Dans la représentation centrale du champ visuel, la disparité rétinienne horizontale est impliquée directement dans la perception stéréoscopique. Son implication en vision périphérique est moins évidente tout comme celui de la disparité verticale dont le rôle fonctionnel reste controversé.<br />Par des enregistrements extra-cellulaires réalisés chez le singe vigile, nous montrons que la disparité horizontale est codée de façon préférentielle dans la représentation fovéale du champ visuel du cortex visuel primaire (aire V1). En périphérie, les interactions fortes entre disparités horizontales et verticales et leur lien étroit avec la sélectivité à l'orientation (en accord avec le modèle d'énergie binoculaire) suggèrent leur implication dans la construction du percept stéréoscopique dans les zones excentrées du champ visuel. De plus les modulations de l'activité visuelle des neurones par la direction du regard que nous observons dans l'aire V1 également, nous permettent de conclure que le cortex visuel primaire participe aux mécanismes neuronaux de reconstruction de l'espace tridimensionnel.

La signalisation purinergique participe à de nombreux processus physiopathologiques dans le système cardiovasculaire. Alors que les nucléotides extracellulaires sont considérés comme des « signaux de danger » ; la NTPDase1(CD39), ectonucléotidase à l’origine de leur hydrolyse, permet de maintenir l’homéostasie vasculaire par ses actions anti-thrombotiques etimmuno-modulatrices. Le rôle de CD39 dans la fonction vasculaire liée à l’hypertension artérielle(HTA) reste méconnu. L’HTA, facteur de risque majeur de complications cardiovasculaires, est caractérisée par un remodelage structurel(hypertrophie, fibrose) et fonctionnel (hypercontractilité, dysfonction endothéliale) des vaisseaux, causées notamment par un stress oxydatif et une inflammation périvasculaire. L’objectif de notre projet a consisté à étudier l’évolution de CD39 ainsi que son rôle potentiel dans la condition vasculaire pathologique de l’HTA. Nous mettons en évidence une diminution de l’expression et de l’activité du CD39 vasculaire dans l’HTA. Une diminution de l’activité ADPase du CD39 soluble a également été observée au niveau circulant. L’étude des éléments à l’origine de cette diminution montre une sensibilité du transcrit vasculaire de CD39 à certaines cytokinespro- et anti-inflammatoires, mais également à une tension mécanique. Une étude in vivo du potentiel rôle de CD39 (souris déficientes pour le gène de CD39 (Entpd1) et traitement à l’apyrase) dans un modèle d’HTA à l’Angiotensine-II a également été réalisée. L’ensemble de ces données suggère qu’une diminution du CD39 vasculaire et circulant pourrait contribuer à majorer les altérations vasculaires contemporaines de l’HTA. / Purinergic signaling is involved in numerous physiopathological processes in cardiovascular system. While extracellular nucleotides are considered as « danger signals » ; the NTPDase1(CD39), ectonucleotidase responsible for their hydrolysis, preserves vascular homeostasis by itsanti-thrombotic and immunomodulatory actions.The role of CD39 in vascular function related to arterial hypertension remains unknown. Hypertension, the major risk factor of cardiovascular complications, is characterized by structural remodeling (hypertrophy, fibrosis) and functional (hypercontractility, endothelial dysfunction) of vessels caused in particular by perivascular oxidative stress and inflammation.Our aim was to investigate the evolution of CD39 expression / function and its potential contribution in the pathological vascular condition of hypertension. We highlighted a decrease invascular CD39 expression and activity in the context of hypertension. A decrease in soluble ADPase activity specific to CD39 was also observed in blood circulation. Investigation of elements responsible for this decrease reveals asensitivity of vascular CD39 transcription to several pro- and anti-inflammatory cytokines and to mechanical tension. In vivo study of potential role of CD39 (mice deficient for CD39 gene (Entpd1) and treatment with apyrase) in Angiotensin-II model of hypertension was also carried out. All these data suggest that a decrease in circulating and vascular CD39 may contribute to vascular changes associated with hypertension.

Les vésicules extracellulaires (VE), incluant exosomes et microparticules (MP), vecteurs d’information biologique, peuvent moduler la fonction de cellules cibles. Une élévation du taux de VE circulantes est observée dans les pathologies cardiovasculaires dont l’obésité est l’un des facteurs de risque majeur. Cependant, il existe peu de données concernant la production de VE adipocytaires et leur capacité à moduler le métabolisme des adipocytes. Tout d’abord, nous avons caractérisé de manière morphologique et biochimique les MP et les exosomes adipocytaires. Nous montrons une production accrue de ces VE dans un contexte d’obésité murine. L’analyse protéomique des VE adipocytaires révèle un enrichissement spécifique des MP et des exosomes en protéines clé du métabolisme énergétique et de l’inflammation, respectivement. Dans une seconde partie, nous avons étudié l’effet de MP lymphocytaires portant le morphogène Hedgehog (MPHh+) sur la différenciation adipocytaire. A l’instar d’une activation classique de la voie de signalisation Hh, les MPHh+ inhibent l’adipogenèse. Bien que dépendant du récepteur Smoothened (Smo), cet effet inhibiteur est indépendant des facteurs de transcription Gli. Nous montrons que les MPHh+ activent un axe anti-adipogénique Smo/Lkb1/Ampk pouvant être stimulé par un nouvel agoniste de Smo, le GSA-10. Nos résultats démontrent, d’une part, la capacité des adipocytes à sécréter des VE, et d’autre part, le potentiel fonctionnel des MPHh+ à inhiber l’adipogenèse par une voie de signalisation Hhnon-canonique. Les VE pourraient contribuer aux dysfonctions métaboliques associées à l’obésité en véhiculant des messages métaboliques à l’échelle de l’organisme. / Extracellular vesicles (EV), including microparticles (MP) and exosomes, are able to modulate target cell function through exchange or transfer of biological material. Although EV are present in the blood of healthy individuals, an elevated quantity of circulating EV is associated with cardiovascular diseases, which obesity is a major cardiovascular risk factor. Nevertheless, few studies have reported the ability of adipocytes to release EV and their implication in adipose tissue metabolism. First of all, we could determine morphological and biochemical features of adipocyte-derived exosomes and MP through a combination of methods. We were able to demonstrate an increase in adipocyte EV production in a murine model of obesity. Proteomic analysis of adipocyte EV further revealed a specific enrichment of proteins crucial for glucose and lipid metabolism and related to inflammation in MP and exosomes respectively. We then evaluated the ability of lymphocytes-derived MP harboring the Sonic Hedgehog morphogen to control adipocyte differentiation. Activation of the Hedgehog canonical pathway inhibited adipogenesis, as did MPHh+. Surprisingly, although Smo dependent, inhibitory potential of such MP did not involve the Gli transcription factors. We show that MPHh+ inhibit adipocyte differentiation through a Smo/Lkb1/Ampk axis as does a new agonist of Smo, GSA-10. Our results demonstrate, on one hand, the ability of adipocyte to release EV and on the other hand, the capacity of MPHh+ to control adipogenesis through a non-canonical Hh signaling pathway. In conclusion, EV might contribute to obesity related metabolic dysfunctions through systemic regulation of metabolic pathways.

La pollution atmosphérique est un problème de santé publique. En 2013, le Centre International de Recherche sur le Cancer a classé la pollution de l'air, ainsi que les particules fines (PM₂.₅), de taille inférieure à 2,5 µm, comme cancérogène de groupe I pour l'homme. Les PM₂.₅ ont la capacité de pénétrer en profondeur dans l'appareil respiratoire. En se déposant au niveau des alvéoles pulmonaires, elles entraînent une réponse inflammatoire importante notamment via la libération de médiateurs de l'inflammation et des vésicules extracellulaires (EV) par les cellules immunitaires infiltrantes ou résidentes. Dans ce contexte, ce projet de thèse comportait deux objectifs majeurs : i) déterminer les caractéristiques chimiques des PM₂.₅ collectées en milieu industrialo-urbain, en identifier les origines et la variabilité saisonnière de leur composition chimique ; ii) étudier la réponse et les EV produites par les macrophages suite à l'exposition aux PM₂.₅ et observer les effets des EV sur les cellules pulmonaires.Pour cela, des macrophages primaires ont été exposés aux PM₂.₅ prélevées à Dunkerque et leur réponse cellulaire (stress oxydant, inflammation, polarisation, miARN) a été mesurée. Les EV produites en réponse à cette exposition ont été isolées et caractérisées. Enfin, des cellules épithéliales pulmonaires, les BEAS-2B, ont été exposées aux EV libérées en réponse à l'exposition aux PM₂.₅ et les effets de cette exposition (inflammatoire, stress oxydant, miARN) ont été mesurés. Nous avons mis en évidence une inflammation et une réponse anti-oxydante dans les macrophages, ainsi qu'une modification de leur polarisation. Les PM₂.₅ entrainent une libération plus importante d'EV. / Air pollution is a major public health problem. In 2013, The International Agency for Research on Cancer classified air pollution and fine particle (PM₂.₅), with size lower than 2.5 µm, as carcinogenic to humans (group I). PM₂.₅ are able to penetrate deeply in lungs. When PM₂.₅ settle in pulmonary alveolar, they lead to strong inflammatory response, with inflammatory mediators ans extracellular vesicles release by infiltrating or resident immune cells. In this context, this thesis included two major aims : i) evaluate the physico-chemical characteristics of PM₂.₅ sampled in an industrial-urban site, identify their origin and study the seasonal variability of their composition ; ii) investigate the cellular response and EV produced by macrophages in response to PM₂.₅ and study EV's effects on epithelial cells. To achieve this, macrophages are exposed to PM₂.₅ collected in Dunkerque, and cellular response (oxidative stress, inflammation, polarization, miRNA) was quantified. EV released in response to PM₂.₅ exposition was isolated and characterized. Finally, epithelial cells, BEAS-2B, are exposed to EV released by exposed and non exposed macrophages to evaluate effects from this exposure (inflammation, oxidative stress, miRNA). We observed inflammation and anti-oxidant response in macrophages after PM₂.₅ exposure, as well as polarization modification. PM₂.₅ lead to increased number of EV by macrophages.

In open angle glaucoma, dysfunction of the trabecular meshwork (TM) results in impaired aqueous humour outflow leading to an elevated intraocular pressure (IOP) that underlies optic nerve damage and irreversible blindness. Currently, no curative treatment is available for the disease. Indeed, most pharmacological and surgical interventions usually provide only temporary relief from elevated IOP while little progress has been made in targeting the root cause of this disease: correcting the dysfunctional TM. In this context, we hypothesized that regeneration/refunctionalization of the TM may represent an effective therapeutic option to halt disease progression or even reverse the pathologic process. We previously demonstrated in a rat model of glaucoma that the injection of mesenchymal stromal cells (MSCs) cultured under hypoxic conditions or their conditioned media (MSC-CM) into laser-damaged TM area results in tissue regeneration. Injection of MSC or conditioned media in our glaucoma model led to activation and proliferation of ocular progenitor cells culminating in TM regeneration and a decrease in IOP. However, the mechanistic basis for this regenerative process remained elusive. Thus, the aim of this thesis is to elucidate the mechanistic basis of MSC secretome-mediated TM regeneration and the subsequent decrease in IOP. We now demonstrate that injection of hypoxic MSC-CM into laser-induced glaucomatous eyes resulted in massive immune cell recruitment. We also demonstrate that these hypoxic MSC-CM conditioned cells produced pro-regenerative factors in vitro and in vivo. Next, employing a proteomic approach, we identified and verified the pro-regenerative effect of several factors secreted by hypoxic MSC-CM recruited cells, which in turn induced the activation/proliferation of ocular progenitor cells leading to TM regeneration and decreased IOP. Upon individual injection of the purified factors into glaucomatous rat eyes, we observed a partial and delayed but significant decrease in IOP that correlated with an increase in the activation and proliferation of neuronal progenitor cells in the TM area. The co-injection of these factors resulted in a significant decrease in IOP compared with individual factor injection. Importantly, this drop in IOP was associated with restoration of retinal functionality, thus demonstrating the importance of these factors in the TM regeneration process and disease control. The findings presented in this thesis provide a novel acellular therapeutic approach for glaucoma treatment via in situ TM regeneration. Moreover, the knowledge gained here could have a lasting impact on how we induce tissue regeneration in other degenerative diseases and lead to novel therapeutic advances in regenerative medicine. / Dans le glaucome à angle ouvert, le dysfonctionnement du trabéculum (TM), un tissu nécessaire à la filtration de l'humeur aqueuse, entraîne une élévation de la pression intraoculaire (PIO). Ceci cause des lésions au niveau du nerf optique et une cécité irréversible. Présentement, aucun traitement curatif n'a été développé pour cette maladie. Nous émettons l'hypothèse que la régénération et re-fonctionnalisation du trabéculum peut représenter une option thérapeutique efficace pour arrêter ou inverser la progression de la maladie dans de nombreux cas de glaucome. Nous avons précédemment démontré les effets régénérateurs des cellules mésenchymateuses (MSCs) et de leurs milieux conditionnés par l'hypoxie (MSC-CM) dans la régénération du TM suite à un dommage par laser. Ce processus a conduit à l'activation et à la prolifération des cellules progénitrices oculaires résultant en une diminution de la PIO dans un modèle de glaucome induit par laser chez le rat. Cependant, la base mécanistique de ce processus de régénération reste encore inconnue. Ainsi, le but de cette thèse de recherche est d'élucider cette base mécanistique de la régénération du TM médiée par le sécrétome des MSC et la diminution subséquente de la PIO. À cette fin, l'injection de MSC-CM hypoxique dans les yeux glaucomateux induits par laser a entraîné un important recrutement de cellules immunitaires. Sous l’action du MSC-CM, ces cellules produisent des facteurs pro-régénératifs in vitro et in vivo. Ensuite, nous avons utilisé une approche protéomique et vérifié l'effet pro-régénératif des facteurs sécrétés par ces cellules exposées au MSC-CM hypoxique, sur l'activation et la prolifération des cellules progénitrices oculaires et la PIO. Lors de l'injection de ces facteurs chez le rat glaucomateux, nous avons observé une augmentation significative de l'activation et de la prolifération des cellules progénitrices neuronales présentes dans la zone du TM, résultant en une diminution de la PIO. De plus, l’injection combinée de ces facteurs résulte en une diminution synergique importante de la PIO. Cette baisse de la PIO était associée à une restauration de la fonction rétinienne, démontrant ainsi l'importance de ces facteurs dans le processus de régénération du TM et de contrôle de la maladie. Les résultats présentés dans cette thèse pourraient amener à une nouvelle approche thérapeutique acellulaire pour le traitement du glaucome via la régénération du TM. De plus, les connaissances acquises au cours de cette thèse pourraient avoir un impact durable sur la manière d’aborder la régénération tissulaire dans d'autres maladies dégénératives et amener des avancées thérapeutiques nouvelles en médecine régénératrice

Le vieillissement est l'un premier facteur de risque pour plusieurs maladies telles que l’athérosclérose, la fibrose, l’Alzheimer, le diabète de type 2 et le cancer. L'accumulation de cellules sénescentes avec l'âge contribue au développement de maladies liées à l'âge en induisant une inflammation chronique causée par le phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP). Il y a également une augmentation de la sécrétion de vésicules extracellulaires (EV) lors de la sénescence. Les EV sont des structures à bicouche lipidique permettant le transport de molécules actives vers des cellules réceptrices. De plus, les EV participent aux effets pathologiques des cellules sénescentes. Ainsi, nous proposons que les macrophages sénescents participent au développement de maladies liées à l’âge en induisant l'inflammation par l’action combinée des facteurs solubles du SASP et des EV. Tout d'abord, nous avons établi un modèle de macrophages sénescents induit par l’oncogène Raf-1. Une analyse transcriptionnelle de notre modèle a démontré un profil inflammatoire régulé par Nf-κB. La sécrétion d'EV est également augmentée par les macrophages sénescents. En outre, les EV dérivées de macrophages sénescents sont enrichies en miARN, tels que miR-21, miR-155 et miR-132, ainsi qu'en protéines ribosomiques, qu'en protéine Alix et qu'en protéine Mvp. Les sécrétions des macrophages sénescents induisent un échappement de la sénescence chez les cellules MEF, probablement par l'action combinée des molécules solubles du SASP et des EV. Nous concluons que les macrophages sénescents sécrètent des signaux prolifératifs et inflammatoires dans les cellules réceptrices, ce qui suggère leur rôle potentiel dans le développement de cancer. Le traitement avec le navitoclax élimine les macrophages sénescents et pourrait prévenir leurs effets pathologiques. / Aging is the first risk factor for several diseases such as atherosclerosis, fibrosis, Alzheimer’s, type 2 diabetes and cancer. The accumulation of senescent cells with age contributes to development of age-related diseases by inducing chronic inflammation. This inflammation is induced by the senescence-associated secretory phenotype (SASP). During senescence, there is also an increase of extracellular vesicles (EV) secretion. EVs are lipid bilayer structures that allow the transport of active molecules to recipient cells. In addition, EVs participate in pathologic effects of senescent cells. Thus, we propose that senescent macrophages participate in development of age-related diseases by inducing inflammation through the combined effect of SASP soluble factors and EV. First, we established a model of senescent macrophages induced by the oncogene Raf-1. Transcriptional analysis of our model demonstrated an Nf-κB-regulated inflammatory profile. EV secretion is also increased by senescent macrophages. Moreover, EVs derived from senescent macrophages are enriched in miRNA, such as miR-21, miR-155 and miR-132, as well as ribosomal proteins, Alix protein an Mvp protein. Secretion of senescent macrophages induce senescence escape in MEF cell, probably through the combined action of SASP soluble factor and EV. We conclude that senescent macrophages secrete proliferative and inflammatory signals in recipient cell, suggesting their potential role in cancer development. Treatment with navitoclax eliminates senescent macrophages and may prevent their pathological effects.

Différents effets de nanotubes de carbone (NTC) sur des diatomées benthiques ont été évalués via des approches microscopiques et biochimiques. Il a été montré que la structure du frustule, paroi silicifiée propre aux diatomées, est déterminante sur l'entrée ou non des NTC dans les cellules. Une internalisation des NTC dans la cellule a conduit à des effets génotoxiques et tératogènes. L'interaction des NTC avec les substances polymériques extracellulaires (SPE) produites par les diatomées a aussi été évaluée. Les SPE ont favorisé l'agglomération des NTC entre eux, ainsi que leur isolement physico-chimique vis-à-vis des diatomées. Une réponse des diatomées à la présence des NTC par la surproduction de SPE explique partiellement le retard de croissance observé. De plus, Des interactions entre SPE et NTC, majoritairement hydrophobes, ont été révélées. Ces interactions ont permis de réduire considérablement les effets des NTC sur les diatomées au cours du temps. / Various effects of carbon nanotubes (CNTs) on benthic diatoms were assessed via microscopic and biochemical approaches. It has been shown that the structure of the specific to diatoms silicified frustule has a key role in the entry or not of CNTs into the cells. Moreover, Internalization of CNTs in the cell led to genotoxic and teratogenic effects. The interaction of the CNTs with the extracellular polymeric substances (EPS) produced by diatoms was also evaluated. EPS favored agglomeration of CNTs between them as well as their physico-chemical isolation for diatoms. A response of diatoms in the presence of CNTs by the overproduction of EPS partially explains the observed growth retardation. In addition, interactions between the EPS and CNTs, mainly hydrophobic, have been revealed. These interactions significantly reduced the effects of CNTs in diatoms over time.

Les granulocytes de faible densité (LDGs) sont un sous-type de neutrophiles mis en évidence initialement dans le sang de patients atteints de différentes maladies telles que le lupus érythémateux systémique ou le psoriasis. Cependant, des études rapportent également leur présence chez des individus sains. On connait mal à ce jour les caractéristiques des LDGs, notamment en ce qui a trait à leur profil inflammatoire. De plus, leur biogenèse demeure toujours mal connue. Mes travaux de maîtrise visaient à comparer les propriétés des LDGs à celles des neutrophiles de densité normale (NDNs). Pour ce faire, 8 chevaux atteints d’asthme équin sévère et 11 chevaux sains bien caractérisés ont été sélectionnés pour l’étude et sur lesquels des isolations de NDNs ainsi que des LDGs ont été réalisées. La morphologie des neutrophiles a ensuite été évaluée par microscopie optique. Le contenu en myéloperoxidase, un composant des granules primaires azurophiles des neutrophiles, et la présence de récepteurs du N-formylméthionine-leucyl-phénylalanine (fMLP-R) ont été évalués par cytométrie de flux et immunofluorescence, respectivement. Enfin, la capacité fonctionnelle de ces cellules à produire spontanément des pièges extracellulaires des neutrophiles (NETs) a été étudiée in vitro par microscopie confocale. Les résultats démontrent que le nombre de LDGs est augmenté dans le sang des chevaux asthmatiques lors d'exacerbation de la maladie. De plus, ces cellules présentent une morphologie différente puisqu’elles sont de taille plus petite et contiennent plus de fMLP-R que les NDNs. Le contenu en myéloperoxidase est cependant similaire dans les deux populations de neutrophiles. Enfin, les LDGs produisent plus de NETs, et sont plus sensibles aux stimuli activateurs que les NDNs. Ces caractéristiques sont similaires dans les 2 groupes de chevaux suggérant ainsi que ce sont des propriétés intrinsèques des LDGs et qu’ils représentent une population cellulaire préactivée et qui de plus, est majoritairement mature. Cette étude caractérise et compare pour la première fois les LDGs chez des animaux sains et ceux retrouvés chez des animaux atteints d’une maladie inflammatoire chronique. / Low-density granulocytes (LDGs) are a subset of neutrophils first described in the bloodstream upon pathological conditions. However, several studies also reported the presence of these cells in the blood of healthy patients. Whether LDGs characteristics, especially their enhanced pro-inflammatory profile, are specific to this subset of neutrophils and not related to disease states is unknown. Thus, we sought to compare the properties of LDGs to those of autologous normal-density neutrophils (NDNs), in both health and disease. We studied 8 horses with severe equine asthma and 11 healthy animals. Neutrophil morphology was studied using optical microscopy, and content in myeloperoxidase and N-formylmethionine-leucyl-phenylalanine receptors (fMLP-R) evaluated using flow cytometry and immunofluorescence, respectively. Confocal microscopy was used to determine their functional capacity to spontaneously release neutrophil extracellular traps (NETs) stimulating with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA). LDGs were smaller and contained more fMLP-R than NDNs, but myeloperoxidase content was similar in both populations of neutrophils. They also had an increased capacity to produce NETs, and were more sensitive to activation stimuli. These characteristics were similar in both healthy and diseased horses, suggesting that these are intrinsic properties of LDGs. Furthermore, these results suggest that LDGs represent a population of primed and predominantly mature cells. Our study is the first to characterize LDGs in health, and to compare their characteristics with those of animals with a naturally occurring disease.

La Fibrose Kystique (FK) est une maladie dégénérative qui entraine une dégénération des poumons dû au problème de clairance mucociliaire (CMC). Le volume de surface liquide (SL) couvrant les cellules pulmonaires est essentiel à la clairance de mucus et au combat contre les infections. Les nucléotides extracellulaires jouent un rôle important dans la CMC des voies aériennes, en modifiant le volume de la SL pulmonaire. Cependant, les mécanismes du relâchement de l’ATP et de leurs déplacements à travers la SL, restent inconnus. Des études ultérieures démontrent que l’exocytose d’ATP mécano-sensible et Ca2+-dépendant, dans les cellules A549, est amplifié par les actions synergétiques autocrine/paracrine des cellules avoisinantes. Nous avions comme but de confirmer la présence de la boucle purinergique dans plusieurs modèles de cellules épithéliales et de développer un système nous permettant d’observer directement la SL. Nous avons démontrés que la boucle purinergique est fonctionnelle dans les modèles de cellules épithéliales examinés, mis appart les cellules Calu-3. L’utilisation de modulateur de la signalisation purinergique nous a permis d’observer que le relâchement d’ATP ainsi que l’augmentation du [Ca2+]i suivant un stress hypotonique, sont modulés par le biais de cette boucle purinergique et des récepteurs P2Y. De plus, nous avons développé un système de microscopie qui permet d’observer les changements de volume de SL en temps réel. Notre système permet de contrôler la température et l’humidité de l’environnement où se trouvent les cellules, reproduisant l’environnement pulmonaire humain. Nous avons démontré que notre système peut identifier même les petits changements de volume de SL. / Cystic Fibrosis (CF) patients suffer from respiratory problems associated with pulmonary infections and exacerbations, due to improper mucociliary clearance (MCC). The airway surface liquid (ASL) covering pulmonary epithelial cells plays a pivotal role in MCC and infection control. Extracellular nucleotides control MCC in airway epithelia by modulating ASL volume, ciliary beating and mucin secretion. The mechanism(s) of their release and dispersal within the ASL remain incompletely understood. Studies with A549 cells, a human alveolar type II cell model, have shown that mechanosensitive, Ca2+-dependent ATP secretion is strongly amplified by the synergistic autocrine/paracrine actions of released nucleotides. The aim of this study was to examine whether the autocrine purinergic loop operates in different lung epithelial cell models and to develop an imaging system allowing the direct monitoring of ASL height during purinergic stimulation. We demonstrated that the signaling loop is functional in all epithelial cells tested, with the exception of Calu-3 epithelial cells. With different purinergic signaling modulators, we demonstrated that ATP release and [Ca2+]i elevations evoked by hypotonic stress were strongly amplified by autocrine/paracrine effects in cells expressing the P2Y receptor family. To monitor ASL volume changes in real time, we developed a novel epi-fluorescence, side-view microscopy system to observe ASL height. During experiments, cell cultures grown on permeable filters were mounted in a custom-designed chamber that allows control of the temperature, humidity and air flow above the cell monolayer, mimicking the pulmonary environment. This system detects even small changes in ASL volume following purinergic stimulation.

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