Die Leber ist ein zentrales Organ für den Energiestoffwechsel mit großer regenerativer Kapazität. Nach akut schädigenden Einflüssen und selbst nach Entfernen von bis zu 80% des effektiven Lebervolumens kann sich die Leber zu voller Funktionsfähigkeit regenerieren (Fausto und Campbell 2003; Guglielmi et al. 2012). Anhaltende Schädigungen können hingegen über eine chronische Entzündungs- und Wundheilungsreaktion zu einem fortschreitenden bindegewebigen Umbau und damit verbundenem Funktionalitätsverlust führen (Anthony et al. 1978). Für fortgeschrittene fibrotische und zirrhotische Leberveränderungen gibt es bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten, sodass bei terminalem Leberversagen die Lebertransplantation die einzig kurative Strategie darstellt. Die komplexen Stoffwechsel- und Syntheseleistungen der Leber vollführen Hepatozyten in der kleinsten Baueinheit des Lebergewebes, dem Sinusoid. In diesem hochdifferenzierten Kompartiment befinden sich außerdem Kupffer-Zellen, hepatische Stellatzellen und Endothelzellen als residente nicht-parenchymale Leberzellen und verhältnismäßig wenig extrazelluläre Matrix. Dieses dreidimensionale makromolekulare Netzwerk und dessen besondere Komposition scheinen von zentraler Bedeutung zu sein, da hierdurch das differenzierte Umfeld der Hepatozyten geschaffen und aufrechterhalten wird. Im Zuge von Leberschädigungen, wie der Fibrose, verändert es sich eindrucksvoll durch vermehrte Matrixdeposition und einen progredienten bindegewebigen Umbau. Es gibt bis dato wenig Daten, welche die Expression von extrazellulären Matrixbestandteilen des humanen Sinusoids konsequent nach einzelnen Zelltypen aufschlüsseln. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Komposition und einzelne produktive Beiträge durch residente Leberzellpopulationen auf Transkriptebene zu analysieren. Aus humanen Gewebeproben gesunder und unterschiedlich geschädigter Lebern wurden primäre Zellen isoliert. Die enthaltene RNA wurde aufgereinigt und mittels quantitativer Echtzeit-PCR auf die Expression 28 leberrelevanter extrazellulärer Matrixgene untersucht. Unterschiede in der Expression wurden mittels Hauptkomponentenanalyse und linearer Modellierung analysiert. In der vorliegenden Arbeit konnten, von 28 untersuchten, 24 Gene aus den drei funktionellen Proteingruppen fibrillärer Kollagene, Basalmembrankomponenten und regulatorischer extrazellulärer Matrix-Proteine nachgewiesen werden. Gene fibrillärer Kollagene, insbesondere COL3A1, deren Produkte als wachsende Hauptmatrixkomponenten des fibrotischen Sinusoids etabliert sind, wurden auch in den untersuchten fibrotischen Proben signifikant hochreguliert. Ähnliche Tendenzen zeigten sich in durch Chemotherapie geschädigten Proben. Die erhobenen Daten legen nahe, dass die nicht-parenchymalen Leberzellen quantitativ ausschlaggebend zur Matrix-Expression beitragen, während primäre Hepatozyten eine untergeordnete Rolle spielen. Stellatzellen und daraus differenzierende (Myo-)Fibroblasten sind in der Literatur als Hauptproduzenten von Matrixkomponenten etabliert. Obwohl die untersuchten Stellatzellen alle detektierten Matrixgene in messbaren Mengen exprimierten, zeigten sie sich weder besonders hoch noch differentiell reguliert. Die Ergebnisse legen außerdem nahe, dass die Produktion und einige Regulationsmechanismen eher von Kupffer-Zellen und Endothelzellen ausgehen, welche bisher nicht zu den klassischen matrixproduzierenden Zellen gezählt werden. Die Experimente zeigten, dass in Kupffer-Zellen ein Set von neun, basalmembranösen und regulatorischen Matrixgenen in Fibrose gegenüber gesunden Proben herunterreguliert war. Dies weist auf einen bisher kaum beschriebenen primär produktiven Beitrag zu der Matrixregulation durch Kupffer-Zellen hin. Endothelzellen exprimierten gefäßtypische Kollagen 4 Gene in den gemessenen Daten erwartungsgemäß am höchsten. Darüber hinaus waren in Proben, die durch Chemotherapie geschädigt wurden, einige basalmembranassoziierte und regulatorische Matrixgene durch Endothelzellen hochreguliert. Diese Beobachtung lässt sich gut in den Kontext des sogenannten sinusoidalen Obstruktionssyndroms einordnen, welches einen sinusoidal-kapillären Schaden darstellt, der bereits mehrfach im Zusammenhang mit Chemotherapie beschrieben wurde. Interessanterweise konnte auch das Gen für Tenascin-R, ein eigentlich streng neuronal reguliertes extrazelluläres Glykoprotein, in den untersuchten nicht-parenchymalen Zellproben detektiert werden. Der daraus resultierende Hinweis auf eine temporäre Expression neuronaler bzw. glialer Proteine von residenten Leberzellen stellt ein Novum dar, welches in zukünftigen Studien validiert und weiter erforscht werden könnte. In den Verlauf von Leberschädigungen verschiedener Ätiologien sind höchst dynamische Prozesse involviert. Die Untersuchung primärer Leberzellen auf Transkriptebene hat sich hierbei als wertvolles Werkzeug erwiesen, um pathologieassoziierte Veränderungen der Regulation extrazellulärer Matrixgene zu detektieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie konnten zeigen, dass neben (Myo-)Fibroblasten gerade Kupffer-Zellen und Endothelzellen potente Matrixgenproduzenten und -regulatoren darstellen. Die Berücksichtigung ihres Beitrages und der präzisen Komponenten der Mikroumgebung im homöostatischen Lebersinusoid könnte relevante Verbesserungen von in vitro Leber- und Co-Kultur-Modellen bedeuten und zukünftig lebensnähere Erkenntnisse befördern. Einige konditionsspezifisch differentiell exprimierte Gene, wie zum Beispiel das fibrilläre Kollagengen COL3A1 oder Kollagen 6-Gene, bieten sich möglicherweise als potenzielle Marker akuter und chronischer Leberschäden an. Sie könnten neue Ansätze für die frühe Diagnostik von Leberpathologien darstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten in Zukunft an größeren Stichproben validiert und für weitere Pathologien vertieft werden.:1 INHALTSVERZEICHNIS 1 INHALTSVERZEICHNIS 3 2 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 5 3 EINFÜHRUNG 8 3.1 DIE LEBER UND IHR STRUKTURELLER AUFBAU 8 3.2 ZELLPOPULATIONEN IM SINUSOID DER LEBER 10 3.2.1 Hepatozyten 10 3.2.2 Stellatzellen 10 3.2.3 Kupffer-Zellen 11 3.2.4 Endothelzellen 12 3.3 EXTRAZELLULÄRE MATRIXPROTEINE IM SINUSOID DER LEBER 13 3.3.1 Fibrilläre Kollagene 13 3.3.2 Basalmembranbildende Matrixkomponenten 14 3.3.3 Regulatorische Matrixkomponenten 15 3.4 UNTERSUCHTE LEBERPATHOLOGIEN 19 3.4.1 Sinusoidales Obstruktionssyndrom, eine akute Leberschädigung 19 3.4.2 Kongenitale Leberfibrosen 20 4 AUFGABENSTELLUNG 21 5 MATERIAL UND METHODEN 22 5.1 MATERIAL 22 5.1.1 Geräte 22 5.1.2 Verbrauchsmaterialien 22 5.1.3 Bestandsmaterialien 23 5.1.4 Chemikalien 24 5.1.5 Kits und gebrauchsfertige Sets 24 5.1.6 Puffer und Medien 25 5.1.7 Datenbanken und Software 26 5.2 METHODEN 27 5.2.1 Isolation primärer Leberzellen 27 5.2.2 Ribonukleinsäure-Isolation 30 5.2.3 RNA-Quantifikation und Qualitätskontrolle 31 5.2.4 Quantitative Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion 31 5.2.5 Auswertung 33 6 ERGEBNISSE 35 6.1 PROBENAUFBEREITUNG 35 6.2 EXPRESSION EXTRAZELLULÄRER MATRIXGENE 35 6.3 LIMMA: GEN-ÜBERGREIFENDE UNTERSCHIEDE ZWISCHEN ZELLTYPEN UND KONDITIONEN 36 6.3.1 NPC: Führende Expression von EZM-Genen 37 6.3.2 Zelltypabhängige differentielle Expression in verschiedenen Konditionen 39 6.3.3 HSC-Population mit wenig differentieller Expression von EZM-Genen 39 6.4 ANOVA: MODELLIERUNG FUNKTIONELLER EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE 40 6.4.1 Hochregulation fibrillenformender Kollagene in geschädigten Lebern 42 6.4.2 Differentielle Expression nicht-fibrillärer Matrixgene durch KC und LEC 44 6.4.3 Leberzellen exprimieren TNR, ein neuronales Glykoprotein 48 7 DISKUSSION 49 7.1 NEUDEFINITION UND EINGRENZUNG DER GENLISTE DURCH ERGEBNISSE DER PCR 49 7.2 HETEROGENITÄT DER LEBERPROBEN 50 7.3 NPC ALS HAUPTPRODUZENTEN VON EZM-KOMPONENTEN 50 7.4 HSC: NUR EINE NEBENFIGUR DER EZM-PRODUKTION UND REGULATION? 52 7.5 ÜBERPRODUKTION FIBRILLENFORMENDER KOLLAGENE IN LEBERSCHÄDEN DURCH NPC 53 7.6 KC ALS PRODUZENTEN UND REGULATOREN IM KONTEXT DER FIBROSE 54 7.7 LEC ALS PRODUZENTEN UND REGULATOREN IM KONTEXT DER AKUTSCHÄDIGUNG 58 7.8 NPC: BETEILIGUNG AN HEPATISCHER NEUROREGULATION? 60 7.9 AUSBLICK 61 8 ZUSAMMENFASSUNG 63 9 LITERATUR-, ABBILDUNGS-, TABELLENVERZEICHNIS 66 9.1 LITERATURVERZEICHNIS 66 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 83 9.3 TABELLENVERZEICHNIS 84 10 ANLAGEN 85 10.1 ERGÄNZENDE ABBILDUNGEN UND TABELLEN 85 10.2 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 94 10.3 CURRICULUM VITAE 95 10.4 DANKSAGUNG 96

Articular cartilage is a highly specialized tissue which provides a lubricated gliding surface in joints and thereby enables low-friction movement. If damaged once it has a very low intrinsic healing capacity and there is still no treatment in the clinic which can restore healthy cartilage tissue. 3D biofabrication presents a promising perspective in the field by combining healthy cells and bioactive ink materials. Thereby, the composition of the applied bioink is crucial for defect restoration, as it needs to have the physical properties for the fabrication process and also suitable chemical cues to provide a supportive environment for embedded cells. In the last years, ink compositions with high polymer contents and crosslink densities were frequently used to provide 3D printability and construct stability. But these dense polymeric networks were often associated with restricted bioactivity and impaired cell processes like differentiation and the distribution of newly produced extracellular matrix (ECM), which is especially important in the field of cartilage engineering. Therefore, the aim of this thesis was the development of hyaluronic acid (HA)-based bioinks with a reduced polymer content which are 3D printable and additionally facilitate chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs) and the homogeneous distribution of newly produced ECM. Starting from not-printable hydrogels with high polymer contents and restricted bioactivity, distinct stepwise improvements were achieved regarding stand-alone 3D printability as well as MSC differentiation and homogeneous ECM distribution. All newly developed inks in this thesis made a valuable contribution in the field of cartilage regeneration and represent promising approaches for potential clinical applications. The underlying mechanisms and established ink design criteria can further be applied to other biofabricated tissues, emphasizing their importance also in a more general research setting. / Gelenkknorpel ermöglicht durch seine gleitfähige Oberfläche reibungsarme Bewegungen der Gelenke. Ist der Knorpel jedoch einmal geschädigt, kann er sich kaum selbst regenerieren und es gibt noch keine klinische Lösung, die das native Gewebe wiederherstellen kann. Ein vielversprechender Ansatz im Feld ist die 3D Biofabrikation, da sie gesunde Zellen mit bioaktiven Tintenmaterialen kombiniert. Hierbei ist die Zusammensetzung der Tinte besonders wichtig für die Funktionsweise des Konstruktes, da sie sowohl die physikalischen Voraussetzungen für den 3D Druck als auch die biologische Unterstützung für die Zellkultivierung mitbringen muss. Bisher wurden häufig Tintenzusammensetzungen mit hohen Polymergehalten und Vernetzungsdichten verwendet, um 3D-Druckbarkeit und Konstruktstabilität zu gewährleisten. Das verursachte jedoch häufig eine eingeschränkte Bioaktivität und die Beeinträchtigung von Zellprozessen wie Differenzierung und der Verteilung der neu gebildeten Extrazellulärmatrix (ECM), die insbesondere in der Knorpelregeneration von großer Bedeutung ist. Daher war das Ziel dieser Arbeit 3D-druckbare Tinten auf Hyaluronsäure (HA)-Basis mit reduziertem Polymergehalt zu entwickeln, die die chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) unterstützen und eine homogene Verteilung der neu produzierten ECM ermöglichen. Ausgehend von nicht-druckbaren Hydrogelen mit hohem Polymergehalt und eingeschränkter Bioaktivität wurde eine schrittweise Verbesserung hinsichtlich 3D-Druckbarkeit, MSC-Differenzierung und homogener ECM-Verteilung erreicht. Alle hier neu entwickelten Tinten leisten einen wertvollen Beitrag auf dem Gebiet der Knorpelregeneration mit Potenzial zur klinischen Anwendung. Die zugrunde liegenden Mechanismen und etablierten Designkriterien können weiterhin auch auf andere biofabrizierte Gewebe übertragen werden, was ihre Bedeutung auch für ein weiter gefasstes Forschungsfeld unterstreicht.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind von einer Lipiddoppelmembran umschlossen und können Proteine, Nukleinsäuren, sowie Kohlenhydrate enthalten. Die sehr heterogenen EVs werden von einer Vielzahl eu- und prokaryotischer Zellen freigesetzt und sind aus allen menschlichen Körperflüssigkeiten isolierbar. EVs können über mehrere Mechanismen Informationen zwischen Zellen übertragen und spielen damit eine wichtige, aber größtenteils unerforschte Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation. So erlauben die Oberflächenproteine der EVs einerseits Interaktionen mit membranständigen Rezeptoren auf Zellen, während EVs andererseits endozytiert werden können und ihr Inhalt somit nach intrazellulär transportiert werden kann. Der enge Informationsaustausch in der Zusammenarbeit verschiedener Zellen ist charakteristisch für das Immunsystem, in dem Monozyten eine zentrale Stellung vor allem bei der Abwehr bakterieller Infektionen einnehmen. Allerdings ist die Funktion von monozytären extrazellulären Vesikeln, wie auch viele ihrer Charakteristika, weitgehend unbekannt. Mit dem Ziel, die monozytären extrazellulären Vesikel genauer zu charakterisieren, erfolgte die Separation primärer humaner Monozyten aus Leukozytenkonzentraten gesunder Blutspender mit Gegenstromelutriation oder Positivselektion über das Oberflächenmolekül CD14. Dabei zeigte sich, dass die Nutzung von Gegenstromelutriation zur Separation primärer humaner Monozyten vorteilhaft hinsichtlich höherer Ausbeute an Zellen und höherer Zellvitalität war, während die Positivselektion eine höhere Zellreinheit erlaubte. Nach Kultur der Monozyten in vesikelfreiem Medium wurden die EVs mittels differentieller Ultrazentrifugation aus den Zellkulturüberständen isoliert und charakterisiert. Die unspezifische Charakterisierung der EVs hinsichtlich der Größenverteilung und Quantität erfolgte mit nanoparticle tracking-Analyse und zeigte gut mit kleinen bis mittelgroßen EVs vereinbare Ergebnisse. In Einklang damit stellten sich die monozytären EVs als sphärische, nanoskalige Strukturen in der Raster-Heliumionenmikroskopie dar. Der Nachweis spezifischer Oberflächenmoleküle auf den EVs erfolgte mit einer bead-basierten durchflusszytometrischen Methode (MACSPlex). Die EVs positivselektierter Monozyten trugen MHC-II, CD63, CD81, CD24, CD44, sowie CD14, CD31 und CD11c auf ihrer Oberfläche. Dies belegte einerseits die Isolation extrazellulärer Vesikel und deutete gleichzeitig auf den monozytären Ursprung und mögliche Interaktionen der Vesikel hin. Die Sensitivität von CD14 als möglicher Marker für monozytäre EVs zeigte sich aufgrund geringer Signalintensität als wahrscheinlich ungenügend. Bei Charakterisierung der EVs von Monozyten, welche mit Gegenstromelutriation separiert wurden, zeigten sich regelmäßig zusätzlich Thrombozyten-spezifische Oberflächenmoleküle. Die Kontamination monozytärer EVs mit thrombozytären EVs konnte durchflusszytometrisch mit MACSPlex erkannt und durch Positivselektion der Monozyten vermieden werden. Das Tetraspanin CD9, welches allgemein einen wenig spezifischen Marker für EVs darstellt, zeigte sich bei Nachweis auf EVs primärer humaner Monozyten am ehesten als Ausdruck einer Kontamination mit thrombozytären EVs. Somit gelang der Nachweis mehrerer Oberflächenproteine auf monozytären EVs unter gleichzeitigem Ausschluss von Kontaminationen mit EVs anderer Blutzellen oder Thrombozyten. Eine Stimulation der positivselektierten, beziehungsweise mit Gegenstromelutriation separierten primären humanen Monozyten mit Lipopolysaccharid (LPS) führte zu einer im Mittel um 70 %, beziehungsweise um 86 % verstärkten Freisetzung extrazellulärer Vesikel in den Zellkulturüberstand. Dabei veränderte sich die Größenverteilung, die Oberflächenbeschaffenheit und die relative Expression der untersuchten Oberflächenproteine nicht signifikant. Extrazelluläre Vesikel, welche in Anwesenheit von LPS gewonnen wurden, wiesen auch nach dem Isolationsprozess eine relevante Endotoxinkonzentration auf, was wahrscheinlich einen erheblichen Einfluss auf andere LPS-sensible Zellen hätte. Daher wurden nur die ohne LPS gewonnenen monozytären EVs auf eine immunmodulatorische Funktion hin untersucht. Dafür wurden in-vitro differenzierte M1- beziehungsweise M2-Makrophagen nach Inkubation mit monozytären EVs einem LPS-Stimulus ausgesetzt. Die Zytokinantwort der Makrophagen wurde mit RT-PCR und ELISA für IL-1β, IL-10, IL-6, IL-8 und TNF-α analysiert. Extrazelluläre Vesikel primärer humaner Monozyten zeigten unter den gewählten experimentellen Bedingungen keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Zytokinantwort von in-vitro differenzierten M1- und M2-Makrophagen auf einen LPS-Stimulus. Dennoch nahm die Transkription der proinflammatorischen Zytokine in LPS-stimulierten M1-Makrophagen durch Vorinkubation mit monozytären EVs ab. Die gewonnenen Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der Forschung an extrazellulären Vesikeln von Primärzellen und unterstützen die Notwendigkeit genauer und kritischer Charakterisierung von EVs, beispielsweise mit durchflusszytometrischen Multiplex-Methoden für die Bestimmung von Oberflächenmolekülen. Weitere Studien sind nötig, um die intravesikulären Charakteristika monozytärer EVs und die Art derer Interaktion mit verschiedenen Zellen zu untersuchen. Das Verständnis der Rolle von EVs im Ablauf inflammatorischer Reaktionen könnte perspektivisch zu deren Einsatz im Rahmen zielgerichteter Immunmodulation oder Diagnostik führen.

Das Ziel des humanen Leber Tissue Engineerings besteht darin, mittels induzierbarer, pluripotenter Stammzellen (iPS) transplantierbares, funktionales Lebergewebe in-vitro zu generieren. Neben der klinischen Anwendung, z. B. im Rahmen der endgradigen Leberzirrhose, sind zudem für die pharmakologische Forschung möglichst stabile und physiologische Kulturmodelle wichtig. Die hierfür notwendige genaue Kenntnis der extrazellulären Matrix (EZM) der Leber, einer komplexen Komposition verschiedener Proteinkomponenten, gilt jedoch als eine der Voraussetzungen für die Weiterentwicklung des Tissue Engineerings. Der bisherige Goldstandard ist die Verwendung von entweder purem Rattenschwanz-Kollagen (RTC), hauptsächlich bestehend aus fibrillärem Typ I Kollagen, oder Matrigel® (MG), einer kommerziell erhältlichen Matrixkombination verschiedener Basalmembrankomponenten, die jedoch beide in der jeweiligen Reinform keine adäquate EZM darstellen. Zudem liegen bis heute keine validen Daten über die exakt notwendigen Konzentrationsverhältnisse der einzelnen EZM-Komponenten für die Zellkultur vor. Die Aufgabenstellung dieser Arbeit war daher erstens die systematische Analyse des Einflusses verschiedener Kombinationen von RTC und MG auf Morphologie, Stabilität, Differenzierungsstatus und Funktionalität von primären, humanen Hepatozyten (PHH) und zweitens die Beantwortung der Frage nach einem bestimmten Mischverhältnis der beiden, welches die physiologische EZM-Zusammensetzung der Leber in-vitro am ehesten repräsentiert. Hierfür wurden insgesamt sechs verschiedene Matrices, zwei davon bestehend aus jeweils RTC und MG in Reinform sowie vier verschiedene Mischverhältnisse aus RTC mit ansteigendem MG-Anteil, zusammengestellt. Anschließend wurden frisch isolierte PHH auf diesen sechs Matrices in 2D-Technik kultiviert und an Tag 0, 2, 4 und 6 anhand der genannten Kriterien systematisch analysiert. Die Ergebnisse der untersuchten Metabolismusparameter sowie der analysierten Genexpressionen zeigten in Hinblick auf die Funktionalität und den Differenzierungsstatus der kultivierten PHH einen klaren Vorteil der kombinierten EZM gegenüber den jeweiligen puren Varianten. Die vielfach beschriebene Dedifferenzierung war in PHH, welche auf kombinierten Matrices kultiviert wurden, deutlich geringer ausgeprägt bzw. stabilisierten sich in diesen Zellen einzelne Parameter, wie z. B. die mitochondrialen Aktivitäten oder die Expressionen der Gene CDH1, ALB und CYP2C9 sogar vollständig. Dies war bei den Kulturen auf purem RTC oder MG nicht der Fall. Im Bereich der Morphologie stellten sich die Unterschiede anhand des Expressionsprofils von CK-18 sowohl auf Transkriptions- als auch auf Proteinebene weniger klar dar. Dennoch ließ sich der erste Punkt der Aufgabenstellung dieser Arbeit in der Gesamtbetrachtung der Resultate sehr eindeutig klären. Schwieriger gestaltete sich die Beantwortung der zweiten Fragestellung. Einzelne Daten, beispielsweise der mitochondrialen Aktivitäten sowie der verschiedenen Genexpressionen, zeigten bereits bei sehr geringer MG-Supplementation von lediglich 5% Vorteile, während eine Überlegenheit z. B. bei den Zellintegritätsparametern oder der Harnstoffsynthese erst ab einem MG-Anteil von 20% evident wurde. Die vorliegenden Daten sollten daher in künftigen Studien mittels 3D-Kulturen, auf welche hier zugunsten einer breiteren Analyse verzichtet wurde, validiert werden. Hierbei könnte das Optimierungspotential weiterer EZM-Komponenten und deren Einfluss auf Proteinebene evaluiert werden. Dies ließe sich z. B. in Metabolismusanalysen von Pharmaka umsetzen. Auch eine größere Donoranzahl wäre zur Verbesserung der statistischen Aussagekraft hilfreich. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit das deutliche Potential einer nachhaltigen Optimierung des bisherigen Goldstandards, nämlich der Verwendung von entweder RTC oder MG in der 2D-Kultur. Deshalb sollten die Daten der vorliegenden Experimente in künftigen Arbeiten um die genannten Punkte systematisch erweitert werden, um insbesondere die zweite Fragestellung und das Einflusspotential weiterer EZM-Proteine besser beantworten zu können.:I. INHALTSVERZEICHNIS II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III. EINFÜHRUNG 3.1 AUFBAU UND STRUKTUR DER LEBER 3.2 SINUSOIDALE EXTRAZELLULÄRE MATRIX 3.3 STABILITÄTS- UND DIFFERENZIERUNGSMARKER 3.3.1 Adhärenz- und Zellaktivitätsparameter 3.3.2 Enzymaktivitäten und weitere Metabolismusparameter 3.3.3 Cytochrom P450-Isoenzyme 3.3.4 Proteinbiosynthese 3.3.5 Differenzierungsfaktoren 3.3.6 Adhäsionsproteine und Intermediärfilamente 3.4 TISSUE ENGINEERING UND KLINISCHER BEZUG IV. AUFGABENSTELLUNG V. MATERIAL UND METHODEN 5.1 MATERIAL 5.1.1 Geräte 5.1.2 Verbrauchsmaterialien 5.1.3 Bestandsmaterialien 5.1.4 Chemikalien 5.1.5 Kits und gebrauchsfertige Sets 5.1.6 Puffer und Medien 5.1.6.1 Kulturmedien 5.1.6.2 Perfusionslösungen 5.1.6.3 Lysepuffer 5.1.7 Datenbanken und Software 5.2 METHODEN 5.2.1 Isolation primärer Leberzellen 5.2.2 Plattenbeschichtung und Kultivierung primärer Leberzellen 5.2.3 Zelladhärenz- und Aktivitätsbestimmung 5.2.4 Proteinquantifizierung 5.2.5 Photometrische Bestimmung weiterer Metabolismusparameter 5.2.6 Immunfluoreszenzfärbung 5.2.7 Ribonukleinsäure-Isolation 5.2.8 RNA-Quantifikation, Qualitätskontrolle und cDNA-Synthese 5.2.9 Quantitative Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion 5.2.10 Auswertung und Statistik VI. ERGEBNISSE 6.1 ERGEBNISSE DER ZELLISOLATION 6.2 METABOLISCHE AKTIVITÄT DER PHH 6.3 DIFFERENZIERUNGSSTATUS DER PHH AUF TRANSKRIPTIONSEBENE 6.3.1 mRNA-Expression von Genen hepatischer Differenzierungsmarker 6.3.2 mRNA-Expression von HNF4α und ausgewählter Cytochrom P450-Isoenzyme 6.4 MORPHOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER PHH VII. DISKUSSION 7.1 KOMBINIERTE MATRICES – EIN NEUER GOLDSTANDARD? 7.1.1 Einfluss der EZM auf den Metabolismus von PHH 7.1.2 Einfluss der EZM auf den hepatischen Differenzierungsstatus von PHH 7.2 HETEROGENITÄT DER LEBERPROBEN 7.3 RELEVANZ VON WACHSTUMSFAKTOREN IM MATRIGEL® 7.4 AUSBLICK VIII. ZUSAMMENFASSUNG IX. LITERATUR-, ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 9.1 LITERATURVERZEICHNIS 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9.3 TABELLENVERZEICHNIS X. ANLAGEN 10.1 ERGÄNZENDE ABBILDUNGEN UND TABELLEN 10.2 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 10.3 DANKSAGUNG

Monozyten gehören zu den Zellen des angeborenen Immunsystems und sind maßgeblich an der Phagozytose von Pathogenen, an Entzündungsreaktionen, an der Wundheilung und bei der Rekrutierung von weiteren Immunzellen beteiligt. Neuere Forschungen zeigten jedoch, dass Monozyten ebenfalls eine entscheidende Rolle bei Tumorerkrankungen einnehmen. So konnte bei verschiedenen Tumorentitäten beobachtet werden, dass Monozyten pro- und antitumorale Funktionen aufweisen. Sie sind außerdem in der Lage, in tumorassoziierte Makrophagen zu differenzieren, welche zum Tumorgewebe migrieren und den Ausgang der Erkrankung maßgeblich beeinflussen. Tumorassoziierte Makrophagen weisen Eigenschaften der Typ-2 Makrophagen auf und üben eine tumorfördernde Funktion aus, bei der Immunsuppression, 106 Zusammenfassung Angiogenese und Metastasierung begünstigt wird. Magenkarzinome enthalten nicht nur hohe Mengen an tumorassoziierten Makrophagen, sondern beeinflussen außerdem Immunzellen im peripheren Blut über parakrine Faktoren, wie z.B. Extrazelluläre Vesikel (EVs). Sie beeinflussen sowohl physiologische als auch pathologische Prozesse, einschließlich der Karzinogenese. Tumore sekretieren EVs in ihre Umgebung und beeinflussen die Zusammensetzung des Tumormikromilieus. Auch im Blut zirkulieren Tumor-EVs und üben einen funktionsmodulierenden Effekt auf periphere mononukleäre Blutzellen aus. In vielen Fällen wurden immunsupprimierende Eigenschaften von Tumor-EVs nachgewiesen. Besonders bei der Beseitigung von Tumorzellen ist ein intaktes Immunsystem erforderlich. Inwiefern Magenkarzinom-EVs die immunologische Aktivität von Monozyten beeinflussen, ist Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Hierbei sollten insbesondere Magenkarzinom spezifische EVs charakterisiert und ihr Einfluss auf die Zytokin-Produktion von aktivierten Monozyten untersucht werden. Um Magenkarzinom-spezifische EVs zu produzieren, erfolgte die Etablierung der Zellkultur der menschlichen Magenkarzinomzelllinie MKN45 und einer Kontrollzelllinie GES-1. Da depletiertes Medium kaum exogene EVs enthielt und eine uneingeschränkte Proliferation von MKN45 zuließ, bewährte es sich als geeignetes Medium für die Gewinnung von EVs. Untersuchungen mittels „Nanoparticle Tracking Analysis“ zeigten, dass die isolierten EVs eine charakteristische Größe zwischen 100 nm – 400 nm im Durchmesser aufwiesen (Modalwert GES-1: 207 nm; Modalwert MKN45: 169 nm). Die EV spezifischen Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 ließen sich mittels durchflusszytometrischer Untersuchungen des Oberflächenproteinprofils nachweisen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten eine charakteristische EV-Struktur. Nach erfolgreicher Produktion von Magenkarzinom-spezifischen EVs erfolgte die Ko-Inkubation mit primären Monozyten, welche von gesunden Spendern mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation und Gegenstromelutriation gewonnen wurden. Untersuchungen der Genexpression mittels RT qPCR zeigten, dass die Inkubation mit MKN45-EVs in LPS-aktivierten Monozyten zu einer Abnahme der relativen mRNA-Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8 und TNF-α, sowie zu einer Zunahme von INF- führt. In Folgeexperimenten konnte nach der Inkubation mit MKN45 eine konzentrationsabhängige Inhibierung der TNF- Produktion auf Genexpressions- und Proteinebene, sowie ein konzentrationsabhängiger Anstieg der IFN- mRNA beobachtet werden. Analog zeigte die Inkubation mit GES-1 EVs eine ähnliche konzentrationsabhängige Inhibierung der TNF--Produktion, jedoch auch eine Hemmung der Genexpression von IFN-Beta. Magenkarzinom- und Kontroll-EVs beeinflussen somit die LPS 107 Zusammenfassung abhängige Induktion von TNF-α und IFN-β. Im Anschluss daran wurde die Untersuchung des zugrunde liegenden Mechanismus durchgeführt. NF-κB ist als Transkriptionsfaktor Toll-like Rezeptor-4(TLR4)-abhängiger Signalwege von großer Bedeutung für die LPS-induzierte Zytokinproduktion. Nach einer Inkubation mit EVs wurde die Phophorylierung von NF-κB in primären Monozyten mittels Western-Blot-Methodik analysiert. Zwar führte die Inkubation mit MKN45 EVs und LPS zu einer erhöhten Phosphorylierung von NF-κB die sich jedoch durch Zugabe von EVs nicht änderte. Die Inkubation mit Tumor-EVs allein hatte keinen Effekt. Somit spiegelte sich die durch die EVs beobachtete Hemmung der LPS-induzierten TNF-a Produktion nicht in den Western-Blot Analysen wider. Es folgten Untersuchungen die den Einfluss sezernierter EVs auf primäre Monozyten, nach Behandlung der GES-1 und MKN45 mit Nikotinamid (NAM) analysierten. NAM ist eine Substanz, die viele zelluläre Prozesse, wie z.b. Energiemetabolismus, Lipidstoffwechsel und DNA-Reperaturmechanismen, maßgeblich beeinflusst und in der Tumortherapie Einsatz findet. Ein Effekt auf die Funktion der EVs auf die TNF-α und IFN-β-Produktion wurde jedoch in der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen. Ein weiteres Hauptaugenmerk lag in der Analyse des zellulären Immunstatus der Monozyten von Magenkarzinompatienten. Es wurden Oberflächenproteine der Monozyten aus Vollblutproben von 30 Magenkarzinompatienten (♀ = 22, ♂ = 8, Ø-Alter = 65 Jahre) und 24 altersentsprechenden gesunden Spendern durchflusszytometrisch untersucht. Auffällig war, dass Monozyten von Magenkarzinompatienten eine erhöhte Expression des Oberflächenproteins Carboxypeptidase M (CPM) aufweisen, eine Metallo-Carboxypeptidase, die mit der Makrophagendifferenzierung assoziiert ist. Weiterhin exprimieren Monozyten von Magenkarzinompatienten in höherem Anteil CD33, ein entscheidender Regulator der inflammatorischen Funktion von Monozyten. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle des Zytokins TGF- bei der Immunmodulation durch Magenkarzinome diskutiert. Mithilfe des Online-Tools GEPIA2 wurden computergestützte Analysen durchgeführt, die zeigten, dass die Genexpression von TGFB1 bei Magenadenokarzinomen und Ösophaguskarzinomen im Vergleich zu gesundem Gewebe erhöht ist und dass eine gesteigerte Genexpression von TGFB1 bei Patienten mit Magen- oder Ösophaguskarzinom mit einer verminderten Überlebensrate korreliert. Abschließend wurde überprüft, ob das in der vorliegenden Studie verwendete Zellkulturmodell mit den computergestützten Analysen übereinstimmt. Im Vergleich zu GES-1 weisen MKN45 eine doppelt so hohe relative Genexpression von TGFB1 auf. Dieser Befund stimmt mit den oben beschriebenen in silico generierten Ergebnissen überein. Zusammenfassend gelang die 108 Zusammenfassung Entwicklung eines erfolgreichen Protokolls für zur Isolation von EVs aus menschlichen Magenkarzinomzelllinien in hoher Reinheit und Effizienz. Die vorliegende Studie demonstrierte einen immunmodulierenden Effekt der EVs aus GES-1 und MKN45 Zelllinien auf periphere Monozyten. Weiterhin unterlagen periphere Monozyten von Magenkarzinompatienten einer Änderung der Expression der Oberflächenproteine CPM und CD33. Diese Arbeit liefert Hinweise, dass magenkarzinomspezifische EVs antiinflammatorische Effekte auf periphere Monozyten ausüben können. Hierbei spielt möglicherweise ein TGF- abhängiger Mechanismus eine übergeordnete Rolle. Weitere Studien sind notwendig, um die intravesikulären Charakteristika der magenkarzinomassoziierten EVs und deren Interaktion mit Immunzellen zu untersuchen. Das Verständnis der Rolle von EVs bei tumorassoziierten Prozessen könnte perspektivisch zu deren Einsatz im Rahmen zielgerichteter Immunmodulation oder Diagnostik führen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Das Immunsystem 1 1.1.1 Die Rolle des Immunsystems und ihre Komponenten 1 1.1.2 Monozyten 3 1.1.3 Die Rolle von Monozyten im Tumorgeschehen 6 1.2 Magenadenokarzinome 7 1.2.1 Beschreibung und Klassifizierung 7 1.2.2 Die Wechselwirkung zwischen Magenadenokarzinom und Immunsystem 7 1.3 Extrazelluläre Vesikel 10 1.3.1 Biogenese und Klassifikation . 10 1.3.2 Isolierung und Charakterisierung 11 1.3.3 Die Immunonkologische Rolle von EVs15 1.4 Nikotinamid 16 1.4.1 Die physiologische Rolle von Nikotinamid 16 1.4.2 Der Einfluss von Nikotinamid auf Immun- und Tumorzellen 17 2 Zielstellung 19 3 Material und Methoden 21 3.1 Menschliche Zelllinien 21 3.2 Geräte und Material 21 3.2.1 Geräte 21 3.2.2 Verbrauchsmaterialien 22 3.3 Software und Web-Tools 23 3.3.1 Software23 3.3.2 Web-Tools . 23 3.4 Chemikalien, Kits und Nährmedien 23 3.4.1 Chemikalien23 3.4.2 Kits 24 Inhaltsverzeichnis II 3.4.3 Puffer und Lösungen25 3.5 Biologische Materialien . 29 3.5.1 Oligonukleotide 29 3.5.2 Antikörper 30 3.5.3 Protein Größenmarker 31 4 Methoden 32 4.1 Zellkultur 32 4.1.1 Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 32 4.1.2 Gegenstromelutriation 32 4.1.3 Kultur, Stimulation und Ernte von Monozyten 33 4.2 Isolation extrazellulärer Vesikel 34 4.2.1 Herstellung von partikeldepletiertem Zellkulturmedium 34 4.2.2 Entfernung von Zelltrümmern aus Zellkulturüberständen 34 4.2.3 Sequenzielle Ultrazentrifugation zur Pelletierung von EVs34 4.3 Charakterisierung extrazellulärer Vesikel 35 4.3.1 „Nanoparticle Tracking Analysis“ (NTA) 35 4.3.2 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen der Struktur von extrazellulären Vesikeln 35 4.3.3 Beadbasierte Charakterisierung von Oberflächenproteinen von extrazellulären Vesikeln 36 4.4 Molekulare Analyse von Zellen mittels RT-qPCR 36 4.4.1 RNA-Isolation36 4.4.2 DNA-Verdau 37 4.4.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription) 37 4.4.4 QRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction) 38 4.5 Molekularbiologische Methoden 39 4.5.1 SDS-PAGE und Westernblot 40 4.5.2 TNF-α-Bestimmung im Zellkulturüberstand mittels ELISA 41 4.5.3 Durchflusszytometrische INF-β-Bestimmung im Zellkulturüberstand42 4.5.4 Durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenproteinen von Monozyten aus Vollblut 42 4.5.5 Durchflusszytometrische Analyse von Viabilität, Apoptose und Nekrose 44 Inhaltsverzeichnis III 4.6 Gatingstrategie 45 4.7 Statistik 47 5 Ergebnisse 48 5.1 Isolation von extrazellulären Vesikeln aus Magenkarzinomzelllinien48 5.1.1 Beschreibung der Zelllinien GES-1 und MKN45 48 5.1.2 Herstellung von partikelfreien Zellkulturmedium. 49 5.1.3 Zellproliferation und Viabilität von MKN45 in partikelfreien Zellkulturmedium .. 52 5.1.4 Gewinnung und Quantifizierung von Partikeln der Zelllinien MKN45 und GES-1 55 5.2 Charakterisierung der isolierten Partikel 58 5.2.1 Analyse von Oberflächenproteinen der isolierten Partikel58 5.2.2 Elektronenmikroskopische Untersuchungen der isolierten Partikel 60 5.3 Einfluss von extrazellulären Vesikeln der Magenkarzinomzelllinien auf die Zytokinproduktion und Signaltransduktion von aktivierten Monozyten 62 5.3.1 Analyse der Zytokinantwort von stimulierten Monozyten auf extrazelluläre Vesikel der Magenkarzinomzelllinien 62 5.3.2 Der konzentrationsabhängige Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β 63 5.3.3 Untersuchungen des zeitabhängigen Effekts von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β 67 5.3.4 Einfluss von extrazellulären Vesikeln auf die Phosphorylierung von Schlüsselproteinen des TLR4 Signalweges 73 5.4 Einfluss von Nikotinamid auf den Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Zytokinproduktion 76 5.4.1 Untersuchungen des Einflusses von Nikotinamid auf die Zellproliferation und Viabilität von MKN4576 5.4.2 Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β aus Nikotinamid behandelten Zelllinien 77 5.5 Analyse und Vergleich der Expression von Oberflächenmarkern auf primären Monozyten von Magenkarzinompatienten und gesunden Spendern 82 Inhaltsverzeichnis IV 5.6 TGFβ im Magenkarzinom 88 6 Diskussion 92 6.1 Isolation und Charakterisierung von EVs 92 6.2 Immunmodulierender Effekt von Magenkarzinom-EVs auf Monozyten 97 6.3 Der Effekt von Nikotinamid auf die Funktion von Magenkarzinom-EVs100 6.4 Expression von CPM und CD33 auf primären Monozyten von Magenkarzinompatienten 102 6.5 TGFβ im Magenkarzinomgeschehen 104 7 Zusammenfassung 106 8 Literaturverzeichnis 110 8.1 Literaturverzeichnis 110 9 Anlagen 127 10 Selbstständigkeitserklärung, Lebenslauf, Publikationen, Danksagung 134 10.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit134 10.2 Lebenslauf 135 10.3 Publikation136 10.4 Danksagung 137

As graft source for lymphoma or leukemia treatment, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) have been the focus of translational medicine for decades. HSPCs are defined by their self-renewing capacity and their ability to give rise to all mature blood cells. They are found anchored to a specialized microenvironment in the bone marrow (BM) called the hematopoietic niche. HSPCs can be enriched by sorting them based on the presence of the surface antigen CD34 before clinical or tissue engineering use. As these cells represent a minority in most graft sources and the amount of applicable cells is limited, ex vivo expansion-cultures were established using cytokine cocktails or small molecules. However, in vitro culture of HSPCs as suspension-cultures result in heterogeneous cell populations with undefined cellular identities. In the BM niche, HSPCs are not exclusively maintained by cytokines but also by cell-matrix adhesions mediated by integrins (ITGs). Thus, β1 and β2 ITGs were found to promote initial contact of HSPCs with mesenchymal stromal cells (MSCs) and ITGβ3 expression was shown to be a marker for long-term repopulating HSPCs in vivo. Consequently, ex vivo remodeling of the BM niche using co-cultures of HSPCs and niche cells like MSCs came into spotlight and was proven to be a promising tool for stem cell expansion. However, in clinical and research applications, direct contact of two cell populations necessitates HSPC post-culture purification. To address these problems, we established a novel culture method for remodeling the BM extra cellular stroma in vitro wherein we used decellularized extracellular matrix (ECM) scaffolds derived from immortalized mesenchymal stromal cells (SCP-1). Such scaffolds were found to be highly reproducible and served as in vitro niche for HSPCs by being more effective for the expansion of CD34+ cells, compared to classical suspension cultures. ECMs were shown to consist of multiple proteins including fibronectins, collagens, and a major niche chemokine responsible for BM homing and retention of HSPCs in vivo, namely, stromal derived factor 1 (SDF-1). SDF-1 is known to be secreted by MSCs and is anchored to matrix proteins. This reveals that ECM scaffolds produced by SCP-1 cells are a naïve reconstructed microenvironment. When CD34+ cells were seeded, only around 20% of the cells adhered to the provided ECM scaffold. These cells recognized SDF-1 via C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR-4), as shown by laser scanning confocal microscopy. Thus, adhesive sides as they are present in the BM niche are provided. However, CD34+ cells isolated from G-CSF mobilized peripheral blood of healthy donors were found to be heterogenous with respect to adhesion capacity. Nonetheless, it was similar to HSPC co-cultures with SCP-1 cells as feeder layer. Therefore, we separated and analyzed two cell fractions, the adherent (AT-cells) and the non- adherent supernatant (SN-cells) cells. Other signals provided by the BM extracellular stroma to HSPCs are physical cues that control HSPC fate. HSPCs sense these physical features through focal contacts and accordingly remodel their morphological and biomechanical properties. Using real-time deformability cytometry (RT-DC) to uncover biomechanical phenotypes of freshly isolated HSPCs, SN-cells, AT-cells, and classical suspension cultured HSPCs in plastic culture dishes (PCD) were analyzed. We found freshly isolated cells to be less deformable and small. AT-cells displayed actin polymerization to stress fibers, and exhibited a stiffer mechanical phenotype compared to PCD-cultured or SN-cells. This might constitute the first hint of functional adaptation. Integrins are known to establish mechanosensing focal contacts. Thus, we analyzed ITG surface expression and identified ITGαIIb, ITGαV, and ITGβ3 to be enriched on AT-cells compared to freshly isolated cells or SN-cells. Active integrins need to form heterodimers consisting of one α- and one β subunit. Interestingly, the identified ITGs exclusively interact with each other to form RGD peptide receptors. RGD is a tripeptide consisting of the amino acids arginine, glycine, and aspartic acid and was identified as an adhesion sequence within fibronectin and other extracellular proteins. Consequently, we could confirm an important role for ITGαVβ3 in HSPC- ECM interaction with respect to adhesion and migration. However, we also identified ITGβ3 expression on a subset of CD34+ cells either freshly isolated or ECM cultured cells, as a marker for erythrocyte differentiation. These findings demonstrate that, in vitro, the ECM compartment acts as a regulator of HSPC fate and portray mechanical recognition as a potent driver of differentiation. In this context, targeted modulation of ECM scaffolds could enhance cell-ECM interactions and accelerate stem cell expansion or differentiation. These modulations could also provide further insights into HSPC-niche regulation. We demonstrate that ECMs derived from osteogenic differentiated SCP-1 cells increase HSPC expansion but do not lead to increased cell adhesion. As ECM adhesion preliminary alters HSPC function, we aimed at developing ECM scaffolds with increased adhesion capacity. Using lentiviral transduction, we generated a stable knock down of fibulin-1 in SCP-1 cells. Fibulin-1 is an ECM protein known to form anti-adhesion sites with fibronectin. However, we failed to increase adherent cell numbers or enhance HSPC expansion in the fibulin-1 knock down ECMs. Taken together, SCP-1 cell-derived ECM protein scaffolds provide an in vitro niche for HSPCs capable of stem cell expansion. Integrin mediated signaling altered the biomechanical and functional properties of HSPCs and hints at suspension cultures as being inappropriate to study the physiological aspects of HSPCs. Targeted modulation of ECM scaffolds could theoretically generate suitable ex vivo environments with the capacity to gain detailed insight into HSPC regulation within their niche. This will enhance the functionality of new biomaterials and will lead to improved regenerative therapies like BM transplantation.

As graft source for lymphoma or leukemia treatment, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) have been the focus of translational medicine for decades. HSPCs are defined by their self-renewing capacity and their ability to give rise to all mature blood cells. They are found anchored to a specialized microenvironment in the bone marrow (BM) called the hematopoietic niche. HSPCs can be enriched by sorting them based on the presence of the surface antigen CD34 before clinical or tissue engineering use. As these cells represent a minority in most graft sources and the amount of applicable cells is limited, ex vivo expansion-cultures were established using cytokine cocktails or small molecules. However, in vitro culture of HSPCs as suspension-cultures result in heterogeneous cell populations with undefined cellular identities. In the BM niche, HSPCs are not exclusively maintained by cytokines but also by cell-matrix adhesions mediated by integrins (ITGs). Thus, β1 and β2 ITGs were found to promote initial contact of HSPCs with mesenchymal stromal cells (MSCs) and ITGβ3 expression was shown to be a marker for long-term repopulating HSPCs in vivo. Consequently, ex vivo remodeling of the BM niche using co-cultures of HSPCs and niche cells like MSCs came into spotlight and was proven to be a promising tool for stem cell expansion. However, in clinical and research applications, direct contact of two cell populations necessitates HSPC post-culture purification. To address these problems, we established a novel culture method for remodeling the BM extra cellular stroma in vitro wherein we used decellularized extracellular matrix (ECM) scaffolds derived from immortalized mesenchymal stromal cells (SCP-1). Such scaffolds were found to be highly reproducible and served as in vitro niche for HSPCs by being more effective for the expansion of CD34+ cells, compared to classical suspension cultures. ECMs were shown to consist of multiple proteins including fibronectins, collagens, and a major niche chemokine responsible for BM homing and retention of HSPCs in vivo, namely, stromal derived factor 1 (SDF-1). SDF-1 is known to be secreted by MSCs and is anchored to matrix proteins. This reveals that ECM scaffolds produced by SCP-1 cells are a naïve reconstructed microenvironment. When CD34+ cells were seeded, only around 20% of the cells adhered to the provided ECM scaffold. These cells recognized SDF-1 via C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR-4), as shown by laser scanning confocal microscopy. Thus, adhesive sides as they are present in the BM niche are provided. However, CD34+ cells isolated from G-CSF mobilized peripheral blood of healthy donors were found to be heterogenous with respect to adhesion capacity. Nonetheless, it was similar to HSPC co-cultures with SCP-1 cells as feeder layer. Therefore, we separated and analyzed two cell fractions, the adherent (AT-cells) and the non- adherent supernatant (SN-cells) cells. Other signals provided by the BM extracellular stroma to HSPCs are physical cues that control HSPC fate. HSPCs sense these physical features through focal contacts and accordingly remodel their morphological and biomechanical properties. Using real-time deformability cytometry (RT-DC) to uncover biomechanical phenotypes of freshly isolated HSPCs, SN-cells, AT-cells, and classical suspension cultured HSPCs in plastic culture dishes (PCD) were analyzed. We found freshly isolated cells to be less deformable and small. AT-cells displayed actin polymerization to stress fibers, and exhibited a stiffer mechanical phenotype compared to PCD-cultured or SN-cells. This might constitute the first hint of functional adaptation. Integrins are known to establish mechanosensing focal contacts. Thus, we analyzed ITG surface expression and identified ITGαIIb, ITGαV, and ITGβ3 to be enriched on AT-cells compared to freshly isolated cells or SN-cells. Active integrins need to form heterodimers consisting of one α- and one β subunit. Interestingly, the identified ITGs exclusively interact with each other to form RGD peptide receptors. RGD is a tripeptide consisting of the amino acids arginine, glycine, and aspartic acid and was identified as an adhesion sequence within fibronectin and other extracellular proteins. Consequently, we could confirm an important role for ITGαVβ3 in HSPC- ECM interaction with respect to adhesion and migration. However, we also identified ITGβ3 expression on a subset of CD34+ cells either freshly isolated or ECM cultured cells, as a marker for erythrocyte differentiation. These findings demonstrate that, in vitro, the ECM compartment acts as a regulator of HSPC fate and portray mechanical recognition as a potent driver of differentiation. In this context, targeted modulation of ECM scaffolds could enhance cell-ECM interactions and accelerate stem cell expansion or differentiation. These modulations could also provide further insights into HSPC-niche regulation. We demonstrate that ECMs derived from osteogenic differentiated SCP-1 cells increase HSPC expansion but do not lead to increased cell adhesion. As ECM adhesion preliminary alters HSPC function, we aimed at developing ECM scaffolds with increased adhesion capacity. Using lentiviral transduction, we generated a stable knock down of fibulin-1 in SCP-1 cells. Fibulin-1 is an ECM protein known to form anti-adhesion sites with fibronectin. However, we failed to increase adherent cell numbers or enhance HSPC expansion in the fibulin-1 knock down ECMs. Taken together, SCP-1 cell-derived ECM protein scaffolds provide an in vitro niche for HSPCs capable of stem cell expansion. Integrin mediated signaling altered the biomechanical and functional properties of HSPCs and hints at suspension cultures as being inappropriate to study the physiological aspects of HSPCs. Targeted modulation of ECM scaffolds could theoretically generate suitable ex vivo environments with the capacity to gain detailed insight into HSPC regulation within their niche. This will enhance the functionality of new biomaterials and will lead to improved regenerative therapies like BM transplantation.:List of contents I List of figures IV List of tables VI Abbreviations VII 1 Introduction 1 1.1 The stem cell microenvironment 3 1.1.1 The cellular endosteal bone marrow microenvironment 6 1.1.1.1 Mesenchymal stem/stromal cells 7 1.1.1.2 Hematopoietic stem and progenitor cells 8 1.1.2 Extracellular bone marrow microenvironment 10 1.1.2.1 Extracellular matrix 11 Chemokines and Cytokines 12 Cell adhesion to ECM 13 1.2 Native ex vivo ECM scaffolds 16 2 Aim of the study 19 3 Materials and methods 21 3.1 Materials 21 3.1.1 Chemicals and reagents 21 3.1.2 Kits 23 3.1.3 Media 24 3.1.4 Antibodies 24 3.1.5 Primers, sh-RNA sequences, and vectors 25 3.1.6 Equipment 26 3.1.7 Software 27 3.2 Methods 27 3.2.1 Cell preparation and culture 27 3.2.1.1 Mesenchymal stromal cells 27 3.2.1.2 Hematopoietic stem cells 28 3.2.1.3 Single cell picked clone 1 (SCP-1) cells 28 3.2.2 Generation of surface immobilized ECM preparations 29 3.2.2.1 Surface functionalization 29 3.2.2.2 ECM preparation 29 3.2.3 Flow cytometry and fluorescent activated cell sorting 30 3.2.4 Cell cycle analyses 30 3.2.5 Proliferation analyses 31 3.2.6 Colony forming unit cell assay (CFU-GEMM) 31 3.2.7 Migration assays 31 3.2.7.1 Transwell migration 31 3.2.7.2 Live cell migration 32 3.2.8 Confocal laser scanning microscopy 32 3.2.9 Real-time deformability cytometry (RT-DC) 32 3.2.10 Molecular biological methods 33 3.2.10.1 RNA isolation, reverse transcription, and PCR 33 3.2.10.2 Lentiviral shRNA transduction 34 3.2.10.3 Western blot 35 3.2.10.4 ELISA 36 3.2.11 Statistical analysis 37 4 Results 38 4.1 Extracellular matrix scaffolds for HSPCs 38 4.1.1 ECM properties 39 4.1.2 HSPC survival in ECM and PCD cultures 40 4.1.3 HSPC expansion in ECM and PCD cultures 41 4.2 HSPC morphological and mechanical adaptation to ECM 44 4.2.1 Actin polymerization and polarization 45 4.2.2 Biomechanical phenotype 46 4.3 Bioactive SDF-1 is incorporated in ECM scaffolds 49 4.3.1 CXCR4 polarization towards ECM 50 4.4 HSPC integrin expression and migration 52 4.4.1 Integrin surface expression on HSPC subsets 52 4.4.2 Focal contact formation 53 4.4.3 Integrin activation via ECM adhesion 55 4.4.4 Clonogenicity of ECM cultured HSPCs 57 4.4.5 HSPC migration when attached to ECM scaffolds 60 4.4.5.1 Reduced migratory behavior via ITGαVβ3 inhibition 61 4.4.5.2 SDF-1 induces migration but not adhesion 64 4.5 Targeted modulation of ECM scaffolds 65 4.5.1 Fibulin-1 knock down in SCP-1 cells 66 4.5.2 HSPC support of fibulin-1 reduced ECM scaffolds 70 5 Discussion 73 5.1 SCP-1 cells as a source for ECM scaffold production 74 5.2 Cell adhesion and focal contact formation 75 5.3 HSPC multilineage potential 78 5.4 ECM scaffold modulation 79 6 Summary 83 7 Zusammenfassung 86 Bibliography 89 Danksagung 108 Anlagen 110 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens [Formblatt 1.2.1] 110 Erklärung zur Einhaltung rechtlicher Vorschriften [Formblatt 1.1] 110

Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf dem Teilvorgang der Migration epithelialer Zellen auf annähernd physiologischem Matrix-Untergrund. Im Zellkulturmodell wurde die migratorische Aktivität der aus dem humanen Mammakarzinom isolierten, schwach invasiven epithelialen Zelllinie MCF-7 untersucht. Es stellte sich die grundsätzliche Frage, ob eine Wnt-bedingte Invasionssteigerung, welche in vorangegangenen Untersuchungen gezeigt worden war, durch die gesteigerte migratorische Aktivität der Tumorzellen verursacht ist. Es sollten zwei an der Tumorprogression (Wnt5b) bzw. an deren Inhibition (Dkk-2) beteiligte Proteine auf den Invasions-Teilvorgang der Migration hin näher beleuchtet werden. Dazu wurden Untersuchungen in einem modifizierten Tumor-Migrationsassay auf extrazellulärer Matrix (ECM) durchgeführt. In Analogie zu den Vorgängen bei der Wundheilung wurde ein in Anlehnung an die bereits seit langem verwendete Methode des Scratchassays sowie an den etablierten Migrationsassay ein Konfrontationsassay auf ECM konzipiert. Der Einfluss von Wnt5b und Dkk-2 auf die Migration der schwach invasiven, epithelialen Zelllinie MCF-7 wurde schließlich im Migrationsassay sowie im neu etablierten Konfrontationsassay auf ECM näher untersucht. Es wurden dazu Messungen zur Migrationsaktivität der eingesetzten Zellen unter Stimulation mit Wnt5b und Dkk-2 erhoben. Jedoch zeigte sich in beiden Assay-Modellen auf ECM kein signifikanter Einfluss der beiden untersuchten Proteine auf das Migrationsverhalten der MCF-7-Zellen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Beobachtungen zum Teilaspekt der Migration nicht automatisch Rückschlüsse auf die Invasion zulassen. Letztere ist ein komplex zusammengesetzter Gesamtvorgang, dessen einzelne Bestandteile es noch weiter zu erforschen gilt.

The desire for repair of tissue defects and injury is the major need prompting research into tissue engineering. Engineering of anisotropic tissues requires production of ordered substrates that orient cells preferentially and support cell viability and differentiation. Towards this goal, this thesis investigated methodologies to align extracellular matrix structures in vitro to guide stem/progenitor cell behaviour for tissue regeneration. Aligned collagen fibrils were deposited on planar substrates from collagen solutions streaming through a microfluidic channel system. Collagen solution concentration, degree of gelation, shear rate and pre-coating of the substrate were demonstrated to determine the orientation and density of the immobilized fibrils. The degree of collagen fibril orientation increased with increasing flow rates of the solution while the matrix density increased at higher collagen solution concentrations and on hydrophobic polymer pre-coatings. Additionally, the length of the immobilized collagen fibrils increased with increasing solution concentration and gelation time. Aligned collagen matrices were refined by incorporating the glycosaminoglycan heparin to study multiple extracellular matrix components in a single system. Multilineage (osteogenic/adipogenic/chondrogenic) differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells was maintained by the aligned structures. Most noticeable was the observation that during osteogenesis, aligned collagen substrates choreographed ordered matrix mineralization. Likewise, myotube assembly of C2C12 cells was profoundly influenced by aligned topographic features resulting in enhanced myotube organization and length. Neurites from neural stem cells were highly oriented in the direction of the underlying fibrils. Neurite outgrowth was enhanced on aligned collagen compared to non-aligned collagen or poly-D-lysine substrates, while neural differentiation and cell survival were not influenced by the type of substrate. Using the new method to align collagen type I, the interior walls of cellulose hollow fiber membranes were coated with longitudinally aligned collagen fibrils to fabricate an advanced guidance conduit for nerve regeneration. First cell culture experiments showed that the tubes coated with aligned collagen supported viability and adherence of spinal cord-derived neurospheres. Together, these results demonstrate the feasibility of aligned collagen matrices as a versatile platform to control cell behaviour towards tissue regeneration. Ultimately, the new method to align collagen fibrils and to coat hollow membranes may become an integral component of tissue engineering, working synergistically with other emerging techniques to promote functional tissue replacements.

The bone marrow (BM) niche provides hematopoietic stem (HSC) and progenitor cells with many exogenous cues that tightly regulate homeostasis. These cues orchestrate cellular decisions, which are difficult to dissect and analyze in vivo. This thesis introduces a novel in vitro platform that permits systematic studies of BM-relevant factors that regulate homeostasis. Specifically, the role of 3D patterned adhesion ligands and soluble cytokines were studied in a combinatorial fashion. Analysis of human HSC differentiation and proliferation at both population and single cell level showed synergistic and antagonistic effects of adhesion- and cytokine-related signals. Those effects were dependent on the cytokine concentration and the distribution and number of adhesion ligands. The aim of this thesis was to model the in vivo bone marrow with its porous 3D structure and different sized niche compartments using a microcavity culture carrier. The developed culture system presented extracellular matrix (ECM) adhesion ligands to the HSCs in various defined dimensions ranging from single- to multi-cell capacity. The 3D open well geometry of the microcavity carriers also allowed HSCs to freely explore different scenarios including homing, migration, adhesion, or suspension. Furthermore, the developed setup offered straightforward accessibility to analytical methods like cytometry and quantitative microscopy. Single cell analysis of adherent HSCs showed decreased DNA synthesis and higher levels of stem cell marker expression within single cell microcavities under low cytokine conditions . This effect was reflected in a decline of proliferation and differentiation with decreasing microcavity size. When the cytokine concentration was increased2 beyond physiological levels the inhibitory effect on proliferation and differentiation due to single-cell-microcavity adherence was diminished. This result highlighted the fine balance between adhesion related and soluble cues regulating HSC fate. Within small microcavities more adhesion related receptors were engaged due to the 3D character of the culture carrier compared to multi-cell wells or conventional 2D cell culture plates. This study demonstrated that adhesion-related signal activation leads to reduced proliferation and differentiation. This geometry-based effect could be reversed by increased cytokine supplementation in the culture media. For plane substrates, HSCs attachment to fibronectin or heparin initiated early cell cycle entry compared to non-adherent cells during the initial 24h. Cytokine supplemented media favored integrin activation that induced fast adhesion, ultimately leading to early cell cycle activation. However, after prolonged cell culture the system balanced itself with a lower cycling rate of adherent versus non-adherent HSCs. Furthermore, HSCs within the 3-dimensionality of the microcavities cycled less than 2D adherent cells. These findings additionally supported the above stated idea of limited HSC proliferation as a consequence of more adhesion-related signals overwriting cytokine driven expansion. To complement the various in vitro studies, an in vivo repopulation study was performed. Cultured HSCs derived from single cell microcavities outperformed freshly isolated HSCs in a competitive repopulation assay, indicating that carefully engineered substrates are capable of preserving stem cell potential. Overall the reported findings provide a promising in vitro culture strategy that allows the stem cell field to gain a better understanding of the impact of distinct exogenous signals on human HSCs, which discloses new concepts for the wide scientific community working towards tissue engineering and regenerative medicine. / Die Homöostase der Hämatopoietischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSC) in der Knochenmark Nische wird von einer Vielzahl exogener Faktoren gezielt reguliert. Diese Faktoren orchestrieren intrazelluläre Vorgänge, deren in vivo Analyse kompliziert ist. Die vorliegende These widmet sich einem neuen biotechnologischen Ansatz, der systematische Studien von Knochenmark-relevanten Faktoren ermöglicht. Im Speziellen wurde die Rolle 3D-präsentierter Zell Adhäsionsliganden in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen löslicher Zytokine untersucht. Die Auswertung der Proliferation und Differenzierung von humanen HSC auf Einzelzell- und Populationsebene offenbarte die synergistischen und antagonistischen Effekte von Adhäsions- und Zytokinsignalen in ihrer Abhängigkeit von der Verteilung und der Anzahl von Adhäsionsliganden sowie der Zytokinkonzentration. Um die poröse Struktur des Knochenmarks in vivo-ähnlich darzustellen, wurde eine Zellkultur Plattform mit Mikrokavitäten verschiedenster Dimensionen von Multi- bis Einzelzellgröße entwickelt und mit Molekülen der extrazellulären Matrix beschichtet. Die Vorteile dieser Plattform liegen in der offenen 3D-Geometrie dieses mikrokavitäten Kultursystems, die den Zellen ermöglichte verschiedene Wachstumsbedingungen bezüglich Homing, Migration, Adhäsion oder Suspension frei zu erkunden. Das leicht zugängliche Setup eignete sich zudem hervorragend für die zytometrische Analyse der Zellen oder die quantitative Mikroskopie. Die Einzelzellanalyse adhärenter HSC ergab eine Reduktion von DNA Synthese und eine höhere Expression von Stammzelloberflächenfaktoren innerhalb der Einzelzell-Mikrokavitäten bei niedrigen Zytokinkonzentrationen . Dieser Effekt spiegelte sich auch auf Populationsebene in verminderter Proliferation und Differenzierung mit abnehmender Größe der Mikrokavitäten wider. Wurde die Zytokinkonzentration jedoch weit über physiologische Bedingungen erhöht, verminderte sich der Effekt (reduzierte DNA Synthese und höhere Stammzellfaktorexpression) beschrieben für die Einzelzellmikrokavitäten. Dieses Ergebnis verdeutlicht die empfindliche intrazelluläre Balance, vermittelt durch Adhäsionsignale und löslichen Faktoren, die das Verhalten von HSCs regulieren. Aufgrund des 3D-Charakters des Zellkulturträgers wurden innerhalb kleiner Mikrokavitäten mehr Adhäsionsrezeptoren ringsum die Zelle aktiviert. Dieser Vorteil gegenüber den Multizellkavitäten oder der herkömmlichen 2D–Zellkultur ermöglichte eine hohe Anzahl adhäsionsvermittelter Signale mit entsprechend höherer Proliferations-inhibitorischer Wirkung. Je höher die Konzentration der Zytokine war, desto stärker erfolgte die Stimulation der Proliferation und Differenzierung. Auf 2D Substraten, initiierte Adhäsion zu Fibronektin und Heparin innerhalb der ersten 24h einen frühen Zell-Zyklus-Start im Gegensatz zu nicht adhärenten Zellen. Die Zytokine im Zellmedium förderten die Integrin Aktivierung, was zu einer schnellen Zelladhäsion führte. Die Adhäsionsrezeptoren wiederum kooperieren mit Zytokinrezeptoren im Zellinneren und begünstigten damit einen zeitigeren Zell-Zyklus- Start. Allerdings stellte sich danach ein Gleichgewicht im Kultursystem ein, wobei weniger adhärente Zellen als nicht-adhärente Zellen den Zellzyklus durchliefen. Des Weiteren war die Zellzyklusrate innerhalb von 3D Mikrokavitäten niedriger verglichen mit herkömmlichen 2D Substraten. Diese Ergebnisse bestätigen ferner obenstehende These, dass Zytokin-induzierte Zellexpansion durch erhöhte Zelladhäsions-vermittelte Signale überschrieben wird. Um die in vitro Studien zu komplettieren wurde ein in vivo Repopulationsversuch durchgeführt. HSC kultiviert auf Einzel-Zell-Mikrokavitäten übertrafen frisch isolierte Konkurrenz-Zellen in einem kompetitiven Repopulationsversuch. Dieses erste Ergebnis zeigt, dass sich der Zellgröße entsprechende Biomaterialien für die erfolgreiche Stammzell-Kultur eignen. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten eine vielversprechende in vitro Zellkulturstrategie, die ein besseres Verständnis der Einflüsse von exogenen Signalen auf HSC erlaubt und damit eine Grundlage für neue Erkenntnisse in Richtung erfolgreicheres Tissue Engineering und klinische Anwendungen im Bereich der regenerativen Medizin bildet.