On estime qu'environ 5 millions d'hommes américains souffrent de taux de testostérone réduits ou d'hypogonadisme. Chez les hommes, les cellules de Leydig sont les principales productrices de testostérone et d'insuline-like 3, deux hormones essentielles à la différenciation sexuelle masculine, aux fonctions reproductives et à la santé globale de l’homme. Les facteurs de transcription sont des protéines qui régulent la transcription des gènes en se liant à des séquences d'ADN spécifiques. Le facteur de transcription “chicken ovalbumin upstream promoter type 2” (COUP-TFII) est un facteur de transcription qui appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le testicule, COUP-TFII est exprimé dans les cellules se différenciant en cellules de Leydig adulte (ALCs) pleinement fonctionnelles et joue un rôle majeur dans leur différenciation et leur fonction. La synthèse des stéroïdes est réduite dans des cellules de Leydig appauvries en COUP-TFII, ce qui suggère que ce facteur joue un rôle important dans la stéroïdogenèse. Cependant, le mécanisme d'action de COUP-TFII dans les cellules de Leydig demeuraient largement méconnus. Dans cette thèse, une analyse des données de puces à ADN de cellules MA-10 Leydig appauvries en COUP-TFII a été effectuée afin d’identifier le rôle global de ce facteur dans les cellules de Leydig. Cette étude a permis d’identifier 262 gènes différentiellement exprimés, notamment Hsd3b1, Cyp11a1, Prlr, Pdgfra, Shp, Ear1, Amhr2, Fdx1, Inha et Gsta3. De plus, l’étude du promoteur proximal d’Amhr2 par des études de gène rapporteur a permis de démontrer que COUP-TFII est recruté au promoteur proximal d’Amhr2 et coopère avec SP1 et GATA4 afin de réguler son expression. Les résultats présentés dans cette thèse fournissent une meilleure compréhension du mécanisme d'action de COUP-TFII dans les cellules de Leydig, et des preuves supplémentaires renforçant l'importance du récepteur nucléaire COUP-TFII dans la stéroïdogenèse, l'homéostasie androgénique, la défense cellulaire et la différenciation des cellules de Leydig. / It is estimated that about 5 million American men have low testosterone levels, hypogonadism, and infertility problems. Leydig cells are the primary producers of testosterone and insulin-like 3 hormones in males, both essential for male sex differentiation, reproductive roles, and overall health. Transcription factors are proteins that bind to various DNA sequences to control DNA transcription. Chicken ovalbumin upstream promotertranscription factors II (COUP-TFII) belongs to the steroid/thyroid hormone nuclear receptor superfamily of transcription factors. COUP-TFII is expressed in the cells that give rise to fully functional steroidogenic Adult Leydig cells in the testis and plays an important role in their function and differentiation. Steroid synthesis is reduced in COUP-TFII-depleted Leydig cells, suggesting that this protein plays a vital role in steroidogenesis. However, the mechanisms of action of COUP-TFII in Leydig cells were largely unknown. The analysis of microarray data from COUP-TFII-depleted MA-10 Leydig cells identified 262 differentially expressed genes, including Hsd3b1, Cyp11a1, Prlr, Pdgfra, Shp, Ear1, Amhr2, Fdx1, Inha, and Gsta3. Anti-Müllerian hormone (AMH), which is expressed in Sertoli cells, is essential for the regression of the Müllerian ducts during male embryonic development. In Leydig cells, AMH signals through the anti-Müllerian hormone type II receptor (AMHR2). In male mammals, mutations affecting AMH or AMHR2 expression cause Persistent Müllerian Duct Syndrome (PMDS), characterized by infertility, inguinal hernias, cryptorchidism, and reduced serum testosterone levels. COUP-TFII was found to cooperate with specificity protein 1 (SP1) and GATA-binding factor 4 (GATA4) in the regulation of the Amhr2 promoter using reporter promoter assays. COUP-TFII and GATA4 were found to be recruited to the same region of the Amhr2 gene via chromatin immunoprecipitation assay (ChIP), further strengthening their cooperative roles in the regulation of this gene. Furthermore, COUP-TFII and GATA4 were found to associate in the Leydig cells molecularly. The results presented in this thesis provide a better understanding of the mechanism of COUP-TFII action in Leydig cells, and additional evidence strengthening the importance of COUP-TFII in steroidogenesis, androgen homeostasis, cellular defense, and differentiation.

Le contrôle combinatoire de l’ expression des gènes est une caractéristique importante du profil spatio-temporel de l'accumulation des flavonoïdes chez les plantes. Des résultats précédents avaient démontré chez Arabidopsis thaliana, que la régulation de l’accumulation des anthocyanes et des proanthocyanidines repose sur l'activité de facteurs de régulation de la transcription de type R2R3-MYB et bHLH qui forment des complexes ternaires ("MBW") avec la protéine TTG1 (WDR). L'objectif de la thèse était de caractériser les complexes MBW impliqués et leurs cibles, pour avoir une compréhension globale des mécanismes transcriptionnels qui contrôlent la biosynthèse des flavonoïdes.En utilisant différentes approches génétiques et moléculaires, nous avons montré que seuls les gènes « tardifs » (c’est à dire DFR, LDOX, BAN, TT19, TT12 et AHA10) sont des cibles directes des complexes MBW. Bien que le complexe de régulation impliquant les protéines TT2-TT8-TTG1 ait un rôle majeur dans la régulation de ces gènes structuraux dans la graine d’Arabidopsis, trois autres complexes contenant MYB5, GL3 ou EGL3 sont également impliqués de façon tissu-spécifique. Comme l’expression du gène TT8 joue un rôle clef dans ces régulations, une dissection fonctionnelle de son promoteur a été entreprise. Elle a montré la nature modulaire de ce promoteur avec deux domaines impliqués dans l’expression tissu-spécifique et un troisième dans la force du promoteur. Les résultats obtenus suggèrent également l’existence d’autres régulateurs qui restent à caractériser. Enfin, nous avons développé une nouvelle technique de caractérisation des interactions entre les facteurs de transcription et les promoteurs, basée sur l’expression transitoire dans des protoplastes de mousse (i.e. Physcomitrella patens). Nous avons ainsi pu identifier les éléments cis des promoteurs impliqués dans la régulation de l’expression de TT8 et de chacun des promoteurs cibles des complexes MBW.L’ensemble de ces travaux permet de fournir un modèle plus complet du réseau de régulations transcriptionnelles qui contrôle la biosynthèse des proanthocyanidines et des anthocyanes, ainsi que des outils et de nouvelles pistes pour poursuivre ces études chez Arabidopsis et d’autres plantes. / The combinatorial control of gene expression is a key feature of the spatio-temporal pattern of flavonoid accumulation in plants. Previous results have shown that the regulation of anthocyanins and proanthocyanidins (PAs or tannins) pigmentation relies on the transcriptional activity of R2R3-MYB and bHLH proteins that form “MBW” ternary complexes with TTG1 (WD-Repeats), in Arabidopsis thaliana. The purpose of the thesis was to figure out the nature and spatio-temporal activity of these MBW complexes and to identify their direct targets, which were essential steps toward a comprehensive understanding of the transcriptional mechanisms that control flavonoid biosynthesis. Using different molecular and genetic approaches this thesis has demonstrated that only late biosynthetic genes (namely DFR, LDOX, BAN, TT19, TT12 and AHA10) are direct targets of the MBW complexes. Interestingly, although the TT2-TT8-TTG1 complex was shown to play the major role in regulating the expression of these structural genes in developing seeds, three additional MBW complexes that contain MYB5, GL3 or EGL3 are also involved, in a tissue-specific manner. Because the expression of TT8 is largely involved in these regulations, a functional dissection of its promoter was carried out. Two modules drive the tissue-specific activity of the TT8 promoter in PA- and anthocyanin-accumulating cells, and a third module is responsible for the strength of the promoter. Interestingly, this regulation involves at least six different MBW complexes. Our results also suggest that some putative new regulators remain to be discovered. Last, use of a newly developed fast and sensitive transient expression system that relies on protoplasts of the moss Physcomitrella patens has allowed the identification of both, specific cis-regulatory elements through which TT8 expression is regulated and the minimal promoter for each of the genes that are targeted by the MBW complexes.Altogether, by answering fundamental questions and by demonstrating or invalidating previously made hypotheses, we have provided a new and comprehensive view of the regulatory mechanisms controlling PA and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis, as well as new clues and tools for further investigation of this pathway in Arabidopsis and other plant species.

L'expression des facteurs de transcription C/EBPs est induite dans les cellules épithéliales intestinales lorsque celles-ci sont stimulées avec certaines cytokines. Cette famille de facteurs de transcription joue un rôle très important dans l'élaboration de la phase aiguë de la réponse inflammatoire (APR) dans plusieurs tissus en régularisant l'expression de certains gènes de réponse inflammatoire. Nous avons déjà démontré que différents domaines de l'isoforme C/EBP[minuscule delta] sont impliqués dans le contrôle de son activité transcriptionnelle, mais très peu de choses sont connues sur la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. L'objectif de notre recherche était de déterminer le rôle des histones désacétylases dans la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. Nous avons observé par essai d'interactions in vitro et in vivo, que deux histones désacétylases, HDAC1 et HDAC3, interagissent avec les domaines N et C-terminaux de C/EBP[minuscule delta]. L'intégrité du bZIP (région basique et leucine zipper) est nécessaire pour la liaison de HDAC1 et HDAC3 au domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Les acides aminés 70 à 85 de C/EBP[minuscule delta] sont importants pour la liaison à HDAC1, ainsi que les acides aminés 50 à 60. Il y a un site de liaison de HDAC3 entre les acides aminés 60 à 70 de C/EBP[minuscule delta] et un autre entre les acides aminés 108 à 164. Nos résultats suggèrent que la liaison de HDAC1 à C/EBP[minuscule delta] est indirecte et pourrait être en partie médiée par la protéine mSin3A puisque ce co-répresseur lie le domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Par ailleurs, nous avons également montré qu'une histone désacétylase de classe II, soit HDAC4, pouvait également interagir avec C/EBP[minuscule delta] par ces deux domaines. Nos observations suggèrent que l'interaction des histones désacétylases avec C/EBP[minuscule delta] pourrait impliquer d'autres protéines que celles jusqu'à maintenant identifiées. Nous montrons également par transfections transitoires et essai luciférase que HDAC1 et HDAC3 modulent négativement l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de l'haptoglobine. Ces deux histones désacétylases de classe I pourraient donc jouer un rôle prépondérant dans la régulation négative de l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de gènes cibles.

Les Hedgehogs (Hh) sont des morphogènes multifonctionnels qui ont des rôles importants dans l'embryogenèse et la morphogenèse de plusieurs organes. Leur rôle dans le développement de la glande gastrique humaine n'est pas connu. Peu est connu de la signalisation Hh, plus précisément de Sonic Hedgehog (Shh), dans la glande gastrique humaine adulte, autant dans sa localisation et son association aux différents types cellulaires gastriques que dans son rôle fonctionnel dans cet organe.Les modèles murins de délétion classique des molécules de la signalisation Hh subissent, dans la grande majorité, une mort néonatale ou au stade somites rendant ces modèles inutiles pour l'étude du maintien de l'homéostasie du tube digestif adulte, autant au niveau de l'intestin que de l'estomac. Dans un premier temps, les patrons d'expression des différents gènes clés impliqués dans la voie de signalisation Hh dans le développement foetal humain de la glande gastrique ont été déterminés à l'aide de tissus gastriques foetaux âgés entre 14 et 20 semaines de gestation. Dans un deuxième temps, les rôles fonctionnels et physiologiques de Shh, dans l'homéostasie de l'intestin adulte et dans la morphogenèse et homéostasie de l'estomac ont été élucidés par la génération de souris possédant une délétion conditionnelle de Shh à l'épithélium de l'intestin ou de l'estomac à l'aide du système Cre/loxP. L'analyse des patrons d'expression des ligands SHH et Indian Hedgehog (IHH), des récepteurs PATCHED et SMOOTENED, des effecteurs GLI et de gènes cibles de la voie de signalisation Hh dans la glande gastrique humaine en développement, a confirmé la présence de la majorité de ces protéines dès 14 semaines de gestation. Ces effecteurs n'ont été détectés qu'au niveau des cellules à mucus de surface, des cellules du foveolae et des cellules zymogéniques mais pas au niveau des cellules pariétales. L'expression strictement épithéliale de presque toutes ces protéines suggère fortement l'activation exclusivement autocrine de cette voie de signalisation dans la glande gastrique humaine foetale. Ces patrons d'expression diffèrent de ceux retrouvés dans la glande gastrique murine foetale ou adulte. L'étude du modèle murin Villine -Cre; ShhloxP/loxP , qui possède une délétion de Shh à l'épithélium intestinal, a permis d'élucider les rôles fonctionnels de Shh dans l'homéostasie de l'intestin. Nous avons constaté que Shh a un rôle spécifique dans l'homéostasie intestinale puisque les souris expérimentales présentent un allongement villositaire. Shh est également impliqué dans la maturation des cellules caliciformes et dans l'inhibition de la prolifération épithéliale intestinale.Les résultats montrent aussi que Ihh semble, quant à lui, avoir un rôle compensateur puisqu'il se relocalise dans les régions qui expriment normalement Shh. L'étude du modèle murin Foxa3 -Cre; ShhloxP/loxP , qui possède une délétion de Shh dans l'épithélium gastrique, a permis d'élucider les rôles de Shh dans le développement et le maintien de la glande gastrique. Nous avons déterminé que Shh a un rôle dans la morphogenèse de la glande gastrique et dans le maintien de ce dernier. En effet, l'architecture foveolae-glande est fortement affectée par la perte épithéliale de Shh.Les résultats démontrent également que Shh a un rôle déterminant dans la différenciation des cellules pariétales puisque ces dernières sont absentes chez les souris expérimentales.

La participation de HNF4[alpha] à la réponse inflammatoire se manifeste par différents rôles, notamment par la régulation transcriptionnelle du cytochrome P450, de l'oxyde nitrique synthase inductible, mais également par la protection face aux maladies inflammatoires de l'intestin (MII). En effet, la perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium intestinal de souris rend celles-ci plus sensibles face à l'induction d'une colite chimique. Également, l'expression de HNF4[alpha] est perdue au niveau des tissus coliques de patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin, dont la colite ulcéreuse. Les MII sont caractérisées par une activation chronique de la réponse immune et inflammatoire le long du tractus gastro-intestinal. L'agent causal est, dans la majorité des cas, la flore intestinale, laquelle peut activer plusieurs réponses inflammatoires, telle la sécrétion abondante de cytokines et d'interleukines pro-inflammatoires ainsi que le recrutement et l'infiltration de cellules immunitaires à l'épithélium, causant des dommages importants à la muqueuse intestinale et menant ainsi à une augmentation de la perméabilité de l'épithélium intestinal. La perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium colique de souris a mené à l'apparition spontanée d'inflammation, à l'infiltration massive de cellules leucocytaires et a révélé une augmentation de la production de plusieurs facteurs pro-inflammatoires, dont la chimiokine KC/CXCL1. Cette molécule est en fait un chimioattractant important pour les neutrophiles et autres cellules leucocytaires. Dans cette optique, nous avons évalué, par immunobuvardage et gel de rétention, l'impact d'un stress pro-inflammatoire sur l'expression et l'activité de HNF4[alpha]. Nous avons également déterminé l'effet de l'expression de HNF4[alpha] sur la production de KC/CXCL 1 ainsi que les mécanismes de régulation de HNF4[alpha] sur l'expression de la chimiokine. Nous avons quantifié, par qPCR et par ELISA, la production et la sécrétion de KC/CXCL1 par les différentes lignées de cellules épithéliales intestinales surexprimant le facteur de transcription HNF4[alpha]. Aussi, nous avons montré l'influence de HNF4[alpha] sur l'activation de NF[kappa]B, puisque ce facteur est responsable de la régulation transcriptionnelle de KC/CXCL1. Nous avons, en effet, montré que l'activation par phosphorylation, la translocation nucléaire et la capacité de liaison à l'ADN de NF[kappa]B sont diminuées dans les modèles cellulaires de surexpression de HNF4[alpha]. Nous avons finalement évalué l'effet de HNF4[alpha] sur la dégradation de l'inhibiteur de kappaB (I[kappa]B[alpha]). Dans cette étude, nous avons montré que le facteur de transcription HNF4[alpha] régule de façon négative la production de la chimiokine KC/CXCL1 en modulant l'activité transcriptionnelle de NF[kappa]B via la stabilisation de l'inhibiteur I[kappa]B.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chez le riz, la céréale modèle, le système racinaire est principalement constitué de racines issues de la tige, nommées racines coronaires (RC). Peu de gènes contrôlant le développement des RC sont connus, parmi eux CROWN ROOTLESS1 (CRL1) code une protéine à domaine AS2/LOB (ASL/LBD), qui est probablement un facteur de transcription. Le gène CRL1 est nécessaire à l'initiation des primordia de RC, il est directement activé par l'auxine et est situé en amont du réseau de gènes contrôlant le programme de différentiation des RC. Afin de mieux connaître les processus génétiques impliqués dans l'initiation des RC, l!objectif principal de cette thèse est de comprendre la fonction moléculaire de la protéine CRL1 en validant sa fonction de facteur de transcription et en identifiant ses gènes cibles. L'interaction de la protéine CRL1 avec l!ADN a été montrée in vitro et une expérience de SELEX a permis d'identifier sa séquence de fixation à l!ADN : CACA(A/C)C (CRL1-box). Des expériences en levure ont permis de montrer que CRL1 est un activateur de la transcription. Une comparaison entre le sauvage et le mutant crl1, ainsi que l'élaboration d!un système inductible à la dexaméthasone permettant d'activer l'expression de CRL1 dans le fond génétique mutant crl1, ont été utilisés pour identifier des gènes cibles précoces de CRL1 grâce à des analyse de transcriptome. 277 gènes sont activés dès quatre heures après induction de CRL1, les deux tiers contiennent au moins une CRL1-box dans leur promoteur et peuvent donc être des cibles directes de CRL1. CRL1 induit l'expression d!un ensemble de gènes permettant la mise en place des processus de régulation de l'information génétique, de division, de croissance et de différenciation cellulaires nécessaires à la création d'un méristème de racine coronaire organisé et fonctionnel. Parmi eux, QHB code un facteur de transcription clé nécessaire au maintien des cellules souches des méristèmes racinaires. Ce résultat établit pour la première fois un lien moléculaire entre la signalisation de l!auxine et des gènes impliqués dans la mise en place ou le maintien des cellules souches lors de la formation d!un nouveau méristème racinaire au cours du développement post-embryonnaire. Par ailleurs, une étude histologique a permis de révéler que les RC sont issues d!une couche de péricycle dans la tige, un tissu équivalent en termes de localisation et de potentiel rhizogène au péricycle de la racine à partir duquel sont initiées les racines latérales. Les données acquises suggèrent de fortes similarités dans les processus cellulaires et génétiques de la différentiation des méristèmes racinaires au cours du développement post-embryonnaire chez les monocotylédones et les dicotylédones. La découverte de gènes spécifiques au développement de racines issues de la tige ouvre une voie importante vers la compréhension du déterminisme génétique de l!architecture du système racinaire chez les céréales et offre un nouveau potentiel de ressources génétiques pour l!amélioration variétale. / In rice, the model cereal, the root system is mainly composed of stem-derived roots, named crown roots (CR). Very few genes that control the root system development are known, among them CROWN ROOTLESS1 (CRL1) encodes an AS2/LOB-domain protein that is a putative transcription factor (TF). CRL1 is necessary for CR primordium initiation, it is directly activated by auxin and is situated upstream of the gene regulatory network that control the CR differentiation programme. To better known the genetic processes involved in CR initiation, the main objective of this thesis is to understand the molecular function of the CRL1 protein by validating its function of TF and by identifying its target genes. The interaction of CRL1 with DNA was shown in vitro and a consensus CRL1 DNA-binding motif was identified with a SELEX method : CACA(A/C)C named CRL1-box. A yeast assay showed that CRL1 is a transcriptional activator. A comparison between wild type and c rl1 mutant, and the development of a dexamethasone inducible system to ectopically express CRL1 in the crl1 background, were used to identify CRL1 early target genes by transcript profiling. 277 genes were induced from four hours following CRL1 activation, the two-thirds possess at least one CRL1-box and may be CRL1 direct target genes. CRL1 activates the expression of a broad range of genes that allow to orientate genome expression and to initiate cell division, growth and differentiation mechanisms required for the building of an organized and functional CR meristem. Among these genes, QHB encodes a key TF required for the maintenance of root meristem stem cells. This result evidences for the first time a molecular link between auxin signalling and major genes involved in stem cell patterning and maintenance in the formation of a new root meristem during post-embryonic development. Otherwise, an histological study showed that CR are derived from a shoot pericycle, a tissue equivalent to the root pericycle, from which lateral roots develop, in terms of location and rhizogenic potential. All these data suggest strong similarities between monocots and dicots in cellular and genetic mechanisms that control root meristem differentiation during post-embryonic development. The identification of genes specifically involved in stem-derived root development pave the way towards the understanding of the genetic control of root system architecture in cereals and offer a new potential of genetic resources for plant breeding.

Le facteur de transcription Growth factor independent 1b (GFI1b) est impliqué à différents stades dans la régulation de l'hématopoïèse. Il est notamment fortement exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques et au cours de la différenciation des cellules des lignées érythroïdes et mégacaryocytaires. Grâce à un modèle de délétion conditionnelle chez la souris par le système CreLox, nous avons montré que l'absence de GFI1b entraîne une prolifération de cellules mégacaryocytaires incapables de produire des plaquettes. Notre étude ne permet pas de confirmer formellement la prolifération des cellules souches dans la moelle osseuse précédemment observée par notre équipe dans un autre modèle murin. En revanche, les souris GFI1b "knockout" présentent une augmentation des cellules souches circulantes dans le sang périphérique. Une analyse moléculaire préliminaire montre que GFI1b pourrait influer sur la régulation par le cycle circadien de la mobilisation de ces cellules dans le sang. Finalement, notre étude des effets biologiques de la délétion de GFI1b dans le compartiment hématopoïétique des souris adultes nous a permis de définir de façon plus précise le rôle de GFI1b dans l'hématopoïèse et de confirmer son rôle majeur dans la régulation de la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes matures. / Growth factor independent 1b (GFI1b) is a transcription factor implicated in the regulation of hematopoiesis. It is highly expressed in hematopoietic stem cells (HSCs) and throughout the differentiation of erythroid and megakaryocytic lineages. Using a CreLox system, we have generated mice in which GFI1b is conditionally deleted in megakaryocytic lineages. These mice exhibit a strong proliferation of immature megakaryocytes, which are unable to produce platelets. We were unable to confirm the results of a previously published study from our group, which reported an increase of hematopoietic stem cells in the bone marrow using a different mouse model. However, in agreement with this publication, an increase in the circulating HSC pool can be detected in our GFI1b knockout mice. A preliminary analysis of the molecular role of GFI1b suggests that this transcription factor might be implicated in the circadian regulation of HSC mobilization in the blood. Finally, our experiments on the biological effects of the deletion of GFI1b in the adult murine hematopoietic compartment allowed us to better understand the role of GFI1b in hematopoiesis, and to confirm the major contribution of GFI1b to the development of megakaryocytes and the production of mature platelets.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.