Les bactéries forment des communautés spatiales adhérentes à des surfaces, appelées biofilms. Ces organisations bactériennes sont omniprésentes dans les milieux naturel, industriel et médical et peuvent porter atteinte à notre santé lorsqu'elles hébergent des agents pathogènes, parmi lesquels le médiatique Staphylococcus aureus sur lequel a porté l'ensemble de ce travail de thèse. Cette bactérie est l'une des principales causes d'infections chroniques, mais également d'infections nosocomiales, impliquant le plus souvent des biofilms. Il est aujourd'hui reconnu qu'une telle biostructure est un véritable bouclier à l'action des antimicrobiens et à celle du système immunitaire. Outre les résistances génétiques des bactéries pathogènes aux antibiotiques, l'hétérogénéité chimique et biologique de la structure tridimensionnelle des biofilms pourrait être à l'origine de ces phénomènes de tolérance et de chronicité d'infections. C'est à cette problématique que se rattache ce travail de thèse concernant l'action de la vancomycine sur des biofilms de S. aureus. Alors que les connaissances sur la réactivité de cet antibiotique clef avec S. aureus proviennent essentiellement d'études réalisées sur des cellules planctoniques, l'originalité de notre approche a été d'étudier la diffusion-réaction de la vancomycine in situ dans l'épaisseur des biofilms en utilisant en particulier des outils avancés de microscopie de fluorescence (Time-Lapse, FLIM, FRAP, et FCS). Nous avons ainsi évalué sa biodisponibilité dans la matrice d'exopolymères, ainsi que l'impact de la physiologie spécifique des bactéries incluses en biofilms sur l'activité de cet antibiotique, utilisé seul ou en association avec la rifampicine. Cette approche multidisciplinaire a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la singulière tolérance de ces biostructures à l'action des antibiotiques, et de souligner l'urgence de développer des approches préventives telles que le diagnostic précoce des infections impliquant des biofilms.

<p>Synaptic plasticity is the leading candidate for the cellular/molecular basis of learning and memory. One of the key molecules involved in synaptic plasticity is Calcium/calmodulin-dependent Kinase II (CaMKII). Synaptic plasticity can be expressed at a single dendritic spine independent of its neighboring dendritic spines. Here, we investigated how long the activity of CaMKII lasts during synaptic plasticity of single dendritic spines. We found that CaMKII activity lasted ~2 minutes during synaptic plasticity and was restricted to the dendritic spines undergoing synaptic plasticity while nearby dendritic spines did not show any change in the level of CaMKII activity. Our experimental data argue against the persistent activation of CaMKII in dendritic spines undergoing synaptic plasticity and suggest that the activity of CaMKII is a spine-specific biochemical signal necessary for synapse-specificity of synaptic plasticity. We provide a biophysical explanation of how spine-specific CaMKII activation can be achieved during synaptic plasticity. We also found that CaMKII is activated by highly localized calcium influx in the proximity of Voltage-dependent Calcium Channels (VDCCs) and a different set of VDCCs and their respective Ca2+ nanodomains are responsible for the differential activation of CaMKII between dendritic spines and dendritic shafts.</p> / Dissertation

In this thesis, the development and implementation of fluorescence lifetime imaging microscopy that integrates time correlated single photon counting (TCSPC) and a confocal microscope will be described. The TCSPC method has high detection efficiency, with a time resolution limited only by the transit time spread of the detector, and directly delivers the decay functions in the time domain. TCSPC can also be used to obtain images that indicate the fluorescence resonance energy transfer (FRET) effect between critical fluorophores, an important method distinguish the difference between binding and co-localization. Estimation of distances between RET fluorophore pairs can also be established. Additionally, the effects of ion concentration, oxygen concentration, pH value, ..etc. can also be revealed.

Η ορθή και απρόσκοπτη διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου εξασφαλίζει την πιστότητα στην αντιγραφή του γενετικού υλικού και τη μεταφορά αμιγώς της γενετικής πληροφορίας στα θυγατρικά κύτταρα. Το κύτταρο διαθέτει μια σειρά από μηχανισμούς ελέγχου που διασφαλίζουν ότι η αντιγραφή του γενετικού υλικού πραγματοποιείται μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια της φάσης S και μόνο εφόσον το κύτταρο εξέλθει από τη φάση της μίτωσης. Οποιαδήποτε απορύθμιση στους μηχανισμούς ελέγχου του κυττάρου, μπορεί να οδηγήσει σε γενετική αστάθεια, βασικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Ένα σημαντικό σημείο ελέγχου στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελεί η μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S. Η μετάβαση αυτή ελέγχεται από το σχηματισμό του προ-αντιγραφικό σύμπλοκο στις αφετηρίες έναρξης της αντιγραφής με σκοπό την ορθή τοπικά και χρονικά έναρξη της αντιγραφής, μέσα από μια διαδικασία που ονομάζεται ‘αδειοδότηση της αντιγραφής’. Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο Cdt1, που εμφανίζεται εξελικτικά συντηρημένος από το ζυμομύκητα μέχρι τον άνθρωπο. Στους ανώτερους οργανισμούς, ο παράγοντας Cdt1 υφίσταται αυστηρή ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ενώ η υπερέκφρασή του δύναται να οδηγήσει σε καρκινική εξαλλαγή, γεγονός που υποδηλώνει τον κεντρικό ρόλο που κατέχει στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Πρόσφατα βρέθηκε ο μοριακός αναστολέας του Cdt1, Geminin, ο οποίος πιστεύεται ότι παρέχει ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1 στους ανώτερους εξελικτικά οργανισμούς. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, το ενδιαφέρον μας εστιάστηκε στη μελέτη του παράγοντα Cdt1, καθώς και του αναστολέα αυτού, Geminin, σε ανθρώπινα κύτταρα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ρύθμιση που υφίστανται οι ενδογενείς παράγοντες Cdt1 και Geminin κατά την μετάβαση στη φάση ηρεμίας, καθώς και τα επίπεδα έκφρασης τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς. Τα πειράματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες Cdt1 και Geminin ελέγχονται σε μεταγραφικό επίπεδο κατά τη μετάβαση από και προς τη φάση ηρεμίας G0, αφού τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA τους μειώνονται αισθητά κατά τη μετάβαση στη φάση ηρεμίας και συσσωρεύονται σταδιακά κατά την επαναφορά στον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, οι παράγοντες Cdt1 και Geminin βρέθηκαν να υπερεκφράζονται σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς που εξετάστηκαν σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικά δείγματα. Εν συνεχεία η μελέτη προσανατολίστηκε στη διερεύνηση του τρόπου δράσης του παράγοντα Cdt1 στη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής in vivo, με χρήση σύγχρονων τεχνικών μικροσκοπίας σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια. Για τις μελέτες αυτές δημιουργήθηκε σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά που εκφράζει την πρωτεΐνη Cdt1 σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη GFP (Cdt1GFP)σε φυσιολογικά επίπεδα. Πειράματα ανοσοφθορισμού και πειράματα μικροσκοπίας time-lapse έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP συμπεριφέρεται όπως η ενδογενής τόσο ως προς τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της, όσο και ως προς τη ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η κύρια μορφή ρύθμισης του παράγοντα Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου λαμβάνει χώρα σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο και ότι η σύντηξη με την GFP δε φαίνεται να επηρεάζει τη ρύθμιση αυτή. Πειράματα Επαναφοράς Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (FRAP) σε ζωντανά κύτταρα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP διαχέεται ελεύθερα κατά το μεγαλύτερο μέρος της μίτωσης, ενώ η αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη αρχίζει στη φάση της τελόφασης και συνεχίζεται μέχρι και το τέλος της φάσης G1. Η πρόσδεση του παράγοντα Cdt1 στη χρωματίνη έχει ιδιαίτερα δυναμικό χαρακτήρα, υποδηλώνοντας ότι η δημιουργία του προ-αντιγραφικού συμπλόκου δεν είναι στατική, αλλά επαναπροσδιορίζεται καθ’ όλη τη διάρκεια της φάσης G1. Πειράματα FRAP σε ζωντανά κύτταρα που εξέφραζαν μεταλλαγμένες μορφές του παράγοντα Cdt1 επιπλέον επέτρεψαν την in vivo χαρτογράφηση των περιοχών που χρειάζονται για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη και κατέδειξαν το αμινοτελικό άκρο και τη θηλιά 2 ως περιοχές απαραίτητες για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι περιοχές που συμβάλλουν στην κύρια αλληλεπίδραση με τη Geminin, δεν συμβάλλουν στη δέσμευση του παράγοντα Cdt1 με τη χρωματίνη, σε αντίθεση με ότι είχε προταθεί από in vitro πειράματα. Με σκοπό να ανιχνεύσουμε αλληλεπίδραση του παράγοντα Cdt1 με τον αναστολέα αυτού Geminin σε συγκεκριμένο χώρο και χρόνο σε ζωντανά κύτταρα εφαρμόσαμε μικροσκοπία FLIM. Ειδική αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε σε όλο τον πυρήνα. Αντίθετα, μια μορφή της Geminin μεταλλαγμένη στην περιοχή επαφής με το Cdt1 εμφάνισε σαφώς μειωμένη ικανότητα αλληλεπίδρασης. Ποσοτικοποίηση της αλληλεπίδρασης με μικροσκοπία FLIM επέτρεψε την εκτίμηση της σχετικής συνάφειας (affinity) των δύο βιομορίων στο ζωντανό κύτταρο Πειράματα FRAP υποδηλώνουν ότι η παρουσία της Geminin δεν επηρεάζει τη δέσμευση του Cdt1 στη χρωματίνη. Αντίθετα, ο Cdt1 προσελκύει τη Geminin στη χρωματίνη και επομένως η αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής πραγματοποιείται στη χρωματίνη. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας παρέχουν μια νέα εικόνα του τρόπου με τον οποίο πραγματοποιείται η διαδικασία της αδειοδότηση της αντιγραφής φυσιολογικά καθώς και πώς θα μπορούσε να ανασταλεί η διαδικασία αυτή in vivo. / The correct order of cell cycle phases ensures precise duplication of the genome and division of the genetic material to the two daughter cells. The cell has developed several control mechanisms which ensure once per cell cycle DNA replication. Any defects in the regulation of the cell cycle could lead either to genetic aberrations or to the continuous cell division that characterizes cancer cells. In higher eukaryotes, a major control concerns the transition from G1 to S phase. This transition is regulated through the formation of the pre-replicative complex onto the origins of replications and ensures the timely initiation of replication, through a process called Licensing. A crucial component of this complex is Cdt1, which is conserved from yeasts to mammals. In higher eukaryotes, Cdt1 is strictly regulated during the cell cycle as to be present only in G1 phase, while its ectopic expression potentiates over-replication, indicating that plays a key role in S-phase onset. Recently, a molecular inhibitor of Cdt1, called Geminin, has been identified in higher eukaryotes, which is believed to provide an additional level of control over Cdt1. During this research, we focused our interest in the study of Cdt1 and Geminin in human cells. Our first aim was to study the regulation of the endogenous proteins as cells enter quiescence (G0 phase), as well their expression levels in cancer cell lines and cancer tissues. Cdt1 and Geminin appeared to be controlled at the transcription level, as in this transition protein and mRNAs levels for both factors are decreased when cells enter quiescence and gradually re-accumulate as cells re-enter the cell cycle. In addition, Cdt1 and Geminin mRNA and protein accumulate to much higher levels in cancer cells versus normal diploid cells. In the second part of this work we employed advanced microscopy techniques which permit imaging of molecular processes in live cells, in order to study the role of Cdt1 in the process of licensing in vivo. To this end, a human cell line stably expressing physiologically relevant levels of the fusion protein Cdt1GFP was generated. Immunofluorescence and time-lapse experiments revealed that Cdt1GFP recapitulates the behaviour of the endogenous protein in respect to subcellular localization and regulation through the cell cycle. Our data show that post-transcriptional regulation is sufficient to ensure correct cell cycle behaviour of Cdt1 and that GFP does not interfere with function. FRAP experiments showed that Cdt1GFP though most of mitosis is able to diffuse freely, while is transiently bound onto chromatin during telophase and up to the end of G1 phase. The Cdt1-DNA interaction is highly dynamic, indicating that the pre-replicative complex is not stably bound onto chromatin but re-establishes itself throughout the G1 phase. These experiments also allowed in vivo mapping of the Cdt1 domains necessary for DNA binding. Both the amino-terminus and loop 2 domains are necessary for the binding of Cdt1 to chromatin. In contrary to suggestion based on in vitro experiments, domains that contribute to the main interaction with Geminin do not affect the binding of Cdt1 to chromatin. By using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), interactions between Cdt1 and its inhibitor, Geminin, were detected in living cells. This interaction was abolished when a form of Geminin mutated in the Cdt1 binding domain was used. Quantitation of FLIM experiments allowed an assessment of the relative binding affinity of Cdt1 to Geminin within the living cell. FRAP experiments in cells co-expressing Cdt1 and Geminin indicate that Geminin does not affect Cdt1’s binding to chromatin; on the contrary, Cdt1 recruits Geminin onto chromatin and therefore the inhibition of Licensing by Geminin is likely to take place on chromatin. Taken together, our data allow an insight into how Licensing normally takes place and how it can be inhibited in the living cell.

The overall aim of the study is to identify the general rules for intracellular uptake and localisation of non-targeted nanoparticles by employing colloid quantum dots (QDs) as a model of biocompatible nanoparticle-based drug carriers. The investigation of intracellular uptake of non-targeted negatively charged QDs with fluorescence spectroscopy method revealed three time-related accumulation stages, which are characteristic for all investigated cell lines, but the stages were of different timing for each of the investigated cell line. The confocal fluorescence microscopy imaging showed four intracellular accumulation phases of QDs based on type and localisation of formed vesicles. The fluorescence lifetime imaging microscopy revealed the inner heterogeneity of intracellular vesicles: the endosomes at particular stage of maturity can be identified by different photoluminescence lifetimes of accumulated QDs. QDs do not penetrate plasma membranes through passive diffusion, but enter a cell through endocytosis. Negatively charged QDs without protein corona enter the cells through the single, caveolin-dependent endocytic pathway. Examination of the possibility to combine QDs, as model diagnostic probes, with anticancer agent in vitro revealed, that despite QDs alone had no cytotoxic effects on cells viability, they increased drug resistance. Therefore, this effect needs profound further research before the application of quantum dots in combined diagnosis and therapy in vivo. / Tyrimų tikslas – naudojant kvantinius taškus (KT), kaip tinkamų vaistų pernašai biosuderinamų nanodalelių modelį, in vitro nustatyti bendrus tikslingai nemodifikuotų nanodalelių patekimo į ląsteles ir lokalizacijos jose dėsningumus. Spektroskopiniais metodais ištyrus KT patekimo į ląsteles laikinę dinamiką nustatyta, kad neigiamo krūvio apvalkalo KT patekimo į ląsteles procesą galima suskirstyti į tris etapus, tačiau šie kaupimosi etapai skirtingose ląstelių kultūrose yra nevienodos trukmės. Konfokalinės fluorescencijos mikroskopijos metodu ištyrus neigiamo paviršiaus krūvio KT patekimo į ląsteles procesą, pagal viduląstelinį KT pasiskirstymą ir susiformavusių pūslelių tipus, galima suskirstyti į keturias fazes. Naudojant fluorescencijos gyvavimo trukmės vaizdinimo mikroskopijos metodą užregistruotas nuo endosomų brandos priklausantis viduląstelinių vezikulių vidinės struktūros heterogeniškumas. Skirtingos brandos endosomos gali būti apibūdinamos ir vaizdinamos remiantis jose sukauptų KT savitomis fotoliuminescencijos gyvavimo trukmėmis. Skirtingais fizikiniais ir biocheminiais metodais nustatyta, kad difuzijos būdu KT per ląstelės membraną neprasiskverbia, bet į ląsteles patenka endocitozės būdu. Nepadengti baltymais neigiamo paviršiaus krūvio KT į ląsteles patenka tik vienu nuo kaveolino priklausančiu endocitozės keliu. KT, kaip modelinių diagnostinių priemonių, ir antivėžinio preparato bendras panaudojimas in vitro atskleidė, kad KT, nesukeldami toksinio poveikio ląstelių... [toliau žr. visą tekstą]

This thesis focuses on autofluorescence of flavins in gram-negative bacteria Cupriavidus necator H16 and its mutant strain PHB-4. The main methods used were fluorescence microscopy and flow cytometry. To confirm the presence of flavins, excitation and emission spectra of the bacterial suspension were measured, which were compared with flavin standards. In the part of testing cells without stress response, the autofluorescence of bacteria in PBS buffer and cell suspensions stained with fluorescence probe BODIPY 493/503 was measured. The ratio of short fluorescence lifetime to long autofluorescence lifetime, and its dependence on fluorescence probe was compared with previous conditions. Autofluorescence of the supernatant was measured; it was found that the relative amplitude of long lifetime was multiple times higher than in the cell. In the part devoted to the stress response, this thesis was focused on the amount of dissolved oxygen in the production medium and the effect on bacterial autofluorescence. Then differently concentrated hydrogen peroxide was used, the best results were obtained from the concentration of 100 mM in media. For comparison a combination of hydrogen peroxide with ferro-ammonium sulphate was used, but there was no big difference. Sodium azide and antimycin A were selected as substances that directly influence on bacterial respiratory chain. Both compounds affected change in the ratio of the relative amplitudes, but the distribution of these lifetimes and the autofluorescence change over time was affected only by sodium azide.

This work deals with the study of fluorescence lifetime and spectral changes of nanoparticles in cell biology. It describes the principle of fluorescence, fluorescence microscopy and laser confocal microscope Leica TCS SP8. The classic FLIM method, the Lambda Square mapping and the division of nanoparticles are introduced there. In the practical part, the created program for the evaluation of fluorescence lifetime and spectral changes is described. The program can show two-dimensional lambda maps, the fluorescence lifetime and spectral shift in the space area. In the final part of the thesis, an experiment with rhodamine nanoparticles is carried out and it is evaluated using the created program and then discussed.

<p>Huntington’s disease (HD) is a devastating autosomal dominant neurodegenerative disorder for which there are no disease modifying treatments. Owing to this are the multiple biological functions of the huntingtin protein and the lack of understanding of the exact pathways being affected in HD. It is clear that the huntingtin protein normally provides anti-apoptotic support and that there are underlying energetic problems and cell stress defects associated with disease. Work from our group has shown that huntingtin acts as a stress sensor and translocates from the endoplasmic reticulum to the nucleus upon cell stress. We therefore hypothesized that huntingtin has a nuclear function in the cell stress response; which would tie together what is currently known about huntingtin, its pro-apoptotic function and the energetic defects of neurodegeneration. In this thesis we describe huntingtin as having a role in the nuclear cofilin-actin rod stress response. Cofilin is an actin binding protein normally involved in actin treadmilling. During stress, cofilin saturates F-actin leading to rod formation which functions to alleviate ATP. We show that this response is impaired in the presence of mutant huntingtin and that the aberrations in this response can be mediated through the enzyme tissue transglutaminase. Little is known about the physiological role and requirement of the cofilin-actin rod response. Therefore we created a system to test if rod formation was required in cells during stress, which indicates if and how targeting this pathway will be possible. We additionally looked at targeting the nuclear import and export properties of the cofilin protein, which directly affect rod formation and may be targetable in cofilin modifying drug discovery efforts. Overall, this work has described a specific and relevant pathway affected by mutant huntingtin and started the process of assessing this pathway as a therapeutic avenue for Huntington’s disease.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

The interior of the cell is a densely crowded and complex arena, full of a vast and diverse array of molecules and macromolecules. A fundamental understanding of cellular physiology will depend not only upon a reductionist analysis of the chemistry, structure, and function of individual components and subsystems, but also on a sagacious exegesis of the dynamic and emergent properties that characterize the higher-level system of living cells. Here, we present work on two aspects of the supramolecular organization of the cell: the controlled assembly of the mitotic spindle during cell division and the regulation of cellular metabolism through the formation of multienzyme complexes. During division, the cell undergoes a profound morphological and molecular reorganization that includes the creation of the mitotic spindle, a process that must be highly controlled in order to ensure that accurate segregation of hereditary material. Chapter 2 describes results that implicate the kinase, Zeste-white3/Shaggy (Zw3/Sgg), as having a role in regulating spindle morphology. The congregation of metabolic enzymes into macromolecular complexes is a key feature of cellular physiology. Given the apparent pervasiveness of these assemblies, it seems likely that some of the mechanisms involved in their organization and regulation might be conserved across a range of biosynthetic pathways in diverse organisms. The Winkel laboratory makes use of the flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis as an experimental model for studying the architecture, dynamics, and functional roles of metabolic complexes. Over the past several years, we have accumulated substantive and compelling evidence indicating that a number of these enzymes directly interact, perhaps as part of a dynamic globular complex involving multiple points of contact between proteins. Chapter 3 describes the functional analysis of a predicted flavonol synthase gene family in Arabidopsis. The first evidence for the interaction of flavonoid enzymes in living cells, using fluorescent lifetime imaging microscopy fluorescent resonance energy transfer analysis (FLIM-FRET), is presented in Chapter 4. / Ph. D.

Die Assemblierung von Influenzaviren erfolgt an Rafts der apikalen Wirtszellplasmamembran mit denen das Hämagglutinin (HA) über Acylierungen im C-Terminus und hydrophobe Aminosäuren seiner Transmembrandomäne (TMD) interagiert. M2 besitzt eine cytoplasmatische amphiphile Helix (AH), die ebenso potenzielle Raft-Motive aufweist: Eine Acylierung und Cholesterol-Bindemotive. In dieser Arbeit wurde per Konfokalmikroskopie an polarisierten Zellen, die fluoreszenzmarkierte M2-Varianten exprimierten, gezeigt, dass diese M2-Motive nicht für den apikalen Transport, der vermutlich durch Raft-ähnliche Vesikel erfolgt, benötigt werden. Messungen des Förster-Resonanzenergietransfers über Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM-FRET) in der Plasmamembran lebender Zellen, die fluoreszenzmarkiertes HA und M2 koexprimierten, ergaben, dass diese Motive auch nicht für die Interaktion mit den durch HA, in Abhängigkeit von dessen Raft-Motiven, stabilisierten Raft-Domänen notwendig sind. Mittels reverser Genetik konnten infektiöse WSN-Viren mit fehlender Acylierung am Ende der HA-TMD, nicht jedoch Viren ohne die zwei cytoplasmatischen Acylierungen hergestellt werden. Weiterhin ergaben Wachstumsanalysen, dass die Acylierung von HA und M2 für den gleichen Schritt des viralen Replikationszyklus von Bedeutung sind. Für die M2-AH wurde postuliert, dass sie die Membrankrümmung detektiert und durch Insertion in die Wirtszellmembran die Virusabschnürung bewirkt. Infektiöse Viren ohne M2 oder ohne die AH konnten ebenso wie Viren mit M2 mit einer Helix mit reduzierter Amphiphilität in dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Allerdings führte die Substitution der AH durch typische krümmungsdetektierende oder modulierende Helices zu Viren, deren Wachstum um zwei bis vier Titerstufen im Vergleich zum Wildtyp reduziert war. Die Helix-Amphiphilität scheint wichtig zu sein, aber auch die Sequenz oder bestimmte Aminosäuren sind offenbar für eine effiziente Virusreplikation notwendig. / The assembly of influenza virus particles occurs at the apical plasma membrane of the host cell at membrane rafts which the hemagglutinin (HA) interacts with via acylations in its C-terminal region and via hydrophobic amino acids in the transmembrane domain (TMD). M2 possesses a cytoplasmic amphiphilic helix (AH) that also contains potential raft motifs: an acylation and cholesterol-binding motifs. In this work, confocal microscopy of polarised cells, which were expressing fluorescently labelled M2-variants, demonstrated that these motifs of M2 are not required for apical transport, which is assumed to be mediated by raft-like vesicles. Furthermore, FLIM-FRET (Förster resonance energy transfer measured via fluorescence lifetime imaging microscopy) analyses, performed in the plasma membrane of living cells coexpressing fluorescently labelled HA and M2, revealed that these M2-motifs are not required for association with the large coalesced raft phase organised by HA. In contrast, deleting HA’s raft-targeting features clearly reduced clustering with M2. While the removal of the two cytoplasmic acylations prevented the rescue of infectious virus by reverse genetics, a mutant virus without acylation in the HA-TMD could be rescued. Moreover, growth analyses revealed that the acylations of HA and M2 are important for the same step in the viral replication cycle. It has been postulated that the M2-AH detects membrane curvature and accomplishes membrane scission by inserting into the host cell membrane. Viruses without M2, without the M2-AH or with M2 containing a helix with reduced amphiphilicity could not be produced in this work. However, substituting the AH by typical curvature-sensing or -generating helices led to viruses with two to four orders of magnitude reduced growth as compared to wildtype virus. The amphiphilicity of the helix seems to be important, but also the sequence or specific amino acids appear to be necessary for an efficient virus replication.