Contexte : Les vésicules extracellulaires (VE), très étudiées ces dernières années, possèdent des potentialités très prometteuses pour la médecine de nos jours, dans le diagnostic et le traitement des maladies. Cependant, leur diversité, en termes de contenu et d’origine cellulaire, influence leur comportement et leur cible. Par conséquent, il est important d’étudier des différentes façons que les VE peuvent agir face à des modifications en vue d’être plus spécifique dans les choix de VE pour une cible déterminée. Méthode : Des modifications géniques et biochimiques, basées respectivement sur la méthode CRISPR (TSG101 Knock out), l’inhibition enzymatique (nSMase 2) et la méthode de Gibson (IGF1R5-H2), ont été apportées sur des cellules HEK293T. Les VE de ces cellules modifiées ont été ensuite étudiées en termes de nombre, de taille et de contenu en certains marqueurs protéiques et micro-ARN d’une part, et injectées aux souris, d’autre part, afin d’observer leur préférence de distribution. Résultats : Ici nous rapportons que les cellules avec TSG101 Knock out et inhibition de la nSMase 2 ont une production moindre de VE d’environ 50%. Ces VE sont de plus grande taille avec une diminution de certains marqueurs protéiques et un enrichissement en miR-451 diminué. Les VE des cellules H2 ont une plus grande absorption au cerveau comparativement aux VE des cellules U118 et HEK293T. Conclusion : Notre étude a démontré que des sous-populations de VE peuvent être différenciées à partir de la déplétion de gène ou l’inhibition d’enzyme pour la non-expression de protéines réputées d’être importantes pour leur production. Par ailleurs, des modifications cellulaires pour l’expression de certains anticorps produisent des VE avec une affinité particulière.

Dans cette étude on décrit une méthode reproductible et efficace pour isoler des cellules microgliales et leurs exosomes. Les résultats montrent qu'il n'y a pas de différences morphologiques entre les cellules microgliales issues d'origines tissulaires différentes e.g. cortex et moelle épinière. D'autre part, en utilisant une plateforme de protéomique à grande échelle, nous démontrons que les microglies dérivées du cortex et de la moelle épinière des rats expriment des phénotypes différents tant dans les conditions physiologiques normales ou inflammatoires. Cette différence a été confirmée également au niveau des exosomes qu’elles sécrètent.Des essais biologiques in vitro démontrent que les exosomes dérivées de microglies testées sur des sphéroïdes 3D de gliomes de rat étaient capables d'inhiber l'invasion tumorale. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que des exosomes dérivées de la microglie pouvaient être utilisés comme agents nano thérapeutiques vis-à-vis des gliomes. Sur la base des études précédentes conduites au laboratoire, nous avons montré que les EVs isolées à partir de macrophage KD PC1/3 traitées avec Paclitaxel inhibaient la croissance de la lignée C6 de gliome de rat. Nous avons isolé les exosomes et nos résultats mettent en valeur le potentiel d'une stratégie thérapeutique combinant Paclitaxel et inhibition de PC1/3 et utilisation des exosomes produits par ces cellules comme agents thérapeutiques. / In present study, we present a reproducible and an efficient method for isolating microglial cells and their exosomes. The results show that there are no morphological differences between microglial cells from different tissue origins e.g. cortex and spinal cord. On the other hand, using a large-scale proteomic platform, we demonstrate that microglia derived from the cortex and spinal cord of rats express different phenotypes under both normal and inflammatory physiological conditions. This difference has also been confirmed at the level of the exosomes they secrete.In vitro bioassays demonstrate that microglia-derived exosomes tested on 3D spheroids of rat gliomas were able to inhibit tumor invasion. These results made it possible to demonstrate that exosomes derived from microglia could be used as nano-therapeutic agents vis-à-vis gliomas.Based on previous studies conducted in the laboratory, we have shown that EVs isolated from KD PC1/3 macrophage treated with Paclitaxel inhibited the growth of the rat glioma C6 line. We isolated the exosomes and our results highlight the potential of a therapeutic strategy combining Paclitaxel and PC1/3 inhibition and use of the exosomes produced by these cells as therapeutic agents.

Dans l’environnement marin, les surfaces artificielles sont rapidement colonisées par des bactéries qui s’organisent en communautés appelées biofilms, s’entourant d’une matrice de substances polymériques extracellulaires (EPS). La formation d’un biofilm est une étape critique du processus nommé biofouling, c’est-à-dire l’accumulation de micro- et de macro-organismes sur une surface immergée, pouvant conduire à des conséquences néfastes dans le secteur marin. Dans cette étude, il s’agit d’identifier des souches bactériennes isolées de supports immergés en Mer Méditerranée et de les caractériser phénotypiquement par diverses approches. Leur capacité à former un biofilm in vitro a été évaluée dans différentes conditions avec une attention particulière portée sur leurs capacités à produire une matrice polymérique abondante riche en polysaccharides; l’objectif étant d’isoler des exopolysaccharides originaux à activité antifouling. Treize souches ont ainsi fait l’objet d’analyses phylogénétiques et d’une caractérisation phénotypique. Sept genres et douze espèces différentes ont été identifiés au sein desquelles deux isolats peuvent être affiliés à une nouvelle espèce, nommée Persicivirga mediterranea. Ce genre n’a jamais été décrit en Mer Méditerranée jusqu’à présent. L’extraction des EPS de chaque souche cultivée en biofilm a permis de déterminer leur composition générale en glucides, protéines, acides nucléiques et lipides. Une souche, Pseudoalteromonas ulvae TC14, se distingue par sa capacité à produire des exopolysaccharides en quantité importante. Il s’agit essentiellement de polymères du glucose dont les analyses chromatographiques et spectroscopiques ont révélé la diversité de taille (Mw ~ 1–4000 kDa), de charge (neutre ou anionique) et de fonction associée (lactate ou acétate). Les fractions d’EPS enrichies en polysaccharides inhibent la formation de biofilm par d’autres souches marines. Ces derniers sont également synthétisés par les bactéries en culture planctonique mais en proportions très différentes. / In marine environment, artificial surfaces are promptly colonized by biofilms, which are communities of bacteria surrounded by matrix of extracellular polymeric substances (EPS). Formation of biofilm is a critical step of biofouling development, which corresponds to the accumulation of micro and macro-organisms on immersed surfaces and which can have important negative ramifications in particular in the marine sector. In this study, bacteria isolated from the Mediterranean Sea have been identified and characterized using different phenotypical tools. Their capacity to form a biofilm in vitro has been studied in different conditions, with a particular focus on their ability to produce abundant carbohydrate-rich EPS, the overall objective of the study being the isolation of original antifouling-active exopolysaccharides. Thirteen strains have been phylogenetically and phenotypically characterized. Seven genera and twelve species were identified among which two isolates were affiliated to a new species, named Persicivirga mediterranea. This genus has never been described in the Mediterranean Sea. Extraction of EPS of each strain, grown in biofilm conditions, allowed the determination of their general composition in carbohydrates, proteins, nucleic acids and lipids. One strain, Pseudoalteromonas ulvae TC14, was able to produce large quantities of exopolysaccharides, comprising in majority polymers of glucose whose chromatographic and spectroscopic analyzes revealed a diversity in size (Mw ~ 1-4000 kDa), charge (neutral or anionic) and associated function (acetate or lactate). These polysaccharides inhibited biofilm formed by other marine strains isolated from the Mediterranean Sea. They can also be synthesized by planktonic TC14, but in very different proportions.

La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) est la leucémie la plus fréquente des pays occidentaux. Cette maladie est caractérisée par l’accumulation de lymphocytes B (LB) monoclonaux (CD5+/CD19+/CD23+) dans le sang, la moelle et les organes lymphoïdes secondaires. Malgré d’importants progrès durant cette dernière décennie, la LLC reste incurable avec les traitements classiques. De manière intéressante, son évolution clinique est hétérogène :certains patients ne présenteront aucun symptôme alors que d’autres évolueront rapidement nécessitant une intervention thérapeutique. De nombreuses interactions entre les cellules leucémiques et le microenvironnement (ME) médullaire, composé entre autres de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sécrétant une matrice extracellulaire, jouent un rôle important dans la survie cellulaire et la résistance à la chimiothérapie. Actuellement la nature des communications entre le clone leucémique et son ME n’est pas encore complétement élucidée. Notre objectif est d’étudier l’impact des vésicules extracellulaires (VEs abréviées ici EVs) (microparticules et exosomes) du ME, spécifiquement des CSM, sur les LB de LLC. Dans la 1ère partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à la caractérisation des microparticules (MPs) par cytométrie en flux (CMF). Cette technique est un des meilleurs moyens de déterminer le phénotype des MPs, elle permet d’étudier les vésicules de 300 nm à 1 µm, excluant donc les exosomes, dont la taille est inférieure à 100 nm. Nous avons ainsi pu caractériser les MPs provenant de plaquettes et d’érythrocytes grâce à la présence respective des antigènes CD41/61 et du CD235a. Par contre, concernant les antigènes classiques des cellules mononucléées (CD3-14-19-20-56), aucun antigène n’a pu être détecté sur les MPs provenant des lymphocytes T (LT), des monocytes, des LB normaux et leucémiques et des cellules ‘’natural killer’’ (NK). Le signal positif obtenu dans certains cas était la conséquence d’un marquage aspécifique. Nous avons dès lors proposé un contrôle négatif supplémentaire qui ne se limite pas à l’utilisation d’isotypes mais qui se base sur des marquages croisés. Grâce à ce travail, nous avons démontré que les MPs dérivant de cellules positives pour un antigène donné n’étaient pas automatiquement positives pour ce dernier. Dans la seconde partie du travail, nous avons étudié les MPs et les exosomes provenant du ME médullaire, regroupés sous le terme EVs. Nous avons démontré que leur intégration dans les LB de LLC est très rapide et qu’elle permet une diminution de l’apoptose ainsi qu’une augmentation de la viabilité et de la migration des cellules leucémiques. Les EVs augmentent leur chimiorésistance vis-à-vis de différents agents leucémiques. A l’aide de la technologie Affymetrix, nous avons comparé les profils d’expression génique des LB leucémiques, ayant reçu ou non des EVs du ME. Ces analyses ont mis en évidence 805 gènes différentiellement exprimés entre les deux conditions. Une grande partie de la signature obtenue suite à l’intégration des EVs, partage de nombreuses similitudes avec des signatures de LB de LLC ayant eu un contact avec des cellules nourricières ou ayant reçu différents stimuli. Le point commun parmi ces différentes signatures est l’activation de la voie du ‘’B-cell receptor’’ (BCR) ;les EVs de CSM semblent en effet avoir la capacité d’induire dans les LB de LLC une réponse semblable à celle d’une activation BCR. Dans cette étude, nous avons démontré que le ME médullaire, en plus d’interagir par contact direct avec les LB de LLC et par la production de facteurs solubles, est également capable d’influencer le comportement des cellules leucémiques via la production d’EVs. Nos données suggèrent un rôle important des EVs dans la survie cellulaire et l’évolution de la LLC et ouvrent donc la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le séquençage à haut débit est une technique très utile pour l’étude des ARN. Pendant mon doctorat, nous l’avons utilisé pour la caractérisation des ARN extracellulaire (ARNex) du plasma humain. Les ARNex du plasma sont retrouvés soit à l’état soluble sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ou encapsulés au sein de vésicules extracellulaires (VE) de diverses origines (exosomes, microvesicles, …). Dans ce projet, j’ai démontré que le plasma contenait principalement des micro ARN, le fragment hY4 et des ARN ribosomiques dégradés. Par ailleurs, après chromatographie à exclusion de tailles ou par traitement consécutif protéinase K/RNase A, des VE hautement purifiées peuvent être obtenus. Nous ne retrouvons plus en majorité les micro ARN et l’ARN hY4 dans ces échantillons mais plutôt des ARN du microbiote humain, montrant une composition différente entre les ARNex solubles et ceux des vésicules purifiées. Par ailleurs, j’ai également effectué une étude comparative de kits commerciaux qui sont supposés purifier les exosomes par précipitation. La composition en ARN de ces fractions est très similaire au plasma humain total, montrant une forte contamination par les RNP solubles. Ainsi, nous sommes en mesure de proposer un protocole pour l’étude des ARNex dans le cadre de biopsies liquides avec des échantillons cliniques afin de découvrir de potentiels biomarqueurs de diagnostic. Au-delà de la caractérisation d’ARN, le séquençage à haut-débit peut être utilisé pour la détection et quantification des modifications post-transcriptionnelles. Pendant ma thèse, j’ai utilisé le séquençage pour l’analyse des 2’O-méthylation des ARN de transfert chez E. coli par RiboMethSeq. Sous plusieurs conditions de stress (manque de nutriments ou des concentrations non létales d’antibiotiques), certaines 2’O-méthylations montrent une réponse adaptative. Alors que plus de la moitié des 2’O-méthylations en position 18 (Gm18) sont augmentées dans toutes les conditions de stress étudiées, les positions Nm34 montrent un effet opposé avec une diminution dans certains stress (chloramphénicol et streptomycine). Chacun de ces deux comportements peut être relié à un phénomène de régulation cellulaire en réponse au stress : un changement au niveau de la wobble base pourrait être un moyen de réguler la traduction en modifiant l’usage des codons. En ce qui concerne Gm18, son rôle dans l’évasion du système immunitaire inné lors de l’invasion d’un hôte est en cours d’élucidation. / For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNA and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were not present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which are supposed to purify human exosomes by precipitation. Their RNA composition was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments (chloramphenicol and streptomycin). Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated.

Les vésicules extracellulaires (EVs) participent à la communication intercellulaire. Dans la littérature actuelle, elles sont divisées en deux classes principales selon leur origine intracellulaire. En premier lieu, les exosomes sont formés à l'intérieur des endosomes multivésiculaires et sont libérés lors de la fusion de ces compartiments avec la membrane plasmique (MP). La taille des exosomes est contrôlée au cours de leur biogenèse et varie de 50 à 150 nm. Deuxièmement, les EVs sont formées par bourgeonnement direct et sécrétion à partir de la MP. Ces EVs sont plus hétérogènes et leur taille varie de 50 à 1000 nm. Malgré le fait que la nature hétérogène de EVs soit clairement documentée dans la littérature, la composition en protéines et les mécanismes exacts de la biogenèse des différentes EVs restent un sujet de débat en cours. Le but principal de ce travail était de redéfinir autant de sous-types différents d’EVs que possible, en trouvant des marqueurs protéiques spécifiques, et d'étudier les outils possibles pour affecter spécifiquement leur sécrétion. Dans ce projet, nous avons mis en place plusieurs outils utiles pour la caractérisation d’EVs. Tout d'abord, mes principaux efforts ont été concentrés sur la mise en place de plusieurs protocoles d'isolation et d'analyse d’EVs. Cela a conduit à la production d'une cartographie des protéines vésiculaires, qui si elle est appliquée pour caractériser les EVs, permettra de mieux les identifier par leur composition. Deuxièmement, j'ai étudié la façon dont la sécrétion de ces sous-populations d’EVs peut être modulée par l'inhibition de quelques protéines de la famille RAB et par certaines drogues. Enfin, grâce à une collaboration établie au sein de l'unité, j'ai eu l'occasion de participer à une comparaison des propriétés fonctionnelles entre les EVs et les virus sécrétés simultanément par les cellules infectées. Mes résultats confirment l'hypothèse selon laquelle l'origine intracellulaire des EVs sera reflétée dans leur composition. Les résultats présentés confirment la coexistence de plusieurs classes d'EVs et donnent un aperçu sur les moyens de les caractériser dans une préparation d’EVs donnée. En outre, nous fournissons un exemple de l'application de notre ensemble de protéines dans les études portant sur la biogenèse des EVs. / Extracellular vesicles (EVs) are participating in intercellular communication. Classically, in the current literature, they are divided into two main classes depending on their intracellular origin. Firstly, exosomes are formed within multivesicular endosomes and released upon fusion of these compartments with plasma membrane. The size of exosomes is controlled during their biogenesis and ranges from 50 to 150 nm. Secondly, EVs are formed by direct budding and pinching off from the plasma membrane. These EVs are more heterogeneous and their size varies from 50 to 1000 nm. Despite the fact that a heterogeneous nature of EVs is clearly documented in the literature, the exact protein content and biogenesis mechanisms of different EVs remain a matter of on-going debate. The principal goal of this work was to re-define as many different subtypes of EVs as possible, by finding specific protein markers, and investigate possible tools to affect specifically their secretion. In this project, we set up several tools useful for EV characterization. Firstly, my main efforts were concentrated on establishment of several protocols to isolate and analyse EVs. This led to the foundation of a vesicle protein cartography, which if applied to characterize EVs, will allow better understanding of the composition of the studied EVs. Secondly, I investigated how secretion of these EV subpopulations might be modulated by inhibition of a few RAB proteins and by some drugs. Finally, thanks to a collaboration established within the unit, I had the opportunity to participate in a comparison of the functional properties between EVs and viruses secreted simultaneously by infected cells. My results confirmed the hypothesis that the intracellular origin of EVs will be reflected in their composition. The results presented in this study point at the coexistence of several EV classes and provide insights on how to demonstrate their presence in a given EV preparation. In addition, we provide an example of the application of our set of proteins in studies addressing EV biogenesis.

Les syndécans forment une famille de quatre protéines transmembranaires qui sont substituées par l'héparane sulfate. Grâce à ces chaînes glucidiques extracellulaires, les syndécans contrôlent la signalisation d'une pléthore de facteurs de croissance et de molécules d'adhésion. Une autre caractéristique remarquable des syndécans est la conservation de leur domaine intracellulaire au cours de l'évolution. Ce domaine contient un motif C-terminal qui peut induire une interaction avec les protéines dites «PDZ». Les interactions PDZ sont promiscues et les protéines PDZ contrôlent divers aspects de la signalisation cellulaire et de la communication cellule-cellule. Quatre interactions syndecan-PDZ ont été décrites à ce jour et toutes ces interactions ont des effets drastiques sur le comportement des cellules. En particulier, il a été documenté que l'interaction syndécan-synténine a un impact sur le trafic intracellulaire de molécules de signalisation liant l’héparan sulfate. De plus, les syndécans et la synténine coopèrent dans le contrôle la biogenèse des exosomes, organites extracellulaires fonctionnant comme des médiateurs importants de la communication cellule-cellule (y compris dans différentes maladies systémiques comme le cancer). Le protéome humain compte 150 protéines PDZ qui contiennent 266 domaines PDZ. Dans ce travail, nous avons mis à jour la complexité de l'interactome syndecan-PDZ et testé son impact sur le trafic membranaire et sur la composition des vésicules extracellulaires. Notre travail ouvre la voie à une meilleure compréhension des réseaux moléculaires contrôlant la communication cellule-cellule en physio-pathologie. / Syndecans form a family of four transmembrane proteins that are substituted with heparan sulfate. By virtue of these extracellular carbohydrate chains, syndecans control the signaling of a plethora of growth factors and adhesion molecules. Another remarkable feature of syndecans is the conservation of their intracellular domain through evolution. This domain contains a C-terminal motif that can mediate interaction with PDZ proteins. PDZ interactions are promiscuous and PDZ proteins control various aspects of cell signaling and cell-cell communication. Four syndecan-PDZ interactions have been described so far and all these interactions have broad effects on cell behavior. In particular, it was documented that syndecan-syntenin interaction has impact on the intracellular trafficking of heparan sulfate cargo. Moreover syndecan-syntenin controls the biogenesis of exosomes, extracellular organelles emerging as important mediators of cell-cell communication in health and diseases. The human proteome contains 150 PDZ proteins and 266 PDZ domains. Here we started addressing the complexity of the syndecan-PDZ interactome and tested for its impact on membrane trafficking and on the composition of extracellular vesicles. Our work paves the way for a better understanding of the molecular mechanisms and networks controlling cell-cell communication in health and disease.

Dans l'environnement marin, les surfaces artificielles sont rapidement colonisées par des bactéries qui s'organisent en communautés appelées biofilms, s'entourant d'une matrice de substances polymériques extracellulaires (EPS). La formation d'un biofilm est une étape critique du processus nommé biofouling, c'est-à-dire l'accumulation de micro- et de macro-organismes sur une surface immergée, pouvant conduire à des conséquences néfastes dans le secteur marin. Dans cette étude, il s'agit d'identifier des souches bactériennes isolées de supports immergés en Mer Méditerranée et de les caractériser phénotypiquement par diverses approches. Leur capacité à former un biofilm in vitro a été évaluée dans différentes conditions avec une attention particulière portée sur leurs capacités à produire une matrice polymérique abondante riche en polysaccharides; l'objectif étant d'isoler des exopolysaccharides originaux à activité antifouling. Treize souches ont ainsi fait l'objet d'analyses phylogénétiques et d'une caractérisation phénotypique. Sept genres et douze espèces différentes ont été identifiés au sein desquelles deux isolats peuvent être affiliés à une nouvelle espèce, nommée Persicivirga mediterranea. Ce genre n'a jamais été décrit en Mer Méditerranée jusqu'à présent. L'extraction des EPS de chaque souche cultivée en biofilm a permis de déterminer leur composition générale en glucides, protéines, acides nucléiques et lipides. Une souche, Pseudoalteromonas ulvae TC14, se distingue par sa capacité à produire des exopolysaccharides en quantité importante. Il s'agit essentiellement de polymères du glucose dont les analyses chromatographiques et spectroscopiques ont révélé la diversité de taille (Mw ~ 1-4000 kDa), de charge (neutre ou anionique) et de fonction associée (lactate ou acétate). Les fractions d'EPS enrichies en polysaccharides inhibent la formation de biofilm par d'autres souches marines. Ces derniers sont également synthétisés par les bactéries en culture planctonique mais en proportions très différentes.

La mucoviscidose est une maladie génétique due à des mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), conduisant à un défaut d'adressage de la protéine CFTR à la membrane apicale des cellules épithéliales, ou à un déficit de sa fonction de canal à ions chlorure. Ce travail a consisté à étudier les vésicules extracellulaires (EV), microvésicules (MV) et exosomes (Exo), comme vecteurs de la protéine CFTR et de son ARN messager. La preuve de concept du transfert de matériel biologique d'intérêt par l'intermédiaire d'EV, d'abord apportée sur un modèle de cellules animales (CHO), a été validée en cellules humaines. Les EV ont été isolées à partir de surnageant de Calu-3, cellules exprimant la protéine CFTR de manière endogène, et de A549 transduites par le vecteur adenoviral Ad5-GFP-CFTR, surexprimant la protéine de fusion GFP-CFTR. Les cellules cibles choisies, A549 et CF15, étaient déficientes en CFTR. Le transfert s'est révélé plus efficace en système homologue (A549/A549) qu'en système hétérologue (A549/CF15). Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs métaboliques suggère que les EV ne suivent pas une voie d'internalisation cellulaire unique, mais que plusieurs mécanismes sont mis en jeu, dont l'endocytose clathrine dépendante et la macropinocytose. Les deux types d'EV sont capables de rétablir la fonction canal associée au CFTR dans les cellules CF15 de façon dose-dépendante, mais avec un effet de seuil minimum. L'activité CFTR reste stable pendant 3 jours, et à un niveau encore détectable après 5 jours. Notre travail démontre l'intérêt potentiel des MV et Exo comme vecteurs de biothérapie de pathologies génétiques / Cystic fibrosis is a genetic disease in which its prognosis depends on the lung damage. It is caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene (CFTR), resulting in a dysfunctional CFTR protein normally located at the plasma membrane of epithelial cells. This thesis is a study of a novel therapeutic approach to use extracellular vesicles (EVs), microvesicles and exosomes, as transfer vectors for CFTR mRNA and protein to target cells. The proof of concept for the transfer of CFTR mRNA and protein was first done in the CHO hamster model. To validate this concept on human cells, we used human bronchial Calu-3 cells, which express the endogenous CFTR protein, and A549 lung epithelial cells transduced by the adenoviral vector Ad5-GFP-CFTR to overexpress the fusion exogenous protein GFP-CFTR. We show that EVs produced by these cells could transfer a new functionality to CF15 target cells carrying the CFTRdeltaF508 mutation and the transfer seems to be more efficient in a homologous cell system versus a heterologous system. Interestingly, the exosomes seem to be more efficient in CFTR transfer than the microvesicles. A study of the mechanism of EVs cellular uptake show that it is temperature dependent and that endocytosis and macropinocytosis are implicated. Collectively, this study demonstrates the potential application of EVs for CFTR transfer and functional correction of the genetic defect in human CF cells

Le développement larvaire de Leptopilina boulardi (guêpe endoparasitoïde) a lieu dans la larve de Drosophile hôte, principalement D. melanogaster. La réponse immunitaire de l’hôte est l’encapsulement, formation d’une capsule mélanisée formée de couches d’hémocytes spécialisés, les lamellocytes, autour de l’œuf du parasitoïde. Le succès de L. boulardi repose sur l’injection de venin qui bloque l’action des lamellocytes. Ce venin, contient des composants protéiques et des vésicules originales baptisées vénosomes. J’ai montré que deux facteurs de virulence (VFs), LbGAP et LbGAP2, s’intègrent aux vénosomes lors de leur assemblage qui semble se faire de façon extracellulaire dans le canal reliant la glande à venin au réservoir. La microinjection de vénosomes purifiés comme celle du venin inhibe l’encapsulement. Les vénosomes marqués par fluorescence et les VFs co-immunolocalisent dans les lamellocytes de l’hôte après injection, leur internalisation passe par une endocytose flotilline/raft-domaine dépendante. Le taux d’internalisation diffère fortement entre les espèces hôtes de Drosophile testées (D. melanogaster>D. simulans>D. yakuba>D. suzukii) et il est corrélé au taux de réussite parasitaire, suggérant l’existence d’un récepteur spécifique sur les lamellocytes de D. melanogaster. Grâce à la souche mutante HopTum-l qui produit des lamellocytes constitutivement, j’ai séparé ces cellules et entrepris l’analyse protéomique de leur membrane pour identifier des récepteurs candidats. Mes résultats démontrent que les vénosomes sont des véhicules de transport interespèces impliqués dans la virulence parasitaire et qu’ils représentent un nouveau niveau de spécificité d’hôte. / Endoparasitoid wasps, such as Leptopilina boulardi (Figitidae), develop inside Drosophila host larvae, mainly D. melanogaster. Egg oviposition normally results in a capsule formation by specialized haemocytes, the lamellocytes, associated with a melanization reaction. The parasitic success of L. boulardi relies on injection with the egg of venom that blocks the action of lamellocytes. This venom, synthesized at the level of a specialized gland and stored in a reservoir, contains protein components and original vesicles (venosomes). I have shown that two described virulence factors, LbGAP and LbGAP2 (VFs), are embedded in venosomes during their assembly which seems to occur extracellularly in the duct connecting the venom gland to the reservoir. Microinjection of purified venosomes protects the egg from encapsulation like venom injection. Fluorescently labelled venosomes and VFs co-immunolocalize in lamellocytes after injection and their internalization involves a flotillin/raft-domain-dependent endocytosis. The venosomes internalization rate differs significantly between the Drosophila host species tested (D. melanogaster>D. simulans>D. yakuba>D. suzukii) and is correlated with the parasite success rate, suggesting the existence of specific receptor on lamellocytes of D. melanogaster. Using the HopTum-1 mutant that constitutively produces lamellocytes, I have purified these cells and performed proteomic analysis of their membrane to identify candidate receptors. My results demonstrate that venosomes are interspecies transport vehicles involved in parasite virulence that represent a new level of host specificity.