A fosfolipase A2 (PLA2) é uma enzima chave no metabolismo dos fosfolípides de membrana e é um dos principais componentes envolvidos na sinalização celular. Alterações da atividade da PLA2 tem sido descritas no cérebro e no sangue (soro, plasma e plaquetas) de pacientes com diversas doenças neuropsiquiátricas. Neste estudo foi desenvolvido um ensaio radioenzimático para detectar em plaquetas, a atividade dos três principais grupos de PLA2, que são PLA2 secretórias ou PLA2 extracelular dependente de Ca 2+ (sPLA2); PLA2 citósólicas dependentes de Ca 2+ (cPLA2) e as PLA2 intracelulares independentes de Ca 2+ (iPLA2). Para confirmar a presença desses grupos da enzima em plaquetas, algumas variáveis foram testadas, como as diferenças de preferência ao ácido graxo como substrato, o requerimento de cálcio e a inibição seletiva com os inibidores Bromoenol lactone (BEL) e o Methyl Arachidonyl Fluorophosphonate (MAFP). Os resultados obtidos demonstram a presença dos três principais grupos de PLA2 (sPLA2, cPLA2, and iPLA2) em plaquetas. Estes achados sugerem o uso de plaquetas, uma amostra biológica de fácil acesso, como possível modelo periférico de neurônios para o estudo do metabolismo de fosfolípides. / Phospholipase A2 (PLA2) is a key-enzyme in the metabolism of membrane phospholipids and is one of the major components involved in cell signaling. Alterations of PLA2 activity have been reported in brains and blood cells in several neuropsychiatric diseases. In this study we developed a radio-enzymatic assay to detect in platelets the activity of the three main groups of PLA2, which are secretory PLA2 or extracellular calcium dependent PLA2 (sPLA2), cytosolic calcium dependent PLA2 (cPLA2) and intracellular calcium independent PLA2 (iPLA2). To confirm the presence of these PLA2 groups some variables were tested, such as differences in the preferred fatty acid substrate, calcium dependence, and selective inhibition with Bromoenol lactone (BEL) and Methyl Arachidonyl Fluorophosphonate (MAFP). Our findings demonstrate the presence of the three main groups of PLA2 (sPLA2, cPLA2, and iPLA2) in platelets. In addition, this study is in line with others suggesting that platelets, a typical biological sample, can be used as a peripheral model for neurons.

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) catalisam a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios. Membros da sub-família de fosfolipases A2-Lisina49 (PLA2-Lys49), isolados de venenos de serpentes Viperidae mostram uma substituição do resíduo de aspartato na posição 49 por uma lisina, com a eliminação concomitante da atividade hidrolítica contra fosfolipídeos. Apesar da ausência de atividade catalítica, as PLA2-Lys49 apresentam propriedades farmacológicas variadas incluindo miotoxicidade, e danifica membranas artificiais por um mecanismo Ca2+-independente, que não envolve hidrólise de fosfolipídeos. As PLA2-Lys49 formam homodímeros em solução, e estudos cristalográficos e espectroscópicos de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, revelaram que a transição na estrutura quaternária do dímero provoca a mudança de posição da região C-terminal, apoiando a sugestão do envolvimento desta região no modelo proposto de danificação da membrana Ca2+-independente. Um papel para a região Cterminal das PLA2-Lys49 também foi sugerido na atividade bactericida observada para esta proteína, e o presente estudo investiga uma possível correlação entre a atividade de danificação de membranas Ca2+-independente e o efeito bactericida. O efeito bactericida de BthTx-I e mutantes da proteína na região C-terminal foi avaliado contra bactéria Escherichia coli (K12). A BthTx-I nativa e recombinante tiposelvagem apresentaram alta atividade bactericida com uma concentração de 5 mg/mL, porém as mutantes Y117W, Y119W, K122A e F125W reduziram significativamente este efeito, mostrando uma correlação entre os determinantes estruturais das atividades bactericida e de danificação em membranas artificiais. Na tentativa de correlacionar o mecanismo de danificação de membranas artificiais com a atividade bactericida de BthTx-I contra linhagem E.coli (K12), um estudo por partição de sondas fluorescentes em compartimentos celulares específicos foi realizado. A sonda hidrofóbica N-fenil-N-naftilamina (NPN) foi utilizada para avaliar a integridade da membrana externa da bactéria e a sonda Sytox Green (SG) para avaliar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana. A cinética de permeabilização da membrana externa é rápida e não foi influenciada por mutagênese da região C-terminal da proteína. Entretanto, a cinética de permeabilização da membrana plasmática mostrou-se lenta, com um efeito máximo de 2 horas de ação e identificou os mesmos determinantes estruturais como os identificados para a atividade bactericida de BthTx-I. Resultados obtidos pelas técnicas de citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão auxiliaram os dados evidenciando a importância da região C-terminal de BthTx-I na atividade bactericida contra linhagem E.coli. / Phospholipases A2 (PLA2 - EC 3.1.1.4) catalyze the hydrolysis of acid ester bonds at the sn-2 position of glycerophospholipids liberating fatty acids and lysophospholipids as catalysis products. Lysine 49 phospholipase A2 (Lys49-PLA2) are isolated from the venom of viperid snakes, and in these proteins, the aspartic acid at position 49 is replaced by a lysine, resulting in the elimination of hydrolytic activity against phospholipid substrates. Despite the absence of catalytic activity, these Lys49-PLA2s present various pharmacological properties and furthermore damage artificial membranes by a Ca2+-independent mechanism. Lys49- PLA2s form homodimers in solution, and crystallographic and spectroscopic studies of the bothropstoxin-I (BthTx-I), a Lys49-PLA2 isolated from venom of Bothrops jararacussu, reveal that a quaternary structure transition in the homodimer results in a change in the position of the C-terminal loop of the protein, suggesting the involvement of this region in the Ca2+- independent membrane damaging activity. A role for the C-terminal region of Lys49-PLA2 has also been suggested for the bactericidal activity of theses proteins, and using BthTx-I one as a model system, the present study investigates the possible correlation and between the Ca2+-independent membrane damaging and the bactericidal activities. The bactericidal effect of native BthTx-I and site-directed mutants of the C-terminal loop was evaluated using the Gram negative bacteria E. coli strain K12. Both the native and wild type recombinant BthTx-I presented a high bactericidal activity at a concentration of 5 mg/mL, whereas the mutants Y117W, Y119W, K122A and F125W showed significantly reduced the bactericidal effects, showing a correlation between the structural determinants of the bactericidal and membrane damaging activities. The fluorescent probe NPN was used to evaluate the integrity of the external membrane of the bacterial cells after exposure to the BthTx-I and mutants. The permeabilization of the external membrane is complete within 2 minutes, and neither the kinetics nor the extent of membrane damage was influenced by mutagenesis in the C-terminal region. The fluorescent probe Sytox Green (SG) was used to evaluate the integrity of the bacterial plasma membrane, an event which showed a significantly slower kinetic, with a maximum effect observed after two hours exposure to the BthTx-I. Furthermore, the extent of the membrane damage is influenced by mutagenesis in the C-terminal loop, and the structural determinants for the bactericidal activity of BthTx-I are the same as those that determine the permeabilization of the bacterial plasma membrane. Evidence obtained using flow cytometry and transmission electron microscopy support of the suggestion that the C-terminal region of BthTx-I is an important structural determinant of the plasma membrane damaging bactericidal activities.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

Os conhecimentos sobre os mecanismos regulatórios responsáveis pelo crescimento dos fungos filamentosos apresentam lacunas e sua compreensão é necessária para o desenvolvimento de uma terapêutica antifúngica mais adequada, assim como para incrementar a síntese de produtos de interesse comercial. Assim sendo, estudar o envolvimento do Ca2+ na resposta de um fungo modelo como A. nidulans sob fontes de carbono diferentes constitui um meio de gerar conhecimentos sobre as características de crescimento dos fungos filamentosos, de sua resposta a adaptação ambiental e dos mecanismos que controlam essa resposta. Analisou-se na linhagem A26 e na AP27, esta última com ruptura do gene da plcA, o gradiente de Ca2+ citosólico, a morfologia das hifas, a germinação e o ciclo de divisão nuclear quando as linhagens tinham calcineurina ou calmodulina inibidas e quando os canais de Ca2+ estavam bloqueados ou abertos. Os níveis de Ca2+ citosólico na linhagem A26, crescendo em presença de glicose, foram maiores que os detectados em meio suplementado com pectina. O ciclo de germinação e divisão celular no AP27, independentemente da fonte de carbono, mostrou-se mais lento se comparado com a linhagem A26, provavelmente devido ao fato de seus estoques intracelulares de Ca2+, tanto em nível vesicular quanto citosólico, serem menores. A linhagem AP27 apresentou ramificações dicotômicas nas pontas das hifas e nas hifas laterais em ambas as fontes de carbono nas quais foi cultivada, o que não se observou na linhagem A26. Quando calcineurina foi inibida por ciclosporina A, as hifas das duas linhagens, em ambas condições de cultivo, alongaram-se menos e apresentaram-se mais ramificadas, no entanto este efeito foi mais pronunciado em presença de glicose, e entre as duas linhagens pode-se dizer que foi mais intenso na linhagem AP27, demonstrando a importância dos níveis de cálcio na atividade desta enzima e conseqüentemente no desenvolvimento normal das hifas. A abertura dos canais de Ca2+, por ionóforo, produziu hiperramificação em ambas as linhagens, mas principalmente quando cresciam em pectina e ao contrário do efeito observado em presença de verapamil, que bloqueia os canais de Ca2+, não promoveram hifas laterais e nem pontas dicotômicas. No entanto o outro bloqueador dos canais de Ca2+ testado, ácido caurenóico, apresentou efeito morfológico diferente, pois as hifas tornaram-se curvas o que indica perda de polaridade. O inibidor da calmodulina (TFP) retardou a germinação, principalmente no mutante AP27, quando crescendo em presença de glicose. Lembrando que o complexo Ca2+/CaM ativa a calcineurina e que o mutante apresenta menores níveis de cálcio, esse resultado é justificável. A ruptura do gene plcA não impediu o crescimento e desenvolvimento do mutante, provavelmente porque a função desta enzima poder ser provida por outras partes do genoma, mas comprometeu os níveis intracelulares de cálcio e conseqüentemente a sua morfologia. Este estudo mostra a importância da fosfolipase C, para manutenção dos níveis intracelulares de Ca2+, no desenvolvimento normal das hifas de A. nidulans e, pela primeira vez, demonstra que esses níveis são diferentes quando o fungo cresce em presença de uma fonte de carbono, prontamente metabolizável ou não. Esses resultados conferem ao cálcio um papel modulador nessas condições de cultivo. / The knowledge about regulatory mechanisms responsible for filamentous fungi growth presents lacks and its understanding is important to develop adequate antifungal therapy either to contribute the synthesis of interestingly commercial products. By this way, study Ca2+ relationship to a fungal model as A. nidulans about different carbon sources, constitute knowledge about the filamentous fungi growing characteristics, environment adaptation and its control mechanisms. The strains A26 and AP27 was analyzed, this last one with disruption plcA gene, cytosolic Ca2+ gradient hyphal morfology, germination and nuclear division cycle when these strains had calcineurin or calmodulin inhibition and Ca2+ channel were blocked or opened. Cytosolic Ca2+ levels in A26 strain, growing in the presence of glucose was higher than supplemented media with pectin. AP27 strain, independently of carbon source, demonstrated lower germination and cell division than A26 strains, probably due to the fact that intracellular Ca2+ stocks either vesicular as cytosolic levels were lower. AP27 strain presented dichotomous branching at tip-high and lateral hyphae, at both carbon source that was grown, didnt observed at A26 linkage. When calcineurin was inhibited by cyclosporin A, hyphae from both strains, in both growth conditions, had less elongated and showed more branching, however this effect was more pronounced in presence of glucose, and between both strains was more intense at AP27 strain, indicating the importance of Ca2+ levels at this enzymatic activity and therefore the normal development of hyphae. The opening of Ca2+ channel by ionophore, produced hyperbranching in both strains, even when growth in pectin and in contrast of effect observed in the presence of verapamil, that blocks Ca2+ channels, didnt promote lateral or tip high dichotomous branching. However kaurenoic acid, an another Ca2+ channel blocker tested, presented different morphological effect, because hyphae became curved, indicating loss of polarity. Calmodulin inhibitor (TFP) delayed germination mainly at mutant AP27, when growing in the presence of glucose. Remembering that Ca2+/CaM complex activate calcineurin and the mutant exhibit lower Ca2+ levels, justifying this results. The rupture of plcA gene didnt affected growth and development of mutant, probably because the function of this enzyme can be provided by another parts of genoma, damaged the Ca2+ intracellular levels and consequently its morphology. This study shows the importance of fosfolipase C to maintaining the intracellular Ca2+ levels, at the normal hyphae development of A. nidulans and for the first time, demonstrating that this levels are different when fungi are grown in the presence of carbon source, promptly metabolizable or not. This results gives to Ca2+ as modulator at growth conditions.

A Apis mellifera é um inseto pertencente à ordem Himenóptera, família Apidae, possui ocorrência cosmopolita e grande importância ecológica, econômica e médica. As subespécies hibridas que ocorrem no Brasil possuem características predominantemente africanas e passaram a ser conhecidas como abelhas africanizadas. As principais características das abelhas africanizadas são o comportamento agressivo, boa resistência a doenças, alta produção de mel e o aumento da frequência de enxameamentos, que tem causado preocupação por estar acompanhado, de aumento no número de acidentes. A agressividade e o aumento da frequência do exameamento fazem com que elas estejam repetidamente envolvidas em ataques massivos a humanos e animais, tornando esse tipo de envenenamento um problema de saúde pública. A busca de tratamento para o envenenamento tem sido alvo de diversas pesquisas. De uma forma geral, os tratamentos atuam sobre os efeitos causados pelo veneno (medicamentos) ou sobre os componentes do veneno (soros e inibidores). Os principais componentes do veneno são a fosfolipase A2 (PLA2) e a melitina. A PLA2 é uma das principais proteínas do veneno, que degrada a membrana plasmática das células e tem o seu efeito potencializado pela presença da melitina. A PLA2 da Apis mellifera possui a estrutura protéica determinada e sítio ativo identificado. Essas características qualificam a PLA2 como potencial alvo de estudos de planejamento de fármacos. A estratégia de planejamento de fármacos tem como objetivo acelerar o processo de identificação de ligantes, contribuindo para o processo da descoberta de fármacos. Este trabalho teve como objetivo identificar in silico potenciais inibidores contra a PLA2 de Apis mellifera, avaliar in vitro e in vivo a potencial atividade inibitória dos compostos selecionados e identificar a citotoxicidade in vitro dos compostos. A estrutura da PLA2 foi obtida da base de dados (PDB) e a busca de compostos feita das bibliotecas Maybridge e Chembridge. A triagem virtual foi realizada com o auxilio do programa GOLD. Os compostos identificados (22 da Maybridge e 68 da Chembridge) pelos programas GOLD foram filtrados com o uso das ferramentas computacionais para seleção dos compostos com melhores interações no sítio ativo. Os parâmetros utilizados como filtros foram as análises das ligações químicas e os campos de interação molecular. Os compostos selecionados (20 da Maybridge e 29 da Chembridge) foram submetidos a um grupo de programas computacionais para predição de características físico-químicas (drug-like), toxicidade e atividade biológica dos ligantes. Os resultados das predições sugeriram que os compostos da Chembridge fossem utilizados nas análises experimentais. Os compostos da biblioteca Chembridge foram adquiridos (29 do total de 49 compostos). Os compostos tiveram as suas potenciais atividades inibitórias avaliadas in vitro e in vivo. A atividade fosfolipásica foi avaliada para os 29 compostos e 11 apresentaram atividade inibitória contra PLA2. Os 11 compostos foram avaliados in vivo com o experimento de indução de edema e 5 compostos conseguiram reduzir o edema. Os compostos foram avaliados em relação a citoxicidade que poderiam causar. A citotoxicidade in vitro foi calculada para 3 compostos dos 5 inibidores obtidos. O resultado do experimento identificou 2 compostos como citotóxicos e 1 com menor citotoxicidade. Apesar da citotoxicidade identificada, mais estudos devem ser realizados para determinar a concentração inibitória não tóxica. Portanto, o trabalho identificou 5 potenciais inibidores específicos contra a PLA2 de Apis mellifera. / Apis mellifera is an insect belonging to the order Hymenoptera , Apidae family , has cosmopolitan occurrence and major ecological , economic, and medical . The hybrid subspecies that occur in Brazil have predominantly African features and came to be known as Africanized bees . The main characteristics of Africanized bees are aggressive behavior , good disease resistance, high honey production and increased frequency of enxameamentos , which has caused concern to be monitored , the increase in the number of accidents . The aggressiveness and increased frequency of exameamento cause they are repeatedly involved in massive human and animal attacks , making this kind of poisoning a problem of public health. The search for treatments for poisoning has been the subject of several studies . In general , treatments act on the effects caused by poison ( drug ), or the components of poison ( sera and inhibitors) . The main components of the venom are A2 ( PLA2 ) and phospholipase melittin . PLA2 is a major venom proteins , which degrades the plasma membrane of the cells and its effect is potentiated by the presence of melittin . The Apis mellifera PLA2 has determined the protein structure and active site identified . These characteristics qualify PLA2 as a potential target for drug design studies . The strategy for drug design aims to accelerate the identification of ligands , contributing to the process of drug discovery . This study aimed to identify in silico potential inhibitors of PLA2 Apis mellifera , in vitro and in vivo the potential inhibitory activity of selected compounds and identify the in vitro cytotoxicity of the compounds . The structure of PLA2 was obtained from the database (PDB ) and the search for compounds made from Maybridge Chembridge and libraries. The virtual screening was done with the aid of the GOLD program. The identified compounds ( 22 and 68 of the Maybridge Chembridge ) by GOLD programs were filtered with the use of computational tools for the selection of compounds with better interactions in the active site . The parameters used were as filters analyzes of chemical bonds and the fields of molecular interaction. The selected compounds ( 20 and 29 of the Maybridge Chembridge ) were submitted to a group of computer programs for the prediction of physico- chemical characteristics ( drug -like) , toxicity and biological activity of the ligands . The results of the predictions suggest that the compounds of Chembridge were used in experimental analysis . The compounds were obtained from Chembridge library (29 of 49 compounds). The compounds had their potential inhibitory activity evaluated in vitro and in vivo . The phospholipase activity was assessed for compounds 29 and 11 showed inhibitory activity against PLA2 . The 11 compounds were evaluated in vivo experiment with the induction of edema and 5 compounds were able to reduce edema . The compounds were evaluated for cytotoxicity that could cause . The in vitro cytotoxicity was calculated for three of the compounds obtained 5 inhibitors . The result of the experiment identified as cytotoxic compounds 2 and 1 with lower cytotoxicity . Despite the cytotoxicity identified , further studies should be conducted to determine the non-toxic inhibitory concentration . Therefore, the study identified 5 potential specific inhibitors of PLA2 Apis mellifera.

Os insetos são os mais numerosos animais encontrados no mundo, com mais de 675 mil espécies conhecidas. Pertencentes à ordem Hymenoptera, da superfamília Apoidea, as abelhas são encontradas distribuídas em aproximadamente 20 mil espécies. No Brasil estima-se que existam 1.700 espécies. Uma das principais espécies é a Apis mellifera, com ocorrência cosmopolita. A Apis mellifera, popularmente conhecida como abelha africanizada, é agressiva, enxameia várias vezes ao ano e utiliza uma grande variedade de locais para nidificar. Esse comportamento aumenta o contato direto entre o inseto e a população, aumentando o número de acidentes. Os acidentes com abelhas representam um problema de saúde pública em diversos países do mundo pela freqüência com que ocorrem e pela mortalidade que ocasionam. O presente estudo propõe a busca por inibidores naturais contra o veneno de abelhas. Um sistema e uma base de dados foram desenvolvidos para a integração entre dados de plantas medicinais antivenenos e os venenos de abelhas. As atividades anti-hemorrágica, anti-proteolítica, anti-miotóxica, antifosfolipase e anti-edema de plantas medicinais antiveneno foram analisadas por meio de ensaios farmacológicos. As possíveis interações entre as toxinas Melitina e Fosfolipase A2 com inibidores foram avaliadas, através do docking virtual. O banco de dados, denominado Bee Venom, foi implementado e os dados de bancos de dados públicos foram inseridos no sistema. O sistema foi liberado para acesso público no endereço eletrônico http://gbi.fmrp.usp.br/beevenom/. Durante a análise da proteína Melitina foram encontradas as regiões da proteína em que os possíveis inibidores devem interagir e identificadas as propriedades químicas que os inibidores devem possuir para interagir corretamente com a Melitina. Nas análises in silico foi possível identificar 10 possíveis inibidores que interagiram corretamente com o sítio ativo da Fosfolipase A2. Algumas espécies do Banco de Germoplasma da FMRP/USP foram obtidas e utilizadas nos experimentos de atividade fosfolipásica indireta e de Edema, sendo possível observar inibição do veneno total e da proteína Fosfolipase A2. Os compostos sintéticos e inibidores avaliados não causaram inibição em todos os experimentos avaliados. Já as plantas obtidas no laboratório de Toxinas Animais e Inibidores Naturais e Sintéticos causaram inibição do veneno total e da proteína Fosfolipase A2. / Insects are the most numerous animals worldwide, with more than 675 thousand known species. Belonging to Hymenoptera order, Apoidea, superfamily, bees are found distributed in approximately 20 thousand species. In Brazil there are about 1,700 species. One of the major species is Apis mellifera, with cosmopolitan occurrence. Apis mellifera, popularly known as Africanized bee, is aggressive, swarm several times per year and uses a great variety of locals to nidificate. This behavior raises the contact between the insect and the population, increasing the accidents numbers. Bee accidents represent a public health problem in many countries because of their frequency and mortality. The present study proposes to search for natural inhibitors of bee venom. A system and a data base have been developed to integrate anti-venom medicinal plants data and bee venoms. Plants activities against venom have been evaluated by farmacological assays, such as anti-hemorraghic, anti-proteolitic, anti-myotoxicity, anti-Phospholipase and anti-edema. The possible interactions between Melittin and Phospholipase A2 toxins with inhibitors have been evaluated by virtual docking. The data base, denominated Bee Venom, was implemented and the data from public data bases have been inserted in the system. The system was released to public access in the following address http://gbi.fmrp.usp.br/beevenom/. In Melittin analysis the protein regions which the inhibitors may act have been found and also the chemical properties that the inhibitors must have to interact with Melitina have been identified. During in silico analysis it was possible to identify 10 possible inhibitors that interacted well with Phospholipase A2 active site. Some plants species from FMRP/USP Germoplam Bank have been obtained and used in the indirect Phospholipase activity and edema, being possible to observe inhibitions of total venom and Phospholipase A2 protein. The synthetic compounds and inhibitors evaluated did not cause inhibition in any experiments. However, the plants obtained on Animals Toxins and Natural and synthetic Inhibitors laboratory have caused inhibition of total venom and Phospholipase A2 protein.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:00:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rojas-Hualpa_JoseMiguel_M.pdf: 2266212 bytes, checksum: ad52a054d91af49b26ef11cf744381fe (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:30:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_VeronicaCristinaGomes_D.pdf: 49857534 bytes, checksum: b3727eb6c966531052574dc180e90fd1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Mesmo após décadas do descobrimento dos anti-inflamatórios inibidores de fosfolipase continua a busca por novas moléculas que sejam capazes de apresentar esse efeito terapêutico sem a indução de efeitos colaterais. O objetivo deste estudo foi obter extrato polar de partes aéreas de Tithonia diversifolia, viabilizando um padrão de qualidade para esse extrato a partir da identificação de seus principais constituintes e após essa determinação, avaliar o seu efeito sobre a atividade de frações de fosfolipase A2 básicas secretórias (sPLA2) obtidas de Bothrops jararacussu (Bj) e Crotalus durissus ssp (Cd). Os extratos foram obtidos por infusão e decocção e após a identificação dos constituintes por cromatografia e LC/MS-MS, determinou-se que o extrato de melhor rendimento foi obtido por decocção e que seus principais constituintes são derivados do ácido cinâmico: cafeoil-glicosídico, tagitinina C e ácido quínico. A técnica de molecular imprint (MP) permitiu uma separação dos constituintes sendo uma metodologia prática. O extrato polar apresentou atividade anti-agregante plaquetária na concentração de 0,6 a 20µg/mL, frente ao estímulo de indução por trombina, o que representa que o chá não é tão inerte e que pode promover complicações em indivíduos com distúrbios de coagulação. A purificação de Bj e Cd foi realizada por técnicas cromatográficas, com rendimento de aproximadamente 30% (p<0,05) de sPLA2. Ensaio enzimático in vitro, que utilizou substrato cromogênico sintético de PLA2 o 4-nitro-3-octanoiloxi-benzóico (NOBA) identificou que o extrato polar foi capaz de reduzir em 60% (p<0,05) a atividade enzimática de sPLA2 de Bj, independente do tipo de tratamento aplicado. A redução da atividade de sPLA2 de Cd foi reduzida em 30% (p<0,05) quando a mesma foi incubada por 30 min em presença do extrato. As modificações dos efeitos patológicos causados por sPLA2s foram avaliadas por ensaios in vivo. A ação edematogênica de sPLA2 de Bj foi reduzida em 50% (p<0,05), quando esta estava em presença do extrato, independe de prévia incubação, já a mesma ação para sPLA2 de Cd foi reduzida drasticamente pelo extrato, no entanto, após 60 min da administração do agente indutor de inflamação, a capacidade miotóxica com consequente liberação de creatina-quinase (CK) foi modulada pelo extrato de forma distinta dependendo da fonte de sPLA2. Para sPLA2 de Bj o extrato promoveu uma atividade protetora de liberação de CK, pois reduziu a liberação da enzima quando foi aplicado intraperitoneal 30 min antes do agente agressor, no entanto, a sPLA2 de Cd apresentou capacidade reduzida de liberação de CK quando foi incubada com o extrato por 30min antes da aplicação do mesmo no músculo do cobaio. Diante da ação do extrato sobre a inflamação induzida por sPLA2 buscou-se, através de técnica da reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR em tempo real), determinar a influência do extrato na expressão de genes envolvidos na inflamação. Determinou-se que o gene Nf-Kb, embora responda a presença do extrato, é o que mais tardiamente é ativado (ou expresso), possivelmente por ser nuclear. Através desses ensaios foi possível determinar a ação desses extratos sobre a resposta inflamatória aguda induzida pela ação de sPLA2s de venenos de serpentes / Abstract: Even after decades of the discovery of the anti-inflammatory inhibitors of phospholipase, there is a continuous search for new molecules which are able to provide this therapeutic effect without inducing side effects. The aim of this study was to obtain polar extract of the aerial parts of Tithonia diversifolia, enabling a quality standard for this extract from the identification of its main constituents and after this determination, to evaluate its effect on the activity of fractions A2 phospholipase basic secretory (sPLA2) obtained from Bothrops jararacussu (Bj) and Crotalus durissus ssp (Cd). The extracts were obtained by decoction and infusion and after the identification of the chromatography and LC / MS-MS. It was determined that the best yield of extract was obtained by decoction and its main constituents are cinnamic acid derivatives: caffeoyl - glycosidic, tagitinina C and quinic acid. Molecular imprint technique (MP) enabled separation of the constituents being a practical methodology. The polar extract showed anti-platelet activity at a concentration of 0.6 to 20 ?g/mL, opposite the stimulus induced by thrombin, which indicates that tea is not as inert and may promote complications in patients with coagulation disorders. Purification of Bj and Cd was performed by chromatographic techniques, with a yield of approximately 30% (p<0,05) of sPLA2. In vitro enzyme assay, which used synthetic chromogenic substrate of sPLA2 4-nitro-3-octanoyloxy benzoic acid (NOBA), it was identified that the polar extract was able to reduce by 60% (p<0,05) the enzymatic activity of sPLA2 Bj, regardless of the type of treatment applied, the reduction of the activity of sPLA2 Cd was reduced by 30% (p<0,05) when it was incubated for 30 min in presence of the extract. The modifications of the pathological effects caused by sPLA2s were evaluated by in vivo tests. The edematous action of sPLA2 Bj was reduced by 50% (p<0,05) when it was in presence of the extract, independent of incubation, since the same action for sPLA2 Cd was drastically reduced by the extract, however, after 60 min of administration of the agent inducer of inflammation, the myotoxic capacity with consequent release of creatine - kinase (CK) was modulated by the statement differently depending on the source of sPLA2, sPLA2 Bj to extract promoted a protective activity of CK release, because it reduced the release of enzyme, when applied intraperitoneally, 30 min before the offending agent, however, sPLA2 Cd showed reduced ability to release when CK was incubated with the extract for 30 min before application of the same muscle. Before the action of the extract on the sPLA2 induced inflammation was sought through the technique of polymerase chain reaction in real time (real time PCR), to determine the influence of the extract on the expression of genes involved in inflammation. We determined that Nf - Kb gene was the answer that although the presence of the extract is that the later is activated (or expressed), possibly because it was nuclear. Through these studies it was possible to determine the effect of these extracts on the acute inflammatory response induced by the action of sPLA2s from snake venoms / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T10:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Heleno_MauricioAurelioGomes_D.pdf: 8695465 bytes, checksum: 8ac64464abefb901cab1d4e5b6b96336 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma grande variedade de toxinas provenientes de venenos animais tem sido largamente utilizada no estudo de mecanismos de ação e processos fisiológicos, sendo consideradas valiosas ferramentas moleculares. As serpentes peçonhentas expressam no veneno diversas proteínas muito estudadas e utilizadas clinicamente, apresentando diferentes graus de variabilidade inter e intraespecífica em suas composições e nos seus efeitos biológicos. O conhecimento obtido com os estudos destas moléculas tem grande importância clínica na compreensão dos processos fisiopatológicos envolvidos nos envenenamentos ofidicos e também acadêmico-tecnológica, devido à possibilidade do desenvolvimento de novos instrumentos moleculares utilizados na pesquisa e também de novos modelos moleculares para princípios ativos de drogas. Neste trabalho pesquisamos as atividades neurotóxica, miotóxica e inflamatória de uma PLA2 básica, D49, purificada do veneno da serpente Bothrops roedingeri após duas etapas cromatográficas, exclusão molecular em Sephadex G-75 e hidrofobicidade em HPLC de fase reversa em coluna 'mi'-Bondapak C-18. A BrTX-I apresentou massa molecular relativa em tomo de ~14 kDa (SDS-PAGE) e confirmada por espectrometria de massas (ESI-MS), em 14.358,69 Da. A análise da composição de aminoácidos da BrTX-I, revelou que esta é constituída aproximadamente por 120 resíduos aminoacídicos, com alto conteúdo de aminoácidos básicos e hidrofóbicos, resultando em um valor calculado de pI de 8,63. A presença de 14 resíduos de cisteína sugere a formação de sete pontes dissulfeto. A análise estrutural da BrTX-I foi realizada por ESI-MS e as regiões analisadas mostraram semelhança com outras PLA2 miotóxicas isoladas de venenos botrópicos. A BrTX-I apresentou alta atividade PLA2 e um comportamento tipo sigmoidal em baixas concentrações do substrato. Atividade PLA2 ótima da BrTX-I foi em pH 8,0 e temperatura de 37°C. A BrTX-I mostrou-se dependente de Ca2+ (mM) e na sua substituição por zn+2, Mn+2, Mg+2 e Cd+2 a atividade foi reduzida. O estudo da homologia sequencial da BrTX-I mostrou posições extremamente conservadas na molécula. Nas posições 1 e 2 há predominância da sequência de aminoácidos (DL), na posição 4 (Q). Uma das regiões altamente conservadas na sequência de aminoácidos das PLA2 é a alça de ligação ao cálcio, segmento ...YGCYCGXGG. Resíduos formando a alça de ligação ao cálcio e a rede catalítica da BrTX-I mostraram um alto grau de conservação, refletindo na manutenção da atividade. A região relacionada à atividade neurotóxica pré-sináptica (80-11 O) apresentou principalmente resíduos hidrofóbicos. Em preparações ex vivo, o veneno e a BrTX-I causaram rápido bloqueio da neurotransmissão na preparação biventer cervicis de pintainho de modo similar a outras Bothrops, sem alterar significativamente as respostas contraturantes à adição de AChe de KCl (5 e 20 'mi'g/mL), indicando atividade neurotóxica pré-sináptica. Em camundongos, a BrTX-I induziu miotoxicidade local, determinada pelo aumento nos níveis plasmáticos de CK e mostrou efeito pró-inflamatório analisado através da formação do edema de pata e liberação das citocinas IL-1 , IL-6 e TNF-'alfa'. Como BrTX-I produz um efeito inflamatório, a hidrólise de fosfolipídios pode ser relevante na fisiopatología do envenenamento / Abstract: A great variety of animal venom toxins has been widely used in the study of action mechanisms and metabolic processes, thus considered valuable molecular tools. Poisonous snakes contains in their venom several well studied and clinically used proteins, showing these venoms different intra or interspecific variability degrees in their composition and biological effects. The knowledge obtained with these molecules study, has a great clinical relevancy understanding pathophysiological process regarding snake envenomations, and also academic technological, due to the possibility to develop new molecular tools and new molecular models to study active principies of some drugs. ln this work, we study neurotoxic, myotoxic and inflammatory activities of BrTX-I, a basic PLA2, purified from Bothrops roendigeri snake venom after two chromatographic steps, using molecular exclusion chromatography (Sephadex G-75) and reverse phase HPLC on 'mi'-Bondapak C-18 column. BrTX-I showed relative molecular mass around 14 kDa (PAGE) and specific molecular mass of 14,358.69 Da was determined by ESl-MS mass spectrometry. The amino acid composition analysis showed that BrTX-I contains 120 aminoacidic residues with high content of basic and hydrophobic amino acids, resulting in a calculated pi value of 8. 63. The presence of 14 Cysteine residues, suggests the formation of seven dissulfide bonds. Structural analysis of BrTX-I PLA2, performed by ESI-MS showed high identity values when compared to other myotoxic PLA2, isolated from Bothrops snakes venoms. BrTX-I presented high PLA2 activity and showed a sigmoidal behavior at low substrate concentrations. The BrTX-I reached its maximal PLA2 activity at pH 8.0 and 37 °C. Maximum PLA2 activity required Ca2+ (mM) and substitution of Ca2+ by zn+2, Mn+2, Mg+2 or Cd+2 showed reduced enzymatic activity. Sequence homology studies of BrTX-I showed extremely conserved positions in the molecule. ln positions 1 and 2, there is a predominance of the amino acids sequence (DL), and in position 4 (Q). One of the highly conserved regions in the amino acid sequences of PLA2 is the Ca2+ -binding loop, segment ... YGCYCGXGG. Residues forming the Ca2+-binding loop and the catalytic network of BrTX-I PLA2 showed a high conservation grade, reflecting the non-decreased catalytic activity. The region related to the presynaptic neurotoxic activity (80-110), showed mainly the presence of hydrophobic residues. ln ex vivo studies, the whole venom and BrTX-I caused a fast blockade of the neuromuscular transmission in young chick biventer cervicis preparations m a similar way to other Bothrops species, without alters significantly the contractures induced by ACh and KCL at doses of 5 and 20 'mi'g/mL, respectively, indicating presynaptic neurotoxic activity. ln mice, BrTX-I induced local myotoxicity, determined by increase in CK serum leveis, and showed proinflammatory effects analyzed through edema-forming activity and citokines IL-1 , IL-6, and TNF'alpha' release. Once BrTX-I induces a strong pro-inflammatory effect, the enzymatic phospholipid hydrolysis may be relevant for envenomation pathophysiology / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T11:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ponce-Soto_LuisAlberto_D.pdf: 2824712 bytes, checksum: 7aeb46c8d2e647484f7c95e4df5cfb42 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Através de metodologias otimizadas de purificação em HPLC, foram purificadas novas toxinas a partir do veneno total de Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (isoforma de Bj-IV) obtida da fração BthTX-II e Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. A nova neurotoxina V-1 de Crotalus durissus collilineatus caracterizada físico-quimicamente como desprovida de atividade catalítica, ácida e com uma massa molecular de 9859.45 Da, uma única cadeia polipeptídica, induz uma facilitação contínua no modelo biológico nervo frênico diafragma isolado de camundongo e uma facilitação pronunciada seguida de um bloqueio súbito em biventer cervicis de pintainho, na junção neuromuscular. Os estudos estruturais, neurotóxicos e miotóxicos da PLA2 F6 do complexo crotoxina de Crotalus durissus collilineatus mostram que a PLA2 F6 precisa da crotapotina (estudos de re-associação) para potencializar seu efeito neurotóxico na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo, mas a PLA2 F6 é capaz de induzir neurotoxicidade in vitro na ausência de crotapotina na preparação biventer cervicis de pintainho. Foram purificadas, a partir da fração BthTX-II, duas PLA2 D49 Bj-IV e V, sendo consideradas como isoformas devido ao fato de que compartilham de várias características físico-químicas, tais como: massa molecular, tempo de retenção na re-purificação em HPLC de fase reversa, análise de composição de aminoácidos, pI e estrutura primária, embora a isoforma Bj-V apresente algumas mutações com respeito à isoforma Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D; importantes para a atividade catalítica, os efeitos neurotóxicos in vitro foram mantidos e, quando foram inibidas cataliticamente por crotapotinas crotálicas de Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), continuaram diminuindo a resposta contrátil na junção neuromuscular nas preparações nervo frênico diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho, mostrando que são mais pronunciadas no músculo esquelético de camundongo. A nova toxina Bt II-2 purificada, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, do veneno de Bothrops alternatus, foi caracterizada como uma PLA2 básica K49, em função das características físico-químicas, evidenciadas: massa de 13898.71 Da, possui caráter básico e uma alta homologia seqüencial na sua estrutura primária, quando comparada com outras PLA2 K49 procedentes de veneno de serpentes.Essa nova PLA2 K49 Bt II-2 revelou um potente efeito neurotóxico in vitro na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo (1 µg/mL) pré-sináptico, como foi mostrado nos estudos de estímulo indireto via nervo e potencial de membrana ou repouso, diferentemente de qualquer PLA2 neurotóxica botrópica que, para causar um efeito neurotóxico, precisa de dosagem acima de 50 µg/mL. Outros perfis biológicos foram estudados para a Bt II-2, que mostrou uma miotoxicidade local ¿in vivo¿, citotoxicidade em mioblastos e miotubos C2C12, atividade inflamatória e letalidade, corroborando que se enquadra dentro da família de proteínas PLA2 homólogas K49, mas com características únicas nos estudos de neurotoxicidade in vitro. A reprodutibilidade da atividade biológica, através dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC, LC, espectrometria de massa, cujos resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada por veneno total ou frações impuras. Essa abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo revelar mecanismos ainda desconhecidos na relação estrutura-função das PLA2 procedentes de veneno de serpentes. A presença de um sítio farmacológico distinto do sítio catalítico presente nas PLA2 pode ser usada como ferramenta molecular para o reconhecimento dos receptores de membrana desconhecidos em células ou tecidos / Abstract: Through optimized methodologies of purification in HPLC, new toxins were purified from total venom of Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (Bj-IV isoform) obtained from the fraction BthTX-II and Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; with a high level of purity and molecular homogeneity, with no loss of biological activity. The new neurotoxin V-1 of Crotalus durissus collilineatus, chemically and physically characterized as unproved of catalytic, acid activity and with a molecular mass of 9859.45 Da, an only polypeptide sequence, induces to a continual facilitation in the biological isolated mouse phrenic nerve diaphragm model of mouse and a pronunciated facility of a subital block in chick biventer cervicis preparation en, in the neuromuscular junction. The structural, neurotoxic and miotoxic studies on PLA2 F6 from crotoxin complex of Crotalus durissus collineatus show crotapotin is necessary (re-association studies) to increase its neurotoxic effect in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse, but the PLA2 F6 is able to induce neurotoxity in vitro in ausency of crotopatin in the preparation chick biventer cervicis. Two PLA2 D49 Bj-IV and V were purified from the fraction BthTX-II and considered isoform because they share several chemical and physical characteristics, such as molecular mass, retention time in re-purification in reverse phase HPLC, analyses of amino acid composition, pI and primary structure, although the Bj-V isoform shows some mutations regarding Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D isoform. Important for the catalytic activity, neurotoxic in vitro effects were maintained and, when catalytically inhibited by crotapotin crotalic of Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), they continued dimishing the contractile reply in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparations of mouse and preparation chick biventer cervicis, which shows they are more pronunciated in the skeleton muscle of the mouse. The new and purified BtII-2 toxin of venom of Bothrops alternatus, with a high level of purity and molecular homogeneity, was characterized as a PLA2 basic K49, because its chemical and physical evidenced characteristics, mass of 13898.71 Da, basic character and a high sequential homology in its primary structure, when it is compared with other PLA2 K49 from venom of serpents. This new PLA2 K49 Bt II-2 has revealed a potent neurotoxic effect in vitro in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse (1 µg/mL) ante-synaptic, as it was proved by studies on indirect stimulus through nerve and potential of membrane or rest, differently of some neurotoxic botropic PLA2 that needs a dose above 50 µg/mL to cause a neurotoxic effect. Other biological profiles were studied for the Bt II-2, and the conclusion was a local myotoxic ¿living¿, a cytotoxic in myoblasts and myotubes C2C12, imflammatory and letality activity, showing they are fitted in the family of proteins PLA2 homologous K49, but with particular characteristics in studies on neurotoxic in vitro. The reprodubility of biological activity, through pharmacological effects, is just possible with the utilization of chemically homogenous fractions that maintain the integrity of biological function. These fractions were obtained with high efficient methodologies as HPLC, LC, and mass spectrometry, whose results may be associated with their biological activities, eliminating the subjectivity caused by total venom or impure fractions. This approximation may be applied in the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, and it may reveal still unknown mechanisms in the relation structure-function of PLA2 from the venom of serpents. The presence of a pharmacological site different of the catalytic one in the PLA2 may be used as a molecular instrument to the recognition of the receptors of unknown membranes in cells or tissues / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular