La dysfonction endothéliale est associée à plusieurs pathologies, dont l'hypertension artérielle et l'insuffisance rénale chronique. Elle se caractérise par un déséquilibre dans la production des facteurs vasodilatateurs, vasoconstricteurs et de certaines cytokines. Chez le rat en insuffisance rénale chronique, la production du monoxyde d'azote (NO) est diminuée alors que la production de l'angiotensine II (Angll), de l'endothéline-1 (ET-1), du transforming growth factor-f31 (TGF-pl) et du tumor necrosis factor-a (TNF-a) est a ugmentée. Le rôle exact de ces facteurs endothéliaux et de ces cytokines dans le développement de l'hypertension artérielle en insuffisance rénale chronique reste à élucider. À l'aide d'un inhibiteur de la synthèse du NO, nous avons développé un nouveau modèle d'hypertension maligne chez le rat. Nous avons démontré que le traitement avec le Nu-nitro-L-arginine-méthyl ester (L-NAME) induit une hypertension maligne dose-dépendante et des dommages vasculaires et rénaux caractéristiques de la néphroangiosclérose maligne chez le rat Harlan Sprague-Dawley. Nous avons démontré que le traitement de l'hypertension artérielle contribue à ralentir la progression de l'insuffisance rénale chronique et que le blocage des récepteurs ATi de l'AnglI permet d'obtenir une protection tissulaire à long terme. Nous avons également observé que la neutralisation du TNF-a prévient l'hypertension artérielle, l'inflammation et la fibrose rénale chez le rat rendu urémique par réduction de la masse rénale. Ces effets sont associés à une diminution de l'activation du NF-KB et de l'expression de MCP-1, ICAM-1 et VCAM-1 et de la production rénale du TGF-f31 et de 1ET-1. L'ensemble de ces résultats suggèrent que le TNF-a joue un rôle important dans l'inflammation, les dommages rénaux et l'hypertension artérielle associés à l'insuffisance rénale chronique.

L’hypertension artérielle secondaire à la progression de l’insuffisance rénale chronique (IRC) est généralement associée à une dysfonction de l’endothélium vasculaire, caractérisée par une production exagérée de vasoconstricteurs tels l’endothéline-1 (ET-1) et l’angiotensine II (Ang II) et une réduction de la relâche de vasodilatateurs dont le monoxyde d’azote (NO). Cette dysfonction endothéliale peut entraîner la surproduction du transforming growth factor-Beta 1 (TGF-β1), une cytokine aux propriétés pro-fibrosantes et hypertrophiques. Nos travaux ont pour but d’élucider les interactions entre les facteurs dérivés de l’endothélium en IRC. Dans un premier temps, nous avons étudié l’implication de l’ET-1 chez le rat urémique avec masse rénale réduite, en utilisant un antagoniste des récepteurs ETA de l’ET-1, l’ABT-627. Une semaine après l’induction de l’insuffisance rénale par néphrectomie subtotale 5/6, des rats urémiques recevant l’ABT-627 sont comparés avec un groupe de rats urémiques ne recevant aucun traitement et des témoins, sur une période de 6 semaines. À la fin de l’étude, la pression artérielle systolique des animaux urémiques est augmentée comparativement à celle des animaux témoins. Les animaux urémiques présentent une augmentation de la créatinine sérique, de la protéinurie, de l’excrétion urinaire d’ET-1 et du TGF-β1 ainsi que de l’expression de l’ARNm du TGF-β1 dans le cortex rénal. De plus, ils montrent une augmentation de l’expression d’ET-1 et du TGF-β1 dans l’endothélium vasculaire de l’aorte thoracique. Par ailleurs, l’expression de l’ARNm du récepteur ETB de l’endothéline est réduite dans le cortex rénal des animaux urémiques. Les dommages histologiques rénaux comprennent de la glomérulosclérose, de la nécrose tubulaire et de la fibrose interstitielle associée à une production accrue d’alpha-actine de muscle lisse (α-SMA). Le traitement des animaux urémiques avec l’ABT-627 atténue l’élévation de la pression artérielle et les dommages histologiques rénaux, sans toutefois prévenir la détérioration progressive de la fonction rénale. Par ailleurs, l’ABT-627 ne contre pas la surproduction vasculaire et rénale d’ET-1 et du TGF-β1 ainsi que la réduction de l’expression rénale du récepteur ETB chez l’animal urémique. Ces résultats montrent que l’ET-1 est impliquée, du moins en partie, dans la pathogenèse de l’hypertension et des dommages rénaux chez le rat urémique. Cependant, le blocage des récepteurs ETA ne confère pas la protection cardiovasculaire et rénale escomptée, suggérant l’implication d’autres facteurs tels le TGF-β1 et l’Ang II dans ce modèle animal d’insuffisance rénale. Dans une seconde étude, nous avons évalué l’implication du TGF-β1 dans la pathogenèse de l’hypertension artérielle associée à l’insuffisance rénale, en utilisant le même modèle animal que précédemment. Pour ce faire, nous avons comparé les effets de la neutralisation du TGF-β1 avec l’anticorps 1D11 avec un antagoniste des récepteurs AT1 de l’Ang II chez l’animal urémique. Après 6 semaines de traitement, la pression artérielle systolique des animaux urémiques est augmentée comparativement à celle des animaux témoins. Les animaux urémiques présentent une augmentation significative de la créatinine sérique, de la protéinurie, de l’expression endothéliale d’ET-1 dans l’aorte thoracique et du TGF-β1 dans le cortex rénal, ainsi qu’une diminution de la créatinine urinaire et de la clairance de la créatinine. Ils montrent aussi des signes évidents d’hypertrophie cardiaque. Le traitement des animaux urémiques avec l’anticorps 1D11 diminue de façon significative la pression artérielle systolique, sans toutefois prévenir la détérioration de la fonction rénale et l’hypertrophie cardiaque, ni contrer la surexpression vasculaire d’ET-1 et rénale du TGF-β1. Par contre, le traitement des animaux urémiques avec le losartan normalise la pression artérielle systolique et la protéinurie, prévient l’hypertrophie cardiaque et limite la surexpression vasculaire et rénale d’ET-1 et du TGF-β1. Ainsi, la neutralisation du TGF-β1 atténue l’élévation de la pression artérielle systolique chez l’animal urémique, sans toutefois prévenir la détérioration de la fonction rénale ni la surexpression vasculaire et rénale d’ET-1 et du TGF-β1. À la lumière des résultats obtenus, il semble que le développement de l’hypertension artérielle associée à l’insuffisance rénale dans notre modèle expérimental soit attribuable plus particulièrement à l’action de l’Ang II. Les effets de l’Ang II seraient médiés en partie par l’ET-1 et le TGF-β1, qui agissent possiblement de façon indépendante. / Hypertension in chronic renal failure (CRF) is associated with endothelial dysfunction, which is characterized by exaggerated production of vasoconstrictors such as endothelin-1 (ET-1) and angiotensin II (Ang II) and a reduction in vasodilators such as nitric oxide (NO). Endothelial dysfunction could lead to TGF-β1 overproduction, a cytokine with pro-fibrotic and hypertrophic properties. Our studies aimed at elucidating the interactions between the endothelium-derived factors in CRF. In a first study, we investigated the role of ET-1 in the rat remnant kidney model of CRF, using the ETA receptor antagonist ABT-627. One week after renal mass reduction, uremic rats receiving ABT-627 were compared with untreated uremic rats and sham-operated rats, during 6 weeks. At the end of the study, systolic blood pressure was elevated in uremic rats as compared to sham-operated animals. Uremic animals showed increased serum creatinine, proteinuria, ET-1 and TGF-β1 urinary excretion and renal TGF-β1 mRNA expression. In addition, ET-1 and TGF-β1 expression was increased in the vascular endothelium of thoracic aorta of uremic animals. However, ETB mRNA expression was reduced in the renal cortex of uremic animals. The renal histological damages were comprised of glomerulosclerosis, tubular necrosis and interstitial fibrosis, which was associated with increased alpha-smooth muscle actin (α-SMA) expression. Treatment with ABT-627 attenuated the rise in systolic blood pressure and the renal damages, but did not prevent the progressive decline in renal function, the ET-1 and TGF-β1 overproduction nor the reduction in ETB receptor expression. Our results show that ET-1 is involved, at least in part, in the pathogenesis of hypertension and the renal injuries in uremic rats. However, ETA receptor blockade does not confer the anticipated cardiovascular and renal protection, suggesting the implication of other factors such as TGF-β1 and Ang II in this animal model of CRF. In a second study, we evaluated the involvement of TGF-β1 in the pathogenesis of hypertension associated with renal insufficiency, in the same animal model. We compared the effects of the TGF-β1 neutralizing antibody 1D11 and the Ang II AT1 receptor antagonist losartan. At the end of the study, systolic blood pressure was increased in uremic animals as compared to the controls. Uremic animals presented a significant increase in serum creatinin, proteinuria, expression of ET-1 in the vascular endothelium of thoracic aorta and renal cortex production of TGF-β1, as well as a reduction in creatinine clearance. They also showed obvious signs of cardiac hypertrophy. Treatment with the 1D11 antibody reduced the rise in systolic blood pressure without preventing the decline in renal function and cardiac hypertrophy nor the vascular ET-1 and renal TGF-β1 overexpression. In contrast, treatment with losartan normalized systolic blood pressure and proteinuria, prevented the cardiac hypertrophy and attenuated the vascular and renal ET-1 and TGF-β1 overexpression. Therefore, neutralization of TGF-β1 attenuates the rise in systolic blood pressure in uremic animal, without preventing the deterioration of renal function or the vascular and renal overexpression of ET-1 and TGF-β1. Based on these studies, the development of hypertension associated with the renal insufficiency in this experimental model is likely attributed to Ang II. The effects of Ang II may be mediated by ET-1 and TGF-β1, which appears to act in an independent manner.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l’Université de Montréal / Notre système hématopoïétique est un système de développement dynamique dont le rôle est de maintenir un niveau suffisant de cellules sanguines fonctionnelles afin d'assurer la survie de notre organisme. C'est ainsi que le système hématopoïétique donne lieu aux huit différentes lignées cellulaires connues. Les cellules sanguines différenciées incluent les erythrocytes ou globules rouges, les mégakaryocytes qui donneront lieu aux plaquettes, les granulocytes et macrophages, les basophiles et eosinophiles, ainsi que les cellules lymphoïdes B et T. Tous trouvent leur origine à partir d'une population de cellules souches hématopoïétiques. La différenciation de cellules hématopoïétiques primitives en granulocytes et monocytes matures constitue un processus de développement complex appelé la myélopoïèse. Le développement de ces cellules primitives en monocytes et granulocytes fonctionnels est en partie contrôlé par une myriade de facteurs de transcription dont le rôle est d'activer l'expression de gènes essentiels à une ou plusieurs lignées. Ces facteurs de transcription peuvent agir de façon positive ou négative à la régulation de gènes codant entre autres pour des facteurs de croissance, leurs récepteurs, pour des molécules d'adhésion, pour des enzymes ou bien pour d'autres facteurs de transcription. 0 Le développement de cellules myéloïdes primitives et de leur différenciation subséquente en cellules myéloïdes matures est également contrôlé par un vaste réseau de facteurs de croissance hématopoïétiques. Tout comme les facteurs de transcription, ces facteurs de croissance, ou cytokines, peuvent être spécifiques à une lignée particulière ou bien peuvent avoir une x n contribution plus générale. Par exemple, le G-CSF (granulocyte-colonystimulating factor) est un facteur de croissance essentiel au développement granulocytaire alors que l'IL-3 (interleukin-3) soutient la prolifération et la survie de plusieurs lignées. Quelle est l'importance d'étudier un processus tel que la myélopoïèse? Environ 120 millions de nouveaux neutrophiles sont générés chaque jour chez l'adulte normal. Ces neutrophiles jouent un rôle fondamental dans notre système de défense. En effet, les neutrophiles agissent comme première ligne de défense face à l'invasion de particules étrangères. Ils participent à notre système immunitaire inné principalement par leur action phagocytaire. Les macrophages quant à eux, jouent un rôle similaire c'est-à-dire qu'ils participent également à notre système immunitaire inné en éliminant toutes particules étrangères par phagocytose. Cependant, ils possèdent une caractéristique additionnelle. Ils jouent également un rôle dans notre système immunitaire adaptif en agissant comme cellules présentatrices d'antigènes aux différentes cellules lymphoïdes T. Chaque cellule est exposée à une multitude de signaux présents dans son environnement. La cellule se doit d'être en mesure de reconnaître et de répondre de façon spécifique à cette panoplie de signaux externes. Elle accompli ceci de plusieurs façons. Premièrement, afin de répondre à un signal particulier, la cellule se doit d'exprimer le récepteur spécifique au signal reçu. Ensuite, elle doit être en mesure d'intégrer et d'interpréter ce signal afin de le transformer en une réponse biologique concrète. Pour cela, la cellule doit posséder la machinerie interne nécessaire à la traduction et la transformation du signal. Les facteurs de croissance sont un exemple de signal externe présent dans l'environnement d'une cellule hématopoïétique. Ces facteurs de croissance sont connus pour être impliqués dans la régulation de la prolifération et de la survie cellulaire. Ces facteurs se lient à leurs récepteurs appropriés exprimés à la surface de certaines cellules. Généralement, cette liaison induit l'activité catalytique du récepteur qui donne suite à l'activation de plusieurs voies de signalisation. Ces différentes voies de signalisation ciblent différents facteurs de transcription qui sont associés à différentes réponses biologiques correspondantes. Ces facteurs de transcription, dont l'activité est induite par l'induction de voies de signalisation spécifique, vont être responsables du contrôle de 1'expression de gènes essentiels à la détermination du destin cellulaire. Vu l'importance de réguler de façon étroite l'expression de tels gènes, l'activité des facteurs de transcription se doit d'être sous haute surveillance. Le temps d'expression ainsi que l'endroit d'activation des facteurs de transcription deviennent donc des variables importantes. Un facteur de transcription responsable de la destinée d'une cellule se doit d'être exprimé dans la bonne cellule et d'être actif au bon moment dans le processus de développement de cette cellule. Souvent, l'activité et l'expression de ces facteurs de transcription sont contrôlés par des facteurs externes tels que les facteurs de croissance. Un modèle qui se veut de plus en plus populaire, malgré qu'aucun exemple définitif n'ait été encore démontré, suggérerait qu'un signal externe serait en mesure d'affecter directement l'activité d'un facteur de transcription qui lui se voudrait essentiel à la détermination de la destinée cellulaire. Le facteur de transcription myélo-spécifique PU.1 est un membre de la famille Ets. Il fût découvert simultanément de deux façons différentes. D'un xii n côté, il fût identifié à partir d'une librairie de cDNA de macrophages comme étant un facteur pouvant lier avec haute affinité, le promoteur du gène MHC classe II 1-Ab. D'autre part, il fût identifié comme site d'intégration préféré du provirus SFFV (Spleen Focus Forming Vims), un provirus associé à une érythroleucémie induite par le virus Friend. Cependant, il est important de mentionner que PU. l n'a pas été impliqué dans l'induction de leucémies humaines en partie dû au fait que son locus ne correspond pas à un site fréquent de translocation chromosomique. La famille de facteurs de transcription Ets est caractérisée par son domaine de liaison à l'ADN (domaine Ets). Ce domaine basique situé en C-terminal lie des séquences riches en purines GGAA/T dénommées boîtes PU. Ets-1, Ets-2 et Spi-B sont d'autres exemples de facteurs appartenant à cette grande famille. PU.1 est un facteur de transcription exclusif au système hématopoïétique. Son rôle dans le développement hématopoïétique semble assez bien décrit. La suppression complète du gène est associée à une absence complète de macrophages et de cellules B matures. Par contre, des monocytes et des précurseurs de cellules B sont présents mais en nombre réduit. Il y a également présence de granulocytes mais au développement et au fonctionnement anormal. Les cellules érythrocytaires ne sont, quant à elles, pas affectées. Ces résultats démontrent bien le rôle primordial de PU.1 dans le développement des cellules B ainsi que dans le développement myéloïde. Cela en fait un excellent candidat comme déterminant génétique dans rengagement du destin cellulaire. Le GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) est un facteur de croissance hématopoïétique impliqué dans la prolifération, la survie et le développement de cellules primitives hématopoïétiques avec des effets additionnels importants sur le développement myéloïde. C'est justement par son implication déterminante dans le développement des cellules granulocytaires et monocytaires que le GM-CSF est de plus en plus utilisé à des fins cliniques. Le GM-CSF fait partie de la grande famille des cytokines qui comprend entre autres l'Epo, Steel Factor, l'IL-3 et le G-CFS. Le GMCSF lie son récepteur qui est exprimé spécifiquement à la surface de certaines cellules et cette liaison active différentes voies de signalisation qui se traduisent par différentes réponses biologiques. Le récepteur du GM-CSF appartient à la super famille des récepteurs de cytokines. Il est composé d'une chaîne a et d'une chaîne p. La chaîne a est spécifique au récepteur et lui confère une basse affinité de liaison à son ligand. La chaîne P est commune à d'autres récepteurs tels les récepteurs de l'IL-3 et de l'IL-5. Elle ne possède aucune capacité de liaison. Par contre, en s'associant à la chaîne a, elle confère à celle-ci, une haute affinité de liaison au GM-CSF. De plus, c'est la chaîne R qui est principalement responsable d'activer les différentes voies de signalisation. En effet, son domaine cytoplasmique comporte de nombreux résidus de tyrosines responsables du recrutement de différents facteurs, ainsi que de deux boîtes situées à proximité du domaine membranaire qui sont responsables du recrutement de Jak2, le facteur actif dans le complexe. Les voies de signalisation qui découlent de l'activation du récepteur par son ligand sont bien décrites. Il est connu que certaines voies conservées, telles les voies MAPK, Jak-STAT et PI3K, sont activées suite à l'activation du récepteur et que ces voies sont impliquées dans des réponses de survie et de prolifération myéloïde. Par centre, rien n'est bien établi en ce qui concerne la différenciation myéloïde. Aucun facteur de transcription impliqué directement dans la détermination du destin cellulaire n'a été identifié clairement. Bien que l'on connaisse des exemples de facteurs responsables d'activer des gènes qui eux, sont spécifiques à une lignée, très peu d'informations concernant les événements transcriptionnels conduisant à la détermination du destin cellulaire sont connues. Le rôle de PU.1 dans le développement myéloïde est bien établi. Cependant, jusqu'à quel point PU.1 est-il déterminant pour qu'une cellule primitive prenne la décision de s'engager de façon irréversible vers une destinée myéloïde? L'importance de PU.1 et du GM-CSF dans le développement myéloïde a été clairement, mais indépendamment démontrée. Cependant, il n'existe aucune documentation démontrant le lien possible entre ces deux facteurs dans le développement myéloïde. Dans cette étude, nous démontrons clairement que le facteur de transcription myélo-spécifique PU. l agit comme effecteur du signal par le GM-CSF dans le développement myéloïde. En d'autres mots, l'activation de PU. l et son effet déterminant dans le développement myéloïde sont directement liés à l'activation du récepteur du GM-CSF par son ligand.

La migration des neutrophiles est une étape importante de la réponse de l 'hôte à un pathogène qui requiert l'intervention de différents facteurs chimiotactiques telles les chimiokines. Depuis quelques années, diverses études portant sur la régulation du processus migratoires des leucocytes ont révélé que les protéines anti-microbiennes agissent également en facteurs chimiotactiques. Les protéines SI 00A8 et SI 00A9 sont des protéines anti-microbiennes qui inhibent la liaison des bactéries aux épithéliums et la croissance des pathogènes. Leur présence dans les serums de patients atteints de maladies inflammatoires telles l'arthrite rhumatoïde et la mucoviscidose a suscité l' intérêt de diverses équipes de recherche. L'étude de leurs fonctions pro-inflammatoires par différents modèles murins d'inflammation suggère fortement qu'elles participent au recrutement des neutrophiles au site inflammatoire. Cependant, peu d'études ont porté sur l'importance des protéines S100A8 et SI 00A9 dans le cadre d'une infection. Afin de mieux cerner les rôles des protéines SI 00A8 et SI 00A9, leur importance dans l'infection à S. pneumoniae a été évaluée. L'étude des fonctions des protéines SI 00A8 et SI 00A9 dans les infections à S. pneumoniae a permis de démontrer que les protéines SI 00A8 et SI 00A9 sont également importantes pour le recrutement des neutrophiles et des monocytes en réponse à une infection pulmonaire puisque le pré-traitement des souris infectées avec S. pneumoniae par des anticorps anti-S 1 00A8 et anti-S 1 00A9 neutralisants diminue de 70% et 80% la migration des neutrophiles et des monocytes dans les alvéoles. La présence des protéines SI 00A8 et SI 00A9 a également éte observée dans des maladies non-inflammatoires comme les leucémies myéloïdes chroniques. Pour caractériser plus précisement leurs fonctions, le rôle potentiel des protéines SI 00A8 et SI 00A9 dans l 'hématopoïèse normale et pathologique a été étudié. Les protéines SI 00A8 et SI 00A9 induisent la prolifération des cellules leucémiques mais également des cellules mononuclées normales de la luoelle osseuse. De plus, en combinaison avec d'autres cytokines, elles dirigent également l 'hématopoïèse vers la myélopoïese ce qui suggère que ces protéines sont des facteurs de croissance hématopoïétique. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des rôles joués par les protéines S 100A8 et S 100A9 dans le recrutelnent des neutrophiles et dans le procesus inflamnlatoire et soulignent également une nouvelle fonction des protéines SI 00 dans l 'hématopoïèse. De plus, ils concourent à élucider l'importance des protéines anti-microbiennes dans la réponse innée.

Thesis evaluated by: Dr. Rémy Sauvé, Dr. Puttaswamy Manjunath and Dr. Madhu Anand-Srivastava. Thank you for all your help. / L’hypertension est associée au remodelage vasculaire dû à l’hyperprolifération et l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs). Nous avons démontré par le passé l’implication de l’expression élevée des protéines Gqα et PLCβ1 dans les CMLVs de rats spontanément hypertendus (RSH) âgés de 16 semaines. Le C-ANP4-23 est un agoniste du récepteur au peptide natriurétique de type C (NPR-C) qui possède la capacité d’inhiber la synthèse de protéines en réponse aux peptides vasoactifs dans les CMLVs. Cette étude a eu pour but d’examiner si le C-ANP4-23 pouvait atténuer l’hypertrophie dans un modèle de rat souffrant d’hypertrophie cardiaque et d’explorer les mécanismes responsables de cette inhibition. Pour ce faire, des CMLVs aortiques de RSH âgés de 16 semaines ont été utilisées. Le taux de synthèse de protéines, un marqueur d’hypertrophie, a été déterminé par l’incorporation de (3H)leucine et l’expression des protéines a été déterminée par la technique d’immunobuvardage de type Western. Le volume cellulaire a été estimé par imagerie confocale tridimensionnelle. Le taux de synthèse de protéines et le volume cellulaire étaient considérablement accrus dans les CMLVs des RSH comparativement aux rats WKY et ont été largement atténués par le traitement au C-ANP4-23. De plus, le traitement au C-ANP4-23 a normalisé l’expression élevée du récepteur AT1 et des protéines Gqα et PLCβ1, des niveaux intracellulaires d’anions superoxide (O2-), de l’activité de la NADPH (de l’anglais nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxydase, ainsi que l’expression des protéines Nox4 et de p47phox dans les CMLVs des RSH. En outre, le C-ANP4-23 a réduit l’activation des récepteurs à L’EGF (de l’anglais epidermal growth factor), au PDGF (de l’anglais platelet-derived growth factor), et à l’IGF-1 (de l’anglais insulin-like growth factor 1). Le C-ANP4-23 a également atténué la phosphorylation des ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), AKT et c-Src. Ces résultats indiquent que l’activation du NPR-C par C-ANP4-23 a atténué l’hypertrophie des CMLVs par sa capacité à diminuer la surexpression du récepteur AT1, l’expression élevée des protéines Gqα/PLCβ1, le stress oxydatif accru, l’activation augmentée des facteurs de croissance et l’augmentation de la phosphorylation des voies de signalisation MAPK/AKT. Ainsi, ces travaux suggèrent que le C-ANP4-23 peut être utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des complications vasculaires associées à l’hypertension et à l’athérosclérose. / Hypertension is associated with vascular remodelling due to hyperproliferation and hypertrophy of vascular smooth muscle cells (VSMCs). We earlier showed the implication of enhanced expression of Gqα and PLCβ1 proteins in VSMCs from 16- week-old spontaneously hypertensive rats (SHR). The present study was undertaken to investigate whether C-ANP4-23, a natriuretic peptide receptor-C (NPR-C) agonist that has been shown to inhibit vasoactive peptide-induced enhanced protein synthesis in VSMCs, could attenuate VSMC hypertrophy in rat models of cardiac hypertrophy and to explore the underlying mechanisms contributing to this inhibition. For these studies, aortic VSMCs from 16-week-old SHR were used. The protein synthesis, a marker of hypertrophy, was determined by (3H)leucine incorporation and the expression of proteins was determined by Western blotting. Cell volume was determined by three-dimensional confocal imaging. The protein synthesis was significantly enhanced in VSMC from SHR as compared to WKY and C-ANP4-23 treatment attenuated the enhanced protein synthesis to WKY control levels. In addition, the enhanced expression of the AT1 receptor as well as Gqα and PLCβ1 proteins, enhanced levels of superoxide anion (O2 -), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase activity, as well as the increased expressions of NADPH oxidase 4 (Nox4) and p47phox exhibited by VSMC from SHR were all attenuated by C-ANP4-23 treatment. Furthermore, C-ANP4-23 also attenuated the enhanced activation of epidermal growth factor receptor (EGF-R), platelet-derived growth factor receptor (PDGF-R), insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) and the enhanced phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2), AKT and c-Src. These results indicate that C-ANP4-23, via the activation of NPR-C, attenuates VSMC hypertrophy through its ability to decrease the overexpression of the AT1 receptor and Gqα/PLCβ1 proteins, the enhanced oxidative stress, the increased activation of growth factors and the enhanced phosphorylation of the MAPK/AKT signalling pathway. Thus, it can be suggested that C-ANP4-23, an activator of NPR-C, may be used as a therapeutic agent for the treatment of vascular complications associated with hypertension and atherosclerosis.

La circulation collatérale non coronarienne (CCNC) perfuse le cœur en provenant d’artères bronchiques, médiastinales et péricardiques. L’éventualité que la CCNC puisse être artificiellement augmentée pour fournir un traitement alternatif pour les patients ischémiques représente une hypothèse intrigante sans réponse en raison de la nature difficile de ce champ de recherche. En se basant sur plusieurs aspects, tel que (1) l’existence des collatérales naturelles entre les artères coronaires et les artères thoraciques internes (ATIs), (2) les effets potentiels de la ligature des ATIs; (3) la capacité des ATIs de développer d’importantes branches collatérales ; (4) et la disponibilité actuelle des facteurs de croissance vasculaire, l’hypothèse ici décrite est que l’augmentation de la CCNC pourrait représenter une stratégie alternative d’apport sanguin au coeur.Ainsi, l’association d’occlusion des ATIs et de l’administration des facteurs de croissance pourrait représenter un moyen de poursuivre cet objectif. Pour le premier travail de recherche, nous avons établi un modèle canin. / Noncoronary collateral circulation (NCCC) comes to the heart from mediastinal, bronchial, and pericardial channels. Whether NCCC can somehow be augmented to provide an alternative therapy for ischemic patients is an intriguing hypothesis with no clear answer yet due to the challenging nature of this research field. Based on several aspects, such as (1) the occurrence of natural collaterals between coronary and the internal thoracic arteries (ITAs), (2) the potentialhemodynamic effects of ITAs ligation, (3) the potential of ITAs for developing important collateral branches, and (4) the current availability of angiogenic growth factors, the hypothesis herein is that enhancement of NCCC may represent an alternative myocardial blood supply strategy, and that combining ITAs occlusion with angiogenic growth factors may represent a way to achieve this objective. We established an ischemic canine model for first experiment.

Garantir la qualité des produits sanguins est crucial. Les lysats plaquettaires (LP) riches en facteurs de croissance (FC) s’imposent comme le complément idéal pour l’expansion ex vivo des cellules souches, et comme produit thérapeutique pour la régénération cellulaire. L’intérêt est croissant pour les microparticules (MPs) extracellulaires, mais l’expression de phosphatidylsérine à leur surface peut induire des effets thrombotiques et inflammatoires. L’autre risque transfusionnel, la transmission de virus, dont le virus de l’hépatite C (VHC), est maîtrisable par traitements de réduction virale par solvant/détergent (S/D), chauffage, ou nanofiltration. Nous avons étudié des technologies de sécurisation des produits sanguins: (a) élimination des MPs par nanofiltration sur filtres de 75 nm et (b) traitements S/D, chauffage à 56°C ou nanofiltration pour inactiver ou éliminer le VHC. Les informations ont été utilisées pour développer des LP utiles en médecine régénérative. L’un d’eux destiné à la neurorégénération, a été préparé en émettant l’hypothèse qu’un lysat de culot plaquettaire (LCP) enrichi en facteurs neurotrophiques et dépourvu de protéines plasmatiques se montrerait efficace contre les maladies neurodégénératives. Nos résultats montrent que la nanofiltration sur des filtres de 75 nm préserve la composition en protéines plasmatiques, et le pouvoir hémostatique. La nanofiltration retire les MPs et évite, in vitro, la génération de thrombine. Par ailleurs le traitement S/D à 31°C pour 30 minutes élimine le pouvoir infectieux du VHC. Pris globalement les traitements de nanofiltration et S/D apparaissent donc comme des méthodes de choix pour l’amélioration de la sécurité du plasma vis à vis de risques thrombogènes et infectieux. Nous avons ensuite préparé un LCP appauvri en protéines plasmatiques (dont le fibrinogène) et enrichi en un mélange pléiotrope physiologique de FC destiné à l’administration cérébrale. Les analyses par ELISA et par protéomique ont montré qu’un chauffage de 56°C pour 30 min réduisait le contenu en protéines et modifiait favorablement la composition relative en facteurs neurotrophiques. Par ailleurs le chauffage améliore l’action neuroprotectrice et, associé aux traitements S/D et de nanofiltration, contribue à l’inactivation du VHC. Ce LCP exerce une neuroprotection élevée dans des modèles de la maladie de Parkinson (MP) tout à la fois (a) in vitro (cellules LUHMES différentiées en neurones dopaminergiques et exposées au MPP+) et (b) in vivo (souris intoxiquées par MPTP). L’expression de la tyrosine hydroxylase (TH) dans la Substantia nigra pars compacta montre que l’administration intracérébroventriculaire (ICV) ou intranasale (i.n.) apparait comme une option thérapeutique possible des maladies neuro-dégénératives. Les études cellulaires In vitro sur LUHMES et NSC34 ont montré que l’inhibition spécifique des voies signalétiques relayées par AkT et ERK altère l’activité neuroprotectrice du LC. Des événements neuro-inflammatoires pouvant aggraver l’évolution des maladies neurodégénératives, nous avons vérifié que le LCP n’induit pas de marqueurs inflammatoires (COX-2, iNOS) chez des cellules microgliales BV2, et pouvait même diminuer celle de COX-2 après exposition à des lipopolysaccharides. De plus, nous avons identifié que le LCP contenait 1.7 x 1012 MP/mL d’une taille moyenne de 160 nm. Isolées, ces MPs pourraient exercer un rôle neuroprotecteur des cellules LUHMES exposées à des agents neurotoxiques. En conclusion, nos résultats montrent la faisabilité technique à préparer des lysats plaquettaires viro-inactivés pour des usages dans le domaine de la médecine régénérative, y compris comme agent neuroprotecteur du système nerveux central. / Ensuring quality and safety of blood products is crucial. Platelet lysates (PL) rich in growth factors (GFs) have emerged as ideal clinical-grade supplement for ex vivo expansion of mesenchymal stromal cells, and as therapeutic product promote cellular regeneration. Interest for platelet extracellular microparticles (MPs) is growing but expression of phosphatidylserine on their surface may cause thrombotic and inflammatory side effects. Another transfusional risk, transmission of viruses, including hepatitis C virus (HCV), can be fully controlled by dedicated viral reduction methods as solvent/detergent (S/D) or heat treatments, or nanofiltration. We have evaluated technologies to secure therapeutic blood products: (a) removal of MPs by 75nm-nanofiltration and (b) inactivation/removal of HCV by S/D or 56°C heat treatments, or nanofiltration. Data have been used to develop LP of interest for regenerative medicine. In particular, one, targeting neuroregenerative applications, has been prepared based on the hypothesis that a platelet pellet lysate (PPL) enriched in multiple neurotrophic growth factors and depleted of plasma proteins could exert potent neuroprotective actions in neurodegenerative disease models. Our data show that 75 nm-plasma nanofiltration preserved plasma protein biochemical profile, and hemostatic power. Nanofiltration removes MPs and avoids in vitro the generation of thrombin. In addition, the S/D treatment at 31°C for 30 minutes fully inactivates HCV infectivity. Therefore, altogether, nanofiltration and S/D emerge as choice procedures to improve the safety of plasma for thrombogenic and infectious risks. We have then prepared a PPL depleted of plasma proteins (in particular fibrinogen), and rich in a physiological pleiotropic mixture of neurotrophins for brain administration. ELISA and proteomics studies revealed that the heat-treatment at 56°C for 30 min decreased the protein content and favorably modified the relative composition in neurotrophic factors. Heat-treatment improved the neuroprotective activity and, together with S/D and nanofiltration contributed to HCV inactivation. This PPL exerted strong neuroprotective effects in Parkinson’s disease (PD) models (a) in vitro, using LUHMES cells exposed to MPP+ neurotoxin, and (b) in vivo, in mice intoxicated by MPTP neurotoxin. Expression of tyrosine hydroxylase (TH) in the Substantia nigra pars compacta indicated that brain delivery by intracerebroventricular (ICV) or intranasal (i.n.) administration may be a therapeutic option for disease-modifying strategies of neurodegenerative diseases. In vitro studies in LUHMES and NSC34 cells showed that specific inhibition of signal transduction pathways through AkT and ERK influenced PPL neuroprotective function. Since neuro-inflammation detrimentally affects neurodegenerative disorders, we verified that the PPL did not stimulate the release of inflammatory markers (e.g. COX-2, iNOS) by BV2 microglial cells in culture, and could even restrict COX-2 expression when cells were exposed to LPS. In addition, the PPL was found to contain 1.7 x 1012 MP/mL with a mean size of 160 nm. These MPs may exert neuroprotective activity on LUHMES cells exposed to neurotoxins. Altogether, our data demonstrate the technical feasibility of developing virally-safe customized platelet lysate preparations with specific applications for cell therapy and regenerative medicine, in particular as neuroprotective agents of the central nervous system.

Introduction Adipocytes are part of hematopoietic microenvironment, even though they are generally believed to play no active role during hematopoiesis. We have shown that accumulation of fat cells in femoral bone marrow (BM) coincides with increased expression of neuropilin-1 (NP-1), while it is weakly expressed in hematopoietic iliac crest BM. Starting from this observation, we postulated that adipocytes might exert a negative effect on hematopoiesis mediated through NP-1. Material and Methode To test this hypothesis, we set up BM adipocytes differentiated into fibroblast-like fat cells (FLFC), which share the major characteristics of primitive unilocular fat cells, as an experimental model. Results Morphological and immunophenotypic analysis of FLFCs in co-culture with CD34+ cells revealed that FLFCs constitutively produced M-CSF and induced CD34+ differentiation into macrophages independently of cell-to-cell contact. By contrast, granulopoiesis was hampered by cell-to-cell contact but could be restored in transwell culture conditions, together with G-CSF production. Both functions were also recovered when FLFCs cultured in contact with CD34+ cells were treated with an antibody neutralizing NP-1, which proved its critical implication in contact inhibition. Conclusion Our data provide the first evidence that adipocytes exert regulatory functions during hematopoiesis that might be implicated in some pathological processes.

Notre laboratoire a démontré que la capacité proinflammatoire du vascular endothelial growth factor (VEGF-A165) implique la synthèse endothéliale du facteur d’activation plaquettaire (PAF) via l’activation du récepteur tyrosine kinase homodimérique VEGFR-2/R-2. La synthèse du PAF requiert l’activation de la p38 MAPK et p42/44 MAPK qui activent la phospholipase A2 secrétée de type V (sPLA2-V). Nous avons découvert que la synthèse aigue de prostacycline (PGI2) induite par le VEGF-A165 requiert l’activation des récepteurs hétérodimériques VEGFR-1/R-2. L’activation sélective des récepteurs du VEGF peut donc agir comme balance dans la synthèse de facteurs pro-(PAF) et anti-(PGI2) inflammatoire. Cependant, les tyrosines impliquées dans la transphosphorylation de VEGFR-2/R-2 menant à la synthèse du PAF sont inconnues. Par mutagenèse dirigée, nous avons effectué des transfections transitoires de cellules endothéliales avec des plasmides codant pour le VEGFR-2 dont les tyrosines ciblées ont été remplacées de façon séquentielle par une phénylalanine. Un vecteur vide pcDNA a été utilisé comme contrôle négatif. La stimulation des cellules endothéliales de l’aorte bovine (BAEC) transfectées avec le VEGF-A165 (1nM) pendant 15 minutes augmente la synthèse du PAF de 300%, laquelle était similaire dans les BAEC non transfectées. Dans les BAEC transfectées avec les vecteurs pcDNA codant pour les mutations Y801F, Y1059F, Y1175F et Y1214F, nous avons observé une réduction de 54, 73, 68, et 57% respectivement de la synthèse du PAF induite par le VEGF par rapport au pcDNA témoin. Nos résultats apportent un nouvel aperçu sur le mécanisme par lequel le VEGF induit la synthèse du PAF qui est connu pour sa contribution dans l’activité pro-inflammatoire du VEGF. / Vascular endothelial growth factor (VEGF) inflammatory effects require acute platelet-activating factor (PAF) synthesis by endothelial cells (EC). We reported that VEGF-mediated PAF synthesis involves the activation of the homodimeric tyrosine kinase receptor VEGFR-2/R-2 which is leading to p38 and p42/44 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and secreted group V phospholipase A2 (sPLA2-V) activation. We also reported that VEGF-A165-mediated prostacyclin (PGI2) synthesis requires VEGFR-1/R-2 heterodimeric receptor activation. Selective activation of VEGF receptors can thus act as a balance in the synthesis of pro-(PAF) and anti-(PGI2) inflammatory factors. It is unknown which VEGFR-2 tyrosine phosphorylation site(s) contribute(s) to PAF synthesis. Bovine aortic endothelial cells (BAEC) were transfected with pcDNA vectors encoding for native VEGF receptor-2 (VEGFR-2) cDNA, or tyrosine phosphorylation sites mutated into phenylalanine (Y801F), (Y1059F), (Y1175F), (Y1214F), and an empty pcDNA vector was used as negative control. Treatment of pcDNA-transfected BAEC with VEGF-A165 (1nM) for 15 minutes increased PAF synthesis by 300%, which was similar to VEGF-mediated PAF synthesis in untransfected BAEC. In BAEC transfected with pcDNA vectors encoding mutated Y801F, Y1059F, Y1175F or Y1214F VEGFR-2 cDNA, we observed a marked reduction of VEGF-mediated PAF synthesis by 54, 73, 68 and 57% respectively as compared to pcDNA-transfected BAEC. Our current data provide novel insight on the mechanisms by which VEGF promotes endothelial PAF synthesis which is known to contribute to VEGF pro-inflammatory activities.

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