Th.--Biol. vég.--Toulouse 3, 1977. N°: 766.

Les procédés de bioraffinerie, et notamment les agrocarburants, sont aujourd'hui reconnus comme essentiels pour sortir de l'économie actuelle basée sur le pétrole. Dans le cas du bioéthanol produit à partir de biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique par les enzymes de Trichoderma reesei est le principal point faible du procédé et doit être améliorée. Ces travaux de thèse s'intègrent dans le cadre du projet Futurol, et ont pour objectif d'identifier de nouvelles enzymes capables d'améliorer l'activité de T. reesei sur la lignocellulose. Une analyse post-génomique réalisée sur les secrétomes de vingt souches fongiques s'est révélée particulièrement prometteuse pour l'identification d'enzymes lignocellulolytiques d'intérêt. Une approche de génomique comparative a également abouti à la sélection de deux endo-mannanases de famille GH5 et GH26 chez le champignon Podospora anserina. Ces hémicellulases ont permis d'améliorer significativement la libération de glucose par T. reesei à partir d'épicéa. Une étude fondamentale approfondie a permis de résoudre les structures cristallographiques et de mettre en évidence les relations entre les spécificités enzymatiques de chaque enzyme et leurs caractéristiques structurales. La structure tridimensionnelle de la mannanase GH26 couplée à son CBM35 présente un linker court et rigide et une organisation du site actif atypique. Les deux mannanases ont également fait l'objet d'un travail d'ingénierie aléatoire qui a abouti à des variants des deux enzymes présentant une amélioration de l'efficacité catalytique et/ou une modification de spécificité. / Biorefineries such as biofuels are nowadays considered as essential to reduce our dependence on oil products. In the production process of bioethanol from lignocellulosic biomass, enzymatic hydrolysis performed by Trichoderma reesei enzymes is the main bottleneck of the process and requires improvements.The present work is part of the Futurol project, and aims at identifying new enzymes to improve the activity of T. reesei toward lignocellulose. Post-genomic analyses on twenty fungal strains have revealed the potential of this approach to identify lignocellulolytic enzymes of interest. Comparative genomics also led to the selection of two endo-mannanases from families GH5 and GH26 from the fungus Podospora anserina. These hemicellulases significantly improved glucose release upon T. reesei hydrolysis of spruce. An in-depth fondamental study allowed the solving of cristallographic structures and revealed the relationships between enzymatic specificities and structural characteristics. The structure of GH26 catalytic module appended to CBM35 highlighted a short and rigid linker and an atypical active site organization. The two mannanases were subjected to molecular engineering. Variants displaying improved catalytic efficiency and/or modified specificity were identified for both enzymes.

Les archées sont principalement connues pour leur capacité à croître et survivre dans des conditions extrêmes de température, pression, pH, etc. qui sont hostiles à l’homme. Néanmoins, il est désormais clair que les archées sont aussi présentes de manière ubiquitaire dans divers environnements. L’étude détaillée des différents aspects de la biologie de ces microorganismes a amené à des découvertes pour le moins inattendues comme celle de la virosphère associée aux archées qui est unique. En effet, plusieurs virus infectant les archées ont été isolés et présentent une incroyable diversité tant au niveau morphologique que génomique et ne ressemblent aucunement aux virus connus de bactéries ou d’eucaryotes. Récemment, l’analyse en détails du cycle viral a mis à jour de nouveaux mécanismes d’interactions avec la cellule hôte. Au cours de mes travaux de thèse, nous nous sommes intéressés aux systèmes virus-hôtes présents dans les milieux hyperthermiques et acidophiles en sélectionnant les virus fusiforme et filamenteux SSV1 et SIRV2 en tant que modèles d’étude. Tout d’abord, nous avons défini une nouvelle classification des virus fusiformes en basée sur l’analyse comparative des protéines structurales et des génomes viraux. L’ensemble des virus considérés forme un réseau global malgré le fait qu’ils ont été isolés dans des environnements distincts ; qu’ils infectent des hôtes qui sont distant phylogénétiquement parlant et que certains de leurs virions présentent une certaine pléomorphicité. Ensuite, la caractérisation en détails de l’architecture des virions fusiformes de SSV1 a révélé qu’ils étaient enveloppés, composés de protéines de capside glycosylées et contenaient le complexe nucléoprotéique. Finalement, nous nous sommes concentrés sur la manière dont les virus d’archées interagissent avec la cellule hôte. Alors que les virions de SIRV2 semblent utiliser une stratégie pour l’entrée qui est similaire aux bactériophages dits flagellotrophiques ; on observe que les virions de SSV1 emploient un mécanisme de sortie qui rappelle le bourgeonnement des virus eucaryotes enveloppés. L’ensemble de ces recherches participent à une meilleure compréhension de la biologie des archées ainsi que de leurs virus et permettent de définir des cibles intéressantes pour de futures études. / Although, archaea were initially regarded as exotic microorganisms capable of growing in conditions which are hostile to humans, it became clear that they are ubiquitous and abundant in various environments. Detailed studies focusing on different aspects of archaeal biology have led to many unexpected discoveries, including the unique virosphere associated with archaea. Indeed, highly diverse viruses characterized by uncommon virion shapes and mysterious genomic contents have been isolated that typically do not resemble viruses of either bacteria or eukaryotes. Recent analysis of the sequential events of the viral cycle resulted in major breakthroughs in the field. In the framework of my PhD studies, I have focused on two model hyperthermo-acidophilic virus-host systems, the spindle-shaped SSV1 and rod-shaped SIRV2, both infecting organisms of the genus Sulfolobus. Initially, we defined structure-based lineages for all known spindle-shaped viruses isolated from highly divergent hosts and residing in very different environments. Then, we provided insights into the architecture of spindle-shaped viruses by showing that SSV1 virions are composed of glycosylated structural proteins and contain a lipid envelope. Finally, we focused on virus-host interplay. Whereas SIRV2 virions appear to use a similar entry strategy as flagellotrophic bacteriophages, SSV1 virions employ an exit mechanism reminiscent of the budding of eukaryotic enveloped viruses. Collectively, these studies shed light on the biology of archaeal viruses and help to define interesting targets that should be the focus of intensive research in the next future.

La société Adisseo produit un cocktail d’enzymes hydrolytiques appelé Rovabio® Excel sécrété par un champignon filamenteux Talaromyces versatilis. Ce cocktail est utilisé comme additif alimentaire pour augmenter la digestibilité de complexes polysaccharidiques en nutrition animale et ainsi augmenter la valeur nutritionnelle des matières premières agricoles. Une récente étude protéomique de ce champignon (Guais et al., 2008) a révélé la présence d’un grand nombre d’arabinofuranosidases (ABFs) appartenant à différentes familles de glycosides hydrolases : 5 ABFs de la famille GH54, 3 ABFs de la famille GH62 et enfin une de la famille GH51. Un des objectifs de mes travaux de thèse a été le clonage, l’expression hétérologue (hôte lévurien Pichia pastoris) des 9 gènes codant pour ces 9 enzymes et la caractérisation complète de la famille GH62. La caractérisation des capacités d’hydrolyse des ABFs 54 et 62 a également été étudiée grâce à une technique d’empreintes d’hydrolyse enzymatique sur arabinoxylane de blé. Enfin, la dernière partie de mes travaux consistait à confectionner des mélanges d’enzymes hydrolytiques des différentes familles d’ABFs associés à des xylanases et de suivre l’efficacité de la dégradation de l’arabinoxylane insoluble grâce à l’utilisation d’un réacteur torique permettant l’acquisition d’images et l’analyse en ligne de la dégradation. Ces travaux sur le réacteur ont permis de mettre en évidence une synergie entre Abfs et Xylanases. / Adisseo produce and commercialize a hydrolytic enzymatic cocktail termed Rovabio and secreted by a filamentous fungus Talaromyces versatilis. This cocktail is used as feed additive for increased digestibility of complex polysaccharides in animal nutrition. A recent genomic study of this fungus revealed the presence of 5 arabinofuranosidases (Abfs) to family GH 54, 3 of GH 62 and 1 of GH51. The first aim of my thesis works was about cloning, heterologous overexpression (in pichia pastoris yeast) of this 9 genes encoding for this 9 enzymes and characterization of the family GH 62. Mode of action of ABFs 54 and 62s has been characterized by enzymatic fingerprinting analysis on wheat arabinoxylan. Then, last part was to design enzymatic cocktail with differents families of ABFs and Xylanases and test their impact on insoluble arabinoxylan hydrolysis with toric reactor. These works on reactor have bringing to light a synergy between ABFs and Xylanases

Les espèces du complexe Scedosporium apiospermum sont des agents pathogènes émergents qui se situent au deuxième rang parmi les champignons filamenteux rencontrés au cours de la mucoviscidose. Ils sont omniprésents et particulièrement rencontrés dans les zones polluées. En dépit de leur importance clinique, nos connaissances sur leur biologie moléculaire et leur physiologie restent limitées. Chez les champignons, la paroi constitue un bouclier protecteur face à des conditions environnementales défavorables, et joue un rôle essentiel dans la pathogénicité. Ici, nous avons étudié les changements dynamiques de la paroi des conidies de S. boydii, l’une des deux espèces majeures de ce complexe avec S. apiospermum, avec pour objectif d'identifier des facteurs de virulence potentiels. En utilisant une large variété de techniques, allant de la microscopie électronique à balayage ou à transmission à l’analyse protéomique des protéines à ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) en passant par la microélectrophorèse et la partition de phase, la cytométrie en flux, la microscopie de force atomique, la résonance paramagnétique électronique, ou encore des techniques moléculaires, nous avons mis en évidence diverses modifications qui se produisent dans la paroi pendant la maturation et la germination des conidies de S. boydii et nous avons identifié la DHN-mélanine ainsi qu'un nombre important de protéines à ancre GPI. Enfin, nous avons fourni la première séquence complète du génome de S. apiospermum qui appuierait les différents domaines de la recherche sur ces champignons que ce soit pour l’étude des mécanismes pathogènes ou pour des applications biotechnologiques. / Species of the Scedosporium apiospermum complex are emerging human pathogens which rank the second, after Aspergillus fumigatus, among the filamentous fungi colonizing the airways of patients with cystic fibrosis. These fungi are ubiquitous in nature and particularly encountered in polluted areas. Despite their clinical relevance, our knowledge about their molecular biology and physiology remains rather limited. In fungi, the cell wall forms a protective shield against adverse environmental conditions, and therefore plays a key role in pathogenesis, which makes it an interesting target for antifungal drug development. Here, in an attempt to identify potential virulence factors, we investigated the dynamic changes of the cell wall of conidia in S. boydii, one of the main pathogenic species within this species complex with Scedosporium apiospermum. Using various techniques, ranging from scanning and transmission electron microscopy to proteomic analysis of glycosylphosphatidylinositol (GPI)- anchored proteins, through two-phase partitioning and microelectrophoresis, atomic force microscopy and chemical force spectroscopy, flow 5 cytometry, electron paramagnetic resonance and molecular techniques, we highlighted various modifications occurring in the cell wall during maturation and germination of S. boydii and we identified DHN-melanin as well as a substantial number of GPI-anchored proteins in the cell wall. Finally, we provided the first publicly available genome sequence of S. apiospermum that would support various research fields on these fungi whether for understanding their pathogenic mechanisms or for various biotechnological applications.

Le champignon filamenteux, Podospora anserina, possède deux types sexuels, mat+ et mat-, caractérisés chacun par une séquence spécifique. La séquence mat+ contient un seul gène FPR1; la séquence mat- contient trois gènes : FMR1, SMR1 et SMR2. La fonction moléculaire de SMR1 est inconnue, les autres gènes codent des facteurs de transcription qui contrôlent la fécondation (reconnaissance intercellulaire), et le passage d'un syncytium à un hyphe spécialisé binucléé contenant un noyau mat+ et un noyau mat- (reconnaissance internucléaire). Il n'y a pas eu d'analyse exhaustive des gènes impliqués dans la reconnaissance intercellulaire et le mécanisme de la reconnaissance internucléaire est encore inconnu. Afin de déterminer les cibles de FPR1 et FMR1, et les différents mécanismes impliqués, nous avons utilisé une approche microarray. Le profil transcriptomique des souches mat+ et mat- compétentes pour la fécondation a permis d'identifier 157 gènes cibles, et l'analyse transcriptomique des souches mutantes fpr1- et fmr1- a révélé que ces cibles peuvent être soit réprimées, soit activées par FMR1 ou FPR1, ou être sous le contrôle de ces deux facteurs. Ces expériences ont aussi détecté l'existence de 10 gènes activés ou réprimés au même niveau dans mat+ et mat-. La délétion de 32 gènes choisis parmi ces 167 gènes cibles n'a permis de mettre en évidence que deux gènes impliqués dans la fécondation. Les comparaisons des gènes cibles des facteurs de transcription MAT de Gibberella moniliformis et Sordaria macrospora avec ceux de P. anserina révèlent un nombre significatif de gènes cibles communs entre ces espèces, mais ces gènes ont des profils transcriptomiques différents, soulevant la question du rôle de ces gènes cibles. La recherche des gènes cibles de FPR1, FMR1 et SMR2 impliqués dans la reconnaissance internuléaire a été effectuée en comparant le transcriptome des périthèces issus de deux croisements, l'un n'exprimant que les gènes spécifiques mat+, l'autre que les gènes spécifiques mat-. Les résultats ont été interprétés selon le modèle d'identité nucléaire et le modèle de ségrégation aléatoire. Le premier modèle a conduit à l'identification de 27 gènes cibles, tandis que 154 gènes cibles ont été identifiés en appliquant le deuxième modèle. Au total 46 souches mutantes ont été construites. Cependant aucune délétion n'a affecté le développement sexué. En parallèle de ces expériences transcriptomiques, nous avons invalidé tous les gènes à HMG-box de P. anserina. Les résultats montrent que ces derniers ont un rôle très important dans le développement sexué, particulièrement Pa_1_13940 qui code un régulateur des gènes des types sexuels, le premier identifié chez les Pezizomycotina.

L’avènement de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a révolutionné la microbiologie en permettant l’identification précise des bactéries et des levures en seulement quelques minutes. En 2010, la MALDI-TOF SM n’était pas applicable à l’identification des champignons filamenteux. Un protocole d’identification générant des spectres interprétables de champignons filamenteux fut d’abord mis au point, suivi par le développement d’une architecture de banque originale. Enfin une banque de références solides, intégrant des références pour la majorité des espèces de moisissures impliquées en pathologie humaine, fut créée en collaboration avec le BCCM/IHEM. Les qualités d’identification de cette banque ont été démontrées non seulement à l’échelle localemais également à l’échelle nationale . Dans un second temps, nous sommes intéressés à l’identification des levures. Nous avons déterminé qu’une extraction complète est le meilleur protocole d’identification des levures en utilisant la banque de référence Bruker ™. Afin d’améliorer le diagnostic clinique,nous avons testé un protocole d’identification sur un séries de 6192 levures isolées de prélèvements cliniques reçus au laboratoire pendant un an. Enfin nous avons pu démontrer en utilisant nos « systèmes » d’identification par MALDI-TOF MS la sous-estimation de la diversité des espèces de moisissures et de levures isolées des prélèvements cliniques, lorsqu’on ne disposait que de techniques conventionnelles d’identification. La mise à disposition d’un tel outil ouvre de grandes perspectives dans le domaine de la mycologie, tant d’un point de vue épidémiologique que clinique. / During the last decade, MALDI-TOF MS has revolutionized microbiology by enabling the accurate identification of bacteria and yeast in only few minutes1. At the beginning of this work in 2010, MALDI-TOF MS was not yet optimized for mold identification. To meet this need, we established an identification protocol to generate interpretable mold spectra. The structure of the reference database was developed taking intoaccount the heterogeneity of molds in culture. Finally, a comprehensive reference database,including references for the majority of molds encountered in human pathology, was created in collaboration with the BCCM/IHEM. Identification performance of this database was tested and validated at both a local scale and an international scale . We also determined the best-adapted pre-treatment protocol to identify yeasts in a routine setting. The protocol was tested on a panel of 6192 yeast isolates recovered from clinical samples submitted to our laboratory over the course of one year. Using our fungal identification system, we were able to identify morphologically similar species and highlight the underestimation of fungal pathogen diversity. The development of our MALDI-TOF MS-based fungal identification system presents numerous opportunities in the field of mycological, from both an epidemiological and clinical point of view. In subsequent studies, defining the clinical meaning of emerging species identified via MALDI-TOF MS will profoundly modify our perspective of fungal diseases.

Cette étude a pour objectif la mise en évidence, chez les basidiomycetes du genre Pycnoporus, de nouvelles oxydo-réductases impliquées dasn la dégradation de la biomasse végétale: de l'expression des gènes aux applications biotechnologiques. Les champs d'application visés concernent essentiellement le domaine de la chimie verte, dans le cadre du projet européen BIORENEW. Le travail s'est articulé autour de trois axes principaux. Le premier a concerné l'exploration de la biodiversité naturelle en particulier tropicale, pour la sélection de souches productrices de nouvelles laccases de haut potentiel d'oxydo-réduction. Le gène codant pour la laccase Lac1 chez Pycnoporus a été utilisé comme marqueur moléculaire d'identification et de relation phylogénie-fonction, mettant en évidence une distribution des souches fortement corrélée avec leur écozone. Le deuxième axe a porté sur l'isolement de trois nouvelles laccases issues de P.sanguineus et P. coccineus qui exhibent des caractéristiques biochimiques complémentaires: haute thermostabilité, résistance aux solvants, au pH, constantes catalytiques et potentiels rédox élevés. Ces enzymes constituent de bons modèles pour des applications en biotechnologies blanches:décoloration de colorants polyphénoliques, oxydation de composés modèles de type lignine non-phénolique, oligomérisation de flavonoides naturels adaptés aux applications cosmétiques et pharmaceutiques. Enfin, dans le cadre de l'annotation du génome des souches monocaryotiques P. cinnabarinus BRFM 137 et P; sanguineus BRFM 1264, dont le séquençage a été réalisé par notre Unité, un regard tout à fait nouveau est porté sur le système lignolytique du genre Pycnoporus, longtemps décrit comme produisant que de la laccase comme enzyme du système lignolytique. Pour la première fois, nous avons montré la présence de gènes codant pour tout l'arsenal enzymatique de dégradation des lignines, c'est à dire plusieurs laccases mais surtout de nombreuses peroxydases et des enzymes auxilliaires génératrices d'H2O2 comme les glyoxal oxydases. Ces nouvelles enzymes ont été caractérisées in silico. Pour la première fois également, la sécrétion effective de peroxydases, de glyoxal oxydases et d'autres FOLymes dans nos conditions de culture a également pu être démontrée par analyse protéomique. / The purpose of this work was to prospect, in the genus Pycnoporus, for new oxido-reductases involved in the degradation of lignocellulosic biomass: from gene expression to biotechnological applications. This research was conducted in the framework of green chemistry applications according to BIORENEW European Project. The study was divided in three main research axes. Firstly, the exploration of natural biodiversity, especially tropical biodiversity, for the selection of new high redox potential-laccase producing strains. These strains were repositionned in a context of phylogenomic/function through the lac1 gene. Molecular clustering based on lac1 sequences enabled the distribution of P. sanguineus and P. coccineus through four distinct, well supported clades and subclades. This distribution was highly correlated with ecozones. The second part of the work deals with the biochemical and molecular characterization of three novel laccases from P. coccineus and P. sanguineus, and their applicability on natural or model phenolic substrates. The three laccases showed complementary biochemical features: high thermo- and pH stability, high catalytic efficiency and resistance to organic solvents. The three novel laccases proved to be suitable models for white biotechnology processes: polyphenolic dye decolourization, non-phenolic lignin model compound oxidation, and synthesis of new oligomers from natural flavonoids suitable for cosmetic or pharmaceutical applications. Finally, annotation of genomic data from the monocaryotic strains P. cinnabarinus BRFM 137 and P. sanguineus BRFM 1264 (genomes sequenced by the UMR1163 BCF ) was performed for lignolytic enzymes. For the first time, new oxidases (peroxidases, glyoxal oxidases and other FOLymes) were evidenced in Pycnoporus and in silico characterized. Moreover, the active secretion of several of these enzymes has been demonstrated in our culture conditions by 1D-proteomic analysis

Le champignon filamenteux, Podospora anserina, possède deux types sexuels, mat+ et mat-, caractérisés chacun par une séquence spécifique. La séquence mat+ contient un seul gène FPR1; la séquence mat- contient trois gènes : FMR1, SMR1 et SMR2. La fonction moléculaire de SMR1 est inconnue, les autres gènes codent des facteurs de transcription qui contrôlent la fécondation (reconnaissance intercellulaire), et le passage d’un syncytium à un hyphe spécialisé binucléé contenant un noyau mat+ et un noyau mat- (reconnaissance internucléaire). Il n’y a pas eu d’analyse exhaustive des gènes impliqués dans la reconnaissance intercellulaire et le mécanisme de la reconnaissance internucléaire est encore inconnu. Afin de déterminer les cibles de FPR1 et FMR1, et les différents mécanismes impliqués, nous avons utilisé une approche microarray. Le profil transcriptomique des souches mat+ et mat- compétentes pour la fécondation a permis d’identifier 157 gènes cibles, et l’analyse transcriptomique des souches mutantes fpr1- et fmr1- a révélé que ces cibles peuvent être soit réprimées, soit activées par FMR1 ou FPR1, ou être sous le contrôle de ces deux facteurs. Ces expériences ont aussi détecté l’existence de 10 gènes activés ou réprimés au même niveau dans mat+ et mat-. La délétion de 32 gènes choisis parmi ces 167 gènes cibles n’a permis de mettre en évidence que deux gènes impliqués dans la fécondation. Les comparaisons des gènes cibles des facteurs de transcription MAT de Gibberella moniliformis et Sordaria macrospora avec ceux de P. anserina révèlent un nombre significatif de gènes cibles communs entre ces espèces, mais ces gènes ont des profils transcriptomiques différents, soulevant la question du rôle de ces gènes cibles. La recherche des gènes cibles de FPR1, FMR1 et SMR2 impliqués dans la reconnaissance internuléaire a été effectuée en comparant le transcriptome des périthèces issus de deux croisements, l’un n’exprimant que les gènes spécifiques mat+, l’autre que les gènes spécifiques mat-. Les résultats ont été interprétés selon le modèle d’identité nucléaire et le modèle de ségrégation aléatoire. Le premier modèle a conduit à l’identification de 27 gènes cibles, tandis que 154 gènes cibles ont été identifiés en appliquant le deuxième modèle. Au total 46 souches mutantes ont été construites. Cependant aucune délétion n’a affecté le développement sexué. En parallèle de ces expériences transcriptomiques, nous avons invalidé tous les gènes à HMG-box de P. anserina. Les résultats montrent que ces derniers ont un rôle très important dans le développement sexué, particulièrement Pa_1_13940 qui code un régulateur des gènes des types sexuels, le premier identifié chez les Pezizomycotina. / The filamentous fungus, Podospora anserina, has two mating-type idiomorphs, mat+ and mat-. The mat+ sequence contains one gene FPR1, while mat- contains three genes: FMR1, SMR1 and SMR2. The molecular function of SMR1 is unknown, FPR1, FMR1 and SMR2 encode transcriptional regulators which control the fertilization (intercellular recognition) and the transition from a syncytium to a specialized dikaryotic hypha which contains one mat+ and one mat- nucleus (internuclear recognition). No exhaustive analysis is available for the genes involved in the intercellular recognition, while the mechanism of the internuclear recognition is unknown. In order to understand the mechanism of these events and to identify the target genes of mating-type transcription factors, we used a microarray approach. The transcriptomic profiles of the mat+ and mat- strains that are competent for fertilization revealed 157 differentially transcribed genes, and transcriptomic analysis of fmr1- and fpr1- mutant strains was used to determine the regulatory actions exerted by FMR1 and FPR1 on these differentially transcribed genes. All possible combinations of transcription repression and/or activation by FMR1 and/or FPR1 were observed. Furthermore, 10 additional mating-type target genes were identified that were up- or down-regulated to the same level in mat+ and mat- strains. Of the 167 genes identified, 32 genes were selected for deletion, which resulted in the identification of two genes essential for the sexual cycle. A comparison with similar data set from the two ascomycetes, Gibberella moniliformis and Sordaria macrospora, reveals significant numbers of orthologous pairs, although transcriptional profiles were not conserved between species, questioning the function of these target genes. Internuclear recognition was investigated by the transcriptomic analysis of perithecia from two crosses expressing mat+ and mat- genes, respectively. The tow internuclear recognition models: nuclear identity and random segregation, were used to interpret our results. According to the former model, 27 target genes have been identified, while 154 target genes were identified with the latter model. A total of 46 mutant strains were constructed. However, these strains showed no defects in sexual development. Besides this microarray experiences, we have invalidated all HMG-box genes of P. anserina. The results show that the HMG-box genes have a very important role in sexual development, especially Pa_1_13940 which encodes the first identified regulator of Pezizomycotinan mating-type genes.

Les objectifs de cette thèse sont, d’une part, de développer un système d’agitation performant en termes de transfert d‘oxygène et de forces de cisaillement afin qu’il soit adapté aux cultures de levures, de bactéries et de champignons filamenteux. D’autre part, de mettre au point un procédé de production des spores de champignons en milieu liquide pour remplacer la culture sur milieu solide (boîte de roux) utilisée au démarrage de la thèse par la société DSM. Ces travaux ont permis de sélectionner le mobile type « oreilles d’éléphant » comme système d’agitation. Son efficacité de transfert d’oxygène a été caractérisée dans une large gamme de débits d’air et de vitesses d’agitation. Les données obtenues ont été modélisées pour développer un outil de prédiction du KLa et d’extrapolation de procédé d’agitation. L’approche utilisée pour l’extrapolation est basée sur la similitude non géométrique et le maintien du coefficient de transfert d’oxygène (KLa) constant entre les échelles. L’efficacité du nouveau mobile d’agitation a été validée à l’échelle pilote en présence des cultures de bactéries, de levures et de champignons. Parallèlement au choix du mobile d’agitation, un procédé de production de spores de champignons filamenteux en milieu liquide a été développé. Ainsi, le milieu de culture et les conditions opératoires de chaque étape de la fermentation (germination, croissance végétative et sporulation) ont été optimisés. Ce nouveau procédé permet d’obtenir jusqu’à 200.106 cellules par millilitre de culture aussi bien à l’échelle du laboratoire que pilote (900L). Il a été aussi validé en présence de cultures de levures et de bactéries. Sur le même principe, les données obtenues à l’échelle pilote ont permis de développer un outil d’extrapolation à l’échelle industrielle de 10 m3 / The objectives of this thesis are, on one hand, to develop an efficient system of agitation in terms of oxygen transfer and shear stress, suited for the fermentation of yeasts, bacteria and filamentous fungi, on the other hand, to develop a process of spore production in a liquid medium. This new process will be used instead of the solid culture in Roux flasks used by DSM at the beginning of the PhD program. In a first step, we have selected “Elephant Ears” impellers as stirrers; its effectiveness of oxygen transfer was characterized in a broad range of stirring speeds and airflow rates. The data obtained were modeled and a predictive tool for KLa and process extrapolation was developed. The extrapolation is based on the non-geometrical similarity and the coefficient of oxygen transfer (KLa) was kept constant between scales. The effectiveness of the new stirrer was validated in a pilot-scale in the presence of the cultures of bacteria, yeasts and filamentous fungi. Besides the studies on the stirrer, a process in a liquid medium of filamentous fungi was developed. Thus, the fermentation medium and the operating conditions of each steps of the fermentation (germination, vegetative growth, and sporulation) were optimized. This new process makes possible to obtain up to 200.106 cells per milliliter of culture on both laboratory and pilot scale (900L). Finally, the data gathered on the pilot scale was used to extrapolate this process to the industrial-scale of 10m3