Los genes MSN2 y MSN4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae fueron aislados como supresores en multicopia de mutaciones termosensibles en el gen de la proteína quinasa Snf1p, necesaria para la desrepresión de genes reprimidos por catabolito. Las proteínas Msn2p y Msn4p están funcionalmente relacionadas. Ambas contienen dos dedos de cinc del tipo Cys2-His2, que guardan una gran similitud con los encontrados en las proteínas de Respuesta Temprana al Crecimiento de mamíferos, la proteína del tumor de Wilms, y el represor de levadura Mig1p. Msn2p y Msn4p son capaces de actuar como activadores transcripcionales, pero cuando se inició este trabajo se desconocía su función fisiológica. Durante la caracterización fenotípica del doble mutante msn2 msn4 se observó que esta cepa era sensible a la ausencia de fuente de carbono. Al extender el estudio a otras condiciones de estrés severo, como el estrés térmico, el estrés osmótico o el estrés oxidativo, se observó en todos los casos una mayor sensibilidad de la cepa mutante respecto a la cepa silvestre. Por el contrario, la sobre-expresión de los genes MSN2 y MSN4 produce un aumento de la resistencia celular a las condiciones de estrés. En la cepa msn2 msn4 se encontraron defectos en la expresión de genes de respuesta a estrés, como HSP12, HSP26, CTT1 y DDR2. Estos genes tienen en común la presencia en sus promotores de varios Elementos de Respuesta General a Estrés (STRE). En Saccharomyces cerevisiae, el elemento STRE (consenso: CCCCT ó AGGGG) puede mediar la activación transcripcional en respuesta a múltiples estreses, entre ellos el choque térmico, el estrés osmótico, el estrés oxidativo, el pH ácido, la presencia de ácidos débiles, o el ayuno de fuente de carbono o nitrógeno. Al analizar la expresión regulada por STRE, mediante una fusión STRE-LEU2-lacZ, en el mutante msn2 msn4, se pudo comprobar que en ausencia de las proteínas Msn2p y Msn4p los niveles de expresión basal vía STRE están muy reducidos, y la activación transcripcional en diversas condiciones de estrés se encuentra prácticamente abolida. Por otra parte, la sobre-expresión de los genes MSN2 y MSN4 produce activación de la expresión dependiente de STRE incluso en condiciones de ausencia de estrés. Msn2p y Msn4p se requieren para una correcta regulación de la respuesta mediada a través de este elemento. Se demostró que estas proteínas se unen directamente al elemento STRE mediante la técnica de retardo en gel: las proteínas Msn2p y Msn4p, purificadas o presentes en extractos totales de proteína, se unen in vitro, de forma específica, a elementos STRE presentes en oligonucleótidos sintéticos. Además, mediante análisis de footprinting in vivo con DMS se demostró que existe unión in vivo de estas proteínas a los elementos STRE presentes en diversos promotores de Saccharomyces cerevisiae. Por ello proponemos que Msn2p y Msn4p son los Factores de Unión a STRE (STRF), que no habían sido identificados con anterioridad. En el segundo capítulo de este trabajo analizamos las causas de un hecho observado en la cepa silvestre W303-1A. La transferencia brusca de células silvestres en fase exponencial de crecimiento en glucosa a un medio con rafinosa produce una larga parada del crecimiento, durante el cual las células no son capaces de sintetizar suficiente cantidad de invertasa. Se demostró que durante las primeras horas de cambio de medio, aunque el gen que codifica la invertasa, SUC2, se desreprime normalmente, la privación brusca de glucosa produce en las células de levadura un bloqueo de la traducción, el cual impide que se exprese el enzima. En este proceso no parecen estar implicadas la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico ni la proteína quinasa Gcn2p. / The Saccharomyces cerevisiae genes MSN2 and MSN4 encode homologous and functionally redundant Cys2Hys2 zinc finger proteins. A disruption of both MSN2 and MSN4 genes results in a higher sensitivity of yeast cells to different stresses, including carbon source starvation, heat shock and severe osmotic and oxidative stresses. In this work we show that Msn2p and Msn4p are required for the activation of several yeast genes such as CTT1, HSP104, DDR2 and HSP12, whose induction is mediated through stress-response elements (STREs). Msn2p and Msn4p are important factors for the stress-induced activation of STRE dependent promoters and bind specifically to STRE-containing oligonucleotides. Moreover, by in vivo footprinting we demonstrate that Msn2p and Msn4p bind in vivo to the STREs present in several stress gene promoters. We propose that Msn2p and Msn4p are the previously unknown STRE binding factors, or STRFs.In the second chapter of this work we analyse the causes of an experimentally observed fact: expression of invertase in the yeast Saccharomyces cerevisiae is greatly delayed when derepression occurs in a medium that lacks a usable carbon source. The delay is not a consequence of defects in the transcription of the SUC2 gene but is due to the impossibility of translating the normal levels of mRNA generating under derepressing conditions. In the absence of glucose a complete inhibition of translation occurs, and this causes the lag time before the new carbon source can be used, even if the mRNAs of glucose-repressible genes are transcripted early.

Genetic alterations and deregulation of the epigenetic mechanisms collaborate in the initiation and progression of cancer. In contrast to the genetic defects, the epigenetic abnormalities are potentially reversible. This fact has driven the search for drugs that induce selectively changes in the epigenetic patterns of the tumor cells and thus lead to differentiation, cell death and/or cell growth arrest. Inhibitors of DNA (cytosine-5)-methyltransferases (DNMTs) and inhibitors of Zn(II)-dependent histone deacetylases (HDACs) have been developed with this purpose. The DNMTs inhibitors allow the reactivation of genes, including tumor-suppressor genes, silenced through hypermethylation of the CpG island at their promoter. The HDACs inhibitors allow the reexpression of genes silenced by ypoacetylation of the histones associated at their promoters. Despite all these chemicals have promising effects on cultured cancer cells, many of them have side-effects that limit their use in anticancer chemotherapy. Because of that, we analyzed the properties of the anesthetic procaine (4-aminobenzoic acid 2-diethylaminoethyl ester) as a new inducer of DNA demethylation and we also compared the effects of seven HDACs inhibitors. In both cases, the breast cancer cell line MCF7 was the model system.1. Procaine reduces the proportion of 5-methylcytosine into global genomic DNA, achieving its maximum effect within 24-48 h of treatment. Low concentrations of procaine decrease the amount of 5- methylcytosine at RAR¦Â2 promoter, which is hypermethylated in MCF7 cells, and reactivate its expression with only small decrease in global DNA methylation. This fact could be an advantage, since global DNA hypomethylation leads to chromosomal instability. Finally, procaine reduces cell proliferation and arrests cell cycle in mitosis, but does not induce apoptosis in MCF7 cells after treatments 3 days long.2. The seven inhibitors of Zn(II)-dependent HDACs chosen for comparison were: two carboxylic acids (butanoic and valproic acid); one N-(2¡¯-aminophenyl) benzamide (MS-275); and four hydroxamic acids(trichostatin A, suberoylanilide hydroxamic acid, CX and CY). The results of in vitro HDAC activity assays performed on MCF7 nuclear extracts show the existence of a relationship between the chemical structure of these compounds and their activity: low micromolar concentrations of hydroxamic acids are sufficient for inhibiting almost completely the deacetylase activity, whereas millimolar concentrations of carboxylic acids are required for similar effects. Also the alterations that the drugs cause on cell growth and cell cycle arrest depend on its chemical structure. The IC50 for cell treatments 24 h long is in the range of millimolar concentrations for butanoic and valproic acids and low micromolar for the rest of the chemicals. At the IC50, MS-275 induces cell growth arrest in G1/G0, whereas the hydroxamic acids stop cell cycle mostly at G2/M and the carboxylic acids seems to arrest the cycle at both G1/G0 and G2/M. Despite all these inhibitors induce similar changes in the global acetylation of H4 and H3 when employed at their respective IC50, not all of them are able of reactivate the expression of the same genes. Moreover, it seems that the induced expression levels of CDKN1A and GADD45¦Â determine the alterations induced by the drugs on cell cycle. The changes on histone modifications at the promoters of six genes ( CDKN1A, GADD45¦Â, JunD, IGFBP3, MT1X and MT2A) upon CY treatment were studied. HDACs inhibition induces an increase in histone H4 tetraacetylation and in dimethylation of lysine 4 in H3, as well as a decrease in dimethylation of lysine 9 in H3. Additionally, HDAC2 is released from the promoters upon CY treatment. These changes take place also in the promoters of MT1X and MT2A, the genes whose expression remains unaltered after the treatment with CY. / Las alteraciones genéticas y la desregulación de los mecanismos epigenéticos colaboran en la iniciación y progresión del cáncer. Los defectos epigenéticos son potencialmente reversibles, lo que ha suscitado la búsqueda de fármacos que selectivamente causen cambios en los patrones epigenéticos de las células tumorales, con la consiguiente diferenciación, muerte y/o parada de crecimiento de las mismas. Se han estudiado especialmente inhibidores de metiltransferasas de DNA (DNMTs) e inhibidores de desacetilasas de histonas (HDACs) dependientes de Zn(II). Los inhibidores de DNMTs posibilitan la reactivación de genes silenciados mediante hipermetilación de la isla CpG de su promotor y los inhibidores de HDACs, de genes silenciados vía hipoacetilación de las histonas asociadas a su promotor. A pesar de sus prometedores efectos en cultivos celulares, muchas de estas sustancias presentan inconvenientes que limitan su aplicación en quimioterapia. Por ello, en esta tesis:1. Se ha estudiado por primera vez la capacidad del anestésico procaína para reducir la metilación de DNA genómico y la proliferación de la línea celular MCF7. Procaína reduce la cantidad de 5-metilcitosina en DNA, reactiva genes silenciados por hipermetilación ( RAR¦Â2) e induce parada del ciclo celular en mitosis.2. Se han comparado siete inhibidores de HDACs dependientes de Zn(II): ácido butanoico, ácido valproico, MS-275, tricostatina A (TSA), SAHA, CX y CY. Existe una relación estructura-actividad para los efectos de estas sustancias en ensayos in vitro y en el crecimiento de MCF7. Además, aunque estos inhibidores inducen cambios similares en acetilación global de histonas, no todos reactivan los mismos genes. Los niveles expresión de CDKN1A y GADD45¦Â parecen determinar los efectos de estos compuestos en el ciclo celular. En los promotores de los seis genes estudiados, la inhibición de HDACs aumenta la acetilación de H4 y la dimetilación de la lisina 4 de H3, mientras disminuye la dimetilación de lisina 9 de H3.

Las poliaminas constituyen un grupo de moléculas de bajo peso molecular implicadas en una gran cantidad de procesos esenciales para las plantas. En su síntesis participa la S- Adenosil-L-metionina decarboxilasa1 (SAMDC1) que hemos sobreexpresado de forma constitutiva en Arabidopsis en este trabajo. Se ha profundizado en el estudio de los efectos de la sobreexpresión constitutiva del gen SAMDC1 en plantas de Arabidopsis. Se han seleccionado tres líneas sobreexpresoras, S3´, S9´y S15, que presentaban unos niveles de mRNA del orden de 3 veces superiores a las plantas control no transformadas. El análisis de los efectos de la sobreexpresión de SAMDC1 revela una serie de cambios en la germinación y desarrollo de las plantas transgénicas, alteraciones en el tejido vascular de tallos y hojas, así como alteraciones en los niveles de expresión de una gran cantidad de genes. En las plantas sobreexpresoras se encuentran inducidos genes participantes en la síntesis de poliaminas, en la respuesta al estrés abiótico y en la respuesta al estrés biótico. Asímismo, las plantas transgénicas presentan un mayor contenido en ácido Abscísico. Por el contrario, estas plantas presentan una menor producción de etileno y de su precursor ACC. Estos cambios van acompañados de una tolerancia por parte de las plantas sobreexpresoras de SAMDC1 al estrés abiótico causado por la salinidad, el déficit hídrico y el ozono. De forma similar, las plantas transgénicas presentan una tolerancia al estrés biótico causado por la infección por bacterias y hongos. Un análisis en profundidad revela la implicación de la espermina, una de las tres poliaminas más importantes, en los cambios observados. Así, en este trabajo se ha comprobado que el crecimiento de plantas Col0 en presencia de espermina provoca un descenso en los niveles de etileno y ACC similar a la presente en las plantas transgénicas. Asimismo se ha observado que el crecimiento en presencia de altas concentraciones de ACC provoca en Col0 un aumento en los niveles de etileno, pero no ocurre lo mismo en las plantas transgénicas. Se ha comprobado también que el crecimiento de Col0 en presencia de espermina provoca también un aumento en los niveles de ABA. De igual forma la aplicación de espermina provoca una inducción de la expresión de los genes de síntesis de ácido jasmónico, de señalización de etileno y de respuesta al estrés abiótico y biótico similares a los presentes en las líneas transgénicas. El crecimiento de las plantas transgénicas en presencia de MGBG, inhibidor de la SAMDC, da lugar a unos niveles de etileno, ACC, ABA y de los genes estudiados similares a los presentes en plantas Col0 no tratadas. Esto establece una relación entre esta poliamina, los niveles de ABA y etileno y las respuestas al estrés abiótico y biótico. La responsabilidad de la Spm en los cambios observados en las plantas sobreexpresoras de SAMDC1 se reveló al compararlas con plantas sobreexpresoras de ADC2, que acumulan putrescina. Mientras que en las plantas sobreexpresoras de ADC2 no se observan cambios importantes en otros genes de la síntesis de PAs, la sobreexpresión de SAMDC1 provoca un aumento en los niveles de SPMS y SPDS1. Otra diferencia se encuentra en el efecto de la sobreexpresión de SAMDC1 o ADC2 sobre los niveles de expresión de enzimas relacionados con la síntesis de ABA y ácido jasmónico, defensa frente a estrés abiótico o biótico o señalización por etileno. Así como la sobreexpresión de SAMDC1 da lugar a un claro aumento en la expresión de muchos enzimas relacionados con estos procesos, la sobreexpresión de ADC2 no provoca tales efectos. En consecuencia las plantas sobreexpresoras de ADC2 no presentan una mayor resistencia al estrés salino que las plantas silvestres. / Polyamines are a group of low molecular weight molecules implicated in a lot of different and essential proceses in plants like the promotion of plant growth and development by activating the synthesis of nucleic acids. Polyamine metabolism has long been known to be altered in plants responding to abiotic environmental stress and to undergo profound changes in plants interacting with fungal and viral pathogens. The most important polyamines are spermidine, spermine and putrescine. These small compounds are positively charged at physiological pH and are known to bind to negatively charged molecules, e.g. nucleic acids, acidic phospholipids and various types of proteins. The biosynthesis of polyamines in Arabidopsis thanliana is a well-known process in which S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) contitutes an important metabolic control point. This enzyme catalizes de decarboxylation of S-adenosylmethionine which is also an intermediate product in the synthesis of ethylene. Changes in SAMdC expression have been observed as a response to environmental factors. In this work we have studied the effects of the constitutive overexpression of SAMDC1 under the control of the CAMV-35S promoter in Arabidopsis thaliana plants. Results show that the transgenic lines show a direct increase in levels of spermine. Furthermore, these SAMDC1 overexpressing plant show an induction in the expression levels of a series of genes related to response during salt or drought stress and pathogen infection. There are as well, changes in the expression levels of genes involved in Abcisic acid (ABA) and jasmonic acid biosynthesis. These changes result in a higher tolerance against abiotic and biotic stresses, increased production of ABA, lower levels of ethylene biosynthesis and a series of estructural differences with Col 0 wildtype plants. Further studies in this work have established a direct relationship between the higher levels of espermine and the changes observed in the transgenic plants.

En las células eucariotas el DNA se encuentra asociado a diferentes tipos de proteínas,empaquetándose en una estructura organizada, denominada cromatina. La unidad básica de lacromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pb de DNA ensamblados alrededor de unoctámero de histonas, formado por dos copias de cada una de las histonas, H2A, H2B, H3 y H4.Cada histona contiene dos motivos funcionales, el motivo histone fold que participa eninteracciones histona-histona y también en interacciones histona-DNA, y las colas de losextremos NH2-terminal, que son susceptibles de sufrir modificaciones postraduccionales, talescomo acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación y sumoilación. Estas colas tambiénparticipan en la interacción con nucleosomas adyacentes. Además de las histonas internas, lacromatina de eucariotas también contiene la histona H1, que se dispone en el exterior delnucleosoma, y otras proteínas no histona como las HMGs (High Mobility Group). La acetilaciónde histonas es una de las modificaciones postraduccionales que más se ha estudiado. Estamodificación es realizada por complejos histona acetiltransferasa (HATs), y es revertida porcomplejos histona desacetilasa (HDs). En base a la localización subcelular, la preferencia dehistona y la habilidad de modificar histonas nucleosomales, los complejos HAT nativos se hanclasificado en dos grupos. Los enzimas HAT tipo A son enzimas nucleares capaces de acetilarhistonas ensambladas en cromatina, y que frecuentemente se asocian con procesos deregulación de la transcripción. Los enzimas HAT tipo B tienen una localización principalmentecitoplasmática y únicamente acetilan histonas libres, presumiblemente antes de su deposiciónen el DNA para formar nucleosomas. En levadura se describió la presencia de una HAT tipo B,[Ruiz-García et al., 1998], que se aisló en la fracción citoplásmica y que tenía una masamolecular de 200 kDa. Este enzima acetila específicamente la histona H4 libres, pero esincapaz de acetilar nucleosomas, y está formado, al menos, por la subunidad catalítica Hat1p ypor Hat2p [Lopez-Rodas et al., 1991, Kleff et al., 1995 y Parthun et al., 1996]. En este trabajo seha identificado bioquímicamente la proteína Hif1 (43.3 kDa, 385 aminoácidos), como unasubunidad del enzima B, no identificada hasta el momento. Además se han realizado estudiosde localización subcelular, mostrando que las proteínas del complejo HAT-B se encuentranmayoritariamente en el núcleo. Asimismo, encontramos una dependencia de la localizaciónsubcelular de Hat1p con la presencia de Hat2p. En este trabajo mostramos que el complejoHAT-B acetila una fracción soluble de H4, no ensamblada en cromatina, en las lisinas 12 y 5.Cuando esta fracción soluble de H4 se acumula por alguna causa, es degradada por una rutadependiente de la proteína Rad53, una proteína quinasa de checkpoint. La acetilación de lahistona H4 es dependiente de las proteínas Hat1 y Hat2, pero no de la subunidad Hif1p, que noparece estar implicada en la función de acetilación. Además, tanto la proteína Hat1 como Hat2son necesarias para la unión del sustrato, H4, pero Hif1p no participa en esta unión. / Hat1 is the catalytic subunit of the only type B histone acetyltransferase known (HAT-B). Theenzyme specifically acetylates lysine 12, and to a lesser extent lysine 5, of free, non-chromatinboundhistone H4. The complex is usually isolated with cytosolic fractions and is thought to beinvolved in chromatin assembly. The Saccharomyces cerevisiae HAT-B complex also containsHat2, a protein stimulating Hat1 catalytic activity. At these work we identified by two-hybridexperiments Hif1 as both a Hat1- and a histone H4-interacting protein. These interactions weredependent on HAT2, indicating a mediating role for Hat2. Biochemical fractionation and coimmunoprecipitationassays demonstrated that Hif1 is a component of a yeast heterotrimericHAT-B complex, in which Hat2 bridges Hat1 and Hif1 proteins. In contrast to Hat2, this novelsubunit does not appear to regulate Hat1 enzymatic activity. Nevertheless, similarly to Hat1,Hif1 influences telomeric silencing. In a localization analysis by immunofluorescencemicroscopy on yeast strains expressing tagged versions of Hat1, Hat2, and Hif1, we have foundthat all three HAT-B proteins are mainly localized in the nucleus, and the nuclear Hat1plocalization is dependent on Hat2 protein. Thus, we propose that the distinction between A- andB-type enzymes should henceforth be based on their capacity to acetylate histones bound tonucleosomes and not on their location within the cell. At these work we demonstrate HAT-Bcomplex acetylates a soluble histone H4 fraction, not assembled in chromatin, at lysines 5 and12. When the soluble histone fraction is acumulated in the cell, it is degradated by a pathwayregulated by Rad53p.Histone H4 acetylation is dependent on Hat1 and Hat2 proteins, but noton Hif1p. These subunit not seems be related with histone acetylation function. Indeed, both,Hat1p and Hat2p, are necessaries for the histone H4 binding, but not Hif1p.

La ruta de la Proteína quinasa C en Saccharomyces cerevisiae desempeña funciones esenciales en el control de la integridad celular y además se ha sugerido que participa en la coordinación entre el crecimiento y la división celular. En este trabajo se ha estudiado el mecanismo molecular de regulación de la expresión génica mediada por la ruta PKC, tomando como modelo en gen FKS1 que codifica para la subunidad catalítica de la glucano sintasa. Se ha caracterizado que la secuencia mínima responsable de la regulación mediada por la ruta PKC en el gen FKS1 corresponde con una secuencia de unión del factor Rlm1. Además se ha detectado unión in vivo de Rlm1 al promotor del gen FKS1 y que dicha capacidad de unión no está regulada por la ruta PKC. Por otro lado, se ha detectado que la MAP quinasa Slt2 de la ruta PKC se une al DNA en la zona cercana al ATG del gen FKS1. Se detectó que la RNA polimerasa II se une tanto a la zona del ATG como al final del gen FKS1 con independencia de la función de la ruta PKC. Por otro lado, se ha observado una modificación post-traduccional de la proteína Paf1 (miembro del complejo Paf1C) dependiente de Slt2, consistente con una posible fosforilación de Paf1 por Slt2. Se observó que aunque la ruta no regula la capacidad de unión in vivo al gen FKS1 de Paf1 en la zona del ATG si parece controlar el desplazamiento de Paf1 a lo largo del gen FKS1. En esta tesis se ha realizado un estudio de expresión global de un mutante pkc1-8 termosensible, dicho estudio ha permitido identificar 65 genes cuya expresión se modifica significativamente al inactivar la función Pkc1. En este mismo sentido se han identificado proteínas asociadas a Pkc1 y Slt2 mediante la utilización del método TAP de purificación de proteínas. A destacar las proteínas Rpc34, Ssk22 y Apd1 que se detectaron asociadas a Pkc1. Y las proteínas Mot1, Sec31 y Kap123 asociadas a Slt2. Los estudios realizados han descubierto una relación de la carioferina Kap123 con la ruta PKC. Kap123 podría participar en la ruta PKC importando al núcleo a alguna de las proteínas downstream de la ruta PKC. Se ha detectado también una relación génica entre la ruta PKC y la ciclina Cln2, en la que la deleción del gen CLN2 suprime los defectos de crecimiento de los mutantes de la ruta PKC, posiblemente debido al retraso en el proceso de gemación que supone la inactivación de la ciclina Cln2. / In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the PKC pathway main function is maintaining the cell integrity, moreover it has been said that partipates in coordination between division and cell growth. In this work, we have studied the molecular mecanism that controls gene expression by the PKC pathway using the FKS1 gene (glucan sintase gene) as a model. We have identified that the minimun sequence in FKS1 responsible of the regulation of transcription mediated by PKC pathway corresponds with a Rlm1 binding sequence. Rlm1 binds in vivo to the FKS1 promoter and this binding is not dependent on PKC pathway. In other hand, it has been detected that MAPK Slt2 is bind to the FKS1 promoter near to the ATG. We have also detected the RNA pol II subunit Rpb1 binds to the FKS1 promoter near to the ATG and in the end of the coding region independently of the PKC function. We have also observed a Slt2 dependent post translationally modification (consistent with a phosphorilation) of Paf1. Moreover, the PKC pathway seems to regulate the Paf1 movement right across the gene FKS1. A global expression study using DNA arrays in a pkc1 mutant allow us to identified 65 genes whose expression is modified by inactivating PKC function. In the same way, we have identified by TAP purification several proteins associated with Pkc1 and Slt2. It´s worth mentioning, Rpc34, Ssk22 and Apd1interacting with Pkc1. And Mot1, Sec31 and Kap123 interacting with Slt2. We have uncover a relationship between karyopherin Kap123 and the PKC pathway. We propose that Kap123 could participate in PKC pathway importing into the nucleus some of the proteins dowstream of Slt2. In other way, we have detect a genetic interaction between PKC pathway and cyclin Cln2, where deletion of CLN2 gene supress the growth defects associated to PKC pathway mutants, probably because of a delay in the budding process caused by inactivating Cln2.

El aroma es una de las propiedades organolépticas más valorada para determinar lacalidad de un vino. Se caracteriza porque está determinado por cientos de compuestosvolátiles de diversa naturaleza química que se encuentra a concentraciones muy bajas .En términos enológicos el perfil aromático de un vino se clasifica en tres categoríasdenominadas, aroma primario, secundario y terciario. El aroma primario se componede sustancias que proceden directamente de la variedad de uva utilizada y de loscompuestos que se generan en el transcurso de la manipulación y acondicionamientodel mosto. El aroma secundario, es el que se atribuye a los compuestos generadosdurante el proceso de fermentación por el metabolismo de las levaduras vínicas. Elaroma terciario, está constituido por sustancias que se sintetizan como consecuencia delas reacciones enzimáticas y/o físico-químicas en el proceso de envejecimiento delvino. Pese a esta clasificación, el aroma genérico de fondo, se atribuyemayoritariamente, a compuestos aromáticos volátiles sintetizados por la levaduravínica S. cerevisiae a lo largo de la fermentación alcohólica. Los metabolitos secundariosmás relevantes en el aroma genérico de fondo son los ésteres volátiles con fraganciasaromáticas y sus correspondientes precursores alcohólicos cuya producción dependedel balance de actividades alcohol acetiltransferasa y éster hidrolasa. Las alcoholacetiltransferasas, codificadas por los genes ATF1 y ATF2, catalizan la síntesis deésteres volátiles a partir de un alcohol superior y acetil-CoA. La esterasa, codificadapor el gen IAH1, hidroliza los ésteres de acetato rindiendo acetato y el alcoholconstituyente.Dada la importancia que el metabolismo de la levadura S. cerevisiae ejerce en laproducción de compuestos volátiles responsables del aroma de fermentación,fundamentalmente ésteres de acetato y alcoholes, en este trabajo se han desarrolladodistintos tipos de estrategias moleculares basadas en técnicas de ingeniería metabólica.Todas ellas encaminadas a incrementar el aroma secundario originado por la levaduravínica en forma de ésteres de acetato y alcoholes superiores.En primer lugar se realizó un estudio de la implicación de las distintas actividades desíntesis y de degradación que contribuyen en la producción de volátiles. Dicho estudiose centró en el análisis cuantitativo de la acumulación de ésteres y alcoholes endistintos tipos de cepas mutantes que carecen de los genes ATF1, ATF2 e IAH1. Losdatos obtenidos muestran que la enzima codificada por el gen ATF1 participa de formamayoritaria y por este orden en la síntesis de acetato de isoamilo, acetato de isobutilo,acetato de 2-feniletilo. Además, indican que la proteína Atf2 también interviene en elproceso de síntesis, aunque su participación es cuantitativamente menor. Finalmente seconcluye que la proteína Iah1 interviene en la degradación de estos mismoscompuestos.Posteriormente, las estrategias de ingeniería metabólica desarrolladas fueron lassiguientes:1.- Sobreproducción de ésteres de acetato por sobreexpresión del gen ATF1bajo el control del promotor del gen glicolítico TDH3. Con esta estrategiade consiguió incrementar, del orden de 50 veces, la concentración de ésteresvolátiles en condiciones de vinificación.2.- Sobreproducción de volátiles por deleción de la éster hidrolasa Iah1. Eneste caso se consiguió duplicar la acumulación de dichos compuestos.3.-Sobreexpresión del gen que codifica la a-cetoisocaproato descarboxilasaimplicada en la conversión del a-cetoisocaproato en alcohol isoamílico. Conesta estrategia no se consiguió incrementar la cantidad del precursoralcohólico y/o éster de acetato acumulado.En conclusión, la estrategia más adecuada para incrementar y/o mejorar el aromasecundario en el vino es obtener una levadura vínica industrial genéticamentemodificada que contenga una expresión fuerte y constitutiva del gen ATF1. / Flavour is a wine's most important distinguishing characteristic that stem from acomplex, completely non-linear system of interactions among many hundreds ofcompounds. Wine flavour is classified according to the sources of the differentcompounds contributing to it. This include varietal flavour, flavour compoundsoriginating from the grapes, fermentative flavour, produced by yeast during alcoholicfermentation and post-fermentative flavour, compounds that appear during the ageingprocess through enzymatic or physicochemical actions. It is well known that duringfermentation processes, yeast cells produce a broad range of aroma-active substances,which greatly affect the complex flavour of wine. While these secondary metabolitesare often formed only in trace amounts, their concentrations determine the flavourprofile of these beverages. In the main secondary metabolites synthesised for S.cerevisiae are the volatile esters. Their are the product of an enzyme-catalyzedcondensation reaction between acetyl-CoA and a higher alcohol. Several differentenzymes are involved in formation of esters, which are encoded by genes ATF1 andATF2. Furthermore, they can be hydrolyzed by esterase like IAH1 gene product.Therefore, a balance of these two enzyme activities controls accumulation of volatileesters.The aims of this study are to develop several molecular strategies to construct wineyeast strain that improve accumulation of acetate esters through genetic engineering.The strategies develops were:1.- Construct disruptant strain that were lose ATF1, ATF2 and IAH1 gene,to resolve implication of gene product in volatile production.2.-Ester overproduction by regulated over expression of ATF1 genecontrolled TDH3 promoter gene and disruption IAH1 gene3.- Alcohols over production by over expression of THI3 gene.In conclusion, this study has demonstrated that in the main strategy for improvefermentative flavour in wine is construct a genetically modified wine yeast which haveheave and constitutive over expression of ATF1 gene

En la cromatina de los organismos eucariotas el DNA se organiza alrededor de octámeros de histonas, dando lugar a la estructura nucleosomal. Las histonas sufren una serie de modificaciones postraduccionales entre las que se encuentra la acetilación de residuos de lisina, situados en los extremos N-terminales de estas proteínas. Esta modificación reversible, catalizada in vivo por las histona desacetilasas (HD) y las histona acetiltransferasas (HAT), ha sido implicada durante muchos años en la regulación de diversos procesos celulares de gran importancia. Recientemente, el papel de la acetilación de histonas en la regulación de la transcripción ha cobrado gran importancia con el descubrimiento de que proteínas con actividad HAT y HD son reguladores transcripcionales. En la levadura Saccharomyces cerevisiae se han identificado los genes que codifican para cuatro proteínas con actividad HAT, GCN5, HAT1, ESA1 y TAF130. Mediante métodos bioquímicos se había detectado previamente la existencia de al menos cuatro actividades histona acetiltransferasa diferentes, HAT A1, HAT A2, HAT A3 y HAT B. El análisis bioquímico de cepas de levadura mutantes en estos genes, y en otros genes que codifican proteínas relacionadas funcionalmente con estas HATs clonadas, realizado en este trabajo, ha permitido caracterizar estos enzimas previamente descritos en cuanto a su composición en proteínas, su localización subcelular y su especificidad de sustrato. Además el estudio bioquímico de cepas de levadura mutantes ha llevado a la identificación de una nueva actividad histona acetiltransferasa no descrita hasta el momento, el enzima denominado HAT A4. / In eukaryotes DNA is packaged with histones into chromatin. One of the most important posttranslational modifications of the N-terminal tails of histones is the reversible acetylation of lysine residues. Acetylation has been correlated with the regulation of many important cellular processes such us chromatin assembly, DNA replication and gene transcription. Histone acetylation is maintained in vivo by two different enzymatic activities, namely histone acetyltransferases (HAT) and histone deacetylases (HD). The relationship between chromatin acetylation and gene transcription has become very clear since several proteins known to be transcriptional regulators have been reported to posses HAT or HD activity.In the yeast Saccharomyces cerevisiae four proteins with HAT activity have been reported, the products of the genes HAT1, GCN5, ESA1 and TAF130.By biochemical methods it had been previously reported the presence in yeast of at least four HAT activities, HAT A1, HAT A2, HAT A3 and HAT B. In this work, the biochemical analyses of the HAT activity present in yeast strains bearing mutations on HAT genes, or genes coding for proteins related to HATs, have allowed the characterization of these enzymatic activities previously described in terms of protein composition, subcellular location and substrate specificity. The biochemical study of yeast mutants has also lead to the identification of a new yeast HAT activity, HAT A4 enzyme.

La Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la fijación fotosintética del CO2 a través del ciclo de Calvin. La estructura del holoenzima activo en organismos eucariotas es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa). En condiciones de senescencia natural o inducida por estrés la Rubisco sufre una degradación rápida y selectiva. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estrés en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Los residuos de cisteínas filogenéticamente conservados de la Rubisco son candidatos potenciales a mediar esta regulación redox. Con estos antecedentes, el objetivo general del presente trabajo ha sido evaluar la implicación de los residuos Cys172 y Cys192 (altamente conservados en eucariotas y cianobacterias) en la actividad, modulación redox, y en la organización estructural del holoenzima. Para ello se han abordado los siguientes aspectos:I. Obtención y caracterización de las Rubiscos mutantes C172S, C192S y C172S/C192S Las funciones de los residuos Cys172 y Cys192 se han investigado estudiando el fenotipo de mutantes en los que dichos residuos se han sustituido por serina mediante mutagénesis dirigida del gen rbcL en el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El enzima C172S posee un factor de especificidad mayor que el silvestre, con unas constantes aparentes de Michaelis para el CO2 y O2 aumentadas. La Rubisco C192S presenta una especial sensibilidad a la inactivación por agentes modificadores de grupos sulfhidrilo. Ello parece responder al carácter crítico de la modificación de la Cys172 en la actividad enzimática y al efecto protector que sobre este residuo ejerce la Cys192. El estudio del ensayo de la sensibilidad térmica, de los cambios en la sensibilidad proteolítica y de la movilidad del holoenzima en geles nativos indica que la sustitución de las Cys172 y/o Cys192 afecta a la estructura de los enzimas. II. Determinación de la estructura de las Rubiscos C172S y C192S por difracción de rayos X Se ha determinado la estructura tridimensional de la Rubisco de los mutantes C172S y C192S. Como diferencia más significativa se ha detectado un desplazamiento de la hebra β1 del barril α/β en el enzima C172S en relación a la estructura del enzima silvestre. III. Estudio de la respuesta de los mutantes a diferentes tipos de estrés El mutante C172S sometido a estrés salino degrada la Rubisco de forma más lenta que la cepa silvestre o los demás mutantes. Además, bajo un estrés por diamida específicamente dirigido a la oxidación de los grupos sulfhidrilo, el mutante C172S se muestra resistente a la inactivación que sufren las demás cepas. Ello apunta a un papel singular del residuo Cys172 en la modulación del catabolismo de la Rubisco en respuesta a situaciones de estrés. En condiciones de estrés por diamida, todas las cepas mutantes (C172S, C192S y C172S/C192S) presentan una degradación retardada de la Rubisco por comparación con la cepa silvestre. Ello sugiere que, en estas condiciones de oxidación directa de los tioles celulares, la formación de un puente disulfuro entre la Cys172 y la Cys192 podría actuar como una señal condicionante de la degradación del enzima. / Cysteines 172 and 192 from the large subunit of the photosynthetic enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) are a pair of vicinal residues evolutively conserved among cyanobacteria, algae and higher plants. In the present study, it has been analyzed the effect of the substitution of Cys172 and Cys192 by serine on the catalytic properties, thermostability, three-dimensional structure of the mutant enzymes, and the in vivo turnover and inactivation of Rubisco enzymes in stressed cells.1. Site-directed mutagenesis of conserved cysteine residues (Cys172 and Cys192) of Rubisco in Chlamydomonas reinhardtii and Rubisco mutants characterization.The most remarkable effect of the C172S mutant was a 15% increase in the value of the specificity factor compared to the wild-type enzyme, while the specificity factor of C192S Rubisco was identical to wild-type.The C192S enzyme was more sensitive to inactivation through oxidation of cysteines than the wild type and the rest of the enzymes. The results suggest that the Cys192 protects the critical modification of the Cys172. The results of thermal stability, proteolytic susceptibility assays and holoenzyme mobility in native electrophoresis show that the substitution of Cys172 and/or Cys192 affect to the enzyme structure. 2. Crystallization and Structure determination of C172S and C192S Rubisco mutants.X-ray structures of the mutant enzymes reveal that the substitution at position 172 causes a significant shift of the main chain backbone atoms of β-strand1 of the α/β-barrel.3. In Vivo turnover and inactivation of the C172S, C192S, C172S/C192S and wild-type Rubisco Enzymes in stressed Cells.The absence of Cys172 protects Rubisco from degradation under saline stress conditions. The C172S mutant enzyme is more resistant to inactivation under oxidative (diamide induced) stress.In a oxidative conditions (diamide stress) Cys172-Cys192 disulfide bond formation could act as a redox signaling pathway.

La propagación de una infección viral en plantas está mediada por unasproteínas codificadas por el propio virus denominadas proteínas de movimiento(MP). Estas proteínas unen el genoma viral de forma cooperativa y sinespecificidad de secuencia, formando unos complejos RNA-MP, que se asocian,en la mayoría de casos, al retículo endoplasmático (RE) para ser transportadosmuy posiblemente a través del citoesqueleto hacia los plasmodesmos, canalesmembranosos que interconectan las células en plantas. Una vez estos complejosalcanzan los plasmodesmos, el RNA viral es translocado a las célulasadyacentes a través de un mecanismo todavía desconocido.A pesar de la variabilidad entre las distintas familias virales en elnúmero y tamaño de este tipo de proteínas, se ha descrito que muchas de estasMPs interaccionan con las membranas celulares. Sin embargo, la naturaleza deesta interacción y los mecanismos que subyacen a este fenómeno no se hanexplorado todavía. Así pues, el objetivo central de la presente tesis se ha basadoen el estudio y caracterización de la asociación de estas proteínas con lamembrana del RE. El virus objeto de estudio ha sido el Virus del Moteado delClavel, que codifica dos MPs, p7, una proteína soluble capaz de unir el genomaviral y p9, que presenta dos regiones hidrofóbicas susceptibles de interaccionarcon las membranas celulares.En primer lugar, mediante experimentos de transcripción/traducción invitro se ha demostrado que p9 es una proteína integral de membrana quecontiene dos fragmentos transmembrana y adopta una orientación N-/Cterminalcitoplasmática.En segundo lugar, se ha caracterizado el mecanismo a través del cual p9alcanza las membranas celulares. Los resultados obtenidos demuestran que lainserción de p9 tiene lugar de forma co-traduccional y es dependiente de SRP,un complejo ribonucleoproteico que, en general, participa en eldireccionamiento de proteínas a la membrana del RE. Además, el virus explotala propia maquinaria celular responsable de la integración de las proteínas demembrana celulares. Así, el complejo Sec61 y la proteína TRAM participan en elproceso de inserción de p9. Entre los resultados obtenidos cabe destacar que (i)los segmentos transmembrana de este virus se integran en la membrana através de un mecanismo secuencial y ordenado desde Sec61a a TRAM; y (ii) laproteína TRAM media la integración de esta proteína viral desempeñando unaposible función de reclutamiento de segmentos transmembrana antes de queéstos particionen conjuntamente a la bicapa lipídica, una vez completada latraducción de la proteína.Finalmente, se ha realizado un estudio de los determinantes topológicosde la proteína que determinan su orientación en la membrana. Se ha exploradola contribución de toda una serie de parámetros, que se han establecido comodeterminantes en el caso de proteínas de membrana de procariotas o eucariotas.Entre estos factores se encuentran la presencia de residuos cargados en lasecuencia de la proteína, la hidrofobicidad de los fragmentos transmembrana, lalongitud de dominios extramembranosos y/o la presencia de residuosaromáticos en las regiones flanqueantes de los propios segmentostransmembrana. Los resultados demuestran que la proteína viral p9 presenta lainformación topológica distribuida a lo largo de la secuencia de aminoácidos dela proteína. Esta estrategia impediría que la posible aparición de una mutaciónno conservativa en el gen de la proteína, proceso muy habitual durante lareplicación de los genomas virales, alterara la orientación de la proteína en lamembrana y en definitiva, comprometiese su función biológica. / The cell-to-cell movement of plant virus is assisted by the viral so-called"movement proteins" (MP). Functions assigned to these proteins include nucleicacid binding, targeting to the endoplasmic reticulum (ER), and modification of the sizeexclusion limit of the plasmodesmata, a membranous channel that connectadjacent cells. Although the number and size of these proteins vary from viralfamilies it has been described that many of the viral MPs interact with the membranesbut the nature of this interaction is not well defined yet. Therefore, the main goal ofthis study is the characterization of MPs interaction to the ER membranes. TheCarnation Mottle Virus has been used as an experimental model. This virusencodes two MPs, a cytoplasmic soluble protein of 7 kDa, p7, which binds viralgenome, and a hydrophobic protein of 9 kDa, p9, with two putativetransmembrane segments.Firstly, it has been demonstrated that p9 is, in fact, an integral membraneprotein containing two transmembrane segments and facing both N- and Cterminusto the cytosol.Secondly, it has been dissected the cellular pathway followed by p9 toreach the host membranes. This viral protein is targeted to ER membrane by thesignal recognition particle, and the translocon components Sec61a and TRAMmediate p9 integration into the membrane. The unexpected results obtained inthese studies are the following: (i) viral TM fragments integrate into the lipidbilayer through a sequentially ordered contact to Sec61a and TRAM; and (ii)TRAM mediates viral protein integration by collecting TM domains, which areonly partitioned into the lipid bilayer after translation termination.Finally, it has been studied the topological determinants of p9 thatgovern the proper orientation of this viral membrane protein. It has beenanalysed contribution of different parameters such are distribution of positiveresidues along the protein sequence, hydrophobicity of transmembranesegments, length of extramembranous domains, and presence of aromaticresidues flanking transmembrane domains. The results demonstrate thattopological information of p9 is distributed along the amino acid sequence. Thisstrategy could avoid any alteration of native topology of p9 due to a randommutation in the protein gene, a common process during viral genomereplication.

El ciclo celular en mamíferos está regulado positivamente por holoenzimas formadas por una subunidad reguladora (denominada ciclina) y quinasas dependientes de ciclinas (CDK). Estos complejos ciclina/CDK se activan e inhiben secuencialmente en las diferentes fases del ciclo celular. Las proteínas inhibidoras de las CDKs, CKIs, constituyen una familia importante de supresores de cecimiento celular. La proteína p27Kip1 es una CKI de la familia CIP/KIP que actúa como inhibidor universal de CDKs. Sus niveles son elevados en células en reposo y disminuyen durante la entrada en el ciclo celular inducida por mitógenos. La fosforilación de p27Kip1 en treonina 187 (T187) es un mecanismo importante que regula los niveles de p27Kip1.. La proteína supresora de tumores p53, que puede ser activada en respuesta a determinados insultos celulares, también modula el número de células, regulando negativamente el ciclo celular e induciendo apoptosis. Diversos modelos animales de arteriosclerosis, denudación mecánica y arteriosclerosis por transplante han demostrado que p27Kip1 y p53 protegen frente al desarrollo de lesiones vasculares obstructivas, cuya formación depende en parte de una respuesta hiperproliferativa de células de la pared arterial, principalmente células musculares lisas vasculares (CMLVs) y macrógafos. El trabajo de esta Tesis Doctoral se ha centrado en la elucidación de mecanismos moleculares implicados en el control de la proliferación celular, con especial énfasis en CMLVs en cultivo y modelos animales de aterosclerosis y daño vascular mecánico. Se han perseguido los siguientes objetivos: 1) Estudiar el el mecanismo molecular por el que los agentes citostáticos PCA-4230 y STI571 inhiben la proliferación de CMLVs y células cancerosas (Trabajo 1 y Trabajo 2). 2) Estudiar la importancia de la fosforilación de p27Kip1 en la T187 en la progresión del ateroma inducido por dieta rica en grasa y colesterol en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE-KO) (Trabajo 3) 3) Analizar el papel de la ganancia de función de p53 en la prevención del desarrollo de la placa de ateroma en un modelo de aterosclerosis experimental así como en la protección frente al desarrollo de la neoíntima tras daño mecánico en la arteria femoral de ratones apoE-KO (Trabajo 4). Los resultados de los trabajos 1 y 2 demuestran que la inhibición de E2F y la represión transcripcional de la ciclina A son parte del mecanismo molecular por el que PCA-4230 y STI571 inhiben la proliferación de CMLVs. Además, STI571 también inhibe la activación de las ERK1/2, mientras que la activación constitutiva de estas MAPKs en CMLVs de arteria femoral previene tanto el efecto citostático como su capacidad de inhibir la transcripción del promotor de la ciclina A del STI571. Los resultados del trabajo 3 en el modelo de arteriosclerosis experimental inducida por dieta muestran idéntico tamaño de ateroma, celularidad y tasas de proliferación y apoptosis cuando se comparan ratones apoE-KO con p27T187A-apoE-KO. Además nuestros resultados demuestran que la fosforilación de p27Kip1 en T187 no está implicada en el control de la expresión de p27 en la aorta. Estos resultados contrastan con los de estudios previos de otros investigadores que han implicado este evento de fosforilación con la regulación del ciclo celular y expresión de la proteína p27Kip1 en otros tipos celulares. Por tanto, la relevancia de la fosforilación de p27Kip1 en la T187 parece depender del tipo celular, tejidos y condiciones patofisiológicas, tanto in vitro como in vivo. Los resultados del manuscrito 4 mostraron que la ganancia de fucnión de p53 puede reducir la hiperplasia de la neoíntima tras daño mecánico, pero no tiene efecto sobre la aterosclerosis, por lo que pone de manifiesto importantes diferencias en el papel de p53 en diferentes modelos de daño vascular que pueden tener importantes implicaciones para futuras aplicaciones terapéuticas. / The mammalian cell cycle is positively regulated by holoenzymes constituted by a regulatory subunit (called cyclin) and a cyclin-dependent kinase (CDK). Cyclin/CDK complexes are sequentally activated and inhibited in different phases of the cell cycle. CDK inhibitory proteins (CKIs) constitute an important family of growth suppressors. The p27Kip1 protein is a CKI that belongs to the CIP/KIP family which acts as an universal CDK inhibitor. Its levels are elevated in quiescent cells and decreased during mitogen-dependent entry into the cell cycle. Phosphorylation of p27Kip1 at threonine 187 (T187) is an important mechanism by which p27Kip1 levels are regulated. The tumour suppressor protein p53, which can be activated in response to several cellular insults, also modulates cell number by negatively regulating the cell cycle and inducing apoptosis. Several animal models of atherosclerois, mechanical injury and transplant-atherosclerosis have demonstrated that p27Kip1 and p53 protect against vascular obstructive lesion development, which depends in part on a hiperproliferative response of arterial wall cells, mainly smooth muscle cells (SMCs) and macrophages. The work carried out in this Doctoral Thesis has been focused in the elucidaton of molecular mechanisms implicated in the control of cellular proliferation, with especial interest in cultured SMCs and murine models of atherosclerosis and mechanical injury of the vessel wall. The following specific objectives were pursued: 1) To study the molecular mechanism by which the cytostatic agents PCA-4230 and STI571 inhibit SMC and cancer cell proliferation (Paper 1 and Paper 2). 2) To investigate whether p27Kip1 phosphorylation on T187 regulates atheroma progression in apolipoptotein E-null mice (apoE-KO) fed a high-fat and cholesterol-rich diet (Paper 3) 3) To analyze in apoE-KO mice the consequences of hightening p53 function on the development of aortic atherosclerosis and neointimal lesions induced by mechanical injury of the femoral artery (Manuscript 4). Results from paper 1 and paper 2 demostrated that E2F inhibition and transcriptional repression of cyclin A contribute to PCA-4230- and STI571-dependent SMC growth arrest. STI571 also inhibited ERK1/2 activation, whereas forced activation of these MAPKs in femoral artery SMCs impaired STI571-dependent inhibition of both cyclin A promoter activity and SMC proliferation. Results from paper 3 in the experimental model of diet-induced atherosclerosis showed identical atheroma size, lesion cellularity, proliferation, and apoptotic rates when comparing apoE-KO and p27T187A-apoE-KO mice. Moreover, our findings demonstrate that phosphorylation of p27Kip1 on T187 was not implicated in the control of aortic p27 expression. These findings are in contrast with previous studies by other investigators that have implicated this phosphorylation event on cell cycle regulation and p27Kip1 protein expression in other cell types. Thus, the relevance of p27Kip1 phosphorylation on T187 level seems to depend on the cell type and tissues and on pathologic conditions both in vitro and in vivo. Results from manuscript 4 revealed that gain of p53 function can reduce neointimal hyperplasia after mechanical injury, but has no effect on atherosclerosis, thus highlighting profound differences in the role of p53 in different models of vascular injury that may have important implications for therapeutic purposes.