El estudio de las acciones del ácido retinoico (RA) en células de neuroblastoma posee dos vertientes de interés. En primer lugar, el RA es una señal que desempeña un papel central en el desarrollo embrionario y la generación de diversos órganos y sistemas, incluyendo el sistema nervioso, y por lo tanto hay un interés científico en conocer los mecanismos moleculares por los cuales ejerce estas acciones. En segundo lugar, el RA y sus derivados sintéticos están siendo ensayados en terapia de enfermedades neoplásicas, debido a su capacidad de regular el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular, con resultados clínicos muy relevantes, como en el caso del neuroblastoma. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los que el RA ejerce sus acciones terapéuticas no han sido establecidos claramente. El objetivo de esta tesis ha sido descifrar los mecanismos moleculares por los que el RA induce la diferenciación de células neurales, utilizando como sistema modelo células de neuroblastoma. Resultados previos del laboratorio indican que, en células de neuroblastoma, la respuesta a la administración de RA no sólo se produce a nivel transcripcional, sino que también produce la activación de la ruta de señalización de PI3K/AKT (López-Carballo, G. 2002. J Biol Chem 277, 25297-25304). Esta activación es necesaria para la inducción de la diferenciación por RA y pensamos que ocupa un lugar central en el control ejercido por RA sobre el crecimiento, diferenciación y supervivencia celular, por lo que hemos llevado a cabo su caracterización con más detalle. A través del estudio de los aspectos mecanísticos de la activación de la vía de señalización de PI3K/AKT por RA, hemos determinado que la activación de las vías PI3K/AKT y MAPK/ERK por RA se produce a través de un mecanismo no genómico, que no requiere ni transcripción de nuevos genes ni síntesis de proteínas. Además, hemos demostrado que esta activación no es exclusiva de células de neuroblastoma, sino que es un proceso más general. Se ha establecido la participación del Receptor Nuclear RAR en la activación de la vía de señalización de PI3K/AKT, y hemos caracterizado qué dominio del receptor RAR está involucrados en la activación de la vía de PI3K/AKT. Además hemos puesto de manifiesto que la localización intracelular de RAR desempeña un importante papel en la activación de PI3K, y hemos descrito las interacciones físicas entre el receptor RAR y componentes de la vía de transducción de señal PI3K/AKT y cómo la unión de RA al receptor RAR regula estas interacciones. Finalmente, hemos analizado las consecuencias transcripcionales de estas acciones no genómicas del RA en células de neuroblastoma mediante el uso de microarrays de DNA. Los resultados obtenidos permiten plantear un nuevo modelo para la activación de la vía PI3K/AKT por RA en el que la unión del ligando al receptor nuclear RAR desempeña un papel central en la regulación de la localización intracelular de RAR y de la interacción de RAR con las subunidades de PI3K. / Administration of Retinoic Acid (RA) to SH-SY5Y neuroblastoma cells results in activation of phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) signalling pathway, and this activation is required for RA-induced differentiation. Here we show that RA activates PI3K and ERK1/2 MAP Kinase signalling pathways through a rapid, non-genomic mechanism that does not require new gene transcription or newly synthesized proteins. Activation of PI3K by RA appears to involve the nuclear receptor RAR, on the basis of the pharmacological profile of the activation. In addition, activation of PI3K in RA-treated COS-7 cells was strongly increased by transfection of a RAR expression vector. The intracellular localization of RAR resulted to be relevant for PI3K activation. A chimerical RAR receptor fusing c-Src myristylation domain to the N-terminal of RAR (Myr-RAR) was targeted to plasma membrane. Transfection of Myr-RAR to COS-7 cells results in strong activation of PI3K signalling pathway, although both in the absence as well in the presence of RA. This result would argue for a role of ligand binding in the localization of RAR to plasma membrane, allowing there interactions with components of the signal transduction machinery that result in PI3K activation. By means of biochemical fractionation experiments we demonstrated that the levels of RAR in the membrane fractions (microsomal and purified plasma membrane fractions) were rapidly increased upon RA administration to NIH-3T3 cells. Immunoprecipitation experiments showed a physical interaction between RAR and p85, the regulatory subunit of PI3K, both in the absence as well in the presence of RA. Ligand administration increased the association of p110, the catalytic subunit of PI3K, to this complex. The results shown here suggest a model in which RAR forms a stable complex with p85-PI3K. Ligand binding to RAR promotes targeting of this complex to plasma membrane, facilitating the association with p110-PI3K and resulting in increased PI3K activity.

Esta tesis versa sobre el estudio de cuatro enzimas que tienen como función específica la síntesis y liberación del anhidridos fosfóricos, y que son cruciales para la biosíntesis de los aminoácidos ornitina/arginina, prolina, lisina e isoleucina, y para la síntesis microbiana de nucleótidos de pirimidina. Previamente a mi incorporación en el laboratorio, éste habia identificado un plegamiento característico y novedoso común a los enzimas carbamato quinasa (Marina, A. et al., 1999; Ramón-Maiques, S. et al., 2000) y acetilglutamato quinasa (Ramón-Maiques, S. et al., 2002). Ambos enzimas, pertenecen al grupo de la Enzyme Commission EC 2.7.2, transferidores de un fosforilo a un grupo carboxilato, y por tanto, con la misión específica de sintetizar anhidridos mixtos carboxílico-fosfórico, en rutas de biosíntesis de aminoácidos. Carbamato quinasa y acetilglutamato quinasa, pertenecen a la familia estructural aminoácido quinasa (Base de datos PFAM, familia PF00696; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), familia que por similitud de secuencia de aminoácidos, incluye además, a los enzimas aspartatoquinasa, glutamato 5-quinasa, UMP quinasa bacteriana y N-acetil L-glutamato sintasa. Dada la similitud de secuencia entre los enzimas de la familia aminoácido quinasa, el laboratorio propuso que el plegamiento de carbamato quinasa y acetilglutamato quinasa iba a ser común al resto de enzimas de la familia y la puesta a prueba experimental de esta hipótesis ha sido uno de los objetivos principales del laboratorio y de mi trabajo. Parte de mi trabajo inicial, se centró en la acetilglutamato quinasa (NAGK), enzima cuya estructura había sido ya determinada a alta resolución (Ramon-Maiques, et al., 2002), por otros miembros del grupo en el que he desarrollado mi trabajo. Mi trabajo en relación con este enzima fue corroborar mediante mutagénesis dirigida, las inferencias funcionales derivadas del estudio estructural previo. Dada la similitud entre acetilglutamato quinasa y aspartoquinasa (AK), otro enzima de la familia amino ácido quinasa, clave en la síntesis de treonina, metionina, lisina e isoleucina, y con gran potencial desde el punto de vista biotecnológico, utilizamos la información estructural de NAGK, para realizar un trabajo de mutagénesis dirigida de aspartoquinasa, cuyos resultados nos permitieron construir un modelo estructural de AK. El tercer enzima que he estudiado, la UMP quinasa, es clave en la síntesis de nucleótidos de pirimidina y presenta la peculiaridad dentro de los enzimas de la familia aminoácido quinasa de sintetizar la formación de un anhidrido fosfórico-fosfórico. Mi trabajo con este enzima se ha centrado en determinar su estructura mediante difracción de rayos X. Por último he estudiado el enzima glutamato 5-quinasa, clave en la síntesis de prolina en microorganismos y plantas, que es tambien clave para la síntesis de ornitina en animales. He determinado la estructura tridimensional de la glutamato 5-quinasa de E. coli mediante difracción de rayos X. El ámbito de estudio con los cuatro enzimas objeto de esta tesis, ha sido siempre el estructural, buscando conectar y asociar rasgos estructurales con comportamiento funcional. El trabajo que he realizado, ha dado lugar a las siguientes publicaciones:- Marco-Marín, C. et al (2003). Journal of Molecular Biology (2003) 334, 459-476. - Marco-Marín, C. et al (2005). Biochim. Biophys. Acta. (2005) 1747, 271-275. - Marco-Marín, C. et al (2005). Journal of Molecular Biology (2005) 352, 438-454.- Marco-Marín, C. et al (2007). Journal of Molecular Biology (2007) 367, 1431-1446. / This thesis is about four enzymes that synthesize phosphoric anhydrides, and which have key roles on the biosynthetic pathways of ornithine/arginine, proline, lysine and isoleucine, and on the microbial synthesis of pyrimidine nucleotides. A novel and characteristic fold common to the enzymes carbamate kinase (CK) and acetylglutamate kinase (NAGK) had been identified by other members of the laboratory, previously to my incorporation. CK and NAGK belong to the amino acid kinase structural family (PFAM database, PF00696; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), that also includes aspartokinase (AK), glutamate 5-kinase, bacterial UMP kinase and N-acetyl L-glutamate synthase. Based on the sequence similarity of these enzymes, the laboratory proposed a common fold for all of them, equivalent to that previously described for CK and NAGK. One of the main objectives of the laboratory and of my work has been to probe this hypothesis experimentally. Initially, I studied NAGK from E. coli and I corroborated by site-directed mutagenesis, functional inferences derived from the previous structural work. The high similitude between NAGK and AK allowed to perform a site-directed mutagenesis study of AK, and to use the results of this study to build a molecular model of the AKIII from E. coli. The third enzyme that I have studied, UMP kinase, is a key enzyme of the pathway of biosynthesis of pyrimidine nucleotides in bacteria, that different to the other enzymes of the amino acid kinase family, synthetizes a phosphoric-phosphoric anhydride. I have determined the 3D-structure of the UMP kinase from Pyrococcus furiosus using X-ray crystallography, and also of the glutamate 5-kinase fom E. coli, which is a key enzyme of the biosynthesic pathway of proline in microorganisms and plants, and also of ornithine in animals. The work of this thesis is included in the following publications: - Marco-Marín, C. et al (2003). Journal of Molecular Biology (2003) 334, 459-476. - Marco-Marín, C. et al (2005). Biochim. Biophys. Acta. (2005) 1747, 271-275. - Marco-Marín, C. et al (2005). Journal of Molecular Biology (2005) 352, 438-454.- Marco-Marín, C. et al (2007). Journal of Molecular Biology (2007) 367, 1431-1446.

Este trabajo estudió la acetilación postraduccional de una estructura dinámica implicada en un gran número de procesos celulares, la cromatina. Para ello se realizaron experimentos utilizando el organismo eucariota Sacharomyces cerevisiae (la levadura de la cerveza). En una primera parte se llevó a cabo el análisis bioquímico de complejos histona acetiltransferasa (HAT) en S. cerevisiae, detectándose una nueva actividad HAT con especificidad sobre la histona H3, y a partir de este descubrimiento, se analizaron las actividades HAT A4-I y HAT A4-II. La segunda parte del trabajo consistió en la localización genómica de diversas HATs, y de marcas epigenéticas mediante ChIP-chip (combinación de inmunoprecipitación de cromatina y chips de DNA). Para ello se diseñó un nuevo método localización genómica (utilizando macrochips de ORFs de levadura y marcaje radiactivo) con el que se estudió la asociación de una serie de HATs a cromatina y el patrón de acetilación de la lisina 14 de la histona H3. Finalmente, se realizó un estudio de los efectos sobre la longevidad y sobre el perfil transcriptómico de la deleción de los genes HAT1 y HAT2, codificantes de proteínas pertenecientes al complejo HAT B de S. cerevisiae. / This work studied posttranslational acetylation of chromatin, a dynamic structure involved in a great number of cellular processes. Experiments using eukariotic organism Sacharomyces cerevisiae (baker's yeast) were done with this aim.The first part consists in a thorough biochemical analysis of histone acetyltranferase (HAT) complexes in S. cerevisiae. This analysis dectected a new HAT activity with specificity towards H3 histone, so the activities we called HAT A4-I and HAT A4-II were analysed. The second part covers the genomic location of several HATs and epigenetic marks through ChIP-chip (a combination of chromatin immunoprecipitation and DNA chips). We designed a new genomic location method (involving ORF macroarrays and radiactive labelling) in order to study association of HATs to chromatin and the acetylation pattern of lysine 14 of histone H3.Finally we have performed several experiments to assess the effects on longevity and transcriptome caused by the deletion of two genes coding for proteins that belong to HAT B complex in S. cerevisiae.

El fruto es un órgano esencial para las plantas, dado que permite que las semillas se desarrollen y maduren correctamente, y que se dispersen una vez completada su maduración. Desde hace varias décadas se ha propuesto que el proceso de desarrollo del fruto está modulado por fitohormonas, fundamentalmente giberelinas y auxinas, y que las semillas en desarrollo impulsarían el crecimiento del fruto mediante la síntesis de estas hormonas en su interior. Los mecanismos molecularres que rigen la actuación de estas hormonas, sin embargo, no se conocen. En diversas especies se ha descrito desde los años 30 que auxinas y giberelinas pueden inducir desarrollo del fruto independientemente de la fertilización, y en la planta modelo Arabidopsis thaliana también se ha comprobado, más recientemente, este efecto. En este trabajo se ha querido determinar qué mecanismos moleculares median la acción de estas hormonas, así como cuál es la naturaleza de la interacción entre auxinas y giberelinas en este proceso del desarrollo. Para facilitar el estudio de la fructificación y las fases iniciales del desarrollo del fruto, se ha utilizado el mutante de esterilidad masculina condicional cer6-2. En primer lugar, se ha demostrado que el ácido giberélico (GA3) y la auxina sintética 2,4-D son capaces de inducir desarrollo partenocárpico del fruto en el mutante cer6-2. El inhibidor del transporte polar de auxinas NPA, cuya capacidad de desencadenar desarrollo de fruto en pepino fue descrita en los años 70, también induce partenocarpia en este mutante de Arabidopsis. Experimentos de localización de auxinas, utilizando plantas transgénicas que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo la dirección del promotor sintético de respuesta a auxinas DR5, han demostrado que el primer paso del proceso de fructificación inducida por polinización y fertilización de los óvulos consiste en una acumulación de auxinas en los óvulos, y que el tratamiento con NPA mimetiza este efecto. Esta acumulación se restringe a los óvulos, ya que en el pericarpo del fruto no se aprecia incremento de la señal de GFP. Las giberelinas no tienen ningún efecto sobre la distribución de auxinas, lo que sugiere que su actuación en este proceso tiene lugar independientemente o con posterioridad a las auxinas. La polinización, así como los tratamientos inductores de partenocarpia con 2,4-D o NPA inducen la expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de giberelinas, y reprimen la expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la inactivación de estas hormonas. La fructificación, inducida tanto por polinización como por todos los tratamientos, induce eventos de señalización por giberelinas: una fusión traduccional de GFP a la proteína de señalización por giberelinas RGA se degrada en respuesta a todos los tratamientos. Además, la capacidad de respuesta a los distintos tratamientos de diferentes mutantes en la ruta de señalización por giberelinas se ve afectada. Estos resultados apoyan la hipótesis de que las giberelinas medien la acción de las auxinas en el proceso de fructificación. Por último, un análisis transcriptómico de la respuesta a la inducción de partenocarpia mediante tratamiento con GA3 mostró que numerosos genes de respuesta a auxinas se inducen a consecuencia de tratamiento. Este resultado sugiere que la vía de señalización debe de ser compleja, con las giberelinas mediando la acción de las auxinas, pero actuando posteriormente, o en una rama independiente, también a través de la acción de las auxinas. / Fruit development is an essential process in the plant life cycle, because the fruit allows the correct development and maturation of the seeds, and also their dispersal. It has long been proposed that phytohormones, especially gibberellins and auxins, synthesized in developing seeds, would play a determinant role in fruit development, although their molecular mechanism of action remains unknown. Auxins and gibberellins have been shown to induce parthenocarpy, i.e. seedless fruit development, in several species, including Arabidopsis thaliana. The aim of this work has been to decipher the molecular mechanisms of action of auxins and gibberellins in fruit set, and to determine whether these hormones act independently, in a concerted manner, or sequentially, and which is the hierarchy between them. In order to simplify the study of fruit set, a conditional male sterile mutant, cer6-2, has been used. The capacity of different hormones to induce fruit development independent of fertilization in this mutant was assessed: gibberellic acid (GA3), the synthetic auxin 2,4-D, and the inhibitor of polar auxin transport NPA were found to induce parthenocarpy, although with a limited effect compared to pollination. Auxin distribution analysis showed that pollination triggers a strong accumulation of auxins in the ovules, but not in the pericarp of the fruit. NPA treatment mimicked this effect, whereas GA3 treatment had no effect upon auxin distribution, suggesting that GAs act downstream of auxins in fruit set. Induction of fruit set via pollination, auxin or NPA treatment resulted in an upregulation of GA biosynthetic genes, further supporting the role of GAs as mediators of auxin action. GA signaling events were activated after fruit set induction by all treatments and pollination, as shown by the degradation of the GA signaling protein RGA, and by the altered response to all treatments shown by GA signaling mutants. Finally, microarray analysis showed that fruit set induction by GA3-treatment triggers changes in the expression of several auxin-responsive genes, which suggests that the signaling pathway in early fruit development is more complex, with gibberellins acting downstream of auxins, but also triggering auxin signaling events further downstream, perhaps on an independent branch of the pathway.

Eukaryotic gene expression is a highly regulated process that has to ensure the right cellular response to any type of stimulus. Nevertheless, chromatin structure, despite the fact of being dinamic, imposes certain contraints to this regulation. To solve this restrictions, cells have organized the recruitment of chromatin modifying enzymes and ATP-dependent chromatin remodelling enzymes. The first class of enzymes are responsible for the covalent modifications of histones which alter the global charge of the histones and also serve to recruit specific co-factors to the chromatin. The second group of enzymes uses the energy from ATP hydrolisis to modify the interactions DNA-histones, therefore increasing the nucleosomal DNA accesibility to the transcriptional machinery. The understanding of the mechanisms that the cell uses to regulate expression of an immediate-early gene such as egr-1, are very important, not only for the basic molecular knowledge but also for the understanding of different pathologies. The coordinated action of the signalling pathways, the union of transcriptional factors and enzymatic complexes that act over the chromatin is crucial for the right interpretation of the genetic code, which is specific for each gene under study. In the case of egr-1, treating MLP29 cells with TPA activates expression after 5 min of treatment, has a peak around 15 and 30 min, and decreases subsequently to be undetectable at 180min after the treatment. This induction takes place through the MAP and p38 kinase cascades which also act phosphorylating the promoter transcriptional factors ELK1 and CREB. Chromatin immunoprecipitation experiments (ChIP), suggest that egr-1 is a gene "ready to be expressed", as the RNAPol II and the SRF, ELK1, CREB and SP1 transcriptional factors are already present in the basal state of the gene. During the induction process SP1 leaves the promoter and EGR-1, NAB1 and NAB2 are recruited. In the same manner, ChIP experiments have detected the presence of two HDAC complexes implicated in egr-1 repression (mSIN3A and HDAC3-NcoR) and the presence of two HAT complexes (CBP, with a possible role as maintaining the basal acetylation levels and GCN5 which putative role would favour the induction process). The presence of these enzymes has been correlated with a general increase in the levels of acetylation of histone H3 and H4 by immunoprecipitating against specific histone modifications. Additionally, experiments of Micrococcal nuclease protection have suggested the existence of three positioned nucleosomes in egr-1 promoter and also the movement of the more proximal to the transcription start during the induction process. That nucleosomal mobility has been related to the presence of the ATPase BRM and BRG1 in the promoter of the gene and also with specific increases in the acetylation levels of the three nucleosomes as revealed by mononuclesomal ChIP experiments. Moreover, to study the biological effect of the lack of EGR1, it has been designed a siRNA sequence that is able to decrease egr-1 expression up to a 70%, and which biological activity has been shown by a decrease in nab2 (EGR1 target gene) expression of 40%. Lastly, the interconnection between these results has allowed us to hypothesize a model for the epigenetic regulation of egr-1 gene in murine cells treated with TPA. / La regulación de la expresión génica en eucariotas se encuentra condicionada por la estructura de la cromatina. Por ello, la comprensión de los mecanismos que utiliza la célula para regular la expresión de un gen inmediato-temprano, como egr-1, es de gran importancia tanto para el conocimiento básico molecular como para la compresión de diferentes patologías. El tratamiento de células MLP29 con TPA activa la expresión del gen egr-1 a los 5 min., alcanza un pico entre los 15 y 30 min. y deja de ser detectable a los 180 min. Dicha inducción, se produce a través de las cascadas de quinasas MEK y p38, que además fosforilan a los factores ELK1 y CREB, presentes en el promotor del gen. Experimentos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), indican que egr-1 posee la RNAPol II y los factores SRF, ELK1, CREB y SP1 unidos al promotor en el estado basal. Durante la inducción, SP1 se libera y EGR1, NAB1 y NAB2 son reclutados. Asimismo, experimentos de ChIP han detectado la presencia en el promotor de dos complejos HDAC (mSIN3A y HDAC3-NCoR) y de dos complejos HAT (CBP y GCN5). Estos enzimas se han correlacionado con un incremento general en los niveles de acetilación de las histonas H3 y H4 mediante ChIP con anticuerpos específicos. Además, experimentos de protección frente a digestión con nucleasa de micrococo sugieren la existencia de 3 nucleosomas posicionados en el promotor de egr-1 así como el movimiento del más próximo al inicio de la transcripción durante el proceso de inducción. Dicha movilidad nucleosomal se ha correlacionado mediante ChIP con la presencia de las ATPasas BRM y BRG1 en el promotor del gen y con incrementos específicos de acetilación de los tres nucleosomas, estudiados mediante ChIP de mononucleosomas. El efecto biológico de EGR1 se ha estudiado mediante RNA de interferencia capaz de producir una disminución del nivel de expresión de egr-1 de un 70% y la inhibición parcial de genes diana como es el caso de nab2. Finalmente, la interconexión de estos resultados nos ha permitido hipotetizar un posible mecanismo de regulación epigenética del gen egr-1 en células MLP29 inducidas por TPA.

La longevidad de los transcritos del gen cloroplástico rbcL en Chlamydomonas reinhardtii depende de la presencia de una corta secuencia de 10 nucleótidos localizada en el extremo 5´ del mRNA. Este elemento de secuencia forma parte de una estructura secundaria que, probablemente, también es importante para la estabilidad de los transcritos de rbcL. Utilizando genes quiméricos constituidos por modificaciones de la 5´UTR de rbcL y la secuencia codificante del gen uidA, como gen reportero, e introduciéndolos en el cloroplasto de C. reinhardtii se ha podido determinar los requisitos de secuencia y de conformación esenciales para la estabilidad de estos transcritos. Los cambios realizados afectan a la secuencia del extremo 5´, a su estructura secundaria o a ambos. Cambios de la secuencia de la estructura secundaria localizada en el extremo 5´ (p.e. haciendo mayor o menor el stem o la horquilla) no tienen efecto en la vida media de los transcritos siempre y cuando mantengan la secuencia y la conformación de la base de la misma que afecta al elemento de estabilidad. En cambio, cualquier cambio nucleotídico que altere la conformación del elemento de estabilidad produce la rápida degradación de los transcritos. La conformación del elemento de estabilidad debe de contener los cuatro primeros nucleótidos, desde +38 hasta +41, en doble cadena, formando la base de la primera estructura secundaria. Las posiciones centrales, +42 (C), +43 (C) y +44 (G), deben de quedar en simple cadena mientras que las posiciones 3' del elemento, +45, +46 y +47, quedan en doble cadena, formando parte de la base de la segunda horquilla. Los resultados sugieren que, para que el elemento de estabilidad sea funcional sus 10 nucleótidos deben de quedar plegados en esta conformación. En C. reinhardtii se han descrito interacciones entre elementos cis, localizados en la 5´UTR de mRNA específicos cloroplásticos, y proteínas citosólicas que median de manera específica la estabilidad de estos mensajeros. Los mecanismos moleculares responsables del control de la estabilidad de los mRNAs cloroplásticos, aunque no se conocen en detalle, parecen basarse en estas interacciones. Los requisitos de secuencia y conformación de la 5´UTR de rbcL sugieren que la vida media de estos transcritos depende de la asociación del elemento de estabilidad con elementos trans que protegen el transcrito del ataque de las ribonucleasas y, de este modo, modulan su longevidad. Hasta el momento, no se ha descrito ninguna proteína implicada en el control de la estabilidad de este mensajero. Con objeto de identificar proteínas de unión a esta región se planteó una aproximación bioquímica in vivo de búsqueda global de proteínas de unión a un transcrito quimérico gobernado por la 5´UTR de rbcL. Se irradiaron con luz ultravioleta células vivas de C. reinhardtii, fijando así las interacciones directas entre el RNA y las proteínas que en ese momento del ciclo celular estén unidas al RNA quimérico in vivo. Los aductos RNA-proteínas obtenidos tras la irradiación se observaron como una banda retardada. Las proteínas asociadas se analizaron por espectrometría de MS/MS. De entre las proteínas identificadas en la banda de retardo en gel destacan la proteína disulfuro isomerasa (PDI) y la proteína de unión a RNA (RB38). Se ha corroborado in vitro la unión de éstas a la 5'UTR de rbcL. Estos resultados se ven apoyados tanto por la función de estas proteínas como por el hecho de que se han descrito formando parte de un complejo proteico con capacidad de unión a la 5'UTR del mRNA de psbA. Estas proteínas resultan prometedoras ya que, a través de ellas, se pueden diseñar nuevas aproximaciones que permitan acotar la búsqueda de las proteínas de unión específicas. / RNA secondary structures, e.g. stem-loops that are often found at the 5' and 3' ends of mRNAs, are in many cases known to be crucial for transcript stability but their role in prolonging the lifetime of transcripts remains elusive. In this study we show for an essential RNA-stabilizing stem-loop at the 5' end of rbcL gene transcripts in Chlamydomonas reinhardtii that it neither prevents ribonucleases from binding to the RNA nor impedes their movement along the RNA strand. The stem-loop has a formative function in which it mediates folding of a short 10 nucleotides sequence around its base into a specific RNA conformation, consisting of a helical and single stranded region, i.e. the real structure required for longevity of rbcL transcripts in chloroplasts. Disturbing this structure renders transcripts completely unstable, even if the sequence of this element is not altered. The requirement of a specific 5' sequence and structure for RNA longevity suggests an interaction of this element with a trans-acting factor that protects transcripts from rapid degradation in chloroplasts. At the moment, no protein has been described with specific affinity for this region. We have planned a biochemistry in vivo approach in order to look for proteins able to bind to a chimeric RNA headed by the 5'UTR of rbcL messenger. Alive cells of C. reinhardtii were irradiated with UV light and the RNA-proteins aducts were purified. The associated proteins were analyzed by MS/MS spectroscopy. Among the identified proteins, PDI and RB38 could be pointed proteins because, both of them, has been described in a ribonucleoprotein complex with affinity by the 5'UTR of the psbA chloroplast messenger. We have corroborated the in vitro affinity of both proteins, in an independent way, to the 5' UTR of rbcL. These proteins could be promising because, through them, we can propose new approaches to determine the specific protein involved in the regulation of the rbcL mRNA stability.

En múltiples tejidos de mamíferos, la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) controla el metabolismo de la glucosa y de los lípidos. Esta importante función de AMPK como sensor energético conservado evolutivamente y regulador clave del metabolismo estaría, además, apoyada por el papel de su ortólogo en el metabolismo de la glucosa del eucariota unicelular Saccharomyces cerevisiae. La proteína se activa en respuesta a un aumento en la relación de AMP respecto a ATP en el interior de la célula y, por lo tanto, actúa como un eficiente sensor del estado energético celular. Con el objetivo de mantener el balance energético celular, la activación de AMPK va a inhibir rutas anabólicas y otros procesos que consuman ATP, mientras que va a activar rutas catabólicas que generen ATP. Estos efectos se alcanzan tanto por fosforilación rápida y directa de enzimas metabólicas como a través de efectos a largo término en la expresión de genes y proteínas. Debido al papel central que AMPK tiene en el control del metabolismo energético, la identificación de nuevas proteínas que puedan interaccionar con ella puede ayudar al entendimiento de las funciones de AMPK. Mediante un escrutinio de doble híbrido en levadura de una genoteca de cDNA de páncreas humano y, utilizando AMPK α2 como cebo, se identificó TRIP6. TRIP6 es un coactivador transcripcional perteneciente a una familia de proteínas con dominios LIM que se localizan en placas de adhesión focal. TRIP6, además de interaccionar con la subunidad catalítica de AMPK cuando ambas proteínas están en el núcleo, también aparece fosforilado en su extremo amino-terminal por acción de AMPK in vitro. Y aunque la activación de AMPK no afecta a la localización subcelular de TRIP6, sí que incrementa sus propiedades transactivadoras. Últimamente se ha apuntado a TRIP6 como coactivador de genes regulados por NF-B. Consistentemente con estas observaciones, la actividad transcripcional de TRIP6 sobre promotores regulados por NF-B aumenta significativamente en condiciones de activación de AMPK. Dentro de los efectos metabólicos que produce AMPK, una mención especial merece su implicación en la regulación del metabolismo del glucógeno. Así, AMPK es capaz de interaccionar con R5, una de las subunidades reguladoras de la proteína fosfatasa de tipo 1 (PP1). PP1 es la responsable de la defosforilación de la glucógeno sintasa y de la glucógeno fosforilasa, conduciendo a la síntesis de glucógeno. También se ha descrito que R5 es capaz de interaccionar con laforina, una de las proteínas implicadas en la enfermedad de Lafora. La epilepsia mioclónica progresiva de tipo Lafora es un desorden autosómico recesivo de consecuencias fatales caracterizado por la presencia de acúmulos de glucógeno poco ramificado en distintos tipos celulares, denominados cuerpos de Lafora. Hasta el momento se han identificado dos genes que se encuentran mutados en la enfermedad de Lafora. El primero codifica para la proteína laforina y el segundo, para una E3 ubicuitina ligasa, denominada malina. R5 es una fosfoproteína in vivo cuyo grado de fosforilación se ve afectado por AMPK. Se desconoce todavía el residuo donde reside esta fosforilación, aunque hemos podido descartar la Ser35. La activación de AMPK conduce a una disminución del efecto glucogenogénico producido por la sobreexpresión de R5. Este efecto puede también producirse a través del complejo laforina-malina, ya que laforina interacciona y también puede ser fosforilada in vitro por AMPK, y la formación del complejo laforina-malina está regulada positivamente por AMPK. El complejo laforina-malina inhibe la producción de glucógeno debida a la sobreexpresión de R5, mediante la degradación de R5. Sin embargo, la expresión de una forma dominante negativa de AMPK puede prevenir la inhibición por parte del complejo laforina-malina de los efectos glucogenogénicos de R5. / AMP-activated protein kinase (AMPK) acts as a sensor of cellular energy charge. Once activated it switches on catabolic pathways and switches off many ATP-consuming processes (anabolic pathways) to preserve the energy status of the cell. This important function is supported by SNF1 complex, its ortologue in Saccharomyces cerevisiae. The identification of new proteins able to interact with AMPK may be useful in order to understand new AMPK roles. To identify new targets of AMPK action we have performed a two-hybrid screening of a human pancreas cDNA library, using AMPK α2 as a bait. As a result, we have identified TRIP6 as a novel target of AMPK. This protein belongs to the zyxin family of proteins located at the focal adhesion plaques. TRIP6 interacts with AMPK α2 when both proteins are in the nucleus. AMPK is able to phosphorylate in vitro TRIP6 at the N-terminus. Although AMPK activation does not affect subcellular localization of TRIP6, transcriptional co-activator properties of TRIP6 on NF-kB-regulated promoters were enhanced by AMPK action. AMPK is also involved in glycogen metabolism. AMPK interacts physically with R5, one of the glycogen targeting subunits of type 1 protein phosphatase (PP1). PP1 dephosphorylates glycogen synthase and glycogen phosphorylase, leading to glycogen synthesis. It has been also described that R5 interacts with laforin, one of the proteins implicated in Lafora disease. Lafora progressive myoclonus epilepsy is a fatal autosomal recessive neurodegenerative disorder characterized by the presence of glycogen-like intracellular inclusions called Lafora bodies. Lafora disease associates with mutations in two genes, encoding respectively laforin, a dual-specificity protein phosphatase, and malin, an E3 ubiquitin ligase. R5 is also phosphorylated by AMPK and its phosphorylation status is modified by AMPK in vivo. AMPK activation decreases the glycogenic effect of R5, and this effect can be also produced through laforin-malin complex, because AMPK interacts and phosphorylates laforin in vitro, and the interaction between laforin and malin is regulated by AMPK. Thus, laforin-malin complex downregulates the glycogenic activity of R5 and the expression of a dominant negative form of AMPK impairs the effect of the laforin-malin complex on the glycogenic activity of R5.

Introducción: Los pacientes con enfermedad inflamatoria crónica intestinal (EII), enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa presentan lesiones en el epitelio intestinal de carácter inflamatorio. Estas lesiones afectan al intestino grueso en la colitis ulcerosa y a cualquier parte del tracto digestivo en la enfermedad de Crohn. En este tipo de enfermos se ha visto que existe una menor absorción de nutrientes, sobre todo en la enfermedad de Crohn, entre ellos la lactosa (el azúcar de la leche). Hipótesis de trabajo: los pacientes con enfermead inflamatoria tienen mayor prevalencia de malabsorción de lactosa y de fructosa. Pacientes y métodos: se valoró la gravedad de la enfermedad inflamatoria mediante los índices de Truelove-Witts y el CDAI, la extensión de la enfermedad, el patrón fenotípico y la existencia o no de válvula ileocecal en la enfermedad de Crohn. Se realizaron pruebas de absorción a 156 pacientes con enfermedad inflamatoria (71 colitis ulcerosa y 86 con enfermedad de Crohn) y a 41 voluntarios sanos mediante test del aliento de hidrógeno, se recogió mediante un cuestionario la presencia de síntomas durante la prueba y en las 24h posteriores y se realizó una analítica completa con maracadores para enfermedad celíaca con valoración de parámetros nutritivos y de parámetros inflamatorios. Resultados y conclusiones: la prevalencia de malabsorción de lactosa en los enfermos de EII es similar a la de la población general sana y no está influenciada por la localización, actividad inflamatoria, fenotipo ni por la ausencia de válvula ileocecal. La intolerancia a la lactosa es más frecuente en pacientes con colitis ulcerosa que en los sujetos sanos tanto durante el test como en las 24h posteriores, también en los pacientes con afectación izquierda extensa y pancolitis. En la enfermedad de Crohn la intolerancia a lactosa es superior a la población sana sólo en las 24h posteriores al test, y es más prevalente en las localizaciones del íleon terminal y la ileo-colónica, y en los patrones inflamatorio y estenosante. La prevalencia de malabsorción de fructosa es similar a la de la población sana en los pacientes con colitis ulcerosa y mayor en los de enfermedad de Crohn tanto respecto a los sujetos sanos como a colitis ulcerosa, también en las localizaciones: tracto digestivo superior ielo-colon y colon. La intolerancia a fructosa en los enfermos durante el test es similar a la de la población general sana, pero es superior en las 24h posteriores, en la colitis ulcerosa esta prevalencia aparece en las localizaciones distal e izquierda-extensa y en los pacientes sin activiad inflamatoria y en la enfermedad de Crohn en el tracto GI alto, íleon terminal e íleo-colon, en los tres fenotipos, y en pacientes con y sin actividad inflamatoria. Los pacientes con EII refieren síntomas sin existir malabsorción con mayor frecuencia. La prevalencia de sobrecrecimiento bacteriano en los pacientes con colitis ulcerosa es similar a la población sana, excepto en la pancolitis y cuando existe actividad, en la enfermedad de Crohn es superior para el grupo completo y para las localizaciones Tracto GI alto, íleon terminal e ileocolon, patrones estenosante y penetrante, en fase de remisión y en ausencia de válvula ileocecal. El tiempo de tránsito orocecal es similar a la población sana en los pacientes con enfermedad de Crohn, mientras que está enlentecido en los pacientes con colitis ulcerosa, en la localización izquierda extensa y tanto si hay como no actividad inflamatoria. / Introduction: There are specific foods or groups of foods that can be linked to the aggravation of inflammatory bowel disease (IBD). Foods commonly identified by IBD patients (Ulcerative colitis and Crohn's disease) as causing symptoms on reintroduction, rechallenge, and double-blind challenge, include milk, peanuts, citrus fruits, wheat, eggs, fish, etc. IBD is controversially discussed as an independent risk factor for lactose malabsorption. Some data show lactose intolerance in 40% to 70% of patients with Crohn's disease (CD), whereas a prevalence of lactose intolerance seems not to be increased in patients with ulcerative colitis (UC). Lactose maldigestion may be influenced by bacterial overgrowth and increased small bowel transit time. Hypothesis: Patients with IBD show lactose and/or fructose malabsorption frequently than healthy people. Patients and methods: 156 patients with IBD (86 with CD and 71 with UC) and 41 controls were included prospectively in the study. The diagnosis of IBD was based on findings of characteristic radiologic, endoscopic, and microscopic features. Disease activity was determined using the CDAI and the Truelove index for CD and UC, respectively. Blood was drawn to determine concentrations of inflammatory markers, hemoglobin and Celiac disease markers. Lactose, fructose and lactulose hydrogen breath test were carried out to all subjects. All individuals completed a symptom score where were asked about their subjective experience with diarrhea, bloating, flatulence and abdominal distension after ingestion of each sugar. Results and conclusions: The prevalence of lactose malabsorption in patients with IBD was similar to that of healthy group and was not influenced by location, inflammatory activity, Viena's phenotype or previous ileocolic resection. Lactose intolerance occurred more often among patients than among controls both during the test and in the next 24h. Fructose malabsorption was similar in UC patients and controls, but was increased in CD patients with respect to both groups. Patients show fructose intolerance 24h after the test more often than controls while patients and controls intolerance during the test was similar. The prevalence of bacterial overgrowth in patients with UC and controls was similar while was increased in CD patients. Orocecal transit time was slower in UC patients.

Con la finalidad de diseñar nuevas estrategias biotecnológicas relacionadas con la contaminación por cobre (Cu), los esfuerzos de esta Tesis se centraron en tres objetivos:1. Identificación de la respuesta molecular a diferentes niveles de Cu en el medio en Arabidopsis thaliana mediante análisis global de los cambios de expresión génica entre exceso y déficit de Cu. Determinamos que el medio estándar de crecimiento en placa ½ MS es deficitario en Cu para las plántulas (~ 4 g/g P.S.), mientras que el mismo medio suplementado con Cu 10 M provoca una elevada concentración endógena del metal próxima al exceso (~ 30 g/g P.S.). Las respuestas moleculares observadas mediante micromatrices a estos niveles de Cu en el medio se dividen en tres categorías:- Respuesta al estrés y alteración del metabolismo, incluyendo la respuesta al estrés hídrico y salino, la división celular y la modificación de DNA en exceso de Cu, así como la respuesta al estrés por patógenos, expansión celular y metabolismo del azufre en déficit del metal. El ritmo circadiano también se encuentra alterado por los niveles de Cu. En estas respuestas están implicados factores de regulación por déficit de Cu como las SPLs y los miRNAs.- Prioridad en el uso del Cu para proteínas esenciales, como la plastocianina, y sustitución de proteínas con función equivalente que utilizan otros metales en sus centros activos, como la Cu/ZnSOD y la FeSOD cloroplásticas. En este sentido, CSD2 y FSD1 son buenos indicadores de niveles elevados y deficitarios de Cu, respectivamente, dentro de la célula. - Regulación de los niveles intracelulares de Cu mediante alteración de los mecanismos de incorporación del metal en la célula, como los transportadores de Cu de alta afinidad COPT, y de destoxificación del metal, como la familia de ATPasas tipo P transportadoras de Cu.2. Caracterización de transportadores de Cu de familias génicas que responden a los diferentes niveles de Cu en Arabidopsis thaliana. - HMA5, ATPasa tipo P transportadora de Cu.HMA5 se expresa principalmente en raíces y su expresión se induce en plántula entera específicamente por Cu. Mutantes por pérdida de función hma5 son hipersensibles específicamente al Cu y acumulan más Cu en las raíces que las plantas silvestres en exceso de Cu. - COPT3, transportador de Cu de alta afinidad.COPT3 se expresa principalmente en flores y semillas. COPT3 se localiza intracelularmente, probablemente en algún compartimento de la ruta de secreción. La sobrexpresión de COPT3 en plantas transgénicas provoca retraso en el desarrollo de la planta, cotiledones en "forma caída" y estambres más cortos que los de plantas silvestres. Estas plantas sobrexpresoras muestran hipersensibilidad al Cu, acumulan más Cu en las semillas y, en exceso de Cu, acumulan más Cu que las plantas silvestres en plántula entera. 3. Obtención de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana con posibles aplicaciones biotecnológicas en procesos de fitorremediación, mediante el estudio del transportador de Cu de alta afinidad COPT1. La expresión de COPT1 en plántula entera se reprime específicamente por Cu. COPT1 se localiza en la membrana plasmática. La sobrexpresión de COPT1 en plantas transgénicas provoca reducción del tamaño global de la planta, cotiledones en "forma de remo", curvatura cóncava de las hojas, pétalos y estambres protegidos por los sépalos y escasa fertilidad. Estas plantas sobrexpresoras son hipersensibles específicamente al Cu y acumulan más Cu respecto a las plantas silvestres. La sobrexpresión simultánea de COPT1 y TcMT3 podría ser una estrategia candidata en procesos de fitorremediación de suelos contaminados por Cu. Estas plantas reúnen dos características fundamentales para este tipo de aplicaciones biotecnológicas: acumulación y tolerancia al Cu. / With the aim of designing new biotechnological strategies related to copper (Cu), the objectives of this Thesis were: 1. Identification of the Arabidopsis molecular responses to Cu status in the medium by microarray global analysis of gene expression. The internal Cu content in seedlings grown in the ½ MS medium is below the sufficiency levels, whereas the same medium supplemented with Cu 10 M provoke a high endogenous metal concentration close to excess. The responses observed are divided in three categories:- Metabolic changes and stress responses. Circadian rythm is also alterated. Transcription factors and miRNAs are implicated. - Prioritizing the use of Cu for essential proteins and substitution of counterpart proteins with different metals at their active sites. CSD2 and FSD1 expression is a good marker of Cu levels in Arabidopsis. - Regulation of intracellular Cu levels by modification of expression of metal homeostasis components, such as the COPT and HMA families of transporters. 2. Characterization of Cu transporters from gene families that respond to Cu in Arabidopsis. - HMA5, Cu transporting P-type ATPase.HMA5 is mainly expressed in roots and specifically induced by Cu. The hma5 knockout mutants are specifically Cu hypersensitive and accumulate Cu in roots under Cu excess. - COPT3, high affinity Cu transporter.COPT3 is mainly expressed in flowers and seeds. COPT3 is intracellulary located, probably at some secretory pathway compartment. COPT3 overexpression provokes a delay in plant development, phenotypically characteristic cotyledons and short stamens. These overexpressing plants are Cu hypersensitive, accumulate Cu in seeds and, under Cu excess, accumulate Cu in the whole seedling.3. Obtaining Arabidopsis transgenic plants with possible biotechnological applications, by overexpressing the high affinity Cu transporter COPT1.COPT1 expression is specifically repressed by Cu. COPT1 is located at the plasma membrane. COPT1 overexpression provokes biomass reduction, phenotypically characteristic cotyledons, concave leaves, petals and stamens protected by sepals and low fertility. These overexpressing plants are specifically Cu hypersensitive and accumulate Cu. Simultaneous overexpression of COPT1 and TcMT3 could be a candidate strategy for phytoremediation of Cu contaminated soils. These plants possess two fundamental characteristics for this biotechological application: Cu accumulation and tolerance.

El creixement polaritzat és un fenomen que ocorre pràcticament en totes les cèl.lules, des de procariots fins a organismes pluricel.lulars sent fonamental per a nombrosos processos cel.lulars incloent la proliferació, diferenciació i morfogènesi. En S. cerevisiae tots els aspectes del creixement polaritzat deriven del citoesquelet d´actina.Atès que el gen ROT1 és un gen essencial de Saccharomyces cerevisiae amb funció desconeguda que es va identificar en un rastreig genètic on es buscaven mutacions supressores de la letalitat de la soca mutant tor2ts . TOR2 està implicat en el control del creixement cel·lular i en l´organització del citoesquelet d´actina i com que ROT1 suprimeix a la mutació tor2, podria ser que ROT1 estiguera relacionat amb aquestes funcions.Els resultats obtesos indiquen que la inactivació de ROT1 origina un defecte en la progressió del cicle cel.lular amb l´acumulació de cèl.lules en les últimes etapes de divisió cel.lular i l´aparició de cèl.lules regemmades que no finalitzen correctament la divisió cel.lular per un defecte en la septació. Hem averiguat que Rot1 està implicat en el funcionament del citoesquelt d´actina. Encara que no és necessari per al procés de gemmació, Rot1 és essencial per al manteniment del creixement apical en la gemma i per a la repolarització del citoesquelet d´actina al coll entre la cèl.lula mare i filla al final de la mitosi. La supressió del mutant cdc42 per la sobreexpressió de ROT1 i la letalitat sintètica entre la mutació rot1 i mutacions en la ruta d´integritat cel.lular (ruta PKC) reforcen la connexió entre Rot1 i el citoesquelet d´actina. Les funcions del citoesquelet d´actina afectades en el mutant rot1 i el fet que la inactivació de ROT1 suprimeix el defecte d´hiperpolarització del mutant clb2 però no la hiperpolarització de cèl.lules que sobreexpressen CLN2, indica que Rot1 afecta exclusivament els processos del citosquelet d´actina regulats per Clb2 i no per Cln2. Les dades genètiques i fenotípiques obteses reflecten un antagonisme funcional entre Rot1 i Clb2 en el control del citoesquelt d´actina al llarg del cicle cel.lular. Les cèl.lules rot1 són hipersensibles a la sobreexpressió de Clb2 mentre que la seua letalitat se suprimeix per la deleció clb2. A més a més, les mutacions rot1 i clb2 originen efectes contraris en la funció del citoesquelt d´actina, de fet, aquests efectes es compensen en les cèl.lules doble mutant clb2 rot1. Rot1 controla específicament l´estabilitat de la ciclina Clb2, ja que en les cèl.lules mutants rot1 s'activa la ruta MEN i la fosfatasa Cdc14. De fet, la inactivació de ROT1 en cèl.lules que estan degradant activament Clb2 origina l´estabilització de la ciclina. Interaccions sintètiques de ROT1 amb gens implicats en el proteasoma, APC o SCF, i el fet que Rot1 participe en la degradació de Cln2 i substrats de les rutes de degradació de la regla de l´N-terminal i UFD suggereixen una funció més general de Rot1 en degradació de proteïnes.Hem obtés que Rot1 és una proteïna integral de membrana localitzada en la membrana del reticle endoplasmàtic/embolcall nuclear amb orientació luminal modificada per N-glicosilació en les Asn 103, 107 i 139. Analitzant possibles dominis funcionals en la proteïna hem demostrat que l´extrem C-terminal (aminoàcids 229-256) és necessari per a l´ancoratge de la proteïna a la membrana i a més té un paper essencial per a la seua funció. L´extrem N-terminal (aminoàcids 1-25) és essencial per la funcionalitat de Rot1 però no és necessari per a la translocació. La proteïna s´inserta en el reticle endoplasmàtic a través del translocó Sec61 per un mecanisme posttraducional independent de SRP i dependent del complex Sec62/Sec63. / ROT1 is an essential gene whose inactivation causes defects in cell cycle progression and morphogenesis. Rot1 affects actin cytoskeleton during the cell cycle at two levels. Firstly, it is required for the maintenance of apical growth during bud growth. Secondly, Rot1 is necessary to polarize actin cytoskeleton to the neck region at the end of mitosis; as a consequence of this defect, rot1 cells do not properly form a septum to complete cell division. The inability to polarize actin cytoskeleton at the end of mitosis is not due to a defect in the recruitment of the polarisome scaffold protein Spa2 or the actin cytoskeleton regulators Cdc42 and Cdc24 in the neck region. The previous results point to a connection between Rot1 and the Clb2 cyclin. In fact, an overexpression of CLB2 is toxic when ROT1 is partially inactivated and, reciprocally, a deletion of clb2 suppresses the lethality of the rot1 mutation, which indicates a functional antagonism between Clb2 and Rot1. Several genetic interactions suggest a link between Rot1 and the ubiquitin-proteasome system and in fact, we showed that the Clb2 cyclin is not properly degraded in rot1 mutant cells.Rot1 is primarily located at the endoplasmic reticulum-nuclear membrane facing the lumen. Rot1 migrates more slowly than expected which might suggest post-translational modification. Our results indicate that Rot1 is a protein that is neither GPI-anchored nor O-glycosylated. In contrast, it is N-glycosylated. By a directed mutagenesis of several Asn residues, we identified that the protein is simultaneously glycosylated at N103, N107 and N139. Sequence analysis predicts a transmembrane domain at the C-terminus. This fragment neither affects the targeting of the Rot1 protein to the ER nor its N-glycosylation, although it is important for the anchoring of the protein to the membrane and for its functionality. The existence of a signal sequence at the N-terminus has been suggested. However, deletion of this fragment neither impedes translocation to the ER nor N-glycosylation, but it is required for cell viability. Finally, we found that Rot1 is translocated to the ER by an SRP-independent post-translational mechanism which depends on Sec62.