Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciência da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciência da Saúde, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-18T15:37:56Z No. of bitstreams: 1 2014_OlíviaLaquisDeMoraes.pdf: 2089917 bytes, checksum: 3784e6f7d4b3f8c2057d7a208522f5b9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-26T18:28:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_OlíviaLaquisDeMoraes.pdf: 2089917 bytes, checksum: 3784e6f7d4b3f8c2057d7a208522f5b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T18:28:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_OlíviaLaquisDeMoraes.pdf: 2089917 bytes, checksum: 3784e6f7d4b3f8c2057d7a208522f5b9 (MD5) / INTRODUÇÃO: Feocromocitomas (FEO) e paragangliomas (PGL) são tumores neuroendócrinos, originários de células chromafins, localizados na medula supra-renal e em tecidos extra-adrenais, respectivamente. FEO e PGL são geralmente benignos, com morbidade e mortalidade relacionadas com a produção de catecolaminas. Malignidade é relatada em aproximadamente 10%, dos casos. Estudos recentes têm mostrado que, pelo menos, 25% de todos os casos de FEO / PGL podem ter uma base genética. MÉTODOS: 17 pacientes com FEO / PGL foram incluídos. Os dados clínicos, bioquímicos e radiológicos foram obtidos dos prontuários médicos. Estudos histopatológicos e imuno-histoquímico para marcadores neuroendócrinos foram realizados. DNA genômico foi extraído e as regiões codificantes dos genes VHL, SDHB, SDHC SDHD, MAX foram amplificados e seqüenciados automaticamente. A técnica de MLPA foi utilizada para a triagem de grandes deleções / inserções. A análise do gene RET foi realizada em um paciente com evidência clínica de neoplasia endócrina múltipla do tipo 2A (MEN2A). O consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os pacientes. RESULTADOS: Este estudo é composto por 6 casos de PGL e 11 FEO, 5 pacientes tiveram história familiar postivia e 4 apresentaram malignidade. A análise Imunohistoquímica confirmou a origem de neuroendócrina de todos os tumores. A análise genética revelou a mutação (p.Q164R) no gene VHL em uma paciente do sexo feminino com FEO e hemangioblastoma cerebelar e sua filha assintomática. Uma mutação no gene RET foi encontrada (p.C618R), em uma paciente do sexo feminino com FEO e carcinoma medular da tiróide (CMT; NEM2A) e seus 2 filhas com CMT. Uma grande dleção do exon 1 do gene SDHB foi encontrada em quatro pacientes: Duas irmãs com PGL paraaortico, e dois casos aparentemente esporádicos apresentando PGL. DISCUSSÃO: O diagnóstico molecular feito pelo seqüenciamento de Sanger juntamente com o MLPA constitui uma estratégia adequada para procurar tanto mutações pontuais quanto grandes deleções. Associações genótipo-fenótipo para VHL e RET são bem descritos, mas os efeitos fisiopatológicos das grandes deleções no SDHB ainda não estão bem elucidados. Correlações fenotípicas ainda não foram bem caracterizados já que grandes deleções no SDHB tem uma apresentação muito variável. O SDHB pode atuar como um gene supressor tumoral, e uma grande deleção pode conduzir a um fenótipo tumoral. Estudos genéticos em pacientes com FEO e PGL são recomendados, uma vez que as mutações podem também ser encontrados em casos aparentemente esporádicos, e que um resultado positivo pode influenciar a monitorização clínica e o aconselhamento genético dos pacientes e seus descendentes. ___________________________________________________________________________ ABSTRACT / INTRODUCTION: Pheochromocytomas (PCC) and Paragangliomas (PGL) are neuroendocrine tumors originating from chromafin cells, located in the adrenal medulla and extra-adrenal tissue, respectively. PCC and PGL are usually benign, with morbidity and mortality related to the production of catecholamines. Malignancy is reported in approximately 10%; of cases. Recent studies have shown that at least 25%; of all PCC/PGL cases may have a genetic basis. METHODS: 17 patients with PCC/PGL were included. Clinical, biochemical and radiological data were obtained from medical records. Histopathological and immunohistochemical studies for neuroendocrine markers were performed. Genomic DNA was extracted and the coding regions of VHL, SDHB, SDHC SDHD, MAX were amplified and automatically sequenced. Multiplex ligand-probe amplification (MLPA) was used for screening large deletions/insertions. RET gene analysis was also performed in one patient with clinical evidence of multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A). Genuine consent was obtained from all. RESULTS: Our series consisted of 6 PGLs and 11 PCCs patients; 5 had familial history and 4 were malignant. Immunohistochemistry confirmed the neuroendocrine origin of all tumors. Genetic analysis revealed the (p.Q164R) VHL mutation in a woman with PCC and cerebellar hemangioblastoma and her asymptomatic daughter. A RET mutation was found (p.C618R) in a woman with PCC and thyroid medullary carcinoma (TMCa; MEN2A) and her 2 daughters with TMCa. A large deletion of SDHB exon 1 was found in 4 patients: Two sisters with paraortic PGL, and two apparently sporadic cases presenting with PGL. DISCUSSION: Molecular diagnosis done by Sanger’s sequencing combined with MLPA constitute an adequate strategy to search for both point mutations and large deletions. Genotype-phenotype associations for VHL and RET are well described, but the pathophysiological effects of large deletions on SDHB are still unclear. No phenotype correlations have been characterized for large SDHB deletions due to a highly variable presentation. SDHB may act as a tumor suppressor, and a large deletion may lead to a tumor phenotype. Rational recommendations for genetic studies in PCCs and PGLs are in progress given that mutations may also be found in apparently sporadic cases, and that a positive result might influence clinical monitoring and genetic counseling of patients and their offspring.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Andrielle Gomes (andriellemacedo@bce.unb.br) on 2015-07-01T13:57:13Z No. of bitstreams: 1 2015_CinthiaGabrielMeireles.pdf: 1121380 bytes, checksum: 2b8cfc07567c1725573bf650a4d1e128 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-03T14:04:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CinthiaGabrielMeireles.pdf: 1121380 bytes, checksum: 2b8cfc07567c1725573bf650a4d1e128 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-03T14:04:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CinthiaGabrielMeireles.pdf: 1121380 bytes, checksum: 2b8cfc07567c1725573bf650a4d1e128 (MD5) / O câncer é uma doença que acomete diferentes órgãos do organismo, com comportamento biológico variável. O adenocarcinoma de próstata corresponde a 10% do total de cânceres. O feocromocitoma é um tumor neuroendócrino derivado de células cromafins que se encontram na medula da glândula supra-renal. Tem sido descrito efeito inibidor da metformina sobre sobrevivência e crescimento celular, in vitro, em algumas linhagens celulares de câncer. O presente estudo tem como objetivo investigar o efeito citotóxico da metformina em linhagens celulares de adenocarcinoma de próstata humano e de feocromocitoma de ratos. Foram utilizadas duas linhagens de adenocarcinoma de próstata humano, LNCaP (andrógeno-sensível) e PC3 (andrógeno-resistente) e células de feocromocitoma, PC12-Adh. Foi utilizado o ensaio de MTT para a determinar a viabilidade celular antes, após tratamentos e na associação de fármacos. Para avaliar se metformina altera o ciclo celular da linhagem PC12-Adh foi realizado ensaio com citometria de fluxo, usando concentrações de 20,85mM de metformina e 8,23μM de sunitinib. Por meio de Western Blot, foi avaliado se a metformina altera a expressão de proteínas pró-apoptóticas. Os resultados mostraram que a metformina inibiu a viabilidade de ambas as linhagens celulares de adenocarcinoma de próstata, LNCaP e PC3. A metformina também inibiu a viabilidade das células PC12-Adh, com efeito de magnitude semelhante ao sunitinib. Não foi observado efeito sinérgico ou potencialização do efeito do sunitinib sobre a inibição da viabilidade celular em células de feocromocitoma, quando foi adicionada metformina. Esse resultado sugeriu possível interação entre os dois fármacos, onde o efeito do sunitinib foi aparentemente impedido quando as células foram tratadas com metformina concomitantemente. O tratamento com metformina na concentração de 20,85mM por 48h não alterou o ciclo celular. Contudo, nessas mesmas condições, houve um aumento da expressão de proteína caspase 3, sugerindo indução de apoptose. Os resultados sugerem que a metformina inibe a viabilidade das células LNCaP de forma mais intensa que das células PC3, sugerindo que esse efeito possa ser mediado pelo receptor de andrógeno. A metformina inibe a viabilidade das células PC12-Ahc, nas concentrações utilizadas, em magnitude semelhante à induzida pelo sunitinib. Observou-se possível interação entre metformina e sunitinib, in vitro, caracterizada pela interferência com o efeito do sunitinib induzida pela adição de metformina nas menores concentrações. A metformina não interfere no ciclo celular das células PC12-Adh após 48 horas de tratamento, porém induz aumento da expressão caspase 3, sugerindo efeito pró-apoptótico. / Cancer is a disease that affects different organs and displays with variable biological behavior. Prostate adenocarcinoma accounts for 10% of all cancers. Pheochromocytoma is a neuroendocrine tumor derived from chromaffin cells situated in adrenal medulla. It has been reported inhibitory effect, in vitro, of metformin on survival and growth of some cancer cell lines. The present study aims to investigate the cytotoxic effect of metformin on human prostate adenocarcinoma and rats pheochromocytoma cell lines. Were used two human prostate adenocarcinoma cells lines, LNCaP (androgen-sensitive) and PC3 (androgen-resistant), and pheochromocytoma cell line PC12-Adh. The MTT assay is used to determined cell viability before and after treatment and metformin with sunitinib combination. To assess whether metformin changes cell cycle of PC12-Adh, the flow cytometry was performed, using metformin 20,85mM and sunitinib 8,23μM in PC12-Adh cells. Western blot was used to determinate if metformin alter the expression of pro-apoptotic proteins. The results show that metformin inhibited the cell viability in both prostate adenocarcinoma cell lines, LNCaP and PC3. Metformin also inhibited PC12-Adh cells viability similarly to sunitinib. There was no change in the inhibition of viability in pheochromocytoma cells induced by sunitinib when metformin was added, suggesting an inhibitory effect of metformin upon suntinib. This result suggested a possible interaction between these two drugs, where the effect of sunitinib was apparently prevented when the cells were concurrently treated with metformin. Treatment with metformin in the concentration of 20,85mM for 48 hours did not alter the cell cycle. However, under these same conditions, there was an increase in caspase-3 protein expression, suggesting apoptosis. The results that metformin inhibits the viability of LNCaP cells more intensely compared to PC3 cells, suggesting that this effect may be mediated by the androgen receptor. Metformin inhibits viability of PC12-Adh cells, in similar concentrations those induced by sunitinib. We propose a possible interaction between metformin and sunitinib in vitro, characterized by interference with the effect of sunitinib induced by the addition of metformin in lower concentrations and although metformin does not interfere with PC12-Adh cell cycle after 48 hours of treatment, it leads to increased expression of caspase 3, suggesting a pro-apoptotic effect.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-10-24T12:35:11Z No. of bitstreams: 1 2014_BeatrizTaynaraAraujodosSantos.pdf: 1308928 bytes, checksum: 18a4b7400f101f75567293bfe0231ec4 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-03T11:25:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BeatrizTaynaraAraujodosSantos.pdf: 1308928 bytes, checksum: 18a4b7400f101f75567293bfe0231ec4 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-03T11:25:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BeatrizTaynaraAraujodosSantos.pdf: 1308928 bytes, checksum: 18a4b7400f101f75567293bfe0231ec4 (MD5) / Introdução: Feocromocitomas são tumores altamente vascularizados derivados da medula adrenal. A maioria dos casos é benigna, mas formas malignas já foram descritas. A ressecção cirúrgica é a única forma definitiva de cura para tumores benignos, enquanto tumores malignos ainda não possuem tratamento eficaz. Os sintomas da forma maligna usualmente são tratados com quimioterapia e bloqueadores adrenérgicos, mas vários outros alvos terapêuticos estão sendo estudados recentemente. Grande parte dos medicamentos quimioterápicos comercializados é obtida por semissíntese de componentes químicos de plantas e fungos, e a biodiversidade brasileira pode auxiliar no desenvolvimento de novas drogas para esta patologia. Objetivo: Investigar a atividade antitumoral de extratos de plantas e fungos do Cerrado em linhagem celular de feocromocitoma. Métodos: A PC-12 Adh foi adquirida do BCRJ (Banco de Células do Rio de Janeiro), e cultivada em meio HAM-F12 suplementado com soro de cavalo, soro fetal bovino, bicarbonato de sódio, 10% de penicilina/estreptomicina, encubada a 37°C e 5% de CO2. Para os experimentos, as células foram plaqueadas na densidade de 5 x103 células por poço em placas de 96 poços, em triplicata. Após 24 horas de incubação, o ensaio de citotoxicidade foi realizado com avaliação de 24 e 48 horas de tratamento com concentrações de 500 e 1000 μg/mL das frações dos extratos (aquosa, etanólica e hexânica) dos 65 extratos obtidos de plantas e fungos do Cerrado diluídos em meio de cultura. Os extratos que demonstraram atividade citotóxica foram submetidos ao ensaio de curva dose-resposta em concentrações entre 125 e 2000 μg/mL. Após os tratamentos, a viabilidade celular foi mensurada utilizando o método colorímetro MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,3-difeniltetrazólio). Os experimentos foram realizados em três análises independentes e a atividade citotóxica foi comparada na linhagem celular não tumoral de queratinócitos HaCat. Os dados foram analisados no GraphPad Prism 5® pelos testes estatísticos one-way ANOVA com teste pós-hoc de Tukey para os ensaios de citotoxicidade, e regressão não-linear e determinação do IC50 para os ensaios de dose-resposta. Os extratos que apresentaram atividade citotóxica similar ou inferior na linhagem celular não tumoral foram submetidos aos ensaios de flavonoides, polifenóis totais e cromatografia de camada delgada para determinar e quantificar os compostos químicos. Resultados: Os extratos etanólicos da folha e do fruto da Allamanda blanchetti ADC, e o extrato hexânico da folha e sua fração hexano:acetato de Etila do Erytroxylum subrotundum demonstraram atividade inibitória da viabilidade celular ≥ 50%, efeito dose dependente, e toxicidade similar ou inferior em HaCat. Os extratos de Allamanda blanchetti ADC e os extratos do Erytroxylum subrotundum apresentaram flavonoides e terpenos, respectivamente. Conclusão: Nesta triagem biológica do Bioma Cerrado, 04 dos 65 extratos de plantas e fungos demonstraram capacidade de controlar a proliferação celular do Feocromocitoma in vitro. Esses achados sugerem que os compostos químicos ativos encontrados possuem atividade citotóxica, corroborando com estudos de bioprospecção para o desenvolvimento de drogas antitumorais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Pheochromocytomas are highly vascularized tumors arising from adrenal medulla. The majority of cases are benign, but malignant forms have been described. Surgical resection is the only definitive healing for benign tumors, while malignant tumors still have no effective treatment. Symptoms from malignant disease are usually managed with cytotoxic chemotherapy and adrenergic blockers, but several new therapeutic targets have been studied recently. Most chemotherapy commercialized drugs are obtained by semi-synthesis from chemical compounds of plants and fungi, and Brazilian biodiversity could support on new drugs development for this pathology. Aim: investigate antitumoral activity of extracts from Cerrado plantas and fungi in pheochromocytoma cell line. Methods: The PC-12 Adh was purchased from BCRJ (Banco de Células do Rio de Janeiro), and maintained in HAM-F12 Medium supplemented with horse serum, fetal bovine serum, sodium bicarbonate, 10% penicillin/streptomycin stored at 37°C and 5% CO2. For the experiments, cells were seeded at a density of 5 x103 cell/well in 96-well plates, in triplicate. After 24h of incubation, cytotoxicity assay was performed after 24h and 48h of exposition to 500 and 1000μg/mL of each fraction (aqueous, ethanolic and hexanic) of 65 extracts obtained from Cerrado plants and fungi diluted in cell culture medium. The extracts that demonstrated cytotoxic activity were submitted to a dose response curve assay with concentrations varying from 125 to 2000μg/mL. After treatment, cell viability was measured using MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) colorimetric assay. Experiments were performed on three independent analysis and the cytotoxic activity were compared in non tumoral keratinocytes cell line Hacat. Data were analyzed on GraphPad Prism 5® by one-way ANOVA with Tukey pos-hoc test for cytotoxicity assays, and non-linear regression and IC50 determination. The extracts that presented similar or lower cytotoxic activity in non tumoral cell line were submitted to flavonoids, total polyphenols and thin layer chromatography to determine and quantify chemical compounds. Results: The ethanolics extracts of leaf and fruit from Allamanda blanchetti ADC, and hexanic extract and its Hexane:Ethyl Acetate of leaf from Erytroxylum subrotundum demonstrated a inhibitory activity of cell viability ≥ 50% on cytotoxicity assays, dose response effect, similar or lower cytotoxic activity on Hacat. The Allamanda blanchetti ADC extracts presented flavonoids and Erytroxylum subrotundum extracts terpenes. Conclusion: On this biological trial of Cerrado Biome, 04 of 65 plant and fungi extracts demonstrated the ability to control pheochromocytoma cell line proliferation. These findings suggest the presence of active chemical compounds with cytotoxic activity, corroborating bioprospecting studies for the development of new antitumoral drugs.

Medullary thyroid carcinoma (MTC) is a rare malignant tumor originating from thyroid parafollicular C cells. This tumor accounts for 3-4% of thyroid gland neoplasias. MTC may occur sporadically or inherited. The hereditary MTC is part of syndromes of multiple endocrine neoplasia (MEN) 2A and 2B, familial medullary thyroid carcinoma (FMTC). Germline mutations of the RET (REarranged during Transfection) protooncogene cause hereditary form of cancer, whereas somatic mutations can be present in sporadic form of the disease. The RET gene encodes a receptor tyrosine kinase involved in the activation of intracellular signaling pathways leading to proliferation, growth, differentiation, migration and survival. Nowadays, the only possibility of cure for MTC patients consists of total thyroidectomy associated with lymph node dissection. Based on the knowledge of the pathogenic mechanisms of MTC, new drugs have been developed in attempt to control metastatic disease. Of these, the small-molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs) represent one of the most promising agents for MTC treatment and clinical trials have shown encouraging results. Hopefully, the cumulative knowledge about the targets of action of these drugs as well as TKI-associated side effects will help on choosing the best therapeutic approach in order to enhance its benefits.

Orientadora: Giselle Cerchiaro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012

Medullary thyroid carcinoma (MTC) is a rare malignant tumor originating from thyroid parafollicular C cells. This tumor accounts for 3-4% of thyroid gland neoplasias. MTC may occur sporadically or inherited. The hereditary MTC is part of syndromes of multiple endocrine neoplasia (MEN) 2A and 2B, familial medullary thyroid carcinoma (FMTC). Germline mutations of the RET (REarranged during Transfection) protooncogene cause hereditary form of cancer, whereas somatic mutations can be present in sporadic form of the disease. The RET gene encodes a receptor tyrosine kinase involved in the activation of intracellular signaling pathways leading to proliferation, growth, differentiation, migration and survival. Nowadays, the only possibility of cure for MTC patients consists of total thyroidectomy associated with lymph node dissection. Based on the knowledge of the pathogenic mechanisms of MTC, new drugs have been developed in attempt to control metastatic disease. Of these, the small-molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs) represent one of the most promising agents for MTC treatment and clinical trials have shown encouraging results. Hopefully, the cumulative knowledge about the targets of action of these drugs as well as TKI-associated side effects will help on choosing the best therapeutic approach in order to enhance its benefits.

Medullary thyroid carcinoma (MTC) is a rare malignant tumor originating from thyroid parafollicular C cells. This tumor accounts for 3-4% of thyroid gland neoplasias. MTC may occur sporadically or inherited. The hereditary MTC is part of syndromes of multiple endocrine neoplasia (MEN) 2A and 2B, familial medullary thyroid carcinoma (FMTC). Germline mutations of the RET (REarranged during Transfection) protooncogene cause hereditary form of cancer, whereas somatic mutations can be present in sporadic form of the disease. The RET gene encodes a receptor tyrosine kinase involved in the activation of intracellular signaling pathways leading to proliferation, growth, differentiation, migration and survival. Nowadays, the only possibility of cure for MTC patients consists of total thyroidectomy associated with lymph node dissection. Based on the knowledge of the pathogenic mechanisms of MTC, new drugs have been developed in attempt to control metastatic disease. Of these, the small-molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs) represent one of the most promising agents for MTC treatment and clinical trials have shown encouraging results. Hopefully, the cumulative knowledge about the targets of action of these drugs as well as TKI-associated side effects will help on choosing the best therapeutic approach in order to enhance its benefits.

INTRODUÇÃO: A imensa maioria dos casos com Neoplasia Endócrina Múltipla Tipo 2 (NEM2) é causada por uma única mutação germinativa no proto-oncogene RET. Entretanto, há alguns poucos casos descritos na literatura (~16) que apresentam duplas mutações/polimorfismos no gene RET, geralmente associados a fenótipos atípicos. OBJETIVOS: Os objetivos deste projeto são: a) caracterizar os aspectos clínicos de pacientes advindos de cinco famílias não relacionadas com diagnóstico de NEM2A, nas quais se documentou a presença de uma nova dupla mutação germinativa RET nos códons 634 e 791 e b) realizar rastreamento gênico familiar dos casos sob-risco com a finalidade de identificarmos possíveis casos com esta nova mutação. PACIENTES: Cinco casos-índice foram recentemente descobertos albergando a dupla mutação germinativa RET C634Y/Y791F. Nestas famílias há relato de 208 parentes, potencialmente, sob-risco (~50%) de serem portadores desta mutação. Dentre estes 208 indivíduos, 81 (38,9%) aceitaram participar do rastreamento gênico. MÉTODOS: O estudo foi realizado na Disciplina de Endocrinologia, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O DNA do sangue periférico dos pacientes e de seus parentes sob- risco foi obtido após a obtenção do consentimento livre e esclarecido. Após PCR, foi realizado o sequenciamento gênico direto (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), abrangendo todos os 20 éxons do RET. Foram investigados potenciais polimorfismos e mutações no RET. Os tumores NEM2-relacionados (carcinoma medular de tireoide, CMT; feocromocitoma, FEO; hiperparatireoidismo primário, HPT) foram estudados quanto a vários parâmetros clínicos, como: sinais/sintomas; dimensão, penetrância e agressividade dos tumores; porcentagem de remissão bioquímica do CMT, e recidiva ou persistência dos tumores. RESULTADOS: Dentre os 81 indivíduos que participaram do rastreamento gênico, documentamos 28 casos (34,5%) como portadores da dupla mutação RET C634Y/Y791F. Além disso, as mutações foram testadas in vitro e um gene de efeito fundador foi descartado. Observou-se que: a) os cinco casos-índice (100%) com mutação germinativa RET C634Y/Y791F apresentaram FEO com características tais como, tumores medindo acima de 5,0 cm, e quatro dentre os cinco casos (80%) tiveram o diagnóstico com idades inferiores a 35 anos. A frequência de FEO nos parentes adultos (a partir da terceira década) foi de 73% e eram bilaterais em 80%; b) as características do CMT nos afetados albergando a mutação RET 634/791 eram similares às que ocorrem em pacientes com a mutação 634 isolada. Adicionalmente, estudo in vitro desta dupla mutação revelou que o grau de fosforilação das células com a dupla mutação celular 634/791 era significativamente maior (p=0,04), quando comparada com a capacidade fosforilativa das mutações 634 e 791 avaliadas individualmente. CONCLUSÃO: Diante dos presentes achados, conclui-se que os pacientes com esta nova dupla mutação tenderam a apresentar FEO de maior agressividade (precocidade, tumores volumosos e bilaterais), enquanto que o CMT, nestes casos, apresentava características usuais aos portadores de mutação RET no códon 634. A nossa hipótese é que os achados relativos ao FEO, nos presentes pacientes, foram influenciados pela presença da segunda mutação RET Y791F, a qual teria atuado como fator modulador do fenótipo. Esta hipótese foi suportada pelos estudos in vitro. Além disso, a ausência de um efeito fundador levou-nos a prever que esta dupla mutação RET pode não ser rara, na área geográfica estudada. Ainda que estes achados devam ser validados, os presentes dados podem ser úteis no diagnóstico genético e no manejo clínico e terapêutico dos pacientes com NEM2A / INTRODUCTION: The vast majority of cases with multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A) is caused by a single germline mutation in the RET proto-oncogene. However, some instances (~16) of double germline RET mutations have been reported, most frequently associated with atypical phenotypes. OBJECTIVES: The main goals of this project were: a) to characterize the phenotype of patients from five unrelated MEN2A families harboring a new RET double germline in codons 634 and 791; b) perform the genetic screening in at-risk family members attempting to search for new similarly affected cases. PATIENTS: Five affected index-cases were recently found with this new double RET mutation C634Y/Y791F. In these five families, 208 first-degree relatives were reported and they were at-risk (~50%) to develop this mutation. Eighty-one individuals out of the 208 at-risk relatives (38.9%) were available and signed the informed consent. METHODS: The present investigation was performed at the Department of Endocrinology, School of Medicine, University of São Paulo. DNA was obtained from the peripheral blood of patients and at-risk relatives, after obtaining the informed consent of all individuals. After PCR, the direct genetic sequence was performed (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), involving all 20 exons of the RET proto-oncogene. Potential mutations and polymorphisms were investigated. In addition, the mutations were tested in vitro and a potential founder effect was evaluated. The MEN2A- related tumors (medullary thyroid carcinoma, MTC; pheochromocytoma, PHEO; and primary hyperparathyroidism, HPT) were approached using several clinical parameters, as: signs and symptoms; age at the diagnosis; tumor size and aggressiveness; biochemical remission of MTC; tumor relapse or persistence; RESULTS: Within the 81 genetically screened individuals, 28 cases (34.5%) were documented harboring the RET C634Y/Y791F germline mutation. It was observed that: a) the five affected index-cases (100%) were presented with PHEOs with features such as tumors measuring more than 5.0cm, and four out of the five cases (80%) had this diagnosis under the age of 35 years old. The frequency of PHEO in the adult affected relatives was also high (73%), from the third decade on, and were bilateral in 80%; b) the features and outcome of MTC in the affected C634Y/Y791F cases were similar to those MEN2A cases harboring the RET 634 mutation only. In addition, in vitro studies verified that cells with the 634/791 mutation had a significantly higher capacity of phosphorylation than cells harboring each individual mutation (p=0.04). Also, a founding gene was ruled out in these families. CONCLUSION: Our present data indicated that the earlier and more aggressive PHEOs seen in the present cases were most probably due to a phenotype modulation of the second RET 791 mutation. This hypothesis was supported by data from in vitro studies. Also, the absence of a founding couple led us to predict that this double RET mutation may not be rare, in the studied geographic area. Although these findings need to be validated, the present data may be useful in the genetic diagnosis as well as in the clinical and therapeutic management of MEN2A

Os feocromocitomas são tumores neuroendócrinos constituídos de células cromafins secretoras de catecolaminas e neuropeptídeos diversos, cuja manifestação clínica mais comum é a hipertensão. Doze a 24% dos tumores aparentemente esporádicos, apresentam mutações germinativas em genes até então associados a síndromes herdadas, como, RET, VHL, SDHB e SDHD. A doença de von Hippel-Lindau é causada por mutações no gene VHL. As proteínas codificadas pelos genes SDHB e SDHD fazem parte do complexo mitocondrial II e da cadeia aeróbica de transporte de elétrons. O objetivo deste projeto de pesquisa foi o rastreamento de mutações nos genes VHL, SDHB e SDHD em pacientes portadores de feocromocitoma ou, também, paraganglioma esporádicos acompanhados no Serviço de Endocrinologia do Hospital das Clínicas da FMUSP. Todos os exons dos três genes estudados foram amplificados por PCR e analisados por dHPLC. Os amplicons que apresentaram cromatogramas suspeitos ao dHPLC foram submetidos ao seqüenciamento automático. Nenhuma mutação foi encontrada no gene VHL, apenas dois polimorfismos previamente descritos no exon 1, c. -77 C>T em dois pacientes e c - 195 G>A em 58,6% do total de alelos dos pacientes estudados. No gene SDHB foram encontrados dois polimorfismos previamente descritos (c. 201-36 G>T e c.487 T>C) em quatro pacientes, uma mutação silenciosa não descrita (c.540 G>A) e uma mutação previamente descrita em portadores de feocromocitoma (c. 293 G>A). Um mesmo paciente apresentou a mutação silenciosa c.540 G>A e o polimorfismo c.201-36 G>T. No gene SDHD foram encontrados dois polimorfismos descritos (c.204 C>T e c.315-32 T>C) em um paciente cada, uma variante alélica descrita na literatura na região 3\' não codificante cuja freqüência nunca foi estudada em outras populações (c.*612 C>T) e duas substituições nunca descritas na região 3\' não codificante (c.*799 T>C e c.*803 A>G). As variantes c.*612 C>T e c.*799 T>C foram detectadas em apenas um paciente cada e não foram encontradas em 200 alelos de controles normais estudados. A variante c.*803 A>G foi encontrada em nove de 76 alelos dos 38 pacientes (11,8%) e em cinco de 200 alelos de 100 controles não afetados (2,5%), sendo, portanto, um polimorfismo significativamente mais freqüente entre os portadores de feocromocitoma ou paraganglioma. Dentre os sete pacientes portadores do polimorfismo c.*803 A>G, três pacientes heterozigotos para este polimorfismo apresentaram um segundo polimorfismo no gene SDHD, sendo que um desses pacientes também apresentava uma mutação no gene SDHB. Dentre os demais quatro pacientes, dois apresentavam o polimorfismo c.*803 A>G em homozigose. Este polimorfismo ocorre no nucleotídeo localizado na posição -1 imediatamente 5\' ao Sítio de Clivagem do pré-mRNA para que ocorra a inserção da cauda Poli(A), fundamental para a estabilidade do mRNA. A substituição da base A pela base G muito provavelmente apresenta uma repercussão funcional, pois a base A na posição -1 é considerada como a mais eficiente na promoção da clivagem do pré-mRNA, enquanto a base G é considerada a menos eficiente (ordem de eficiência de clivagem A > U > C > G). Desta forma, a possibilidade desse polimorfismo conferir susceptibilidade ao desenvolvimento do feocromocitoma e do paraganglioma não está descartada, sendo provável que outros eventos genéticos sejam necessários para promover a tumorigênese. Em conclusão, esse estudo evidenciou uma baixa freqüência de mutações nas regiões codificantes dos genes VHL (mutações não detectadas), SDHB (5,2%) e SDHD (mutações não detectadas) nessa série de pacientes com feocromocitomas e paragangliomas esporádicos, porém, encontrou um polimorfismo na região 3\' não codificante do gene SDHD significativamente mais freqüente nos portadores desses tumores que em indivíduos controles não afetados, e que, por suas características, pode estar relacionado à etiopatogenia do feocromocitoma e do paraganglioma. / Pheochromocytomas are neuroendocrine tumors composed of chromaffin cells that produce and secrete catecholamines as well as a variety of neuropeptides, whose most common clinical manifestation is arterial hypertension. Twelve to 24% of the apparently sporadic pheochromocytomas, present germline mutations in genes previously associated to inherited familiar syndromes, such as, RET, VHL, SDHB e SDHD. The von Hippel-Lindau (VHL) disease occurs upon the VHL gene mutation - a tumor suppressor gene whose product encodes complexes with other proteins leading proteic substracts to the proteolysis. The proteins encoded by the SDHD and SDHB genes are parts of the complex mitochondrial II, as well as the aerobic chain of the electron transport. The aim of the present study was the screening of mutations in the VHL, SDHB and SDHD genes in patients harboring sporadic pheochromocytoma and/or paraganglioma, followed by the Endocrinology Service of Hospital das Clínicas of the University of São Paulo School of Medicine. All the three studied gene exons were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and were analyzed by dHPLC, which was the method used for screen mutations. The samples with altered eluting progress were directly sequenced. No mutations were found in the VHL gene, only two polymorphisms previously described in the exon 1, c. -77 C>T in two patients and c - 195 G> in 58.6% out of the total alleles of the studied patients. Two polymorphisms previously described (c. 201-36 G>T and c.487 T>C) in the SDHB gene were found in four patients, as well as silent mutation not yet described (c.540 G>A) and a mutation previously described in patients with pheochromocytoma (c. 293 G>A). A particular patient presented the silent mutation c.540 G>A and the polymorphism c.201-36 G>T. In the SDHD gene two polymorpfisms previously described (c.204 C>T and c.315-32 T>C) were found, one in each patient, as well as an allelic variant previously described in the 3\' non-coding region whose frequency has never been studied in other populations (c.*612 C>T) and two substitutions never described in the 3\' non-coding region (c.*799 T>C and c.*803 A>G). The variants c.*612 C>T and c.*799 T>C were detected in only one patient each and have not been found in 200 alleles of normal control subjects studied. The variant c.*803 A>G was found in nine out of 76 alleles from 38 patients (11.8%) and in five out of 200 alleles from 100 non-affected subjects (2.5%), being, then, a polymorphism significantly more frequent among patients with pheochromocytoma or paraganglioma. Among those seven patients with the polymorphism c.*803 A>G, three patients heterozygotous for the polymorphism presented a second polymorphism in the SDHD gene and one of those patients also presented a mutation in the SDHB gene. Out of the other four patients, two presented the polymorphism c.*803 A>G in heterozygosis. This polymorphism occurs in the nucleotide localized in the position -1 immediately 5\' to the site where the pre-mRNA is cleaved for the insertion of the poly(A) tail, which is essencial to the mRNA stability. The substitution of the A to the G probably presents a functional repercussion, because the A in the position -1 is considered as the most efficient nucleotide in the pre-mRNA cleavage promotion, while the G is considered the least efficient one (scale of cleavage efficiency A > U > C > G). Therefore, the possibility of this polymorphism be associated with susceptibility to the development of pheochromocytoma and paraganglioma is not discarded, being possible that other genetic events are necessary to promote tumorigenesis. In conclusion, this study evidenced a low frequency of mutations in the coding regions of the genes VHL (mutations not detected), SDHB (5,2%) and SDHD (mutations not detected) in this series of patients with sporadic pheochromocytomas and paragangliomas, however, a polymorphism significantly more frequent in patients harboring those tumors was found in the 3\' non-coding region of the SDHD gene and, for its specific characteristics, it can very well be related to the etiopathogenesis of the pheochromocytoma and paraganglioma

INTRODUÇÃO: A imensa maioria dos casos com Neoplasia Endócrina Múltipla Tipo 2 (NEM2) é causada por uma única mutação germinativa no proto-oncogene RET. Entretanto, há alguns poucos casos descritos na literatura (~16) que apresentam duplas mutações/polimorfismos no gene RET, geralmente associados a fenótipos atípicos. OBJETIVOS: Os objetivos deste projeto são: a) caracterizar os aspectos clínicos de pacientes advindos de cinco famílias não relacionadas com diagnóstico de NEM2A, nas quais se documentou a presença de uma nova dupla mutação germinativa RET nos códons 634 e 791 e b) realizar rastreamento gênico familiar dos casos sob-risco com a finalidade de identificarmos possíveis casos com esta nova mutação. PACIENTES: Cinco casos-índice foram recentemente descobertos albergando a dupla mutação germinativa RET C634Y/Y791F. Nestas famílias há relato de 208 parentes, potencialmente, sob-risco (~50%) de serem portadores desta mutação. Dentre estes 208 indivíduos, 81 (38,9%) aceitaram participar do rastreamento gênico. MÉTODOS: O estudo foi realizado na Disciplina de Endocrinologia, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O DNA do sangue periférico dos pacientes e de seus parentes sob- risco foi obtido após a obtenção do consentimento livre e esclarecido. Após PCR, foi realizado o sequenciamento gênico direto (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), abrangendo todos os 20 éxons do RET. Foram investigados potenciais polimorfismos e mutações no RET. Os tumores NEM2-relacionados (carcinoma medular de tireoide, CMT; feocromocitoma, FEO; hiperparatireoidismo primário, HPT) foram estudados quanto a vários parâmetros clínicos, como: sinais/sintomas; dimensão, penetrância e agressividade dos tumores; porcentagem de remissão bioquímica do CMT, e recidiva ou persistência dos tumores. RESULTADOS: Dentre os 81 indivíduos que participaram do rastreamento gênico, documentamos 28 casos (34,5%) como portadores da dupla mutação RET C634Y/Y791F. Além disso, as mutações foram testadas in vitro e um gene de efeito fundador foi descartado. Observou-se que: a) os cinco casos-índice (100%) com mutação germinativa RET C634Y/Y791F apresentaram FEO com características tais como, tumores medindo acima de 5,0 cm, e quatro dentre os cinco casos (80%) tiveram o diagnóstico com idades inferiores a 35 anos. A frequência de FEO nos parentes adultos (a partir da terceira década) foi de 73% e eram bilaterais em 80%; b) as características do CMT nos afetados albergando a mutação RET 634/791 eram similares às que ocorrem em pacientes com a mutação 634 isolada. Adicionalmente, estudo in vitro desta dupla mutação revelou que o grau de fosforilação das células com a dupla mutação celular 634/791 era significativamente maior (p=0,04), quando comparada com a capacidade fosforilativa das mutações 634 e 791 avaliadas individualmente. CONCLUSÃO: Diante dos presentes achados, conclui-se que os pacientes com esta nova dupla mutação tenderam a apresentar FEO de maior agressividade (precocidade, tumores volumosos e bilaterais), enquanto que o CMT, nestes casos, apresentava características usuais aos portadores de mutação RET no códon 634. A nossa hipótese é que os achados relativos ao FEO, nos presentes pacientes, foram influenciados pela presença da segunda mutação RET Y791F, a qual teria atuado como fator modulador do fenótipo. Esta hipótese foi suportada pelos estudos in vitro. Além disso, a ausência de um efeito fundador levou-nos a prever que esta dupla mutação RET pode não ser rara, na área geográfica estudada. Ainda que estes achados devam ser validados, os presentes dados podem ser úteis no diagnóstico genético e no manejo clínico e terapêutico dos pacientes com NEM2A / INTRODUCTION: The vast majority of cases with multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A) is caused by a single germline mutation in the RET proto-oncogene. However, some instances (~16) of double germline RET mutations have been reported, most frequently associated with atypical phenotypes. OBJECTIVES: The main goals of this project were: a) to characterize the phenotype of patients from five unrelated MEN2A families harboring a new RET double germline in codons 634 and 791; b) perform the genetic screening in at-risk family members attempting to search for new similarly affected cases. PATIENTS: Five affected index-cases were recently found with this new double RET mutation C634Y/Y791F. In these five families, 208 first-degree relatives were reported and they were at-risk (~50%) to develop this mutation. Eighty-one individuals out of the 208 at-risk relatives (38.9%) were available and signed the informed consent. METHODS: The present investigation was performed at the Department of Endocrinology, School of Medicine, University of São Paulo. DNA was obtained from the peripheral blood of patients and at-risk relatives, after obtaining the informed consent of all individuals. After PCR, the direct genetic sequence was performed (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), involving all 20 exons of the RET proto-oncogene. Potential mutations and polymorphisms were investigated. In addition, the mutations were tested in vitro and a potential founder effect was evaluated. The MEN2A- related tumors (medullary thyroid carcinoma, MTC; pheochromocytoma, PHEO; and primary hyperparathyroidism, HPT) were approached using several clinical parameters, as: signs and symptoms; age at the diagnosis; tumor size and aggressiveness; biochemical remission of MTC; tumor relapse or persistence; RESULTS: Within the 81 genetically screened individuals, 28 cases (34.5%) were documented harboring the RET C634Y/Y791F germline mutation. It was observed that: a) the five affected index-cases (100%) were presented with PHEOs with features such as tumors measuring more than 5.0cm, and four out of the five cases (80%) had this diagnosis under the age of 35 years old. The frequency of PHEO in the adult affected relatives was also high (73%), from the third decade on, and were bilateral in 80%; b) the features and outcome of MTC in the affected C634Y/Y791F cases were similar to those MEN2A cases harboring the RET 634 mutation only. In addition, in vitro studies verified that cells with the 634/791 mutation had a significantly higher capacity of phosphorylation than cells harboring each individual mutation (p=0.04). Also, a founding gene was ruled out in these families. CONCLUSION: Our present data indicated that the earlier and more aggressive PHEOs seen in the present cases were most probably due to a phenotype modulation of the second RET 791 mutation. This hypothesis was supported by data from in vitro studies. Also, the absence of a founding couple led us to predict that this double RET mutation may not be rare, in the studied geographic area. Although these findings need to be validated, the present data may be useful in the genetic diagnosis as well as in the clinical and therapeutic management of MEN2A