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Viability of Glioblastoma Cells and Fibroblasts in the Presence of Imidazole-Containing CompoundsSeidel, Elisabeth Christiane 23 January 2024 (has links)
Das Glioblastom ist der häufigste maligne Hirntumor. Unter der aktuellen Standardtherapie bestehend aus möglichst kompletter Resektion, kombinierter Radiochemotherapie und einer Erhaltungstherapie mit Temozolomid bleibt die Prognose mit einer 5-Jahresüberlebensrate von 7,2% schlecht. Das natürlich vorkommende Dipeptid L-Carnosin (β-Alanyl-L-Histidin) schwächt das Wachstum von Tumorzellen ab. In der vorliegenden Arbeit sind wir der Frage nachgegangen, ob andere kleine imidazolhaltige Substanzen auch die Vitalität von Glioblastomzellen beeinflussen ohne dabei nicht-maligne Zellen zu beeinflussen und ob diesem Effekt die Bildung von Histamin zugrunde liegt. Primäre Fibroblastenkulturen und Glioblastomzellen wurden mit L-Carnosin, L-Alanyl-L-Histidin, β-Alanyl-L-Alanin, L-Histidin, Histamin, Imidazol, β-Alanin und L-Alanin für 48 Stunden behandelt. Über zellbasierte Vitalitätsassays und mikroskopische Analysen wurde die Zellvitalität unter dem Einfluss der verschiedenen Substanzen sowohl von den primären Fibroblastenkulturen als auch den Glioblastomzellen bestimmt. Zudem wurde die intrazelluläre Freisetzung von L-Histidin und die Bildung von Histamin nach Behandlung der Zellen entweder mit L-Carnosin oder mir L-Alanyl-L-Histidin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. L-Carnosin und L-Alanyl-L-Histidin hemmten das Tumorwachstums bei gleichzeitig nur geringem Effekt auf die Vitalität der primären Fibroblastenkulturen. L-Histidin, Histamin und Imidazol hingegen reduzierten die Zellvitalität beider Zelltypen. Substanzen die keinen Imidazolanteil besaßen hatten keinen Einfluss auf die Zellvitalität. In Anwesenheit von L-Alanyl-L-Histidin aber nicht von L-Carnosin kam es zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären L-Histidinmenge. Die Bildung von Histamin konnte weder nach Behandlung der Zellen mit L-Carnosin und L-Alanyl-L-Histidin noch mit L-Histidin nachgewiesen werden. Zusammenfassend trägt der Imidazolanteil zum antineoplastischen Effekt von L-Carnosin bei, was auch auf den Effekt von L-Alanyl-L-Histidin und L-Histidin zutrifft. Obwohl Histamin einen starken Einfluss auf die Zellvitalität ausübt, ist die Bildung von Histamin nicht für den antineoplastischen Effekt von L-Carnosin, L-Alanyl-L-Histidin und L-Histidin verantwortlich.
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Effekte reduzierter Hyaluronsäure auf die Struktur der Extrazellulären Matrix der Haut - Untersuchungen zur Kommunikation zwischen Fibroblasten und Makrophagen während der MatrixsyntheseFörster, Felix 21 May 2024 (has links)
Hyaluronan (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, welches in der dermalen Extrazellularmatrix eine große Rolle als wasserspeicherndes Molekül spielt. Nach aktuellem Forschungsstand wird dem HA auch eine entscheidende Bedeutung u.a. in der Zellkommunikation und der Gewebehomöostase zugesprochen. Auswirkungen eines deutlich verminderten HA-Gehalts auf die Dermis im Ruhezustand wurden bisher wenig beleuchtet. Klinisch führen die Applikation von Glucocorticoiden und Exposition mit ultraviolettem Licht zu diesem Zustand. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Teiluntersuchung der Folgen nach HA-Suppression auf die ECM der ruhenden Dermis und ihrer Zellen. Wir analysierten ebendiese am Mausmodell auf mRNA-, Protein- und mikroskopischer Ebene. Wir nahmen an, dass durch HA-Reduktion eine Reorganisation der ECM mit Induktion anderer ECM-Komponenten zur Kompensation des HA-Verlusts stattfindet. Mithilfe eines konditionalen Knockout-(KO)-Modells der murinen HA-Synthase Has2 konnten wir eine suffiziente HA-Reduktion im murinen in vivo-Gewebe erreichen. Histologisch wiesen wir bei diesen Mäusen eine erhöhte Ablagerung an Kollagenen verglichen mit Kontrolltieren nach. In vivo-Genexpressionsanalysen zeigten eine signifikant erhöhte Induktion der Kollagene Typ I und III, den häufigsten Kollagentypen der Dermis. Auf Proteinebene wurde zudem ein erhöhter Gehalt der Kollagen-spezifischen Aminosäure Hydroxyprolin nachgewiesen. Diese Resultate unterstützten die Hypothese der ECM-Reorganisation.
Im nächsten Schritt untersuchten wir an Fibroblasten (Fb) und gewebeständigen M2-Makrophagen (Mφ) in vitro eine konkrete Zellkommunikation, die für die Kollagenvermehrung in vivo ursächlich sein könnte. Beide Zellarten kommen in vivo in hoher Zahl in der ruhenden Dermis vor. Fb produzieren den Großteil der ECM, insb. Kollagene und andere fibrilläre Proteine. Aus der Literatur ist bekannt, dass gewebeständige Mφ sowohl mit HA als auch mit Fb komplex interagieren. Zudem sezernieren M2-Mφ zahlreiche profibrotische Zytokine und Wachstumsfaktoren (insb. TGF-β1), welche Einfluss auf den Differenzierungszustand und die Kollagensynthese bei Fb nehmen. Wir stellten die Hypothese auf, dass M2-Mφ im veränderten Microenvironment bei vermindertem HA die Fb hinsichtlich Differenzierungszustand und Matrixsynthese beeinflussen. Aufgrund verringerter Effektivität des Has2-KO im Arbeitsverlauf wurde das HA-Suppressionsmodell für die in vitro-Versuche umgestellt. Die HA-Suppression erfolgte nun mithilfe des etablierten 4- Methylumbelliferon (4MU), welches auf die Zellkulturen appliziert wurde. 4MU wirkt via Depletion eines HA-Vorläuferbausteins suffizient bei Fb. In eigenen Untersuchungen an Fb- und Mφ-Monokulturen in vitro verifizierten wir Effizienz, Reversibilität und Nicht-Toxizität der 4MU-Wirkung auf die Zellen unserer Population erfolgreich. Darauf aufbauend legten wir in vitro-Ko-Kulturen mit murinen Fb und M2-Mφ an. Der residente M2-Status der Mφ wurde durch vorherige IL-4-Applikation über mehrere Tage erreicht. 4MU-beeinflusste Ko-Kulturen wurden gegen nicht beeinflusste Ko-Kulturen verglichen. Zudem variierten wir die Kultivierungsdauer (48 h; 72 h) und das Zellzahlverhältnis der Ko-Kulturen: Eine Ko-Kulturkondition umfasste zehn Anteile Fb und einen Anteil Mφ (10:1-Ko-Kultur); die andere Kondition umfasste einen Anteil Fb und zehn Anteile Mφ (1:10-Ko-Kultur). Nach Ko-Kultivierung trennten wir Fb und Mφ mittels Magnetismus-basierter Separation anhand der CD11b-Oberflächenpräsentation in CD11b-positive Fraktion (murine Mφ) und CD11b-negative Fraktion (murine Fb). Die Reinheit der Separation wurde mittels Durchflusszytometrie verifiziert. Anschließend analysierten wir in Mφ die Expression von Genen, welche die Schlüsselkomponenten eines profibrotischen Signalwegs mit folgender Sekretion von TGF-β1 darstellen (Tlr2, Tlr4, Myd88, Tgfb1). Zudem wurde der bedeutendste HA-Transmembranrezeptor CD44 auf mRNA- und Zelloberflächenebene untersucht. Hinsichtlich der Fb analysierten wir die Genexpression der Kollagene Typ I und III (Col1a1, Col3a1), des fibrillären Matrixproteins ED-A-FN1, sowie verschiedener Gene, die mit dem verstärkten Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren (Tgfb1, Tgfbr1, Ccn2, Cox2). Durch Genexpressionsanalyse des Myofibroblastenmarkers αSMA wurde ein möglicher Differenzierungsprozess der Fb durch Wirkung von TGF-β1 untersucht.
In Mφ- und Fb-Monokulturen, die als Kontrollen angelegt wurden, konnte im Wesentlichen keine signifikante Wirkung des 4MU auf die untersuchten Gene festgestellt werden. Mögliche Unterschiede auf mRNA-Ebene innerhalb ko-kultivierter Zellen wurden dadurch aussagekräftig. Durch Fb-Monokulturen, welche mit TGF-β1 im Überschuss versetzt wurden, verifizierten wir die Stimulierbarkeit unserer Fb-Population. Die genannten Gene sollten nach TGF-β1-Gabe in Fb vermehrt induziert werden; hier zeigten sich mehrheitlich adäquate Resultate. Wir konnten in Mφ aus 4MU-behandelten Ko-Kulturen eine tendenziell erhöhte Genexpression der Toll-like-Rezeptoren (Tlr2, Tlr4) sowie des Tlr-assoziierten Myd88 feststellen. Zudem wurde mithilfe einer durchflusszytometrischen Analyse gezeigt, dass Mφ nach 4MU-Applikation insgesamt weniger CD44 auf der Zelloberfläche präsentieren. Dies ist ein Indiz dafür, dass Mφ ihre extrazelluläre Umgebung wahrnehmen und ihre Rezeptorexpression ab-hängig vom HA-Gehalt verändern. In ko-kultivierten Fb wurde nach 4MU-Applikation eine signifikant verstärkte Genexpression der Kollagene Typ I und III gemessen; dieses Ergebnis war konkludent zu den erläuterten in vivo-Daten. Ebenfalls wurde bei Untersuchungen des Myofibroblastenmarkers αSMA sowie von Genen, die mit dem Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren, eine höhere Geninduktion bei HA-supprimierter Kultur nachgewiesen. Diese Daten aus ko-kultivierten Fb liefern Hinweise dafür, dass nach HA-Suppression durch Anwesenheit von Mφ eine Zellkommunikation mit profibrotischem Effekt bei Fb ablaufen könnte.
Tendenziell schwache Unterschiede zwischen 4MU-behandelten und 4MU-unbehandelten Ko-Kulturen sind vor dem Hintergrund einer mäßigen 4MU-Wirkung zu sehen: Nach ELISA-Messung fiel die HA-Suppression in den Ko-Kulturen schwächer aus als in vorherigen Mono-kultur-Versuchen und Vergleichsstudien. Als Gründe für diese schwächere HA-Reduktion sind Interaktionen mit dem Medium und ko-kultivierenden Mφ zu vermuten – die 4MU-Wirkung auf Immunzellen und ko-kultivierende Zellen in vitro ist in der Literatur nur unzureichend untersucht. Zudem sind einige Sekundär-Effekte von 4MU bekannt, die sich auf die Proliferation der Fb, die Synthese und Aktivierung verschiedener ECM-Komponenten neben dem HA sowie auf den allgemeinen Zellmetabolismus auswirken. Diese Effekte könnten potenziell Einfluss auf unsere Resultate nehmen. Insgesamt konnten wir Hinweise dafür gewinnen, dass HA-Suppression direkte Folgen für den Umbau der ECM hat. Ebenfalls konnten wir Hinweise dafür sammeln, dass unter HA-Suppression eine profibrogene Zellkommunikation zwischen Mφ und Fb besteht. Diese Kommunikation resultierte bei Fb in erhöhter Transkription von Komponenten des TGF-β1-Signalwegs, von Kollagenen und Markern eines profibrotischen Differenzierungsstatus. Da sich diese erhöhten Genexpressionen zumeist erst nach 72 h zeigten, wäre eine Betrachtung der Ko-Kulturen mit längeren Kultivierungszeiten sinnvoll. Ebenso könnten eine Genexpressionsanalyse zusätzlicher profibrotischer Zytokine und Mediatoren, die von Mφ sezerniert werden (bspw. IL-6) sowie ein TGF-β1-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen angeschlossen werden.
Die vorliegende Arbeit beschreibt neue Ergebnisse bezüglich des Forschungsfeldes zu vermindertem HA-Gehalt. Hinsichtlich des zuvor wenig charakterisierten Has2-KO-Modells konnte eine signifikante Vermehrung von Kollagenen bei HA-Suppression beschrieben wer-den. Ebenso wurde erstmals in vitro eine spezifische Rolle von vermindertem HA innerhalb der mannigfaltigen Beziehungen zwischen Fb und M2-Mφ untersucht. Hierbei konnten wir Indizien für einen Mφ-vermittelten Signalweg bei HA-Verminderung gewinnen. Diese Arbeit bildet somit eine Grundlage für sich anschließende in vivo- und in vitro-Studien zum Komplex der HA-Suppression in der Haut.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS V
TABELLENVERZEICHNIS VII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX
1. EINLEITUNG 1
1.1. Funktion und Aufbau der menschlichen Haut 1
1.2. Zelluläre und Extrazelluläre Bestandteile der Dermis 3
1.2.1. Allgemeine Zelluläre Bestandteile 3
1.2.2. Myofibroblasten – Funktion und Charakterisierung 5
1.2.3. Extrazelluläre Matrix (ECM) 6
1.3. Hyaluronan als zentraler Bestandteil der ECM 8
1.3.1. Aufbau, biochemische Eigenschaften, Funktionen und Vorkommen 8
1.3.2. Metabolismus 10
1.3.3. Rezeptoren und Signalwege 11
1.4. Ziel der Dissertation 14
2. MATERIALIEN 17
2.1. Mausstämme 17
2.2. Puffer, Lösungen und Medien 17
2.3. Chemikalien, Enzyme und Reagenzien 18
2.4. DNA-Primer 20
2.5. Kits 21
2.6. Antikörper für Durchflusszytometrie 21
2.7. Geräte 22
2.8. Verbrauchsmaterialien 24
2.9. Software 25
3. METHODEN 27
3.1. Arbeiten am Tiermodell 27
3.2. Induzierbarer Has2-KO in Versuchstieren 27
3.2.1. Das Cre/loxP-System 27
3.2.2. Induktion des Has2-KO in vivo 29
3.3. In vitro-Versuche 30
3.3.1. Zellkulturen 30
3.3.2. Isolation muriner Fb und Kulturerhalt 30
3.3.3. Trypsinieren und definiertes Aussäen der Fb 31
3.3.4. Isolation muriner Mφ und Kulturerhalt 31
3.3.5. Durchführung der Ko-Kultur-Versuche 32
3.4. Molekularbiologische Untersuchungen 33
3.4.1. RNA-Isolation aus Zellkulturen 33
3.4.2. RNA-Isolation aus Hautgewebe 33
3.4.3. RNA-Konzentrationsbestimmung und Analyse der Reinheit 34
3.4.4. cDNA-Synthese durch reverse Transkription 34
3.4.5. Herstellung von Standard-Plasmiden für RT-PCR 35
3.4.6. Quantitative RT-PCR 37
3.4.7. HA-ELISA 39
3.4.8. Hydroxyprolin-Assay 40
3.5. Analyse spezifischer Zellpopulationen 41
3.5.1. Separation von CD11b-positiven Zellen aus Ko-Kulturen 41
3.5.2. Durchflusszytometrie 42
3.6. Histologische Analysen 44
3.6.1. Anfertigen von Paraffinschnitten sowie Entparaffinierung 44
3.6.2. Histochemische Masson-Trichrom-Färbung 45
3.7. Statistische Methoden 46
4. ERGEBNISSE 47
4.1. Histologische Analyse des Has2-KO-Phänotyps in ruhender Haut 47
4.2. mRNA-Analyse am Has2-KO-Modell in vivo 48
4.3. Proteinanalysen am Has2-KO-Modell in vivo 49
4.4. Umstellung der HA-Suppression auf 4MU-Modell 50
4.4.1. Pharmakologische Unterdrückung der HA-Synthese durch 4MU sowie
Evaluierung der Dosis 51
4.4.2. Untersuchungen zu Effizienz und Reversibilität der 4MU-Wirkung 52
4.4.2.1. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 96 h 53
4.4.2.2. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 15 Tage 54
4.4.2.3. Kultivierung von murinen Mφ mit 4MU 56
4.5. Fb-Mφ-Kokultur-Versuche 59
4.5.1. Etablierung des Ko-Kultur-Settings 59
4.5.2. HA-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen 62
4.5.3. Genexpressionsanalysen in Mφ aus Ko-Kulturen 63
4.5.3.1. Analyse von Tlr2 63
4.5.3.2. Analyse von Tlr4 65
4.5.3.3. Analyse von Myd88 66
4.5.3.4. Analyse von Tgfb1 67
4.5.3.5. Analyse von Cd44 69
4.5.4. Genexpressionsanalysen in Fb aus Ko-Kulturen 71
4.5.4.1. Analyse von αSMA 71
4.5.4.2. Analyse von Col1a1 73
4.5.4.3. Analyse von Col3a1 75
4.5.4.4. Analyse von ED-A-FN1 76
4.5.4.5. Analyse von Tgfbr1 78
4.5.4.6. Analyse von Ccn2 79
4.5.4.7. Analyse von Cox2 81
4.5.4.8. Analyse von Tgfb1 82
4.5.5. Zusammenfassung der Genexpressionsanalysen aus Ko-Kulturen 84
4.5.6. Durchflusszytometrische Untersuchungen 85
4.5.6.1. Evaluierung der Reinheit von Fb- und Mφ-Separation 85
4.5.6.2. Analyse von CD44 auf der Zellmembran von Mφ 86
5. DISKUSSION 89
5.1. Grundlage der Arbeitsidee 89
5.2. Betrachtung der in vivo-Ergebnisse (Has2-KO) 90
5.3. Effizienz und Einflüsse der verwendeten HA-Suppressionsmodelle 94
5.4. Betrachtung der in vitro-Ergebnisse (4MU-Applikation) 97
5.5. Fazit und Ausblick auf zusätzliche in vitro-Untersuchungen 106
6. ZUSAMMENFASSUNG 109
LITERATURVERZEICHNIS 115
ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT i
ANERKENNUNG DER PROMOTIONSORDNUNG iii
LEBENSLAUF v
DANKSAGUNG vii
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Cokulturtestsystem für die Untersuchung des Einflusses physikochemischer Eigenschaften von Copolymeren auf das Verhalten von Keratinozyten und Fibroblasten / Coculture test system for the investigation of the influence of physicochemical properties of copolymers on the behaviour of keratinocytes and fibroblastsTrescher, Karoline January 2012 (has links)
Chemische und physikalische Eigenschaften von Polymeren können verschiedene Zelltypen unterschiedlich, z. B. hinsichtlich Adhärenz oder Funktionalität, beeinflussen.
Die Elastizität eines Polymers beeinflusst vor allem, welche Zugkräfte eine Zelle gegenüber ihrem Substrat entwickeln kann. Das Zellverhalten wird dann über intrazelluläre Rückkopplungsmechanismen reguliert. Die Oberflächenladung und/oder Hydrophilie eines Polymers beeinflusst zunächst die Adsorption von Ionen, Proteinen und anderen Molekülen. Vor allem über die Zusammensetzung, Dichte und Konformation der adsorbierten Komponenten werden anschließend die Wechselwirkungen mit den Zellen vermittelt. Des Weiteren können verschiedene Zelltypen unterschiedliche membranassoziierte Proteine, Zucker und Lipide aufweisen, so dass Polymereigenschaften zellspezifische Effekte bewirken können.
Für biotechnologische Anwendungen und für den Einsatz in der regenerativen Medizin gewinnen Polymere, die spezifische Zellreaktionen regulieren können, immer weiter an Bedeutung. Die Isolierung und Kultur von primären Keratinozyten ist noch immer anspruchsvoll und die adäquate Heilung von Hautwunden stellt eine fortwährende medizinische Herausforderung dar. Ein Polymer, das eine bevorzugte Adhärenz von Keratinozyten bei gleichzeitig verminderter Anheftung dermaler Fibroblasten ermöglicht, würde erhebliche Vorteile für den Einsatz in der Keratinozyten-Zellkultur und als Wundauflage bieten.
Um den potentiell spezifischen Einfluss bestimmter Polymereigenschaften auf primäre humane Keratinozyten und dermale Fibroblasten zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Zellkultursystem für die Mono- und Cokultur beider Zelltypen entwickelt. Das Testsystem wurde als Screening konzipiert, um den Einfluss unterschiedlicher Polymereigenschaften in mehreren Abstufungen auf die Zellen zu untersuchen. Folgende Parameter wurden untersucht: 1. Vitalität und Dichte adhärenter und nicht-adhärierter Zellen, 2. Schädigung der Zellmembran, 3. selektive Adhärenz von Keratinozyten in Cokultur durch die spezifische immunzytochemische Färbung von Keratin14 und Vimentin. Für die Polymere mit variabler Elastizität wurden zusätzlich die Ablagerung extrazellulärer Matrixkomponenten und die Sekretion löslicher Faktoren durch die Zellen untersucht.
Als Modellpolymere für die Variation der Elastizität wurden vernetzte Poly(n-butylacrylate) (cPnBA) verwendet, da deren Elastizität durch den Anteil des Vernetzers eingestellt werden kann. Auf dem weniger elastischen cPnBA zeigte sich in der Cokultur ein doppelt so hohes Verhältnis von Keratinozyten zu Fibroblasten wie auf dem elastischeren cPnBA, so dass ein leichter zellselektiver Effekt angenommen werden kann. Acrylnitril-basierte Copolymere wurden als Modellpolymere für die Variation der Oberflächenladung und Hydrophilie verwendet, da die Eigenschaften durch Art und molaren Anteil des Comonomers eingestellt werden können. Durch Variation des molaren Anteils der Comonomere mit positiver bzw. negativer Ladung, Methacrylsäure-2-aminoethylester-hydrochhlorid (AEMA) und N-3-Aminopropyl-methacrylamid-hydro-chlorid (APMA) bzw. Natriumsalz der 2-Methyl-2-propen-1-sulfonsäure (NaMAS), wurde der Anteil der positiven bzw. negativen Ladung im Copolymer variiert. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des hydrophilen Comonomers N-Vinylpyrrolidon (NVP) wurde die Hydrophilie des Copolymers gesteigert. Die Erhöhung des molaren Anteils an positiv geladenem Comonomer AEMA im Copolymer führte tendenziell zu einer höheren Keratinozytendichte, wobei die Fibroblastendichte unverändert blieb. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des positiv geladenen Comonomers APMA ergaben sich keine deutlichen Unterschiede in Dichte, Vitalität oder Selektivität der Zellen. Durch die stufenweise Erhöhung des molaren Anteils des negativ geladenen Comonomers NaMAS konnte, wie im Falle von AEMA, eine Tendenz zur verbesserten Keratinozytenadhärenz beobachtet werden. Die Steigerung der Hydrophilie der Copolymere führte sowohl für Keratinozyten als auch für Fibroblasten zu einer reduzierten Adhärenz und Vitalität.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ein Testverfahren etabliert, das die Untersuchung von primären humanen Keratinozyten und primären humanen Fibroblasten in Monokultur und Cokultur auf verschiedenen Polymeren ermöglicht. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass sich durch die gezielte Modifizierung verschiedener Polymereigenschaften die Adhärenz und Vitalität beider Zelltypen beeinflussen lässt. Die Reduktion der Elastizität sowie die Erhöhung des molaren Anteils geladener Comonomere führten zu einer Zunahme der Keratinozytenadhärenz. Da die Fibroblasten unbeeinflusst blieben, zeigte sich für einige der untersuchten Polymere eine leichte Zellselektivität. Diese könnte durch die weitere Erhöhung der Steifigkeit oder des Anteils geladener Comonomere möglicherweise weiter gesteigert werden. / Chemical and physical properties of polymers can influence various cell types, e.g. concerning adherence and functionality. For instance, the elasticity of a polymer can influence, which pulling force a cell can generate towards a substrate. According to the cell type, its behavior can be controlled by intracellular feedback mechanisms. The surface charge and/or hydrophilicity of a polymer initially influence the adsorption of ions, proteins and other molecules. In particular, the composition, density, and conformation of the adsorbed components mediate the cell-material interactions. Since different cell types present varying cell membrane associated proteins, sugars and lipids, it is assumed that polymer properties can induce cell specific effects.
Polymers, which can regulate specific cell reactions, become more and more important for biotechnological uses and applications in the regenerative medicine. The isolation and culture of primary keratinocytes is still challenging and an adequate wound healing remains a clinical task. A polymer, which enables a preferential adherence of keratinocytes and induces a reduced adherence of dermal fibroblasts, would provide enormous advantages for keratinocyte culture systems as well as for wound dressings.
To investigate the specific influence of certain polymer properties on primary human keratinocytes and fibroblasts, a cell culture system for mono- and coculture of both cell types was established. The test system was designed as a screening to investigate the influence of polymers with gradations of different properties on the cells. Thereby, the viability and density of adherent and not adhered cells, as well as the impairment of the cell membranes were analyzed in mono- and cocultures, and the selective adherence of keratinocytes in the coculture was evaluated using a specific immunocytochemical staining for keratin14 and vimentin. Furthermore, the deposition of extracellular matrix components and the secretion of soluble factors were analyzed for the elastic polymers.
Since the elasticity of crosslinked poly(n-butylacrylate) (cPnBA) networks can be adjusted by the amount of the crosslinker, they were used as model polymers to investigate the influence of varying elasticity to the cells. On the less elastic cPnBA, the ratio of keratinocytes to fibroblasts was increased compared to the more elastic one. From these results, a slight cell selective effect can be assumed. Acrylonitrile-based copolymers were used as model polymers for the variation of surface charge and hydrophilicity, since their properties can be modified by the type and molar ratio of comonomers. By the variation of the molar ratio of positively charged comonomers (Methacrylic acid-2-aminoethylester hydrochloride (AEMA) and N-3-aminopropyl methacrylamide hydrochloride (APMA)), or a negatively charged comonomer (2-methyl-2-propene-1-sulfonic acid sodium salt (NaMAS)), the amount of positive or negative charges was modified. The hydrophilicity was increased by the molar ratio of the hydrophilic comonomer N-vinylpyrrolidone (NVP).
With an increased molar ratio of the positively charged comonomer AEMA, a tendency towards a higher density of adherent keratinocytes could be shown, whereby, the density of adherent fibroblasts remained unaffected. With increasing molar ratios of the positively charged comonomer APMA, no differences between cell densities, viability or selectivity were detectable. Comparable to AEMA, a tendency towards improved keratinocyte adhesion could be shown with an increasing molar ratio of the negatively charged comonomer NaMAS. The increase of the hydrophilicity of the copolymers led to a reduced adherence and viability of the keratinocytes, as well as of the fibroblasts.
In conclusion, a test system was established, which enables the evaluation of primary human keratinocytes and fibroblasts in contact with different polymers in monoculture, as well as in coculture. Furthermore, the present thesis shows that directed modifications of polymer properties influenced the adherence and viability of both cell types. The decrease of elasticity and the increase of the molar ratio of charged comonomers led to an increased keratinocyte adherence. Since the fibroblasts remained unaffected, slight cell selectivity was shown. By further increasing the stiffness or the amount of charged comonomers, further enhancement of this effect might be possible.
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Wirkung von antiseptischen Mundspüllösungen auf die menschlichen Zellen der Mundschleimhaut - Eine in-vitro-Studie / Effect of oral antiseptics on the human cells - an in-vitro-studyZyba, Vitalij 13 July 2011 (has links)
No description available.
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Functional characterization and evaluation of the therapeutic potential of polo-like kinase 2 in cardiac fibroblasts and fibrosisKünzel, Stephan Reinhard 20 September 2019 (has links)
Atrial fibrillation (AF) is the most common and relevant arrhythmia in the clinical routine. AF is predicted to affect 6–12 million patients in the USA by 2050 and 18 million patients in Europe by 2060. Cardiac fibrosis and inflammation decisively determine the course of the disease and the clinical outcome of the patients. Despite the tremendous impact on human health, detailed understanding on the molecular mechanisms that contribute to fibrosis in AF is limited. This study provides further evidence for the current paradigm shift that atrial fibrillation is more of a systemic-inflammatory disease than a mere ion-channel dysfunction. The aim of this study was to investigate the role of polo-like kinase 2 (PLK2) and the pro-inflammatory cytokine osteopontin (OPN) with respect to fibroblast (dys)function and fibrosis formation in order to derive novel targets for targeted, fibroblast-specific pharmacotherapy. All patients who participated in this study gave their written informed consent in accordance to the declaration of Helsinki. The study was approved by the local bioethics committee (Ethikkommission an der Technischen Universität Dresden). Human fibroblasts were isolated by outgrowth culture from right atrial biopsies of patients suffering from sinus rhythm (SR) and AF. Murine fibroblasts were isolated by whole-heart Langendorff-perfusion. Quantitative PCR and western blot were used to detect PLK2 transcript expression and protein abundance, respectively. Functional assessment of cardiac function was done with transthoracic echocardiography and surface ECG recordings. Cell culture experiments were performed to evaluate the effects on functional fibroblast properties such as proliferation and differentiation after changing PLK2 activity by genetic knockout (KO) or pharmacological inhibition. A mass spectrometry based secretome analysis was performed by our collaborating laboratory of Prof. Manuel Mayr at King’s College London. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was done to measure OPN in the peripheral blood of patients in SR and with permanent AF. Right atrial appendage tissue and fibroblasts from AF patients displayed significantly lower expression of PLK2 mRNA and protein due to increased DNA-methylation of the PLK2 promotor when compared to sinus rhythm (SR) control patient atria or fibroblasts. This methylation was induced in cardiac fibroblasts by chronic hypoxia (1% O2) exposure for 96 h. Pharmacological inhibition as well as global KO of PLK2 in cardiac fibroblasts resulted in elevated myofibroblast differentiation and reduced fibroblast proliferation. PLK2 KO mice displayed vast interstitial fibrosis areas as observed from histological cross sections stained either with Sirius red or with Masson’s trichrome staining. Transthoracic echocardiography revealed systolic and diastolic dysfunction in PLK2 KO mice and AF-typical ECG alterations such as prolonged PQ interval and QRS duration. Mass spectrometry proteomics revealed de novo expression of OPN in the PLK2-KO-fibroblast secretome. Furthermore, we found higher OPN plasma levels in AF patients correlated with electrophysiologically determined fibrosis compared to non-fibrosis control patients. Finally, we identified that the p42/44 MAPK signal transduction cascade is linking to reduced PLK2 expression and enhanced OPN release. Specifically, we found that KO of PLK2 increase p42 MAPK phosphorylation which is known to stimulate OPN transcription. Thus inhibition of p42/44 MAPK resulted in diminished OPN expression. In a dermal fibrosis model the administration of Mesalazine in vitro resulted in reduced p42 MAPK and SMAD2/3 phosphorylation and thereby reduced OPN and αSMA expression. To explore the general validity and relevance of the PLK2 signaling pathway for fibrosis, a dermal model of radiation-induced fibrosis was used. This approach a) confirmed the observations that were made in the heart and b) showed that the use of Mesalazine in vitro led to a reduced p42 MAPK and SMAD2 / 3 phosphorylation and thus to a significantly reduced OPN and αSMA expression. Fibroblasts from patients with permanent AF express less PLK2 than cells from SR control patients. The loss of physiological PLK2 activity coincides with marked changes in the proliferation and differentiation of cardiac fibroblasts. These changes favor fibrosis in the atrial tissues, which is further enhanced by the local and systemic increase of OPN. The present study identifies PLK2 as a novel regulator of cardiac fibroblast function and fibrosis. Restoration of the physiological methylation status of the PLK2 promoter or the inhibition of OPN with Mesalazine could be of particular clinical interest. The tangible clinical and pharmacological feasibility will be subject of future investigations. / Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste und bedeutsamste Arrhythmie in der täglichen klinischen Praxis. VHF wird bis 2050 voraussichtlich 6 -12 Millionen Menschen in den USA und bis 2060 zirka 18 Millionen Menschen in Europa betreffen. Fibrose und Entzündungsprozesse bestimmen entscheidend den Krankheitsverlauf und das klinische Outcome der Patienten. Trotz dieser großen Relevanz sind detaillierte Informationen zu den beteiligten molekularen Pathomechanismen weitgehend unklar. Diese Studie liefert weitere Evidenz für den aktuellen Paradigmenwechsel, dass Vorhofflimmern eher eine systemisch-entzündliche Erkrankung als eine bloße Ionenkanaldysfunktion ist. Ziel dieser Arbeit war es die Rolle der polo-like Kinase 2 (PLK2) und des proinflammatorischen Zytokins Osteopontin (OPN) im Hinblick auf Fibroblasten(dys)funktion und Fibroseentstehung zu untersuchen, um neuartige Angriffspunkte für zielgerichtete, Fibroblasten-spezifische Pharmakotherapie abzuleiten. Alle Patienten wurden über die Teilnahme an der Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis. Die vorliegende Studie ist konform mit der Deklaration von Helsinki und enthaltene Tierversuche erhielten ein positives Votum der lokalen Tierschutzbehörde. Humane Vorhoffibroblasten wurden mit der „Outgrowth“-Methode aus Gewebeproben von Patienten im Sinusrhythmus (SR) und im permanenten Vorhofflimmern isoliert. Murine Herzfibroblasten wurden aus dem Überstand nach Langendorff-Perfusion durch mehrere Zentrifugationsschritte gewonnen. Zur Detektion von PLK2 und anderen Markerproteinen wurden (quantitative) PCRs und Western Blots durchgeführt. Zur Beurteilung der Herzfunktion in vivo, wurde transthorakale Echokardiografie mit Oberflächen-EKG-Ableitung genutzt. Nachfolgende Zellkulturexperimente beleuchteten die Auswirkungen pharmakologischer PLK2 Inhibition oder genetischen Knock-Outs auf Fibroblasten im Hinblick auf Proliferation, Differenzierung, Seneszenzentwicklung und Sekretion. Eine Massenspektrometrie-basierte Untersuchung des Sekretoms PLK2-defizienter Fibroblasten wurde im Labor unseres Kollaborationspartners Prof. Manuel Mayr am King’s College London durchgeführt. OPN im peripheren Blut von Vorhofflimmerpatienten wurde mittels eines ELISAs gemessen. Ob die betreffenden Patienten Fibrose der Vorhöfe aufwiesen oder nicht, wurde in klinisch-elektrophysiologischen Untersuchungen, dem sogenannten Mapping, bestimmt. Im Vergleich zu SR-Kontrollen, war die PLK2 mRNA- beziehungsweise Protein-Expression in isolierten Fibroblasten und auf Gewebeebene in VHF-Proben signifikant erniedrigt. Dies korrelierte mit PLK2-Promotermethylierung in der Hälfte der VHF-Proben. In SR-Kontrollen konnten wir keine Methylierung des PLK2 Promoters nachweisen. Die Herunterregulation der PLK2 mRNA-Expression bzw. die Induktion der Promotermethylierung konnten in humanen kardialen Fibroblasten durch Exposition gegenüber chronischer Hypoxie (1% O2) experimentell herbeigeführt werden. Pharmakologische Inhibition und der genetische Knockout (KO) von PLK2 gingen in vitro mit erniedrigter Proliferation aber gesteigerter Differenzierung in Myofibroblasten einher. PLK2-KO-Mäuse entwickelten im Gegensatz zu ihren Wildtyp-Geschwistertieren ausgeprägte Areale interstitieller ventrikulärer Fibrose. Dies spiegelte sich in einer ausgeprägten systolischen und Diastolischen Funktionsstörung des Herzens bei 4 Monate-alten PLK2 KO Tieren wider. Die Sekretomanalyse deckte eine de novo Sekretion von OPN in PLK2-KO-Fibroblasten auf. Im Einklang mit diesem Ergebnis konnten wir höhere OPN-Plasmaspiegel auch bei VHF-Patienten messen, die mit dem Vorhandensein von elektrophysiologisch bestimmten Fibrosearealen korrelierte. Abschließend konnte der p42/44-MAPK-Signalweg als Bindeglied zwischen erniedrigter PLK2-Expression und erhöhter OPN-Freisetzung identifiziert werden. Verminderte PLK2 Expression beziehungsweise Aktivität gehen mit einer gesteigerten Proteinexpression und Phosphorylierung von p42/44 MAPK einher. P42/44 MAPK wiederum stimuliert dann die OPN-Transkription. Folgerichtig führte die Inhibition von p42/44 MAPK zu einer signifikant verminderten OPN-Expression. Um die Allgemeingültigkeit des PLK2-Signalweges für die Entstehung von Fibrose zu erforschen, wurde ein dermales Modell strahleninduzierter Fibrose benutzt. Darin bestätigten sich zum einen die Beobachtungen, die am Herzen gemacht wurden, und zum anderen führte der Einsatz von Mesalazin in vitro zu einer reduzierten p42 MAPK- und SMAD2 / 3-Phosphorylierung und damit zu einer deutlich verringerten OPN- und αSMA-Expression.
Fibroblasten von Patienten im permanenten Vorhofflimmern exprimieren weniger PLK2 als Fibroblasten aus SR-Kontrollpatienten. Der Verlust der physiologischen PLK2-Aktivität geht mit ausgeprägten Veränderungen der Proliferation und Differenzierung von Fibroblasten im Herzen einher. Diese Veränderungen begünstigen eine profibrotische Situation auf Gewebeebene, welche durch die lokale als auch systemische Erhöhung des Plasmaosteopontins weiter begünstigt wird. Die vorliegende Studie identifiziert erstmalig PLK2 als neuen Regulator der Fibroblastenfunktion und Fibrose. Gleichzeitig stellen die Wiederherstellung des physiologischen Methylierungstatuses des PLK2 Promoters oder die Inhibition von OPN mittels Mesalazin vielversprechende therapeutische Optionen im Kampf gegen die Fibrosierung des Herzmuskels dar. Die konkrete pharmakotherapeutische Umsetzbarkeit muss in künftigen Forschungsvorhaben überprüft werden.
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Untersuchungen zur Induktion der Mastzell-Differenzierung durch den Zellkontakt zu FibroblastenLeist, Mandy 04 March 2013 (has links)
Die Mechanismen der Mastzell(MZ)-Homöostase in peripheren Geweben sind weitgehend unbekannt. Die Regulation der MZ-Zahlen schließt wahrscheinlich die lokale Proliferation der Gewebe-MZ sowie die Rekrutierung und Differenzierung von MZ-Vorläuferzellen ein, wobei das Gewebe den MZ-Phänotyp beeinflusst. Fibroblasten (Fb) induzieren die Proliferation und Differenzierung unreifer Knochenmark-generierter MZ (BMCMC) zu Bindegewebs-MZ (CTMC). Da BMCMC an Fb adhärieren, wurde untersucht ob dieser direkte Zellkontakt für die Fb-induzierte Proliferation und die Differenzierung zu CTMC entscheidend ist. Cokultur-Experimente mit BMCMC und Fb zeigten, dass die verstärkte Proliferation, der erhöhte Histamingehalt und die Induktion der Expression der MZ Protease 4 (MCPT-4) mRNA (beides Marker der CTMC) vom direkten Zellkontakt abhängen. Adhäsionsversuche mit blockierenden Antikörpern demonstrierten, dass die Interaktion von alpha4beta7 Integrin auf den BMCMC mit Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1), auf den Fb, an der Adhäsion beteiligt ist, die Proliferation und Differenzierung der MZ selbst jedoch nicht auslöst. Interessanterweise zeigten BMCMC die Kit, den Rezeptor für den wichtigen MZ-Wachstumsfaktor Stammzellfaktor (SCF), nicht exprimieren, ebenfalls die kontaktabhängigen Fb-induzierte Veränderungen, wenngleich im geringeren Ausmaß. Eine genomweite Expressionsanalyse wies schließlich die kontaktabhängige Hochregulation der Expression weiterer Gene, die mit dem Phänotyp der CTMC assoziiert sind, nach. Des Weiteren konnte die Verringerung der Expression bestimmter Gene gezeigt werden, die von unreifen MZ oder MZ-Vorläufern exprimiert werden. Insgesamt zeigen die Daten der hier vorliegenden Arbeit, dass für die durch Fb ausgelöste umfassenden Differenzierung und Ausreifung von unreifen MZ zu CTMC, eine teilweise durch VCAM-1/alpha4beta7 vermittelte direkte Zell-Zell-Interaktion notwendig ist, bei der sowohl Kit-abhängige, als auch Kit-unabhängige Signalwege involviert sind. / The precise mechanisms of mast cell (MC) homeostasis in peripheral tissues are largely unknown. Regulation of MC numbers is assumed to involve the proliferation of local MCs and the recruitment and subsequent differentiation of MC precursors, whereas the tissues determine the MC phenotype. Fibroblasts (Fb) induce proliferation and differentiation of bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs) towards connective tissue type MCs (CTMCs). Since BMCMCs exhibit adhesion to Fbs, it had been analyzed, whether this direct cell-to-cell crosstalk is mandatory for the differentiation towards CTMCs. It was found that Fb-cocultured immature MCs exhibit increased proliferation and histamine content and the induced expression of mast cell protease 4 (mcpt4) mRNA, both markers for mature CTMC, and that these changes required a directed cell-to-cell interaction. Adhesion Assays using blocking mAbs revealed that the interaction of alpha4beta7 integrin on BMCMCs with Fb-expressed Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) is largely responsible for the adhesion, which itself didn’t induce proliferation and differentiation of MCs. Most notably, MCs deficient for Kit, the receptor for the MC growth factor stem cell factor (SCF), also showed a significant Fb-induced increase in histamine content, mcpt4 expression, and proliferation, albeit to a lesser extent than wildtype BMCMCs. Whole genome expression analysis showed contact-dependently upregulated expression of several genes associated with CTMC phenotype and functions. Furthermore, downregulation of genes associated with MC progenitors had been shown. Collectively, the data show that the Fb-induced substantial differentiation of immature MCs towards CTMCs requires a partly VCAM-1/alpha4beta7-mediated cell-to-cell interaction and involves both Kit-dependent and -independent signaling pathways.
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Die Reorganisation des Aktinzytoskeletts in Hypoxie: Neue Erkenntnisse über die Rolle von ArhGAP29 / Remodeling of the actin cytoskeleton in hypoxia: An emerging role for ArhGAP29Peters, Johannes 22 August 2019 (has links)
No description available.
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Organotypic co-culture of bovine keratinocytes and fibroblasts as a 3D skin model for studying the pathogenesis of digital dermatitis.Baumbach, Christina-Marie 22 January 2020 (has links)
Bovine Dermatitis digitalis (DD) ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit bei Rindern, die primär die plantare Haut über dem Kronenrand nahe des Zwischenzehenspalts der Hinterklauen betrifft. Schmerzhafte ulzero-proliferative Läsionen mit akuten und chronischen Erscheinungsformen führen zu Verhaltensänderungen und Lahmheit der Tiere. DD hat damit einen erheblichen Einfluss auf deren Wohl und ihre Leistungen. Zahlreiche Untersuchungen zur Ätiologie der Krankheit ergaben, dass es sich um das Zusammenspiel verschiedener Ursachen handelt. Einer synergistischen multifaktoriellen Infektion mit starker Beteiligung von Bakterien der Gattung Treponema kommt dabei besondere Bedeutung zu. Aspekte wie Tierhaltung, Hygienestandards und genetische Prädispositionen wurden ebenfalls intensiv untersucht. Nichtsdestotrotz bleiben Infektionsherde, Transmissionsrouten und Pathomechanismen weitgehend unklar. Zum besseren Verständnis der Ereignisse, die zu DD-Läsionen führen, sollte im Zuge dieser Arbeit ein organotypisches Zellkulturmodell der bovinen Haut erstellt werden, welches in späteren Versuchen mit dem Krankheitserreger zum Einsatz kommen soll.
Verlässliche und reproduzierbare Techniken zur Isolation und Kultur von bovinen primären Keratinozyten und Fibroblasten wurden etabliert; geeignete Zellkulturmedien für die Langzeitkultivierung und –aufbewahrung der Hautzellen wurden identifiziert. Zur Erstellung des Hautmodells wurden zwei verschiedene Ansätze miteinander verglichen. Der zweite Ansatz, bei dem Keratinozyten direkt auf ein dermales Äquivalent, d.h. ein Pad aus bovinem Kollagen I mit eingesäten post-mitotischen Fibroblasten, gesät wurden, brachte ein vielversprechendes Hautmodell hervor. Die inkorporierten post-mitotischen Fibroblasten wiesen eine charakteristische Zellmorphologie mit intakten Nuklei auf. Die terminale Differenzierung der Keratinozyten auf dem dermalen Äquivalent wurde mittels Immunfluoreszenzfärbungen mit Antikörpern gegen die Markerproteine Keratin 14 und Desmoglein 1 gezeigt. Die Ergebnisse erster Experimente mit Treponema spp. verdeutlichen, dass das Hautäquivalent ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Pathogenese der DD darstellt. / Bovine digital dermatitis (DD) is a worldwide occurring, infectious disease in cattle primarily affecting the plantar skin above the coronary band near the interdigital cleft on hind feet. Painful ulceroproliferative lesions with acute and chronic appearances lead to behavioral changes and lameness. Hence, DD has a major impact on animal welfare and performance. Substantial efforts in investigating the etiology of the disease revealed a synergistic origin with evidence for a multibacterial infection and the strong involvement of bacteria from the genus Treponema. As the interaction between host, pathogen and environment is not negligible, surrounding circumstances such as housing, general hygiene and genetic predispositions have been investigated intensively. Nevertheless, infection reservoirs, transmission routes and pathomechanisms remain widely unclear.
To better understand the cellular and molecular events during Treponema-infection of bovine skin, it was the specific aim of this study to establish an organotypic in vitro skin model, which could be challenged with the causative agent of the disease.
A technique to reliably and reproducibly isolate primary keratinocytes and fibroblasts from the site of infection was established. Appropriate cell culture media for the long-term cultivation and storage of bovine skin cells were identified. Two different methods to develop the skin model were compared. The second strategy in which keratinocytes were directly seeded on top of a dermal equivalent, i.e. a bovine collagen type I pad with embedded post-mitotic fibroblasts, gave rise to a promising organotypic skin equivalent. The incorporated post-mitotic fibroblasts showed a characteristic cell morphology with intact nuclei. The terminal differentiation of the keratinocytes on top of the dermal equivalent was shown with anti-K14 and anti-Dsg1 immunofluorescence stainings. The results of initial Treponema-experiments proved that the skin equivalent is a suitable model to investigate the underlying mechanisms during Treponema-infection of bovine skin and hence, the pathogenesis of DD.
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NF-kB c-Rel in Fibroblasten und Fibrose / NF-kB c-Rel in fibroblasts and fibrosisTrautschold-Krause, Franziska Susanne 13 August 2020 (has links)
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Eine in-vitro-Untersuchung der Biokompatibilität von beschichteten und unbeschichteten Drähten gegenüber humanen Gingivaepithelzellen und FibroblastenSchäfer, Sandra 04 June 2024 (has links)
Die Behandlung von Dysgnathien ist das Kerngebiet der Kieferorthopädie. Neben der schonenden Korrektur der Zahnfehlstellung legen Patienten im Jugend- und Erwachsenenalter zunehmend Wert auf die Optik der Apparatur. Die Entwicklung ästhetischer Brackets und Bögen strebt auf, muss aber nach aktuellem Medizinproduktegesetz vor dem kommerziellen Einsatz in vitro und in vivo einer Biokompatibilitätsprüfung unterzogen werden. Ziel der vorliegenden Promotion war es, die Biokompatibilität ästhetischer Bögen an primären gingivalen Keratinozyten (HGK) sowie primären gingivalen Fibroblasten (HGF) humanen Ursprungs zu untersuchen. Damit sollte sich die Arbeit von bisher veröffentlichten in-vitro-Studien mit L929-Zellen abheben. Die Zelllinien wurden mit den jeweiligen beschichteten und unbeschichteten Drähten verschiedener Hersteller 11 Tage inkubiert und anschließend die Zellproliferation und die Zytotoxizität analysiert. Zusätzlich wurde eine drahtlose Vergleichslinie und eine Gruppe primärer Gingivafibroblasten 3 Tage als Kurzzeitstudie untersucht. Für die Quantifizierung der vitalen und avitalen Zellen wurde der Cytotox-Glo™-Assay verwendet. Lichtmikroskopische Untersuchungen sollten sicherstellen, dass eine gesunde Zellmorphologie vorliegt und die Zellen eine gute Adhäsion zur Probe aufweisen. Sowohl bei den Keratinozyten als auch bei den Fibroblasten traten signifikante Steigerungen der Zytotoxizität und der Zellproliferation häufig sowohl beim verblendeten als auch beim unverblendeten Probendraht eines Herstellers auf, unabhängig mit welchem Material verblendet wurde. Eine gesteigerte Zytotoxiztiät bei gleichbleibender Zellproliferation im Vergleich zur Kontrollgruppe spricht für einen negativen Einfluss der Drahtprobe auf die Biokompatibilität. Dieses Ergebnis fand sich bei den HGK bei den sowohl verblendeten als auch unverblendeten Drähten von zwei Herstellern (WCO, TPO). Auch bei den Fibroblasten fielen die Drähte von WCO sowie TPO mit einer gesteigerten Zytotoxizität und sogar signifikant niedrigerer Zellproliferation nach 3 Tagen Inkubation auf, was sich nach 11 Tagen allerdings änderte. Ab da waren die Zytotoxiztität und die Zellproliferation gesteigert. Eine erhöhte Zytotoxizität bei gleichbleibender Zellproliferation zeigten die Hersteller Forestadent, Ortho-Technology und Dentalline nach 3 Tagen; Dentalline mit seinen verblendeten Drähten auch bis nach 11 Tagen Inkubation. Hieraus kann geschlussfolgert werden, dass die Kunststoffverblendung von Dentalline sowohl kurz- als auch längerfristig einen negativen Einfluss auf die Fibroblasten hat. Positiv fiel hingegen der Hersteller GC-Orthodontics mit seinem rhodinierten sowie unverblendeten Draht auf. Sowohl die HGK als auch die HGF zeigten eine gute Biokompatibilität. Qualitativ zeigte sich bei den Keratinozyten im Lichtmikroskop ein mehr oder weniger dichter Zellrasen an allen Drahtproben. Es gab nur wenige Unterschiede bezüglich der Hersteller oder der Art der Verblendung. Bei den Fibroblasten zeigten sich klarere Unterschiede, welche sich teilweise mit den quantitativen Ergebnissen deckten. Bei den beschichteten Drähten von American-Orthodontics, Teledenta, Ortho-Technology und Dentalline fand sich kein konfluenter Zellrasen, ebenso beim unverblendeten NiTi-Draht von Ortho-Technology sowie World-Class-Orthodontics. Ein dichter Zellrasen konnte hingegen an beiden Drähten des Herstellers GCOrthodontics detecktiert werden. Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass alle Verblendmaterialien biokompatibel sind. Bei der Wahl des zu verwendenden Bogens können sowohl Epoxyresin-, Teflonals auch andere Kunststoffbeschichtungen empfohlen werden. Dagegen werden die herstellerspezifischen Unterschiede bezüglich der Biokompatibilität deutlich. Als Grund kann das herstellereigene Nickel-Titan-Grundgerüst vermutet werden. Die Zellen kamen damit sowohl bei den unbeschichteten als auch bei den beschichteten Drähten in Berührung, da die meißten Drähte nur einseitig beschichtet waren.:Abbildungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Ästhetik in der Kieferorthopädie
1.2 Beschichtungsmaterialien ästhetischer Bögen
1.2.1 Rhodium
1.2.2 Kunststoffbeschichtungen
1.2.2.1 Polytetrafluorethylen
1.2.2.2 Epoxyresin
1.3 Untersuchung der Bioverträglichkeit
1.4 Zielstellung der Studie
2 Material und Methode
2.1 Material
2.1.1 Vorbereitende Maßnahmen und allgemeine Ergänzungen
2.1.1.1 Chemikalien und Gase
2.1.1.2 Medium und Puffer
2.1.1.3 Fertigsysteme
2.1.1.4 Geräte und Hilfsmittel
2.1.1.5 Verbrauchsmaterial
2.1.2 Kieferorthopädische Drähte
2.1.3 Zelltypen
2.2 Methode
2.2.1 Versuchsvorbereitung
2.2.2 Auszählen der Zellen
2.2.3 Aufbereitung der Zellen nach der Inkubation
2.2.4 Statistische Auswertung der ermittelten Zellzahlen
3 Ergebnisse
3.1 Zytotoxizitätsrate
3.1.1 Zytotoxizitätsrate der primären Gingivaepithelzellen nach 11 Tagen Inkubation
3.1.2 Zytotoxizitätsrate der primären Gingivafibroblasten nach 3 Tagen Inkubation
3.1.3 Zytotoxizitätsrate der primären Gingivafibroblasten nach 11 Tagen Inkubation
3.2 Proliferationsrate
3.2.1 Proliferationsrate der primären Gingivaepithelzellen nach 11 Tagen Inkubation
3.2.2 Proliferationsrate der primären Gingivafibroblasten nach 3 Tagen Inkubation
3.2.3 Proliferationsrate der primären Gingivafibroblasten nach 11 Tagen Inkubation
3.3 Qualitative Beurteilung der Zelladhärenz an allen untersuchten Bögen nach 11
Tagen mittels Lichtmikroskop
3.3.1 Zelladhärenz der primären Gingivaepithelzellen
3.3.2 Zelladhärenz der primären Gingivafibroblasten
4 Diskussion
5 Zusammenfassung
Literaturverzeichnis
Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens
Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben
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