sanchez an approach based on the fabrication of Janus particles through multilayer deposition of magnetic material was adopted and particle movement could be guided. To achieve this kind of motor the enzyme was replaced by Pt as an inorganic catalyst for peroxide decomposition. This causes the motion to be more uniform, the percentage of motile particle and the reproducibility of experiments higher and therefore it enabled us to study the behaviour in different fuel containing media. Additionally Zetapotential measurements were used to further characterize the particle behaviour in presence of different kinds of surfactants. Those results might pave the way for novel insights into mechanistic details of gradient driven particle movement. Another point that we found missing in the field of micro motors were comparisons between different kinds of micromotors. Therefore we extended the studies of micromotor motion in different media to microjets and we obtained comparative statements about differences between both motor types. We hope that creating connections between different types of micromotors will contribute to "modularize" the field, so that achievements on one type of motors can be easier applied to other forms of motors. In the last part of the thesis a finding from a side project we used to create light driven micromotors. The delayed precipitation of AgCl led to star-shaped particles - their synthesis was developed further and their properties were characterized. Similar to earlier publications of Sen et al. we tested their potential use as micromotors and found that UV light was able to generate surface modifications that released chlorine ions and led to probably gradient driven motion. Their use as micromotors finally led to a first application: waste water cleaning by means of degradation of organic molecules and antibacterial properties. We hope the concepts developed in this thesis provide a basis for future work and enlarge the knowledge about movement at the microscale.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) está constituida por dos entidades principales: la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. La EII es una incurable y compleja patología con una incidencia creciente en nuestro país. Los glucocorticoides son la primera línea terapéutica en la colitis ulcerosa activa, aunque distintos estudios han demostrado que hasta un 60% de los pacientes no responden de forma adecuada al tratamiento esteroidal. Así que el fracaso terapéutico a los glucocorticoides constituye una de las principales complicaciones en el tratamiento de la EII, con una grave repercusión en la evolución del paciente. Estudios previos de nuestro grupo han asociado la presencia de Interleucina (IL)-10 en biopsias intestinales de pacientes con enfermedad de Crohn activa con una buena respuesta a los glucocorticoides. Por otra parte, la deficiencia de esta misma citocina inmunoreguladora en modelos animales se ha relacionado con un aumento de la permeabilidad intestinal. Asimismo, la IL-10 es capaz de reducir el estrés del retículo endoplasmático en células epiteliales del intestino producido por TNF-α. Además, estudios propios y de otros grupos sugieren un importante protagonismo patológico del epitelio intestinal en la colitis ulcerosa. En conjunto, las premisas anteriores sugieren un papel clave de la IL-10 en la actividad del epitelio intestinal favoreciendo el aislamiento de la lamina propria, facilitando la respuesta a los esteroides en pacientes con colitis ulcerosa activa. Los objetivos de esta Tesis doctoral fueron: a) comprobar in vitro en monocapas de células epiteliales Caco-2, si la presencia de IL-10 puede favorecer la respuesta a los glucocorticoides actuando sobre la función barrera; y b) averiguar si estos cambios in vitro también son percibidos en la mucosa cólica de pacientes con colitis ulcerosa activa con diferente respuesta al tratamiento con glucocorticoides. Los resultados en las monocapas de células Caco-2 demostraron que la presencia de IL-10, conjuntamente con los glucocorticoides, influye sobre el epitelio intestinal reforzando las uniones intercelulares a través de un mecanismo que implica a la fosforilación de p38 MAPK. En estos ensayos comprobamos que la presencia conjunta de IL-10 y glucocorticoides incrementaba los núcleos positivos para p38 MAPK fosforilada en las células epiteliales. En este sentido, la presencia nuclear de la p38 MAPK fosforilada también fue más elevada en las biopsias intestinales previas al tratamiento de pacientes respondedores que en las de los no respondedores, lo que podría suponer mayor capacidad de aislamiento de la lamina propria en los pacientes sensibles al tratamiento. El análisis efectuado por microscopia electrónica de transmisión en células Caco-2 reveló que la principal área de desacoplamiento celular se producía a nivel de desmosomas, fenómeno que conseguía revertir el tratamiento con IL-10 y glucocorticoides. Por otra parte, en pacientes con colitis ulcerosa activa se observó un patrón diferencial en la localización y expresión de los receptores α de IL-10 y glucocorticoides según su respuesta al tratamiento esteroidal. En definitiva, la acción sinérgica de la IL-10 y los glucocorticoides parece favorecer la recuperación del epitelio intestinal lesionado en la colitis ulcerosa activa, fortaleciendo las uniones paracelulares. En esta acción biológica es clave el papel de la p38 MAPK, cuya actividad esta modulada principalmente por la IL-10 que favorece el aislamiento de la lamina propria intestinal frente a los antígenos luminales. De esta manera, la actividad inflamatoria mediada por las células colitogénicas puede verse disminuida, lo que facilitaría la respuesta a los glucocorticoides induciendo su apoptosis. Los cambios moleculares que afectan a la respuesta frente a los glucocorticoides pueden ser detectados en el epitelio intestinal de pacientes con colitis ulcerosa, sugiriendo su potencial papel como dianas en el tratamiento con esteroides. / Inflammatory bowel disease (IBD) consists in two main clinical forms: ulcerative colitis and Crohn's disease. IBD is a complex and chronic disease with an increasing incidence in our country. Glucocorticoids are the first-line therapy in active ulcerative colitis, however, several studies have shown that up to 60% of patients do not respond adequately to steroid treatment. So the glucocorticoid treatment failure is an important complication in the treatment of IBD, with hight impact on patient evolution. Previous studies from our group have associated the presence of interleukin (IL)-10 in intestinal biopsies of patients with active Crohn's disease with a favourable response to glucocorticoid treatment. Moreover, the Il-10 deficiency in animal models has been associated with an increased intestinal permeability. Likewise,, IL-10 is capable of reducing TNF-α endoplasmic reticulum stress in intestinal epithelial cells. Our group and other groups suggest an important role of intestinal epithelium in ulcerative colitis. Taken together these last premises , it is been suggested that IL-10 plays a key role in intestinal epithelial promoting the lamina propria sealing and enabling steroid response in patients with active ulcerative colitis. The objectives of this thesis were: a) test in vitro, in Caco-2 epithelial monolayers cells, if the presence of IL-10 facilitates the glucocorticoid response acting on the barrier function, and b) determine whether these changes in vitro also are observed in the colonic mucosa of active ulcerative colitis patients with different response to glucocorticoid treatment. The results in Caco-2 monolayers cells showed that IL-10 in combination with glucocorticoids, influence the strengthening intestinal epithelium junctions through a mechanism involving the p38 MAPK phosphorylation. In these studies we found that the presence of IL-10 and glucocorticoids, increase positive nuclei p38 MAPK phosphorylation in epithelial cells. In this sense, the nuclear presence of phosphorylated p38 MAPK was higher in intestinal biopsies prior treatment in responders compared to non-responders patients, fact that may involve a higher sealing capacity of lamina propria in patients who were sensitive to treatment. Analysis by transmission electron microscopy in Caco-2 cells revealed that the main area of cell detachment occurred at desmosomes level, which was reversed getting IL-10 and glucocorticoids treatment. Moreover, in patients with active ulcerative colitis a differential pattern in the location and expression of IL-10 and glucocorticoid alpha receptor was observed depending of their steroid treatment response. In short, the synergistic action of IL-10 and glucocorticoids seems to favor the recovery of injured intestinal epithelium in active ulcerative colitis, strengthening the paracellular junctions. In this biological action p38 MAPK has a key role. Its activity is modulated mainly by IL-10 and favors the intestinal lamina propria sealing against luminal antigens. Thus the inflammatory cells activity may be diminished, thereby facilitating the apoptotic glucocorticoid response. Molecular changes that affect the glucocorticoid response can be detected in the intestinal epithelium of ulcerative colitis patients, suggesting their role as potential targets in the steroid treatment.

Haemophilus parasuis es una bacteria Gram negativa común en el tracto respiratorio superior de cerdos sanos y es el agente etiológico de la enfermedad de Glässer, que se caracteriza por poliserositis fibrinosa y poliartritis. En los últimos años, la prevalencia de las infecciones respiratorias, incluyendo la producida por H. parasuis, ha aumentado debido a prácticas de manejo de los animales, como el destete precoz, y a la aparición de virus inmunosupresores. Poco se sabe acerca de la patogénesis y los factores de virulencia de H. parasuis y esto complica el control de la enfermedad. Las fosfatasas ácidas son ubicuas en organismos eucariotas y procariotas y han recibido mucha atención con la finalidad de entender sus estructuras, funciones y mecanismos catalíticos. En bacterias Gram negativas estos enzimas tienen un papel esencial en numerosos procesos, incluyendo la patogénesis bacteriana. Resultados previos de nuestro grupo demostraron la presencia de fosfatasa ácida secretada en sobrenadantes de ciertas cepas de H. parasuis. De especial interés fue la observación de que la secreción de la fosfatasa se perdía tras pases de la bacteria en el laboratorio, indicando un papel de este enzima en la infección. Por lo tanto el objetivo principal de esta tesis fue identificar y caracterizar los genes responsables de esta actividad fosfatasa. El análisis de una genoteca de la cepa virulenta H. parasuis ER-6P permitió la identificación de 2 clones con actividad fosfatasa. Estos clones contenían los genes aphA y pgpB, respectivamente. El clonaje y análisis posterior de estos genes confirmó que codificaban dos fosfatasas. Específicamente, AphA muestra características típicas de fosfatasas ácidas bacterianas de clase B, incluyendo el dominio catalítico típico (motivo F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, localizado en el N-terminal y el motivo Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] localizado cerca del C-terminal), un peso molecular teo rico de 24,33 KDa e inhibicio n por EDTA. Las fosfatasas ácidas bacterianas de clase B son un grupo de enzimas que forman homotetra meros y esta n presentes en una minorí a de bacterias, que incluye pato genos importantes. Por otro lado, PgpB es una fosfatasa de fosfatidilglicerofosfato, con seis dominios transmembrana, que pueden explicar su localización celular en la bacteria. Ambas proteínas, AphA y PgpB, mostraron un pH óptimo distinto que la actividad fosfatasa secretada por H. parasuis al sobrenadante. En un intento de purificar la fosfatasa secretada, sobrenadantes de H. parasuis fueron fraccionado por cromatografía de flujo por tamaño y las fracciones con actividad fosfatasa fueron analizadas por SDS-PAGE y MALDI-TOF-TOF. La proteína hipotética HPS_05483 se identificó en las fracciones con actividad fosfatasa, pero su expresión nativa recombinante no fue posible. Sin embargo, sí pudo ser purificada con una cola de His y se detectaron anticuerpos frente a ella en cerdos infectados, indicando que ésta proteína se expresa durante la infección. Se produjeron anticuerpos monoclonales (Acm) frente a un sobrenadante de H. parasuis con actividad fosfatasa y una selección inicial detectó Acm frente a Apha. Sin embargo, se debe realizar una selección más exhaustiva de los hibridomas para identificar Acm específicos frente a la fosfatasa del sobrenadante de H. parasuis. Finalmente, se estudió el efecto de sobrenadantes con actividad fosfatasa sobre los macrófagos. La expresión de marcadores de superficie de macrófagos alveolares CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesina y SWC3 no se vio afectada por incubación con sobrenadantes de H. parasuis o sobrenadante de un clon que secretaba AphA. En conclusión, hemos identificado y caracterizado parcialmente dos fosfatasas de H. parasuis, AphA y PgpB. Sin embargo, más estudios son necesarios para determinar si la proteína hipotética HPS_05483 es realmente una fosfatasa. El papel de estos enzimas en la biología de H. parasuis debería ser estudiado en más profundidad. / The Gram-negative bacterium Haemophilus parasuis is common in the upper respiratory tract of healthy swine and is the etiological agent of Glässer´s disease, which is characterized by fibrinous polyserositis and polyarthritis. In the last few years the prevalence of respiratory infections, including those by H. parasuis, has increased due to management practices, as early weaning, and the emergence of immunosuppressive viruses. Little is known about the pathogenesis and virulence factors of H. parasuis and this complicates the control of the disease. Acid phosphatases are ubiquitous in eukaryotic and prokaryotic organisms and much attention has been given to these enzymes in order to understand their structures, functions, and catalytic mechanisms. In many Gram-negative bacteria these enzymes have been determined to play a critical role in numerous processes, including pathogenesis. Previous results by our group showed the presence of a secreted acid phosphatase in the culture supernatant of some strains of H. parasuis. Interestingly, the secretion of the phosphatase activity was lost after passages of the bacteria in the laboratory, indicating a role of this enzyme in the infection. Therefore the main objective of this thesis was to identify and characterize the genes responsible for this secreted phosphatase activity. Screening of a genomic library from the virulent strain ER-6P of H. parasuis identified 2 clones with phosphatase activity. These clones contained genes aphA and pgpB, respectively. The subsequent cloning and analysis of the genes demonstrated that their products were in fact phosphatases. Specifically, AphA presented characteristics of bacterial class B acid phosphatases, including the typical catalytic domain (motif F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, located in the N-terminal moiety, and Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] located near the C-terminus), a predicted molecular weight of 24.33 KDa and inhibition by EDTA. Bacterial class B acid phosphatases are a group of homotetrameric enzymes, which are present in a minority of bacteria, most of which are important pathogens. PgpB is a phosphatidylglycerophosphate phosphatase, with six transmembrane domains in the predicted protein, which would explain its location in the bacterial cell. Both proteins, AphA and PgpB, showed a different optimal pH than the activity secreted by H. parasuis into the supernatant. In an attempt to purify the phosphatase from the H. parasuis supernatant, a size exclusion chromatography was performed and fractions with phosphatase activity were analyzed by SDS-PAGE and MALDI-TOF-TOF. A hypothetical protein HPS_05483 was identified in the fractions with phosphatase activity, but cloning and native expression of the gene was not achieved. However, the protein HPS_05483 was purified as a His-tagged protein and antibodies in infected pigs were detected against it, indicating that this protein is expressed during infection. Monoclonal antibodies (mAb) were produced against a phosphatase-positive supernatant from H. parasuis and an initial screening of the mAb identified several hybridomas with reaction against AphA. Further screenings are needed to identify mAb against the secreted phosphatase found in the supernatant of H. parasuis. Finally, the effect of the phosphatase-positive supernatant on porcine alveolar macrophages was studied. The level of macrophage surface markers CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesin and SWC3 was not affected by incubation with supernatants from H. parasuis or supernatant from a clone secreting AphA. In conclusion, we have identified and partially characterize 2 phosphatases of H. parasuis, AphA and PgpB. More studies are needed to determine if the hypothetical protein HPS_05483 is in fact a phosphatase. The role of these enzymatic activities in the biology of H. parasuis needs to be further studied.

Las plataformas Micro / Nanofluídicas, simples y miniaturizadas son especialmente interesantes debido a sus ventajas como la reducción de los volúmenes de muestra y reactivos, la disminución del tiempo de análisis, la posibilidad de portabilidad y la integración de técnicas analíticas convencionales. Además, es importante señalar el papel que pueden jugar los nanomateriales en términos de mejora de las propiedades electroquímicas después de ser integrados en plataformas microfluídicas, o incluso modificaciones superficiales de los transductores. Así, la combinación de la nanotecnología, la electroquímica y la microfluícia, podría proporcionar una plataforma de detección muy potente, por lo que, en esta Tesis se estudian diferentes dispositivos microfluídicos con transductores electroquímicos integrados para aplicaciones bioanalíticas. En esta Tesis se exponen también los aspectos generales y los resultados experimentales, a partir de una introducción general, la cual presenta los trabajos más recientes relacionados con el uso de nanomateriales y tecnologías lab-on-a-chip como una sinergia prometedora para una amplia gama de aplicaciones. Después se presenta la detección electroquímica de proteínas mediante el uso de puntos cuánticos como marcadores. En primera instancia, se describe un chip microfluídico híbrido compuesto por una canal de polidimetilsiloxano flexible (PDMS) y policarbonato (PC) como substrato. Este substrato a su vez tiene impreso electrodos serigrafiados integrados de carbono (SCPE). El dispositivo desarrollado combina las ventajas de los chips microfluídicos flexibles, tales como su bajo coste, la posibilidad de ser desechables y la susceptibilidad de ser producidos en masa con las ventajas de la electroquímica por su facilidad de integración y la posibilidad de ser miniaturizables. En la segunda parte, se realizó la detección electroquímica de puntos cuánticos como marcadores en un ensayo para la determinación de un biomarcador de la enfermedad de Alzheimer: Apolipoproteína E (ApoE). El inmunocomplejo se llevó a cabo mediante el uso de partículas magnéticas tosilactivadas, las que fueron a su vez utilizadas como plataforma de preconcentración de muestra dentro de un canal microfluídico. Debido a la necesidad de lograr límites inferiores de detección en inmunoensayos, en esta Tesis se han propuesto diferentes estrategias para mejorar la sensibilidad de los dispositivos. La primera de ellas es el uso de un campo magnético para inmovilizar una mayor cantidad de partículas magnéticas en una disposición controlable dentro de un canal microfluídico con el fin de obtener una zona de precocentración, donde se lleva a cabo el inmunoensayo. La segunda estrategia que se presenta en esta Tesis es el uso de un sistema de reciclaje de fabricación propia. En esta parte, el incremento de la señal de los puntos cuánticos se demuestra mediante el uso de una bomba peristáltica externa conectada a un chip microfluídico que forma un sistema cerrado. Después de esta demostración, se propuso una micro-bomba peristáltica con válvulas integradas. Todas las etapas de fabricación se optimizaron así como también se desarrolló un software para su control. Por último, el bismuto, que es un material bien conocido para aglomerar los metales pesados, fue usado para aglomerar los puntos cuánticos cuyo núcleo está formado por cadmio II, de esta forma se pudo mejorar la señal electroquímica mediante la reducción de los QDs junto con el Bismuto III. Diferentes optimizaciones fueron hechas usando canales microfluídicos. Adicionalmente, se presentan otras nueva plataforma basada en diamante dopado con boro, transductor utilizado para la determinación electroquímica de la atrazina basado en el desarrollo de un magneto-inmunoensayo. Este inmunoensayo se realizó mediante un ensayo competitivo con peroxidasa de rábano silvestre (HRP) como marcador enzimático y micropartículas magnéticas como plataforma de preconcentración. Otra plataforma propuesta es el transistor orgánico de efecto campo de doble puerta, como transductor para biosensores, desarrollado por la tecnología de inyección de tinta sobre un substrato flexible. Este tipo de transistores orgánicos tiene ventajas importantes para biosensores en términos de coste de fabricación y biocompatibilidad, así como su posibilidad de integración en microcanales. Para demostrar la aplicabilidad de este dispositivo en el campo biológico, se ha funcionalizado su capa externa con un anticuerpo de captura que detecta una proteína modelo sin ningún marcador. Se realiza la fabricación del dispositivo, teniendo en cuenta su estructura, los materiales que lo componen, sus características eléctricas y posibles aplicaciones. Por último, se exponen las conclusiones generales y futuras propuestas. / Simple and miniaturized micro / nanofluidic platforms are especially interesting due to their advantages like the reduction of sample and reagent volumes, the decrease of the analysis time, the possibility of portability and the integration of conventional analytical techniques. Furthermore it is important to point out the role that nanomaterials can play in terms of enhancing electrochemical properties after being integrated into the microfluidic platform or even in the electrode, where the detection event will be performed. Combined together, nanotechnology, electrochemistry and microfluidics could provide a really powerful biosensor platform, thus in the present Thesis different microfluidic platforms with integrated electrodes as transducers in biosensing applications were evaluated. General aspects and experimental results are exposed, starting from a General Introduction that describes various aspects related with the use of nanomaterials and lab-on-a-chip technologies as a promising synergy for a wide range of applications. The electrochemical detection of proteins (ex. Apolipoprotein-E, ApoE) by using CdS or CdSe@ZnS Quantum Dots (QDs) as labels has been one of the main objectives of this Thesis. The immunocomplex was performed by using tosylactivated magnetic beads as preconcentration platform into the same microfluidic system. Due to the need to achieve a lower limit of detection of the immunoassays, different strategies for electrochemical signal enhancing are proposed. The first one is the use of a magnetic field to immobilize magnetic beads in a controllable way into a microfluidic channel in order to obtain a stable magnetic plug where the immunoassay is performed. The second strategy is the use of a home-made recycling system. In this part, the increasing signal of QDs is demonstrated by using an external peristaltic pump connected to a microfluidic chip forming a loop system. After this demonstration, a micro-peristaltic pump with integrated valves is also proposed. All the fabrication steps have been optimized and the software for sequential control of the valves also has been developed. Finally, bismuth is used as it is a well-known material that agglomerates with heavy metals. We took advantages of this property for improving the electrochemical signal of QDs, due to the cadmium content that QDs have in their core. Optimization of the bismuth concentration has been done in order to achieve the highest signal. This detection has been performed in batch system as well as in microfluidic mode. In addition, another novel platform for electrochemical determination of a pesticide (atrazine) based on magneto-immunoassay using boron-doped diamond (BDD) electrode is presented. BDD electrode has been modified by electroreduction of potassium tetrachloroplatinate (K2PtCl4) in order to grow platinum nanoparticles (Pt-NPs) onto the electrode surface. The immunoassay was based on a direct competitive assay using horseradish peroxidase (HRP) as enzymatic label and magnetic microparticles as preconcentration platform. A flexible organic double gate Bio-Field Effect Transistor (Bio-FET) developed by inkjet technology onto a flexible substrate is also presented. This kind of organic transducers has important advantages for biosensors in terms of fabrication cost and biocompatibility as well as their integration into microchannels. To demonstrate the applicability of this device in the biological field, its functionalization with a capture antibody, in order to detect a model protein in a label-free mode was performed. The device fabrication, its structure, materials composition optimization, electrical characteristics and other functionalities are also discussed. Finally, the general conclusions are exposed including some opinions / recommendations for further continuation of the research in the field.

En la actualidad, la selección natural es considerada por la ciencia como el principal mecanismo evolutivo por el que la vida se transforma. Ésta fue formulada asumiendo poblaciones que saturan el medio que habitan. Bajo esta condición, aquellos que mejor explotan los recursos limitados disponibles evolucionan frente a los que no logran dicho cometido. De esta manera, la vida evoluciona hacia la tragedia de los comunes donde los individuos deben luchar entre sí por su vida, o morir desplazados por aquellos capacitados para hacerlo. Sin embargo, la cooperación es ubicua en la vida conocida, desde células hasta sociedades como la humana. Entonces, ¿cómo puede la cooperación evolucionar por selección natural? Este interrogante que está presente desde los tiempos de Darwin, es en la actualidad una de las preguntas centrales de la biología evolutiva. En este largo camino han sido formuladas diversas posibles respuestas que en conjunto permiten explicar gran parte de la cooperación que observamos. Sin embargo, estas propuestas desestiman la posibilidad de que la vida evolucione introduciendo elementos previamente inexistentes e impredecibles a partir de la información disponible. Cuando este elemento es considerado, la cooperación alcanzada por las formulaciones tradicionales evoluciona hacia la extinción. Por lo tanto, las teorías tradicionales sólo permiten explicar la evolución temporal de la cooperación. Tomando esto como motivación presentamos nuestra interpretación de la cooperación en la naturaleza, que construida a partir de conocimiento tradicional soluciona la histórica problemática. En particular, desde nuestra perspectiva el conjunto de individuos que coopera es la primera aproximación de un organismo vivo más complejo que sus partes. De esta manera, el problema de la cooperación es una evidencia del inevitable destino que todo ser vivo experimenta, la muerte. Por lo tanto, para que la cooperación evolucione más allá de este inevitable evento es necesario que el sistema se reproduzca y, por lo tanto, la reproducción del organismo es solución al problema de la cooperación. Posteriormente, buscamos comprender la evolución de la sociedad humana mediante elementos generales de nuestra especie. Para esto presentamos un modelo que permite considerar el crecimiento del sistema simultáneamente a la evolución del comportamiento de los individuos (estrategia) en poblaciones estructuradas. Este modelo es motivado por el hecho de que toda sociedad humana ha sido formada por un proceso de crecimiento en lugar de haberse desarrollado espontáneamente, tal y como se considera habitualmente en la literatura. Mediante esta modelización y considerando diferentes elementos generales, mostramos condiciones cercanas a las mínimas teóricas, a partir de las cuales evolucionan sistemas altamente cooperativos de cualquier tamaño y topología. Este resultado es robusto a toda forma de actualización de estrategia e interacción considerada. Sin embargo, el sistema cooperativo encuentra dificultades para superar cambios espontáneos de estrategia. Teniendo esto en cuenta presentamos una regla que llamamos “actualización democrática ponderada” donde el comportamiento de los individuos es socialmente influenciado por el propio de aquellos con los que interactúan, de manera que la influencia social de los individuos aumenta con su éxito. Mediante esta regla mostramos que un sistema cooperativo estructurado supera los cambios espontáneos de estrategia bajo condiciones cercanas a las mínimas posibles, incluso cuando estos cambios son frecuentes. Dada la robustez y generalidad de nuestra formulación, proponemos nuestra teoría como explicación del origen evolutivo de la sociedad humana así como también de estadios posteriores. Evidentemente, nuestra sociedad presenta un grado de complejidad profundamente superior a la que nuestra modelización ha alcanzado. Sin embargo, considerando la gran simplicidad de nuestra modelización, la consideramos como un primer paso hacia la construcción de un modelo físico-biológico satisfactorio de la sociedad humana contemporánea. / Nowadays, natural selection is considered by science as the main evolutionary mechanism by which life changes in time. This mechanism was formulated by assuming that population’s size is bounded by the limited resources of the environment. Under this condition, only evolve those individuals that exploit the limited resources in the best way. Hence, life evolves to the tragedy of the commons where individuals must fight each other, or die displaced by those prepared to do it. However, the cooperation is ubiquitous in nature, from cells to societies such as the human one. Then, how does cooperation evolve by natural selection? This question is present from Darwin’s theory, and it is currently one of the central questions of evolutionary biology. In this long tradition several possible answers have been proposed and are able to explain a great part of the cooperation observed in nature. However, these theories dismiss the possibility that life evolves introducing new and unpredictable elements from the available information. When this element is considered, the cooperation reached by traditional theories goes to extinction. Therefore, the traditional formulations just can explain the temporal evolution of cooperation. Taking this as a motivation, we introduce a new interpretation for cooperation in nature, which built it from traditional knowledge solves the historical cooperation problem. In particular, from our perspective a highly cooperative set of individuals is the first approximation of a living organism more complex than its parts. In this way, the cooperation problem is evidence of the inevitable fate that all life experiences, i.e. the death. Therefore, in order for cooperation to evolve, beyond this inevitably event, is required the reproduction of the system and, in consequence the reproduction becomes a solution to the problem of cooperation. Subsequently, we try to understand the evolution of the human society by considering general elements of our specie. To this end, we present a model that allows considering the growth of the system simultaneously that the behavior of individuals (strategy) evolves on structured populations. The model is motivated in the fact that human societies have emerged as a result of a growth process rather than spontaneous development, as is usually considered in literature. From this model and considering other general elements, we show conditions close to the theoretical minimum, from which highly cooperative systems of any size and topology may evolve. This result is robust under any strategy update and interaction considered. However, the cooperative system finds difficulties to overcome spontaneous changes of strategy. Taking this into account we present a new rule that we call “democratic weighted update” where the behavior of the individuals is socially influenced by those which interact with, in such a way that the social influence of individuals increase with their success. By considering this rule we show that a structured cooperative system overcomes the emergence of spontaneous changes of strategy, even when these changes are frequent. Given the robustness and generality of our formulation, we propose our theory as a possible explanation of the evolutionary origin of human society as well as for later stages. Obviously, our society presents much higher complexity than the one reached by our model. However, since our model is very simple, we consider it as a good first step towards building a successful biophysical model of the actual human society.