Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2015-06-22T19:07:56Z No. of bitstreams: 3 license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2015GiseliBuffon.pdf: 4725052 bytes, checksum: c3af085ec8f1b2cd556aeb84b1e48fe9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2015-06-25T20:14:45Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2015GiseliBuffon.pdf: 4725052 bytes, checksum: c3af085ec8f1b2cd556aeb84b1e48fe9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-25T20:14:45Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2015GiseliBuffon.pdf: 4725052 bytes, checksum: c3af085ec8f1b2cd556aeb84b1e48fe9 (MD5) / O arroz está entre os cultivos de maior importância, tanto no ponto de vista de consumo, quanto de geração de renda. O Brasil possui um papel de destaque na produção mundial de arroz, sendo o nono maior produtor mundial. Dentre as pragas que infestam a cultura de arroz, destaca-se o ácaro fitófago Schizotetranychus oryzae. Recentemente, este ácaro foi observado em lavouras de arroz do RS causando danos visíveis nas folhas e podendo acarretar danos econômicos. Para que isso não ocorra, as plantas precisam criar tolerância a esse estresse, o que está relacionado com a expressão coordenada de respostas de defesas após a infestação. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas diferencialmente expressas (PDE’s) em folhas de arroz após infestação do ácaro fitófago S. oryzae. Plantas de arroz foram crescidas em casas de vegetação e infestadas com os ácaros. As amostras foram submetidas à extração de proteínas e analisadas através da técnica de MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology). Foram identificadas 925 PDE’s. Aumentando a estringência, foram selecionadas 109 proteínas com no mínimo 10 contagens espectrais. Foi visto que o aparato fotossintético é drasticamente afetado pela presença do ácaro, principalmente o fotossistema II. Outras proteínas diferencialmente expressas evidenciam que as plantas de arroz alteram diversas rotas metabólicas, tentando resistir à infestação dos ácaros, como resposta a estresse oxidativo, síntese de ácido jasmônico, metabolismo de aminoácidos, carboidratos e lipídios, modificação e degradação proteica e fosfatases, o que leva à modulação de várias respostas celulares. O entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na interação do ácaro com a planta, através de técnicas de análise de expressão em nível proteico, pode contribuir para acelerar os processos de melhoramento da espécie cultivada. Nossos dados revelam várias proteínas promissoras para inúmeras abordagens biotecnológicas que buscam, futuramente, a tolerância do arroz ao ácaro S. oryzae e também a outros herbívoros. / Rice is one of the most important crops on both the point of view of consumption, as income generation. Brazil has a leading role in world production of rice, being the ninth largest producer world. Among the pests that infest rice culture, highlights the phytophagous mite Schizotetranychus oryzae. Recently, this mite was observed in the RS rice fields causing visible damage to the leaves and economic damage. To avoid this, plants need to create tolerance to stress, which is related to the coordinated expression of defense responses after infestation. This study aimed to identify differentially expressed proteins (DEP's) in rice leaves after infestation of phytophagous mite S. oryzae. Rice plants were grown in greenhouses and infested with mites. Samples were subjected to protein extraction and analyzed by MudPIT technique (Multidimensional Protein Identification Technology). We identified 925 DEP's. Increasing the stringency, we identified 109 proteins with at least 10 spectral counts. It was seen that photosynthetic apparatus is dramatically affected by the mite presence, especially photosystem II. Other DEP´s demonstrate that rice plants modify several metabolic pathways, trying to resist to the mite infestation, including response to oxidative stress, jasmonic acid synthesis, amino acid, lipid and carbohydrate metabolisms, protein degradation and modification, and phosphatases, which lead to modulation of various cellular responses. Understanding the molecular mechanisms involved in the interaction between rice plants and mite by expression analysis in protein levels can contribute to accelerate the improvement process of crop species. Our data revealed several promising proteins for numerous biotechnological approaches that seek the rice tolerance to the mite S. oryzae and also to other herbivores.

Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-17T13:43:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO FINAL DANILO SEM ASSINATURA.pdf: 1754718 bytes, checksum: 3290ac0ad20ca51beb6265cf1fa23cbc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T13:43:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO FINAL DANILO SEM ASSINATURA.pdf: 1754718 bytes, checksum: 3290ac0ad20ca51beb6265cf1fa23cbc (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / CAPES / Levana é um polímero de frutose produzido por Zymomonas mobilis que apresenta propriedades físico-químicas e biológicas que possibilitam seu uso pelas indústrias alimentícia e farmacêutica. Visando-se detectar proteínas diferencialmente expressas durante a produção deste polímero, procedeu-se a análise proteômica por meio de eletroforese bidimensional seguida por espectrometria de massas. Uma vez que as proteínas são os elementos efetores da expressão gênica e que a análise de proteomas pode auxiliar na identificação de pontos de controle do metabolismo determinantes para a biossíntese. Inicialmente, foi realizada a padronização da etapa de extração de proteínas totais solúveis de modo a obter-se uma análise proteômica global reprodutível e de qualidade. Foram testados três métodos de extração de proteínas totais (trizol, Mehta e Rosato e tampão de lise) em cinco linhagens (Ag11, ZAG-12, ZM4, ZAP e Z1-87) de Z. mobilis que apresentam características metabólicas diferenciadas. Dentre esses métodos, o do reagente Trizol possibilitou a obtenção de proteínas totais em quantidade e qualidade para as análises propostas. A linhagem ZAG-12, por se destacar entre as demais em termos quantitativos na produção de levana, foi escolhida para a realização dos estudos proteômicos. Esta bactéria foi crescida em meio de glicose por 24 horas, inoculada em meio de sacarose na concentração de 100 g L-1 por 24 horas e submetida à fermentação em meio de sacarose na concentração de 200 g L-1 por 72 horas. Alíquotas foram colhidas a cada 24 horas para dosagem de carboidratos e etanol por cromatografia líquida de alta eficiência, e dosagem de levana. Para análise das proteínas diferencialmente expressas foram coletadas amostras nos tempos inicial e final da fermentação. Pode-se reconhecer aproximadamente 450 proteínas diferentes em cada gel e 44 proteínas com expressão diferenciada na comparação das duas condições estudadas. Estas proteínas foram analisadas pelo espectrômetro do tipo MALDI TOF/TOF. As proteínas diferencialmente expressas identificadas foram agrupadas de acordo com suas funções no metabolismo, em que 57% estão associadas com o metabolismo de carboidratos, 13% com mecanismos de tradução e os outros 30% com outros metabolismos, biossíntese e transcrição. Este trabalho contribuiu no estabelecimento de metodologias eficientes para obtenção de proteínas totais solúveis, assim como definiu as melhores condições para separação de proteínas por eletroforese bidimensional em Z. mobilis. Além disso, os resultados obtidos servirão como base para o entendimento acerca do metabolismo da Z. mobilis durante a produção de levana e abrirão oportunidades para novos estudos.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-26T15:12:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leandro, Danilo de Carvalho. Doutorado Acadêmico em Biologia.pdf: 5056189 bytes, checksum: 0f4442baabaf84edda19f8013a0c4012 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T15:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leandro, Danilo de Carvalho. Doutorado Acadêmico em Biologia.pdf: 5056189 bytes, checksum: 0f4442baabaf84edda19f8013a0c4012 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / FACEPE / O mosquito Aedes aegypti, devido à sua importância na transmissão do vírus dengue, vem sendo estudado para compreensão de aspectos relacionados à competência vetorial. Os ovários, importante órgão envolvido na reprodução do vetor e implicado na transmissão viral transovariana, tem sido negligenciados nas análises de infecção viral. Diante disso, o presente trabalho analisou diversos aspectos da transmissão transovariana, como a cinética de infecção dos ovários pelo vírus Dengue, as taxas de transmissão transovariana na primeira geração filial (F1), a influência viral na fertilidade e fecundidade vetorial, os aspectos citopatológicos e ultraestruturais provocados pelo vírus no tecido ovariano, bem como a expressão diferencial de genes de resposta imune e pró-apoptóticos em ovários de A. aegypti. Experimentos de infecção artificial com vírus Dengue sorotipo 2 (DENV-2) foram conduzidos em laboratório, utilizando a população de A. aegypti proveniente de campo (Petrolina). Para as análises de cinética de infecção ovariana ao 7º, 14º, 21º e 28º dia após a infecção (dpi), dois grupos experimentais foram analisados: grupo alimentação única (AU) e grupo múltiplas alimentações (MA). Investigações das taxas de transmissão viral transovariana foram conduzidas a partir da detecção viral em mosquitos machos e fêmeas, oriundos de ovos de insetos que receberam alimentação sanguínea infectada. Experimentos de fertilidade e fecundidade foram conduzidos em fêmeas que realizaram o repasto sanguíneo infectado, e posteriormente foram individualizadas para coleta de ovos. Ovários foram coletados ao 14º dpi e submetidos a processamento e análise histopatológica e ultraestutural. Análises da expressão diferencial dos genes Relish-1 (via Toll), Hop (Via JAK-STAT), Argonaute 2 (mecanismo de RNA de interferência), e dos genes envolvidos na via apoptótica Caspase 16, AeDronc, Ae IAP1, foram conduzidas em ovários de fêmeas do grupo infectado positivas para o DENV-2, no grupo infectado negativo para o DENV-2, no grupo controle, e posteriormente comparadas pelo método ΔΔCt. A positividade para o DENV-2 no tecido ovariano foi registrada ao 14º, 21º e 28º dpi nos dois grupos (AU e MA). A quantificação viral das amostras positivas para DENV-2 apresentou resultados muito similares, com exceção do 28º dpi do grupo MA. A transmissão transovariana na F1 foi registrada apenas em machos ao 14° e 21º dia após a emergência, com 13,3% e 20% de positividade, respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi observada nos padrões reprodutivos (fecundidade e fertilidade) nas fêmeas infectadas. Nas análises histopatológicas, observou-se uma invaginação do epitélio folicular dos oócitos do grupo infectado. Nenhuma alteração a nível ultraestrutural foi observada. A expressão de todos os genes avaliados foi maior nos ovários do grupo infectado positivo para o DENV-2, quando comparado a ovários do grupo infectado negativo e controle. A infecção ovariana e a transmissão transovariana ocorrem a níveis muito reduzidos, porém, quando o vírus está presente no tecido ovariano, os títulos virais são muito similares a outros órgãos relatados na literatura. A expressão de genes envolvidos na resposta imune do hospedeiro ao vírus justifica a baixa infectividade, uma vez que se observa no ovário do grupo infectado, a expressão aumentada de todos os genes avaliados. Diante disso, concluímos que a transmissão transovariana é um evento raro e que não causa alterações importantes na biologia reprodutiva do vetor, porém, não deve ser negligenciada, uma vez que é a principal forma da permanência viral nas populações de mosquitos. / The mosquito Aedes aegypti, due to its importance in the transmission of the dengue virus, has been studied for the comprehension of aspects related to vector competence. The ovaries, important organ involved in the reproduction of the vector and implied in the viral transovarian transmission, have been neglected in the analysis of viral infection. Accordingly, the present study analyzed several aspects of the transovarian transmission as the kinetics of the ovaries infection by the dengue virus, the taxes of the transovarian transmission in the first filial generation (F1), the viral influence in the vector fertility and fecundity, the cytopathological and ultrastructural aspects motivated by the virus in the ovarian tissue, as well as the differential expression of the genes of immune response and pro-apoptotic in A. aegypti ovaries. Experiments of the artificial infection with the Dengue virus serotype 2 (DENV-2) were performed in laboratory by A. aegypti population derived from the field (Petrolina). For the analysis of the kinetics of ovarian infection to the 7th, 14th, 21st and 28th day post the infection (dpi), two experimental groups were analyzed: unique alimentation group (UA) and multiple alimentations group (MA). Investigations of the taxes of transovarian transmission were conducted starting from the viral detection in male and female mosquitoes coming from the eggs of insects which received infected blood alimentation. Fertility and fecundity experiments were directed in females which reached the infected blood repast and subsequently were individualized for the eggs collection. Ovaries have been collected to the 14th dpi and submitted to the process and histopathology and ultra-structural analysis. Analysis of differential gene process Relish-1 (Toll pathway), Hop (JAK-STAT pathway), Argonaute 2 (mechanism of the RNA interference), and of the genes involved in the via apoptotic Caspase 16, AeDronc, Ae IAP1 were conducted to the ovaries of females in the infected group positive for DENV-2 in the group infected negative for the DENV-2 and in the control group and afterwards compared by the method ΔΔCt. The positivity for the DENV-2 in the ovarian tissue was registered to the 14th, 21st and 28th dpi in the two groups (UA and MA).The viral quantification of the positive samples for DENV-2 presented similar results, with the exception of 28th dpi from the group MA. The transovarian transmission in the F1 was registered only in males in their 14th and 21st after the emergency, with 13,3% and 20% of positivity respectively. No significant difference was observed in the reproductive standards (fertility and fecundity) in the infected females. In the histopathology analysis, it was observed an invagination of the follicular epithelium of the oocytes of the infected group. No alteration to the level ultrastructural was observed. The expression of all evaluated genes was bigger in the ovaries from the infected group positive for the DENV-2, when compared to the ovaries of the infected group negative and control. The ovarian infection and the transovarian transmission happen in vey reduced levels, but if the virus is present in the ovarian tissue, the viral titles are very similar to the other organs related to the literature. The expression of the genes involved in the immune response of the host to the virus justifies the low infectivity, once it was observed in the ovary of the group infected, the expanded expression of all evaluated genes. Faced with this, we may conclude that the transovarian transmission is a rare event and that cannot cause important alterations in the vector reproductive biology, but it should not be neglected, once it is the main way of the viral permanence in the mosquitoes’ populations.

Oligodendroglial tumours originate from oligodendrocytes usually arising in the white matter and could be classified into grade-II oligodendrogliomas (OD) and anaplastic oligodendrogliomas (AOD, grade-III) according to the 2016 World Health Organization (WHO) grading scheme. ODs1 could be diagnosed by pathological and immunohistochemical analyses, however recent evidence suggests that they could be better diagnosed on the basis of defined genetic entities, such as the combined loss of chromosome 1p and 19q arms and IDH mutation. 1p/19q co-deletion is molecular hallmark of ODs and is clinically associated with better prognosis, response to chemo/radio-therapy and overall survival. Typical oligodendroglial histological features are strongly associated with 1p/19q loss and IDH mutation, which is critically important as diagnostic point of view. The examining of exclusive molecular signatures and transcriptome expression profiles added to histological class could compliment the classification of OD subtypes. In this regard, microRNAs (miRNAs, miRs) profiles could serve classifier signatures for tumour subsets. MiRNAs are 22nt short non-coding RNAs which are expressed endogenously and regulate diverse cellular process through negative control on gene expression at the posttranscriptional level by direct or imperfect interaction with their target mRNAs. MiRNAs are involved in regulating human tumorigenesis acting as either tumour suppressors or oncogenes. During the passage of tumorigenesis miRNA expression level is significantly increased or decreased compared to corresponding normal tissue. The same is observed with their mRNAs. Therefore, transcriptome profiling of human tumours could identify signatures associated with progression, diagnosis, prognosis and response to therapy. However, until recently the information regarding the expression of miRNAs and mRNA in oligodendroglial tumours is scarce. In this study we performed miRNA and mRNA differential expression profiling between grade II and grade III ODs using microarray based expression profiling platforms (723 transcripts and 41,000 genes, respectively). 7 cases for OD grade-II, and 7 for AOD grade-III, and 15 non neoplastic white matter (nnWM) samples were used after microdissection with no previous history of treatment. We performed a systematic evaluation of miRNAs and mRNAs expressions and determined miRNAs and putative target genes that are differentially expressed in grade III AOD, but not in grade II OD and in non-neoplastic white matter (nnWM). 1 ODs when used with ,,s\" will represent both OD and AOD. 50 miRNAs were overexpressed and 43 were down regulated in AOD-III, whereas 7 miRNAs showed significant reduction in expressions in OD-II group. 3 miRNAs were commonly down regulated in comparisons of both groups. The hsa-miR-23a was strongly upregulated and hsamiR-27a was strongly downregulated in AOD-III. The functions of hsa-miR-23a and hsa-miR- 27a were tested in human adult fibroblasts for cell proliferation assay and apoptosis detection. Cells treated with pre-miR-23a and pre-miR-27a showed 20% reduction in cell proliferation as compared with controls. Further, the functional relevance of miRNAs to their target mRNAs was validated for each group, using real time qPCR. 10 key-miRNAs from AOD were subjected to validation by qPCR. We were able to confirm 7 miRNAs (p? 0.05). Among these, 5 miRs (miR- 193a-3p, miR-24, miR-27a, miR-30a-5p and miR-30c) showed reduced expression whose target genes (CCND1, HDAC2, PDGFA and RAB-26) were upregulated. Whereas, 2 miRNAs likewise miR-301b and miR-378 were overexpressed whose target genes BCL2, FGF2, CD44 and PPP4R4 confirmed by qPCR (p? 0.05). Bioinformatics based gene ontology (GO), and networking analysis revealed that differential expression and targets are attributed to differentiation of embryonic stem cells, cell adhesion, angiogenesis and neurogenesis, resistance to apoptosis, protein-protein interactions and cell proliferation. It was possible to identify and validate miRNAs and their mRNA-targets potentially involved in the progression of oligodendrogliomas particularly in grade III-AOD. Collectively, this analysis provides new insights to malignant progression of oligodendroglial tumours and could compliment WHO-2016 diagnosis scheme and may provide predictive outcome in patients as well as decision to therapy. / Oligodendrogliomas originários de oligodendrócitos que geralmente surgem na substância branca podendo ser classificados em grau oligodendroglioma (II-OD), e anaplastic oligodendrogliomas (grau III-AOD). Os ODs2 podem ser diagnosticados por análises patológicas e imuno-histoquímicas, porém evidências recentes sugerem que poderiam ser melhor diagnosticados com base em assinaturas moleculares, como a deleção combinada dos cromossomas 1p e 19q - marcadores moleculares dos OD associados clinicamente a um melhor prognóstico, resposta à terapia e melhor sobrevida. As características histológicas típicas dos oligodendrogliomas também estão fortemente associadas à deleção de 1p/19q, que é criticamente importante como ponto de vista diagnóstico. Assim, os subtipos de gliomas podem ser fortemente diferenciados não somente em relação ao seu perfil histológico mas também com base em seu perfil de expressão genica e suas assinaturas moleculares exclusivas. Os microRNAs (miRNAs, miRs) emergiram como assinaturas moleculares para os diferentes graus. Os miRNAs são RNAs não codificantes, contendo em torno de 22 nucleótidos. São expressos endogenamente e regulam diversos processos celulares através do controle negativo da expressão gênica em nivel pós-transcricional e por interacção directa ou imperfeita com o RNAm-alvo. Os miRNAs estão envolvidos na regulação da tumorigenese humana atuando como supressores de tumour ou oncogenes. Durante o processo da tumorigenese o nível de expressão dos miRNAs é aumentado ou diminuído significativamente em comparação com tecido normal correspondente. O perfil de expressão de miRNA de tumores humanos poderia identificar assinaturas associadas com progressão, diagnóstico, prognóstico e resposta à terapia. Contudo, até recentemente a informação sobre a expressão de miRNAs em oligodendrogliomas é escassa. Neste estudo, avaliamos o perfil de expressão diferencial de miRNA e RNAm em ODs graus II e III usando plataformas de perfis de expressão baseadas em microarray (723 transcritos e 41.000 genes, respectivamente). Foram utilizados 14 casos de ODs microdissecados, sendo 7 OD grau II, e 7 AOD grau III (anaplasicos) sem histórico prévio de tratamento, além de 15 amostras de substancia branca não neoplásica (nnSB). Por meio de avaliações sistemáticas foram determinados miRNAs e mRNAs expressos em AOD grau III, mas não em OD grau II e em substancias brancas não neoplásicas (nnSB). 2 ODs when used with ,,s\" will represent both OD and AOD. Assim, foram encontrados 50 miRNAs com alta expressão e 43 miRNAs com baixa expressão em AOD-III, enquanto que 7 miRNAs apresentaram expressões reduzidas no grupo OD-II. Na comparação entre os dois grupos, 3 miRNAs apresentaram baixa expressão. A hsa-miR-23a mostrou alta expressão e a hsa-miR-27a apresentou uma diminuição de expressão importante em AOD III. A atividade dos hsa-miR-23a e hsa-miR-27a foram testadas em células de fibroblastos adultos humanos usando ensaios de proliferação celular e detecção de apoptose. As células tratadas com pre-miR-23a e pre-miR-27a mostraram 20% redução de proliferação celular em comparação com os controles. Para cada grupo, a relevância funcional dos miRNAs e seus mRNAs alvos foi validada utilizando qPCR. Dos 10 miRNAs submetidos a validação em grau III, foi possivel confirmar 7 miRNA(p<0,05). Entre esses, 5 miRs (miR-193a-3p, miR-24, miR- 27a, miR-30a-5p e miR-30c) mostraram expressão reduzida, cujos genes alvos (CCND1, HDAC2, PDGFA e RAB-26) apresentavam alta expressão. Enquanto que, 2 miRNAs como miR-301b e miR-378 apresentaram alta expressão cujos genes alvo BCL2, FGF2, CD44 e PPP4R4 foram confirmados por qPCR (p<0,05). Ferramentas de bioinformática (Gene Ontology) e a análises em rede revelaram que a expressão diferencial e os alvos são atribuídos à diferenciação de células-tronco embrionárias, adesão de celular, angiogênese e neurogênese, resistência à apoptose, interações proteína-proteína e proliferação celular. Foi possível identificar e validar miRNAs e RNAm-alvos potencialmente envolvidos na progressão de oligodendrogliomas. Coletivamente, esta análise fornece novos achados relacionados a progressão maligna de tumores oligodendrogliais e poderia facilitar o diagnóstico preciso e mais restritivo, o desfecho preditivo em pacientes, bem como auxiliar na decisão da terapia.

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-07T17:26:10Z No. of bitstreams: 1 Elizabeth Amelia Alves Duarte.pdf: 531566 bytes, checksum: 30a6ba5dcefc32c0b3e28c56510a6913 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-07T17:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elizabeth Amelia Alves Duarte.pdf: 531566 bytes, checksum: 30a6ba5dcefc32c0b3e28c56510a6913 (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Peanut is a worldwide important product for food industries. In Brazil this crop is quite representative due its high consume. Most part of production is concentrated in the Southeast, Center-West and Northeast regions. In this last one, the wheather is a limiting factor for the crop; however, some botanical types present tolerance to prolonged dry conditions. The aim of this work was to identify genes differentially expressed in a peanut cultivar submitted to water stress which could aid on selective processes in the improvement programs carried out with this crop in the Northeast region. The cv. Senegal 55437 was chosen for this study due its recognizable tolerance to drought. It was submitted to five days of water stress under greenhouse conditions. The total RNA was collected from foliar tissues when plants reached 50% stomatic closure. RT-PCR assays were performed using ten ISSR primers and the c- DNAs obtained were re-amplified, purified and cloned into Escherichia coli, INFα cell (Invitrogen). A total of twenty-nine cDNA fragments were obtained, being seventeen at the down regulated condition, two at over regulated and ten activated. These later, only found in stressed samples, were sequenced. Sequences obtained were compared into databanks, focusing on Arabidobis thaliana and Arachis banks, andfour showed homology with genes which are involved in metabolic routes to abiotic and biotic factors. One of these sequences, with about 700pb, showed homology with Arabinogalactan protein 10 of A. thaliana. This structural protein present in the leaves, stems and roots is associated to regulatory processes initiated during the water loss by the cell, which genes increase protection to the cytoplasm, organelles,cell membranes, cellular osmotic potential alteration and improve better regulation in the expression of other genes. The result here obtained suggests a possible relation of this gene with the response routes to water stress. / O amendoim é um produto de grande importância mundial para a indústria de alimentos, sendo bastante representativo no Brasil que é um dos maiores produtores e consumidores dessa oleaginosa. Grande parte da produção está concentrada nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste. Nesta última região, o clima é um fator limitante ao seu cultivo, embora alguns tipos botânicos apresentem tolerância às condições de estiagem prolongada. O presente trabalho teve como objetivo identificar genes diferencialmente expressos em amendoim, submetido a estresse hídrico, que possam auxiliar nos programas de melhoramento genético da cultura na região Nordeste. Para este estudo a cultivar Senegal 55437, de reconhecida tolerância à seca, foi submetida a cinco dias de estresse hídrico em condições de casa de vegetação. O RNA total foi coletado a partir de tecidos foliares, quando as plantas atingiram 50% de fechamento estomático. Para a identificação de genes diferencialmente expressos, procedeu-se ensaios de RT-PCR utilizando-se primers ISSR. Os c-DNAs obtidos foram reamplificados, purificados, ligados em vetor pGEMT-Easy e clonados em Escherichia coli, célula INFα (Invitrogen). Foram obtidos vinte e nove fragmentos de cDNA dos quais dezessete na condição de subregulados,dois super-regulados e dez ativados, estes últimos encontrados apenas nas amostras estressadas, os quais foram seqüenciados. As seqüências obtidas foram comparadas em bancos de dados, evidenciando os bancos de Arabidobis thaliana e Arachis. Dentre as seqüências, quatro apresentaram homologia com genes conhecidos e envolvidos em rotas metabólicas de resposta a fatores abióticos e bióticos. Uma dessas seqüências com cerca de 700 pb apresentou homologia com a proteína Arabinogalactana 10 de A. thaliana. Essa proteína estrutural presente nas folhas, caules e raízes dos vegetais esta associada a processos regulatórios iniciados durante a perda de água pela célula, cujos genes envolvidos promovem aumento da proteção do citoplasma, organelas, membranas celulares, alterações do potencial celular osmótico e maior regulação da expressão de outros genes. O resultado aqui obtido sugere uma possível relação desse gene no envolvimento das rotas de resposta ao estresse hídrico.

Oligodendroglial tumours originate from oligodendrocytes usually arising in the white matter and could be classified into grade-II oligodendrogliomas (OD) and anaplastic oligodendrogliomas (AOD, grade-III) according to the 2016 World Health Organization (WHO) grading scheme. ODs1 could be diagnosed by pathological and immunohistochemical analyses, however recent evidence suggests that they could be better diagnosed on the basis of defined genetic entities, such as the combined loss of chromosome 1p and 19q arms and IDH mutation. 1p/19q co-deletion is molecular hallmark of ODs and is clinically associated with better prognosis, response to chemo/radio-therapy and overall survival. Typical oligodendroglial histological features are strongly associated with 1p/19q loss and IDH mutation, which is critically important as diagnostic point of view. The examining of exclusive molecular signatures and transcriptome expression profiles added to histological class could compliment the classification of OD subtypes. In this regard, microRNAs (miRNAs, miRs) profiles could serve classifier signatures for tumour subsets. MiRNAs are 22nt short non-coding RNAs which are expressed endogenously and regulate diverse cellular process through negative control on gene expression at the posttranscriptional level by direct or imperfect interaction with their target mRNAs. MiRNAs are involved in regulating human tumorigenesis acting as either tumour suppressors or oncogenes. During the passage of tumorigenesis miRNA expression level is significantly increased or decreased compared to corresponding normal tissue. The same is observed with their mRNAs. Therefore, transcriptome profiling of human tumours could identify signatures associated with progression, diagnosis, prognosis and response to therapy. However, until recently the information regarding the expression of miRNAs and mRNA in oligodendroglial tumours is scarce. In this study we performed miRNA and mRNA differential expression profiling between grade II and grade III ODs using microarray based expression profiling platforms (723 transcripts and 41,000 genes, respectively). 7 cases for OD grade-II, and 7 for AOD grade-III, and 15 non neoplastic white matter (nnWM) samples were used after microdissection with no previous history of treatment. We performed a systematic evaluation of miRNAs and mRNAs expressions and determined miRNAs and putative target genes that are differentially expressed in grade III AOD, but not in grade II OD and in non-neoplastic white matter (nnWM). 1 ODs when used with ,,s\" will represent both OD and AOD. 50 miRNAs were overexpressed and 43 were down regulated in AOD-III, whereas 7 miRNAs showed significant reduction in expressions in OD-II group. 3 miRNAs were commonly down regulated in comparisons of both groups. The hsa-miR-23a was strongly upregulated and hsamiR-27a was strongly downregulated in AOD-III. The functions of hsa-miR-23a and hsa-miR- 27a were tested in human adult fibroblasts for cell proliferation assay and apoptosis detection. Cells treated with pre-miR-23a and pre-miR-27a showed 20% reduction in cell proliferation as compared with controls. Further, the functional relevance of miRNAs to their target mRNAs was validated for each group, using real time qPCR. 10 key-miRNAs from AOD were subjected to validation by qPCR. We were able to confirm 7 miRNAs (p? 0.05). Among these, 5 miRs (miR- 193a-3p, miR-24, miR-27a, miR-30a-5p and miR-30c) showed reduced expression whose target genes (CCND1, HDAC2, PDGFA and RAB-26) were upregulated. Whereas, 2 miRNAs likewise miR-301b and miR-378 were overexpressed whose target genes BCL2, FGF2, CD44 and PPP4R4 confirmed by qPCR (p? 0.05). Bioinformatics based gene ontology (GO), and networking analysis revealed that differential expression and targets are attributed to differentiation of embryonic stem cells, cell adhesion, angiogenesis and neurogenesis, resistance to apoptosis, protein-protein interactions and cell proliferation. It was possible to identify and validate miRNAs and their mRNA-targets potentially involved in the progression of oligodendrogliomas particularly in grade III-AOD. Collectively, this analysis provides new insights to malignant progression of oligodendroglial tumours and could compliment WHO-2016 diagnosis scheme and may provide predictive outcome in patients as well as decision to therapy. / Oligodendrogliomas originários de oligodendrócitos que geralmente surgem na substância branca podendo ser classificados em grau oligodendroglioma (II-OD), e anaplastic oligodendrogliomas (grau III-AOD). Os ODs2 podem ser diagnosticados por análises patológicas e imuno-histoquímicas, porém evidências recentes sugerem que poderiam ser melhor diagnosticados com base em assinaturas moleculares, como a deleção combinada dos cromossomas 1p e 19q - marcadores moleculares dos OD associados clinicamente a um melhor prognóstico, resposta à terapia e melhor sobrevida. As características histológicas típicas dos oligodendrogliomas também estão fortemente associadas à deleção de 1p/19q, que é criticamente importante como ponto de vista diagnóstico. Assim, os subtipos de gliomas podem ser fortemente diferenciados não somente em relação ao seu perfil histológico mas também com base em seu perfil de expressão genica e suas assinaturas moleculares exclusivas. Os microRNAs (miRNAs, miRs) emergiram como assinaturas moleculares para os diferentes graus. Os miRNAs são RNAs não codificantes, contendo em torno de 22 nucleótidos. São expressos endogenamente e regulam diversos processos celulares através do controle negativo da expressão gênica em nivel pós-transcricional e por interacção directa ou imperfeita com o RNAm-alvo. Os miRNAs estão envolvidos na regulação da tumorigenese humana atuando como supressores de tumour ou oncogenes. Durante o processo da tumorigenese o nível de expressão dos miRNAs é aumentado ou diminuído significativamente em comparação com tecido normal correspondente. O perfil de expressão de miRNA de tumores humanos poderia identificar assinaturas associadas com progressão, diagnóstico, prognóstico e resposta à terapia. Contudo, até recentemente a informação sobre a expressão de miRNAs em oligodendrogliomas é escassa. Neste estudo, avaliamos o perfil de expressão diferencial de miRNA e RNAm em ODs graus II e III usando plataformas de perfis de expressão baseadas em microarray (723 transcritos e 41.000 genes, respectivamente). Foram utilizados 14 casos de ODs microdissecados, sendo 7 OD grau II, e 7 AOD grau III (anaplasicos) sem histórico prévio de tratamento, além de 15 amostras de substancia branca não neoplásica (nnSB). Por meio de avaliações sistemáticas foram determinados miRNAs e mRNAs expressos em AOD grau III, mas não em OD grau II e em substancias brancas não neoplásicas (nnSB). 2 ODs when used with ,,s\" will represent both OD and AOD. Assim, foram encontrados 50 miRNAs com alta expressão e 43 miRNAs com baixa expressão em AOD-III, enquanto que 7 miRNAs apresentaram expressões reduzidas no grupo OD-II. Na comparação entre os dois grupos, 3 miRNAs apresentaram baixa expressão. A hsa-miR-23a mostrou alta expressão e a hsa-miR-27a apresentou uma diminuição de expressão importante em AOD III. A atividade dos hsa-miR-23a e hsa-miR-27a foram testadas em células de fibroblastos adultos humanos usando ensaios de proliferação celular e detecção de apoptose. As células tratadas com pre-miR-23a e pre-miR-27a mostraram 20% redução de proliferação celular em comparação com os controles. Para cada grupo, a relevância funcional dos miRNAs e seus mRNAs alvos foi validada utilizando qPCR. Dos 10 miRNAs submetidos a validação em grau III, foi possivel confirmar 7 miRNA(p<0,05). Entre esses, 5 miRs (miR-193a-3p, miR-24, miR- 27a, miR-30a-5p e miR-30c) mostraram expressão reduzida, cujos genes alvos (CCND1, HDAC2, PDGFA e RAB-26) apresentavam alta expressão. Enquanto que, 2 miRNAs como miR-301b e miR-378 apresentaram alta expressão cujos genes alvo BCL2, FGF2, CD44 e PPP4R4 foram confirmados por qPCR (p<0,05). Ferramentas de bioinformática (Gene Ontology) e a análises em rede revelaram que a expressão diferencial e os alvos são atribuídos à diferenciação de células-tronco embrionárias, adesão de celular, angiogênese e neurogênese, resistência à apoptose, interações proteína-proteína e proliferação celular. Foi possível identificar e validar miRNAs e RNAm-alvos potencialmente envolvidos na progressão de oligodendrogliomas. Coletivamente, esta análise fornece novos achados relacionados a progressão maligna de tumores oligodendrogliais e poderia facilitar o diagnóstico preciso e mais restritivo, o desfecho preditivo em pacientes, bem como auxiliar na decisão da terapia.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-11-28T14:00:16Z No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-22T20:36:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-22T20:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) Previous issue date: 2018-01-22 / O Brasil possui biomassa de origem lignocelulósica, de abundância, como os resíduos da indústria da cana de açúcar que, podem ser convertidos em produtos de alto valor agregado. Clostridium thermocellum é um microrganismo com grande potencial para degradação de celulose e biomassa lignocelulósica, devido à capacidade dessa bactéria em secretar um complexo multi-enzimático (celulossoma), formado por um arsenal de enzimas entre glicosil hidrolases, carboidrato esterases, e polissacarídeo liases, considerado carboidrato-ativas. Além disso, essa bactéria fermenta hexoses (C6) e não pentoses (C5), produzindo principalmente etanol, acetato e lactato. A regulação da expressão de genes, regulados pela fonte de carbono, é uma temática de contínuo estudo. Assim, foi realizado o proteoma descritivo de Clostridium thermocellum quando crescido por 96 horas em diferentes fontes de carbono: celulose, bagaço e palha de cana. Foram analisadas diferentes frações de conteúdo de proteína; sobrenadante (FS), ligado ao substrato (FES), e parcialmente purificado em coluna de exclusão molecular (CPP). Em todas as frações foram encontradas proteínas relacionadas à degradação da biomassa, em maior número em amostras de CPP de celulose, seguido pela amostra FES de palha. As exoglucanases CelS, CelK, CbhA, e proteínas estruturais CipA e OlpB foram encontradas em todos os substratos. Na amostra de bagaço foram identificadas as endoglucanases CelN, CelA, CelB, CelR, CelJ, CelQ, CelW, CelG e hemicelulases, Xgh74A, XynC, XynZ, Cthe_0798, sendo a última, presente também em palha. O transcritoma (RNAseq) e análise diferencial dos genes nas mesmas condições, porém em 37 horas, foi realizado. Das proteínas encontradas no proteoma, os genes cthe_0798 e xgh74A foram encontrados diferencialmente expressos em bagaço quando comparado com celulose, seguido pelos genes codificadores de CelP, CtMan5A, CelC, XynA, ManA, Cthe_1257, Cthe_3163 e Orf2p. Genes envolvidos na mobilidade celular, incluindo proteínas de formação de flagelos, motor e regulação, foram encontrados como a categoria (COG N) de maior regulação positiva em bagaço e palha. Na mesma categoria estão genes envolvidos na quimiotaxia e quorum sensing. Durante as análises do transcritoma foi verificada a presença de outra bactéria, Moorella thermoacetica, conhecida por não ser celulolítica, porém com a habilidade de fermentar açúcares C5 e C6. A análise de expressão diferencial de genes nos diferentes tratamentos, mostrou moth_0612 e moth_0699 regulados positivamente em bagaço, ambos codificando transportadores de ribose (C5). A análise de proteínas ortólogas entre as duas bactérias revelou que M.thermoacética não possui ortólogos com potenciais de atuar como enzimas carboidrato ativas de C.thermocellum. Relativo à C.thermocellum, o gene cthe_2196, ausente de caracterização, contendo os domínios GH43, CBM6 e Doquerina tipo I, foi encontrado expresso em bagaço e palha, ausente em celulose, além de ser predito como fazendo parte de um operon juntamente com cthe_2195. Cthe_2196, foi clonado em sistema pET, expresso em E.coli, e a proteína denominada AxB8 foi caracterizada bioquimicamente. AxB8 possui habilidade de degradar arabinoxilana e substratos sintéticos pNP-α-Larabinofuranosidase, e pNP-α-L-arabinofuranosidase. AxB8 apresenta domínio Glicosil hidrolase família 43, subfamília 29, e sua sequência mostrou maior similaridade com outras proteínas de termófilos não caracterizadas. Concluindo, os resultados desse trabalho demonstraram proteínas que são essenciais à degradação de bagaço e palha de cana, além de revelar importantes mecanismos regulados nessas condições que facilitam a proximidade da bactéria com o substrato, como os genes envolvidos na motilidade da bactéria. Essas informações podem ser utilizadas para desenvolvimento de novas linhagens e enzimas que aumentem o processo de degradação de biomassas lignocelulósicas, com o concomitante uso de produtos formados na geração de novas tecnologias. / Lignocellulosic biomass is in abundance in Brazil, as the residues of the sugar cane industry, which can be converted into products with high aggregated value. Clostridium thermocellum is a microorganism with great potential for degradation of cellulose and lignocellulosic biomass due to its ability to secrete a multi-enzymatic complex (cellulosome), formed by an arsenal of enzymes between glycosyl hydrolases, carbohydrate esterases, and polysaccharide lyases, considered Carbohydrate-active. In addition, this bacterium ferments hexoses (C6) and not pentoses (C5), mainly producing ethanol, acetate, and lactate. Metabolism gene expression, regulated by the carbon source, is a subject of continuous study. Thus, the descriptive proteome of Clostridium thermocellum was carried out when grown for 96 hours in different carbon sources: cellulose, bagasse and cane straw. Different fractions of protein content were analyzed; Supernatant (FS), bound to the substrate (FES) and partially purified by size exclusion chromatography (CPP). In all the fractions were found proteins related to the degradation of the biomass, in greater number in samples of cellulose CPP, followed by straw FES. The exoglucanases CelS, CelK, CbhA, and structural proteins CipA and OlpB were found in all substrates. In the bagasse sample the endoglucanases CelN, CelA, CelB, CelR, CelJ, CelQ, CelW, CelW, CelG and hemicellulases, Xgh74A, XynC, XynZ, Cthe_0798 were identified, the latter being also present in straw. Transcriptomic (RNAseq) and differential analysis of the genes under the same conditions, but growth at 37 hours, was performed. From the proteins found in the proteome, the encoding genes cthe_0798 and xgh74A were differentially expressed as bagasse when compared to cellulose, followed by the genes encoding CelP, CtMan5A, CelC, XynA, ManA, Cthe_1257, Cthe_3163 and Orf2p. Genes involved in cell motility(COG N), including flagella, motor and regulation proteins, were found in the highest category of up-regulation in bagasse and straw. In the same category were genes involved in chemotaxis and quorum sensing. During ranscriptomic analysis, was detected the presence of another bacterium, Moorella thermoacetica, knowing to be not ellulolytic, but having the ability to ferment C5 and C6 sugars. Differential gene expression in different treatments showed moth_0612 and moth_0699 up-regulated in bagasse, both encoding ribose (C5) transporters. Orthologous proteins analysis between the two bacteria revealed that M.thermoacética did not have orthologs with the potential to act as active carbohydrate enzymes from C.thermocellum. Regarding C.thermocellum, the cthe_2196 gene, absent from characterization, containing the domains GH43, CBM6 and Dockerin type I, was found expressed in bagasse and straw, but absent in cellulose, besides being predicted as part of an operon together with cthe_2195. Cthe_2196 was cloned into pET system, further expressed in E. coli, and the protein named AxB8 was characterized biochemically. AxB8 has the ability to degrade arabinoxylan and synthetic substrates pNP-α-L-arabinofuranosidase, and pNP-α-Larabinofuranosidase. AxB8 contains Glycosyl hydrolase family domain 43, subfamily 29, and its sequence showed greater similarity with other non-characterized thermophilic proteins. In conclusion, the results of this work demonstrated proteins that are essential for the degradation of sugarcane bagasse and straw, besides revealing important regulated mechanisms due to these conditions that facilitate the proximity of the bacterium with the substrate, as the genes involved in the motility of the bacteria. This information can be used to develop new strains and enzymes that increase the degradation process of lignocellulosic biomasses, with the concomitant use of products formed in the generation of new technologies.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-03T13:28:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2083437 bytes, checksum: 8f479543c8dc090087a91955c71d8ba0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-03T13:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2083437 bytes, checksum: 8f479543c8dc090087a91955c71d8ba0 (MD5) Previous issue date: 2014-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os parasitos do gênero Leishmania, que causam um amplo espectro de desordens clínicas referidas comumente como leishmanioses, são um grande problema de saúde pública em vários países. A leishmaniose tegumentar americana está entre as endemias de maior importância em saúde pública no Brasil, devido a fatores como: ampla distribuição pelo território nacional, ocorrência de formas clínicas graves e limitações referentes tanto ao diagnóstico como ao tratamento, sendo a L. (V.) braziliensis uma das principais espécies de importância epidemiológica para a LTA no Brasil. Atualmente existem diversas tecnologias que permitem o sequenciamento do DNA em larga escala, sendo a plataforma 454/Roche utilizada neste trabalho. Assim, este trabalho utilizou ferramentas de bioinformática para montar e analisar o transcriptoma de L. (V.) braziliensis através do sequenciamento do transcriptoma de dois isolados (ET e NSL), que apresentam diferença significativa na virulência em modelo murino. Foram preparadas duas formas evolutivas para cada isolado: metacíclica (MET) e procíclica (PRO). Desta forma foram analisadas quatro bibliotecas. Após sequenciamento, os dados foram visualizados com o programa fastQC, tratados com FASTX- Tollkit e Prinseq-Lite e montados com programa Newbler. A montagem (Assembly) foi efetuada de duas maneiras distintas: primeiro efetuou-se a montagem com as reads de cada biblioteca e posteriormente, as reads das quatro bibliotecas foram alocados em arquivo único para realização de um novo assembly. As open reading frame (ORFs), que são regiões com potencial para codificar proteínas, foram preditas utilizando as sequências resultantes da montagem. A anotação foi efetuada através de duas abordagens: transferência de informações do genoma anotado automaticamente para as ORFs preditas e pela abordagem baseada em homologia de sequências através da ferramenta de anotação funcional Blast2GO. Após anotação, efetuou-se a análise da expressão gênica diferencial através de duas abordagens diferentes: a primeira, utilizou o método de Blind do pacote DESeq do R/Bioconductor e a segunda utilizou uma abordagem baseada em RPKM. Foram produzidas 3.095.724 reads, sendo 916.546, 589.554, 1.083.312 e 506.312 sequências para ET-MET (biblioteca 1), ET- PRO (biblioteca 2), NSL-MET (biblioteca 3) e NSL-PRO (biblioteca 4), respectivamente. Após o tratamento, utilizou-se para o restante das análises 2.899.230 sequências. Com o intuito de validar algumas das análises, foi utilizado neste trabalho um segundo conjunto de reads (Illumina) baixado do banco de dados SRA (Sequence Read Archive) indexado ao NCBI, sendo este composto por 52.014.768 de reads paired end. Após o tratamento, utilizou- se para o restante das análises 47.377.233 de reads. Os resultados das análises com as reads sequenciadas neste trabalho e com os contigs montados, tal como o mapeamento destes no genoma anotado de L. (V.) braziliensis, produziu novas informações ao orfeoma anotado automaticamente de L. (V.) braziliensis. Após montagem, obteve-se 14.362, 13.145, 14.899 e 11.434 contigs maiores que 100 pb para as bibliotecas 1, 2, 3 e 4, respectivamente. Obteve-se como resultado da montagem, considerando as reads de todas as bibliotecas, 14.017 contigs. As ORFs preditas à partir dos contigs que não mapearam no genoma anotado foram utilizados para busca de novos genes de L. (V.) braziliensis. Como resultado, foi possível encontrar seis novos genes, 117 possíveis ORFs sem hits no banco de dados nr e 85 ORFs que, por algum motivo, deixaram de fazer parte do genoma anotado. Foram encontrados, ao se comparar as reads obtidas neste trabalho com o genoma anotado, 6.293 sítios com identidades diferentes, que pode ser devido a divergência alélica entre os isolados analisados ou devido ao polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). / Parasites of the genus Leishmania, which cause a broad spectrum of clinical disorders referred to commonly as leishmaniasis, are a major public health problem in many countries. American cutaneous leishmaniasis is among the endemic most important in public health in Brazil, due to factors such as: wide distribution throughout the country, the occurrence of severe clinical forms and limitations relating to both diagnosis and treatment, with L. (V.) braziliensis being one of the main species of epidemiological significance to the LTA in Brazil. Currently there are several technologies that allow the DNA sequencing in large scale, being the 454/Roche platform used in this work. Thus, this study used bioinformatics tools for assembly and analyze the transcriptome of L. (V.) braziliensis through transcriptome sequencing of two isolates (ET and NSL), which present significant difference in virulence in murine model. Were prepared two evolutionary forms for each isolate: metacyclic (MET) and procyclical (PRO). Thus, four libraries were analyzed. After sequencing, the data were visualized with fastQC program, treated with FASTX-Tollkit and Prinseq-Lite and assembly with Newbler v.2.5.3 program. The assembly was conducted of two distinct ways: first performed the assembly whit the reads from each sample and then, the reads of the four samples were placed in single file to perform a new assembly. The open reading frame (ORF), which are regions with potential to encode a protein were predicted using the resulting assembly. The annotation was carried out using two approaches: transfer of information of automatically annotated genomic to predicted ORFs and by approach based on sequence homology by functional annotation tool Blast2GO. After annotation, performed the analysis of differential gene expression by two different approaches: first, was used the Blind method of DESeq package the R/Bioconductor and the second was used an approach based on RPKM. 3.095.724 reads were produced, with 916.546, 589.554, 1.083.312 and 506.312 sequences for ET-MET (sample 1), ET-PRO (sample 2), NSL-MET (sample 3) and NSL- PRO (sample 4), respectively. After treatment, was used for the remaining analysis 2.899.230 sequence. In order to validate some of the analysis, was used in this study, a second set of reads (Illumina) downloaded from the database SRA (Archive Sequence Read) indexed to NCBI, this being composed of 52.014.768 of reads paired end. After treatment, was used for the remainder analysis 47.377.233 of reads. The results of the analysis with the reads sequenced this work and with the assembly contigs, such as mapping of these in annotated genome the L. (V.) braziliensis, produced new information to automatically annotated orfeoma of L. (V.) braziliensis. After assembly, we obtained 14.362, 13.145, 14.899 and 11.434 contigs larger than 100 bp for samples 1, 2, 3 and 4, respectively. It was obtained as a result of assembly, considering the reads from all samples, 14.017 contigs. The ORFs predicted from contigs not mapped the annotated genome were used to search for new genes of L. (V.) braziliensis. So, were found six new genes, 117 ORFs possible without hits in the nr database and 85 ORFs that, for some reason, no longer in the annotated genome. Were found, when comparing the reads obtained in this work with the annotated genome, 6.293 sites with different identities, which may be due to the allelic divergence between the isolates analyzed or due to single nucleotide polymorphisms (SNPs).

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T13:05:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Tulio_Diego_da_Silva.pdf: 899273 bytes, checksum: fa3051c19d26c20f1582174ad9033bfb (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T13:05:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Tulio_Diego_da_Silva.pdf: 899273 bytes, checksum: fa3051c19d26c20f1582174ad9033bfb (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / O tomateiro (Solanum lycopersicum) é uma das principais hortaliças de valor econômico no mundo e é a segunda solanácea mais cultivada, sendo superada apenas pela batata. Essa espécie está sujeita a várias doenças que comprometem seu desenvolvimento, dentre elas está a murcha de fusário, causada pelo fungo de solo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol). Para está doença o controle químico não é eficiente, assim o uso de cultivares resistentes representa um dos melhores recursos para evitar o prejuízo causado pelo fungo. A proteômica é uma grande ferramenta no estudo de diversos estresses, permitindo a identificação de proteínas alvo no melhoramento genético, a fim de se obter genótipos resistentes. Neste contexto, analisou-se o perfil das proteínas secretadas pelo tomateiro frente ao Fol, para se identificar aquelas que estejam relacionadas com a defesa ao fitopatógeno. Para isso utilizou-se o genótipo BHRS, resistente a isolados da raça 2 do Fol. Coletou-se o tecido radicular da planta, nos tempos 1, 2, 4 e 6 dias após inoculação (DAI). Em seguida as proteínas totais foram extraídas, solubilizadas e separadas por eletroforese bidimensional (2-DE), para posterior identificação via espectrometria de massas. As proteínas do tomateiro apresentam um caráter ácido, não apresentando boa resolução na faixa de pH 3-10. Por isso utilizou-se tiras de pH 4-7 na primeira dimensão da 2-DE. Pode-se reconhecer aproximadamente 500 proteínas diferentes em cada gel e 34 proteinas com expressão diferenciada no experimento. Estas proteínas foram analisadas pelo espectrômetro do tipo MALDITOF/ TOF. As proteínas identificadas foram agrupadas de acordo com os grupos funcionais, para melhor descrever seu papel no metabolismo durante a infecção. Encontraram-se proteínas relacionadas com patogenicidade e relacionadas com a reação de hipersensibilidade. Também foram encontrados proteínas de sinalização, relacionadas com outros mecanismos de defesa e de metabolismo primário. A presença de grupos protéicos relacionados com a resistência a patógenos evidencia alguns dos mecanismos que confere ao genótipo de tomateiro BHRS a qualidade de resistente a fusariose. Entretanto mais estudos são necessários, principalmente nas proteínas de membrana e parede celular, a fim de obter informações sobre a interação inicial entre a planta e o fungo.

Gramíneas cultivadas, como trigo, cevada e milho são produtos agrícolas de fundamental importância no Brasil. Entre os fatores causadores de perdas na produção de grãos dessas espécies estão os estresses causados por fitopatógenos como Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae Schw.), agente causador da fusariose e de difícil controle químico, biológico ou mesmo genético. Uma estratégia que tem se mostrado eficiente no controle de doenças é a utilização de microrganismos antagonistas a diferentes fitopatógenos, dentre os quais destaca-se a bactéria P. agglomerans. O presente trabalho teve como objetivo identificar genes diferencialmente expressos em interações fungo fitopatogênico-microrganismo antagonista, considerando como modelo o sistema F. graminearum-P. agglomerans. A construção de uma biblioteca de cDNA de F. graminearum cultivado in vitro proporcionou a geração de 1.983 seqüências válidas, resultando em 1.283 unigenes. As categorias de maior representatividade desta biblioteca foram aquelas constituídas por proteínas envolvidas em vias da informação genética - DNA-RNA-proteína (26 %); proteínas hipotéticas (24 %) e proteínas do metabolismo (16 %). Tanto a categoria de proteínas envolvidas nos processos de desenvolvimento como as envolvidas na percepção a estímulos externos constituíram 10 % dos unigenes. Dentre os genes presumivelmente anotados, foram identificados aqueles codificadores de enzimas de importantes rotas metabólicas como gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, fosfoglicerato quinases e fosfoenolpiruvato carboxilases, como também componentes produzidos pelo metabolismo secundário como micotoxinas e outras proteínas associadas a estresse e patogenicidade de fungos. Neste trabalho também foi verificado o potencial de antagonismo in vitro da bactéria P. agglomerans frente a três fitopatógenos de trigo: Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem e Bipolaris sorokiniana (Sacc. in Sorok.) e F. graminearum. Foi verificado que a inibição do crescimento destes fungos está associada à liberação de compostos solúveis e voláteis pela bactéria, que foram responsáveis por cerca de 50 % e 40 % de inibição, respectivamente. O perfil da expressão gênica de F. graminearum na interação com a bactéria P. agglomerans foi avaliado via macroarranjo. Dos 1.014 genes avaliados, 29 genes de F. graminearum foram diferencialmente expressos (p < 0,05) durante a interação com a bactéria antagonista, sendo 19 genes induzidos e 10 genes reprimidos. Entre os transcritos induzidos foram identificadas proteínas envolvidas nos processos de defesa e/ou virulência de fungos, cuja expressão foi induzida em resposta a estresses tanto abióticos como bióticos. Dos genes que foram reprimidos, destacaram-se: um transcrito com similaridade a uma proteína com um domínio do tipo dedo de zinco ?zinc finger? que é um fator de transcrição importante no processo de divisão celular, bem como proteínas envolvidas na cadeia respiratória, na modulação protéica e sinalização celular. Os dados do macroarranjo foram validados via transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-PCRq), metodologia que se mostrou adequada para complementar a análise transcricional obtida por macroarranjo. As informações geradas na análise de antagonismo in vitro, bem como a análise e seqüenciamento dos transcritos, juntamente com a quantificação do nível de expressão na interação, foram fundamentais para compreender o padrão de resposta do fungo F. graminearum na interação com a bactéria P. agglomerans. / Cultivated grasses such as wheat, barley and maize are agricultural products of fundamental economic and social importance in Brazil. Among causing factors of important grain production losses in these species are diseases caused by phytopathogenic fungi such as Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae Schw.), the causal agent of fusariosis, a disease of difficult chemical, biological or even genetic control. An efficient and promising strategy to be adopted in order to protect cultivated plants against such diseases is the selection of antagonist microorganisms, amongst them the bacteria Pantoea agglomerans. This microbiota might have an important impact in scab control, isolated or in an integrated management program with chemical treatment. The present work aimed at identifying differentially expressed sequences in pathogenic fungi-antagonistic microorganisms interactions, considering the F. graminearum ? P. agglomerans model. The construction of a cDNA library for F. graminearum grown in PDA medium generated 1,983 valid sequences and provided 1,283 unigenes. The most representative categories in this library were proteins involved in genetic information pathways, DNA-RNA-protein (26 %); hypothetical proteins (24 %); and proteins involved in metabolism (16 %). The protein category involved in developmental processes as well as those related to external stimuli perception comprised 10 % of the obtained unigenes. Among putatively annotated genes, some coding for enzymes of important metabolic routes were identified, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase and phophoenolpyruvate carboxylase. Also secondary metabolism compounds, specially micotoxins and proteins related to fungi stresses and pathogenicity were identified. In the present work, the control of three wheat phytopathogens, Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem, Bipolaris sorokiniana (Sacc.in Sorok.) and F. graminearum, using specific isolates of P. agglomerans was demonstrated. It was observed that the 50 % and 40 % growth inhibition of these fungi is associated to the bacteria release of soluble and volatile compounds, respectively. The gene expression profile of F. graminearum during interaction with the bacteria P. agglomerans was evaluated via macroarray. Among the 1,014 analysed genes, 29 F. graminearum genes were differentially expressed (p < 0,05) during its interaction with the antagonist bacteria: 19 genes were induced while 10 genes were repressed. Among the induced transcripts, proteins involved in fungi defense and/or virulence processes were identified, whose expression was induced in reponse to abiotic or biotic stresses. Among the identified repressed genes, a transcript similar to a protein containing a zinc finger-type domain, a transcription factor relevant in cell division, deserves special attention, as well as proteins involved in respiratory chain, in protein modulation and in cell signaling. Additionally, the macroarray data were validated by reverse transcription followed by real-time quantitative PCR (RT-PCRq), a suitable method for complementing transcriptional analysis through macroarray. Finally, the information generated in in vitro pathogenic fungi-antagonistic microorganisms interactions analysis, as well as in the analysis and sequencing of the obtained transcripts, together with the determination of the level of expression during the evaluated interactions were essential for better understanding the response pattern of the fungus F. graminearum in interaction with the bacteria P. agglomerans