La fosfo-defosforilación de aminoácidos es uno de los procesos de regulación reversible más extendidos en los seres vivos. Este tipo de reacciones es llevado a cabo por la acción opuesta de las proteínas quinasas y las proteínas fosfatasas. A pesar de ello, el genoma de la levadura codifica un número mayor de Ser/Thr quinasas. Por ello, algunas fosfatasas han desarrollado un mecanismo de regulación distinto, que se basa en la unión de la subunidad catalítica a una o más subunidades reguladoras. Éstas determinan la localización subcelular, la especificidad por el sustrato y, en definitiva, la función de la fosfatasa. Éste es el caso de la fosfatasa de tipo 1, que está codificada por GLC7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae, un enzima esencial que desarrolla funciones muy importantes en la biología de la célula y cuya función está regulada por la unión de la subunidad catalítica a multitud de subunidades reguladoras distintas.El genoma de la levadura codifica dos fosfatasas, conocidas con el nombre de Ppz1 y Ppz2 y cuya mitad carboxiterminal está relacionada estructuralmente con Glc7. A pesar de no ser esenciales, estas fosfatasas desarrollan un papel importante en la biología de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En concreto, ejercen un control negativo sobre la tolerancia salina y la progresión del ciclo celular y positivo en el mantenimiento de la integridad celular. En el momento de iniciar este trabajo sólo se conocía una subunidad reguladora de estas fosfatasas, conocida con el nombre de Hal3 o Sis2. Esta proteína actúa como inhibidora de todas las funciones conocidas de Ppz1. Sin embargo, su mecanismo de actuación es desconocido.El primer objetivo de este trabajo ha sido intentar profundizar en la regulación que lleva a cabo la fosfatasa Ppz1 en el control del ciclo celular de la levadura. Para ello, se ha generado un doble mutante condicional sit4 hal3 que presenta una parada entre las fases G1 y S del ciclo. Esta cepa se ha transformado con dos genotecas multicopia diferentes. Gracias a ello se han podido aislar una serie de genes que, en multicopia son capaces de suprimir el fenotipo de esta cepa. Entre ellos se encuentran elementos reguladores del ciclo celular ya conocidos, algunas fosfatasas, elementos involucrados en homeostasis salina y tres genes cuya función era desconocida por el momento, que han sido renombrados VHS1, VHS2 y VHS3. En segundo lugar, se ha investigado el mecanismo de acción de Hal3 sobre la fosfatasa Ppz1. Para ello se han estudiado elementos hallados en la secuencia de Hal3 posiblemente relevantes para la función de esta proteína. Además, se ha realizado una estrategia de mutagénesis al azar de la zona más conservada de Hal3 seguida de una búsqueda de pérdida de función. Esto ha permitido hallar una serie cambios aminoacídicos únicos que interfieren en la función de Hal3. La caracterización bioquímica posterior ha permitido determinar dos regiones en la secuencia de Hal3 importantes para la unión a Ppz1 y una tercera región importante para inhibir a la fosfatasa.Finalmente, se ha estudiado el papel biológico de YFR003c, un ORF cuya función era desconocida por el momento. Estos estudios han demostrado que codifica una proteína con características afines a los inhibidores de la fosfatasa de tipo 1 humana. Además, se ha podido demostrar que Yfr003c es capaz de unirse e inhibir in vitro a Glc7 y, con menor eficiencia, a Ppz1. Estudios posteriores in vivo refuerzan la hipótesis del papel de Yfr003c como inhibidor de Glc7. Por este motivo, ha recibido el nombre de Ypi1 (Yeast Phosphatase 1 Inhibitor) y se ha propuesto como el primer inhibidor conocido de Glc7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae. / Phospho-dephosphorylation of amino acids is one of the most extended mechanisms of reversible regulation found in living organisms. This kind of reactions is driven by the opposite action of kinases and phosphatases. In spite of this fact, yeast genome encodes more Ser/Thr protein kinases. For this reason some phosphatases have developed a different regulatory mechanism based on the union of the catalytic subunit to one or more regulatory proteins which in turn regulate the subcellular location, the specificity for substrate and thus, the function of the phosphatase. This is the case of Protein Phosphatase 1, encoded by the essential gene GLC7 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. This enzyme plays an important role in the yeast and it is tightly regulated by the union of the catalytic subunit to different regulatory proteins.The genome of the yeast also encodes two phosphatases, named Ppz1 and Ppz2 that are structurally related to Glc7. Although they are not essential, they also play an important role in the biology of the yeast. These phosphatases act negatively in the control of the progression of cell cycle and in the maintenance of the salt tolerance and positively in the control of osmotic integrity. In the early steps of this work there was described only one regulatory subunit of these phosphatases named Hal3 or Sis2. Although its specific mechanism of function is still unknown it has been described that this protein acts as an inhibitor for all the known functions of Ppz1.In this work we tried to deepen in the regulation of the cell cycle progression driven by Ppz1. For this reason, we created a conditional sit4 hal3 double mutant, which presents, in non-permissive conditions, a blockade between the G1 and S phases of the cell cycle. This strain was transformed with two different multicopy libraries and colonies able to grow in non-permissive conditions were selected and plasmidic DNA extracted and sequenced. This procedure allowed us to identify a total of 13 genes that, when overexpressed, were able to suppress the phenotype of this strain under non-permissive conditions. They include well-known cell cycle regulatory elements but also some phosphatases, some genes that develop different roles in the control of salt tolerance and three genes with no known function until now that we renamed VHS1, VHS2 and VHS3. We also investigated the regulatory interaction between Hal3 and Ppz1. For this reason, we studied some elements found in the sequence of Hal3 that could be relevant for the function of this protein. Furthermore, we developed a strategy of random mutagenesis of the most conserved region of Hal3 followed by a screening of loss of function of the protein. This procedure allowed us to identify several amino acidic changes that affect Hal3 function in vivo. Biochemical characterization shows the presence of two regions in Hal3 that are important for the union to Ppz1 and a third one that is relevant in the inhibition of the phosphatase activity.Finally, we studied the biological role of YFR003c, an uncharacterized ORF with no known function. Our work demonstrated that YFR003c encodes a protein that shares characteristics commonly found in some inhibitors of the human protein phosphatase 1. We have shown that YFR003c is able to interact with Glc7 and Ppz1 in vitro. Furthermore, YFR003c acts as an inhibitor of Glc7 and, in a lesser degree, of Ppz1. Overexpression studies have shown that YFR003c can act in vivo as an inhibitor of Glc7. For this reason we renamed it YPI1 (for Yeast Phosphatase 1 Inhibitor) and it has been proposed to be the first endogenous inhibitor of Glc7 in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

Fragmentos de DNA que contiene características estructurales encontrados en Ser /Thr proteínas fosfatasas fueron amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de DNA genómico de levadura. La amplificación se llevó a cabo mediante el uso de oligonucleótidos degenerados correspondientes a secuencias conservadas en las proteínas fosfatasas de tipo 1, 2A y 2B. Un fragmento de amplificación de 215 pares de bases se utilizó para un rastrear una biblioteca de DNA genómico seleccionada por tamaño. Se identificó un clon positivo que se aisló y secuenció. La secuencia de nucleótidos revela un ORF de 2076 pares de bases que codifica una proteína de 692 aminoácidos, a la que hemos denominado Ppz1. La mitad carboxi-terminal de esta proteína está estructuralmente relacionada con la fosfatasa de tipo 1, mientras que la mitad amino-terminal de la mitad de la proteína no está relacionada con las secuencias encontradas en otras proteínas fosfatasas. Esta región es muy rica en residuos de Ser y presenta un elevado número de aminoácidos básicos. Este producto génico representa una nueva clase de proteína fosfatasa en base a su singular estructura. El gen PPZ1, que está situado en el cromosoma XIII, se transcribe como un mRNA de aproximadamente 2,7 kilobases, y se ha encontrado que su cantidad aumenta de 3 a 4 veces a lo largo del cultivo. Hemos generado anticuerpos contra Ppz1 e identificado el producto génico de PPZ1 por análisis de inmunoblot a partir de extractos celulares como una proteína de 75-kDa. La cantidad de la proteína inmunoreactiva aumentó en las células que llevaban varias copias del gen. La interrupción del gen a dado lugar a células viables, sin detectarse cambios fenotípicos, lo que indica que el gen PPZ1 no es esencial para el crecimiento. Los experimentos de Southern blot preliminares en condiciones de baja estringencia han puesto de manifiesto la existencia de una secuencia genómica relacionada con PPZ1, a la que denominamos PPZ2. / DNA fragments containing structural characteristics found in Ser/Thr protein phosphatases were amplified by polymerase chain reaction from yeast genomic DNA. Amplification was carried out by using degenerate oligonucleotides encoding conserved sequences found in type 1, 2A, and 2B phosphatases. A 215-base pair amplification fragment was used to screen a size-selected library of genomic DNA. A positive clone was isolated and sequenced. Its nucleotide sequence reveals a 2076-base pair ORF encoding a 692-aminoacid protein that we called Ppz1. The carboxy-terminal half of this protein is structurally related to type I phosphatases, whereas the amino-terminal half of the protein is unrelated to sequences found in other protein phosphatases. This region is very rich in Ser residues and presents a high number of basic amino acids. Therefore, the gene product, on the basis of its unique structure would represent a novel class of protein phosphatase. The PPZ1 gene, which is located at chromosome XIII, is transcribed as an mRNA of about 2.7 kilobases and the amount of message has been found to increase 3- to 4- fold during the culture. We raised antibodies against Ppz1 and identified the PPZ1 gene product by immunoblot analysis of cell extracts as a 75-kDa protein. The amount of the immunoreactive protein was increased in cells carrying multiple copies of the gene. Disruption of the gene resulted in viable cells, with no detectable phenotypic change, indicating that the gene is not essential for growth. Preliminary Southern blot experiments at low stringency revealed the existence of a genomic sequence related to PPZ1 that we called PPZ2.

En el llevat de fissió Schizosaccharomyces pombe Cdc25 és inhibida per fosforilació en resposta a una aturada en la replicació o a dany al DNA per les cinases Cds1 i Chk1. En el nostre grup hem vist que la cinasa activada per estrés Srk1 també està involucrada en la regulació de l'entrada en mitosi a través de la fosfatasa Cdc25.Estudis de co-precipitació i de fosforilació van demostrar la interacció entre Srk1 i Cdc25, així com la fosforilació de Cdc25 per Srk1 in vitro i per Srk1 immunoprecipitada a partir d'extractes cel·lulars. D'altra banda, la fosforilació per Srk1 estabilitza Cdc25 de forma depenent de la proteïna 14-3-3, i la manté retinguda al citoplasma.La fosforilació per Srk1 té lloc en la regió N-terminal de Cdc25, en els mateixos residus fosforilats per les cinases Chk1 i Cds1, i la fosforilació en aquests llocs és necessària per tal que proteïna Srk1 provoqui un bloqueig en la fase G2 del cicle cel·lular. Nosaltres demostrem que Srk1 no regula Cdc25 en resposta a estrès genotòxic, sinó en resposta a estrès ambiental no-genotoxic durant la fase G2. L'estrés osmòtic i oxidatiu provoquen un augment en la taxa transcripcional de Srk1 i una activació de la proteïna depenent de la MAPK Sty1. Sty1 fosforila Srk1 en la treonina 463, augmentant 5 vegades la seva activitat. Srk1 és necessària per mantenir els nivells de Cdc25 durant la resposta a estrès i per tal d'induir la seva estabilització a través de la unió a la proteïna 14-3-3. Tots aquests resultats suggereixen un model en el que Srk1 bloqueja en primer lloc el cicle cel·lular en resposta a estrès ambiental, de forma paral·lela a l'activació transcripcional de gens necessaris per protegir la cèl·lula, i en segon lloc, Srk1 estabilitza Cdc25 per tal que la cèl·lula pugui iniciar la divisió un cop s'ha adaptat a l'estrès.

Phosphateses (EC 3.1.3.x) are a group of enzymes that hydrolyze phosphoesters. That way they affect the energetic metabolism of a cell and its regulation. Phosphatases that dephosphorylate proteins are an integral part of signaling pathways, stress responses and they modulate enzymatic activity. This thesis deals with the study of phosphatases obtained from tobacco leaves (Nicotiana tabacum, L.). Solution of enzymes was prepared by extraction in both acidic and alkaline buffers. Through the use of the chromogenic substrate pNP-phosphate it was determined that there is a higher phosphatase activity in the glycosylated fraction than in the fraction that did not bind to Con A Sepharose. The research of the ions effect on the phosphatase activity has determined that Mg2+ and Ca2+ show positive effect on the phosphatase activity while the effect of Co2+ and Mn2+ is inhibitory. The Zn2+ ions have shown no effect whatsoever. The glycosylated phosphatases also dephosphorylated low-weight-molecular substrates phosphoserine, ATP and glucose-6-phosphate. The research of protein phosphatase activity discovered the affinity to the substrate phosvitin, although neither to casein nor its tryptic cleaves. Detailed experiments have shown that the pH optima for all the substrates lie from pH 5 to 6. Glycosylated phosphatases...

El objetivo de este estudio fue evaluar los factores asociados a la impactación del tercer molar inferior en pacientes atendidos en una clínica universitaria de Chiclayo durante el año 2023. En este estudio se incluyó 120 participantes que contaban con al menos un tercer molar inferior impactado visible en una radiografía panorámica, donde se evaluó el grado de impactación según Pell & Gregory y el espacio retromolar; además, se tomó una muestra sanguínea donde se determinó el grupo sanguíneo y el nivel de fosfatasa alcalina en sangre. Los resultados mostraron una impactación de los niveles A (47.5%), B (40.8%) y C (11.7%), mayor prevalencia de impactación en el sexo femenino y no se encontró una correlación positiva entre la fosfatasa alcalina, grupo sanguíneo, espacio retromolar y la impactación del tercer molar mandibular. Se concluye que no existe relación entre la fosfatasa alcalina, el grupo sanguíneo, el espacio retromolar y la impactación del tercer molar inferior. / The objective of this study was to evaluate the factors associated with the impaction of the lower third molar in patients treated at a university clinic in Chiclayo during the year 2023. This study included 120 participants who had at least one impacted lower third molar visible in a panoramic radiograph, where the degree of impaction according to Pell & Gregory and the retromolar space were evaluated; In addition, a blood sample was taken where the blood group and the level of alkaline phosphatase in the blood were determined. The results showed an mpaction of levels A (47.5%), B (40.8%) and C (11.7%), a higher prevalence of impaction in the female sex and no positive correlation was found between alkaline phosphatase, blood group, space retromolar and impaction of the mandibular third molar. It is concluded that there is no relationship between alkaline phosphatase, blood group, retromolar space and impaction of the lower third molar.

Phosphatases of the haloacid dehalogenase superfamily are one of the cell's tools for dephosphorylation of many diverse endogenous and exogenous compounds. This work is aimed at enzymes Tt82 and cytosolic purine 5'-nucleotidase II (cN-II), two members of this large enzyme superfamily. The Tt82 originates in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus thioreducens. Up to date, there is only a small amount of knowledge about properties and biological function of this enzyme. Based on its sequence and structure, it was predicted that the Tt82 should possess a phosphatase catalytic activity. Consequently, potential substrates of the Tt82 were proposed by the molecular docking. In this work, the phosphatase activity of the Tt82 was confirmed together with several of its substrates: AMP, D-glucose 1-phosphate, D-glucose 6-phosphate and p-nitrophenyl phosphate (pNPP). Activity towards AMP and pNPP was then characterized by steady-state kinetics at 37 řC and 60 řC. In consistence with its thermophilic origin, the Tt82 showed markedly higher activity towards both substrates at 60 řC. Nonetheless, the effectivity of the Tt82 catalytic activity towards these substrates was actually very low. This leads to assumption, that the identified substrates are probably not biologically relevant. On the other hand, it is quite...

El inmunosupresor FK506 (Tacrolimus, Prograf) ha incrementado la tasa de supervivencia del trasplante de órganos. FK506 ejerce su acción inmunosupresora mediante la inhibición de la fosfatasa calcineurina en células T activadas. Desgraciadamente, la terapia con FK506 está asociada con efectos no terapéuticos indeseados, entre los que destaca la diabetes, que implican otras dianas distintas de calcineurina. Para identificar estas dianas hemos estudiado la toxicidad celular de FK506 en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. FK506 aumentó la sensibilidad de la levadura a estrés osmótico de un modo independiente de calcineurina y las proteínas de unión a FK506. FK506 también indujo un fuerte ayuno de aminoácidos y la activación de la ruta de control general de nutrientes (GCN). La prototrofía de triptófano o el exceso de triptófano eliminó la toxicidad de FK506, lo que muestra que el ayuno de triptófano media este efecto. La mutación de los genes GCN3 y 4 alivió parcialmente la toxicidad de FK506, lo que sugiere que la activación de la ruta GCN por FK506 también está implicada en la tolerancia osmótica. FK506 reforzó la fosforilación de la kinasa Hog1p dependiente de estrés osmótico pero sin inducción de un reportero dependiente de Hog1p. Interesantemente, la interrupción del gen GCN2 suprimió la hiperfosforilación de Hog1p dependiente de FK506 y restauró la actividad del reportero dependiente de Hog1p. A la inversa, la interrupción del gen HOG1 afectó a la activación de Gcn2p y traducción de un reportero GCN4-lacZ dependientes de FK506. Esto pone de manifiesto la existencia de una interacción funcional entre las kinasas Gcn2p y Hog1p. En conjunto estos datos demuestran que tanto el ayuno de aminoácidos como la activación de la ruta GCN inducidos por FK506 contribuyen a la sensibilidad celular a estrés osmótico y revelan un bucle regulador positivo entre las rutas GCN y HOG. Dada la naturaleza conservada de estas rutas, este mecanismo de toxicidad de FK506 / Rodríguez Hernández, CJ. (2006). Identificación de nuevos mecanismos moleculares del inmunosupresor FK506 en Saccharomyces cervisiae [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1849