O melanoma representa 4% dos tipos de neoplasias cutâneas e causa 79% de morte por doenças de pele no mundo. Um dos grandes problemas relacionados ao tratamento de melanoma advém da sua resistência às terapias convencionais e, assim, a terapia fotodinâmica surgiu como uma alternativa terapêutica promissora, devido ao seu papel no tratamento de diversos tipos de câncer, além de outras doenças de pele. Ela é baseada no acúmulo seletivo de uma molécula fotoativa no tecido alvo, seguida da iluminação por uma fonte de luz, cujo comprimento de onda é específico para a excitação dessa molécula, ocasionando no dano celular. Neste estudo, foram realizados experimentos in vitro investigando a resposta fotodinâmica em melanoma humano, através de um modelo de tumor tridimensional por levitação magnética. Inicialmente, um protocolo de obtenção dos tumores de melanoma foi desenvolvido para avaliação da terapia em diferentes doses de luz e concentrações de fotossensibilizador. Em seguida, ensaios de cinética e quantificação intracelular com dois fotossensibilizadores, Photogem® e Photodithazine®, também foram feitos com o intuito de averiguar a sua distribuição, bem como tempo de internalização nos tumores. Tendo estabelecido que a incubação por 16 horas com Photodithazine® foi o parâmetro experimental mais adequado, a terapia fotodinâmica foi realizada, em sessão única, com irradiação em 660 nm em tumores de duas diferentes espessuras. Logo, testes de citotoxicidade foram utilizados para comparar os resultados de ambas as condições, onde se notou que o aumento na espessura atenuou o dano oxidativo decorrente da terapia. Além disso, foi observado que o acréscimo na dose de luz não acarretou em mudanças muito significativas na morte celular. No entanto, o maior dano celular, de aproximadamente 90% de morte, foi obtido com 100 μg/mL de Photodithazine® e iluminação com 60 J/cm², resultando na desagregação dos tumores, efeitos promissores da terapia no melanoma. Uma possível alternativa sugerida para aprimorar a eficiência fotodinâmica, seria a aplicação de mais sessões de terapia fotodinâmica, uma vez que os experimentos realizados nesse trabalho foram com uma sessão e, esse procedimento, poderia ocasionar em maior morte celular. / Melanoma accounts for 4% of skin cancers and causes 79% of death from skin diseases worldwide. A major problem associated with melanoma treatment is due to its increasingly resistance to conventional therapies. Thus, photodynamic therapy has emerged as a promising alternative modality to several types of cancer and other skin disorders. It generally involves the selective accumulation of a photoactive molecule in target tissue, followed by illumination with light source of an appropriate wavelength, to excite this molecule, resulting in cell damage. This study sought to investigate the photodynamic response in human melanoma, through a three dimensional tumor model by magnetic levitation. Initially, a protocol to obtain melanoma tumors was developed, to evaluate the therapy at different doses of light and photosensitizer concentrations. Posteriorly, kinetic assays and intracellular quantification with two photosensitizers, Photogem® and Photodithazine®, were also carried out in order to ascertain its distribution, as well as time internalization in tumors. Having established that incubation for 16 hours with Photodithazine® was the most suitable experimental parameter, photodynamic therapy was performed in a single session, with irradiation of 660 nm in two tumors, different in thicknesses. Therefore, cytotoxicity tests were used to compare the results of both conditions, where it was noted that the increased tumor depth may attenuate oxidative damage, induced by the therapy. Furthermore, it was observed that the increase in light dose did not result in significant changes in cell death. Nevertheless, the greater cell damage, approximately 90% kill was obtained with 100 ug/mL Photodithazine® and illumination with 60 J / cm², causing tumor breakdown, which is a promising effect in melanoma therapy. An alternative suggested to enhance the photodynamic efficiency, would be to apply more sessions of photodynamic therapy, so this procedure could result in increased cell death.

A terapia fotodinâmica é uma técnica que vem sendo aprimorada para o tratamento de cânceres e infecções e seu efeito terapêutico consiste na geração de espécies reativas de oxigênio que causam danos irreversíveis às células, levando-as a morte. Ela é considerada menos invasiva que outros tratamentos, podendo ser repetida diversas vezes e utilizada em conjunto com outros tratamentos sem o comprometimento do paciente. Um dos focos da terapia fotodinâmica é o tratamento de cânceres de pele melanoma devido a localização superficial das lesões e a elevada taxa de letalidade que a doença ocasiona, esta alta taxa esta relacionada a formação de tumores secundários em outras regiões do corpo que dificulta a cura. Neste trabalho buscou-se entender a interação do fotossensibilizador de segunda geração, Photodithazine, com as células de melanoma murino de linhagem B16F10. Foram analisadas a captação celular e a co-localização intracelular deste fotossensibilizador através da marcação de componentes celulares em microscopia confocal. Ensaios de viabilidade celular foram realizados para obtenção das concentrações menos citotóxicas sem e com luz, utilizando o teste de MTT. Foi realizada a caracterização do tempo de vida médio fluorescência do fotossensibilzador durante a terapia fotodinâmica em microscópio FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Os resultados indicaram que um maior tempo de incubação no escuro causa maior citotoxicidade para as concentrações acima de 0,1 mg/mL de Photodithazine. Os ensaios de terapia fotodinâmica apresentaram redução de mais de 90% de viabilidade celular para baixas concentrações de Photodithazine®, utilizando fluências acima de 2J/cm2. O tempo de vida médio de fluorescência do Photodithazine livre em solução apresentou tempo de 3,75 ns e quando ligado às células de 4,63 ns, durante a terapia fotodinâmica o tempo de vida médio de fluorescência apresentou alteração de aproximadamente 0,2 ns. Através do cálculo de coeficientes de correlação, foi observado a alta co-localização em mitocôndrias. / Photodynamic therapy is a technique manly applied in the treatment of cancers and infections. The principal compound of this therapy is the reactive oxygen species generated that react and damage various cellular components, causing cell death. Photodynamic therapy is considered minimally invasive and can be repeated several times without compromising the patient. One of the main focuses of photodynamic therapy is threatment of melanoma skin cancer due to it is superficial location of the lesions and also because the disease has a high rate of mortality, caused by the formation of secondary tumors elsewhere in the body that makes it difficult to cure. In this study, murine melanoma cells were studied in monolayer model using Photodithazine, a photosensitizer of second generation. Cellular uptake and intracellular co-localization of the photosensitizer was observed by labeling cellular components that were analyzed by confocal microscopy. Cell viability assays were performed to obtain the cytotoxic concentrations in the dark, using the MTT test. Using the less cytotoxic concentrations, photodynamic therapy trials was performed to obtain the cytotoxic fluences. Finally, the average lifetime fluorescence of photosensitizer was measured to characterize the photodynamic therapy in FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). The results indicated that longer dark incubation cause greater cytotoxicity at the concentrations above 0.1 mg/mL of Photodithazine. Thereby the results of photodynamic therapy experiments observed the decreasing from over 90% cell viability at low concentrations of Photodithazine using fluences above 2 J/cm2. The average fluorescence lifetime of the free Photodithazine solution was 3.75 ns and cell-bound 4.63 ns, during the photodynamic therapy the average lifetime fluorescence changed approximately 0.2 ns. By calculating correlation coefficients, the high colocalization was observed in mitochondria.

A incidência de câncer tem aumentado nas últimas décadas, o que coloca essa doença como um problema de saúde pública mundial. Para melhorar o prognóstico do paciente, é necessário o desenvolvimento e/ou aprimoramento de técnicas que aumentem a efetividade e diminuam os efeitos adversos do tratamento. Entre as técnicas para tratamento local de lesões neoplásicas, destacam-se a terapia fotodinâmica (TFD) e a radioterapia (RT). A TFD consiste na interação entre fotossensibilizador, luz e oxigênio molecular; que combinados causam morte celular. A RT, por sua vez, é uma técnica já consagrada clinicamente que utiliza radiação ionizante para o tratamento de tumores malignos. O efeito da combinação entre as técnicas não está claramente estabelecido, e poderia aumentar o dano causado ao tecido enquanto diminui os efeitos colaterais provenientes da RT. Neste contexto, o objetivo deste estudo é analisar os efeitos da TFD associada à RT quando comparados aos efeitos individuais de cada terapia, avaliando se existe um método preferencial de combinação das técnicas. A primeira etapa do estudo foi realizada na Universidade de São Paulo e tratou a pele sadia de ratos Wistar com diferentes protocolos que combinavam as técnicas em diversos protocolos. Análises clínicas, imunohistoquímica e histológica, além da coleta de espectros de fluorescência, foram realizadas com o intuito de observar a possível sinergia dos efeitos das terapias combinadas. Os resultados mostraram uma maior necrose tecidual para a combinação TFD+24h+RT. A combinação RT+24h+TFD não apresentou um dano tão expressivo quanto o grupo TFD+24h+RT, devido a ineficiência de produção de PpIX em tecido previamente irradiado, comprovado pelo espectro de fluorescência. Na segunda etapa, realizada no Dartmouth College, os grupos que apresentaram maior dano foram escolhidos para avaliação do dano vascular por análises de refletância, da qual foram extraídas informações sobre a saturação de oxigênio, concentrações de meta-hemoglobina e bilirrubina, fração de volume sanguíneo e raio do vaso, tanto em tecido sadio de ratos Wistar quanto em tumores cutâneos em camundongos Nude. O recrescimento dos tumores também foi avaliado. A análise óptica se mostrou um método efetivo para monitorar o dano causado pela TFD na pele normal, mas ineficiente para monitorar o dano na combinação dos grupos, uma vez que a RT não apresenta dano vascular importante. Para os tumores, as análises ópticas não foram eficazes para monitorar o dano das terapias A curva de crescimento do tumor mostrou que o grupo TFD+24h+RT foi a melhor combinação para TFD e RT. Estudar a combinação do uso de raios-X com o efeito fotodinâmico é muito importante para o entendimento de fatores associados ao tratamento de tumores malignos. Os resultados obtidos devem contribuir na escolha da melhor combinação entre os tratamentos, potencializando o resultado do tratamento de lesões, diminuindo o tempo de tratamento e os efeitos colaterais. / The cancer incidence has shown a great increase recently, making this disease a worldwide public health problem. Improving a patient\'s prognosis requires development and/or improvement of techniques that increase efficacy and reduce side effects of the treatment. Among the techniques for non-systemic treatment of cancer, photodynamic therapy (PDT) and radiotherapy stand out. PDT consists in an interaction between photosensitizer, light and molecular oxygen to induce cell death, whereas radiotherapy is a well-established technique which uses ionizing radiation for tumor treatment. The effect of the technique combination is not clear and is expected to increase the damage in the tissue while decreasing the side effects from RT. In this context, the aim of this study is to analyze the effects of PDT associated with RT compared to individual effects of each therapy, assessing whether there is a preferred method of combination of both. The first stage of the study was conducted at the University of Sao Paulo and treated healthy skin of Wistar rats with different protocols that combined the techniques in various protocols. Clinical, immunohistochemistry and histological evaluations, as well as collecting fluorescence spectra were conducted in order to observe the possible synergistic effects of combined therapies. The results showed greater tissue necrosis for combining PDT+24h+RT. The combination RT+24h+PDT did not show as significant damage as the PDT+24h+RT group, due to PpIX production inefficiency in previously irradiated tissue, evidenced by fluorescence spectrum. In a second stage, performed at Dartmouth College, vascular damage was evaluated for the groups that showed enhanced damage through reflectance analysis, which provided information about oxygen saturation, met-hemoglobin and bilirubin concentrations, blood volume fraction and vessel radius, both in healthy tissue of Wistar rats and skin tumors in Nude mice. The regrowth of tumors was also evaluated. The optical analysis proved to be an effective method to monitor the damage caused by PDT in normal skin. This is not, however, an efficient method for monitoring the damage on the combination of groups, since the RT does not present any significant vascular damage. For tumors, the optical analysis did not show an effective method to monitor the damage of therapies. Tumor regrowth curves showed that the PDT+24h+RT group was the best combination for PDT and RT. The study of combination using X-rays and the photodynamic effect is very important to understand factors associated with the treatment of malignant tumors. The results should help in choosing the best combination of treatments and may be used to enhance the result of a lesion treatment, reducing treatment time and side effects.

A terapia fotodinâmica é a combinação do agente fotossensibilizador, da fonte de luz e do oxigênio que pode resultar na oxidação de biomoléculas e gerar danos celulares. Esta técnica é aplicada em diversas situações, desde o controle microbiológico até o tratamento de câncer. A maioria dos estudos utiliza as fontes de luz tradicionais, ou seja, lasers, sistemas à LED e lâmpadas. No entanto, poucos são os estudos que se concentram em propostas de fonte de luz alternativas. Iluminação portátil, flexível e independente de energia elétrica são características de grande interesse, principalmente, aos países em desenvolvimento no qual há uma grande parcela da população não assistida por hospitais de referência, além de cidades que não possuem o fornecimento de energia elétrica. Neste estudo, foi avaliada a viabilidade do uso, in vitro, da quimiluminescência como uma fonte de luz para a terapia fotodinâmica, induzindo a redução microbiana de Staphylococcus aureus. A quimiluminescência é uma reação química onde por meio da mistura de reagentes líquidos ocorre a emissão de luz sem a necessidade de qualquer ativação externa. Previamente aos estudos da aplicação terapia fotodinâmica in vitro, foram avaliadas diversas reações de quimiluminescência no intuito de estabelecer as características mais viáveis ao efeito fotodinâmico. Através de um modelo similar a teoria de Förster, foi estabelecida a relação espectral entre a banda de emissão da quimiluminescência e o espectro de absorção do fotossensibilizador Photogem®. Na análise in vitro, o agente fotossensível foi utilizado em quatro concentrações entre 6 e 75 g/ml e iluminação entre 60 minutos até 240 minutos. Longos tempos de irradiação são necessários devido a baixa intensidade de luz oriunda da quimiluminescência (intervalo de algumas dezenas de W/cm²). Os resultados demonstraram que o longo tempo de experimento não gerou redução microbiana nos grupos em que foi avaliado o efeito isolado da fonte de luz e do fotossensibilizador. Porém, quando foi avaliado o efeito fotodinâmico na combinação da reação química e o fotossensibilizador, atingiu-se redução da bactéria próxima de 98% (redução de duas ordens logarítmicas, aproximadamente) nas maiores concentrações de Photogem® e de dose de luz aplicada. Este estudo demonstra a possibilidade do uso da quimiluminescência como uma fonte de luz alternativa no controle microbiano através do efeito fotodinâmico, além de apresentar as vantagens de irradiação portátil, flexível entre outras quando comparada com as fontes de luz convencionais. / Photodynamic therapy is a combined action of the photosensitizer, a light source and the oxygen that may result in an oxidation of biomolecules and cellular damage. This technique is used for several applications, from microbial control to cancer treatment. The majority of the studies use conventional light sources as lasers, LED systems and lamps, just a few focuse on the proposal of alternative light sources. Portable, flexible and non-wired illumination are duired characteristics especially for developing countries where still great part of the population is not assisted by hospitals and several regions do not have electricity. In this study, the viability of chemiluminescence use a PDT light source was evaluated in the in vitro microbial reduction of Staphylococcus aureus. Chemiluminescence is a chemical reaction where after the reagents mixture a light emission occurs. Previously to the microorganism experiment, several chemiluminescence protocols were tested for the determination of the best reaction for this study photodynamic effect. Using a mathematical model similar to the Förster theory, the spectral relation of chemiluminescence emission and Photogem® absorption band was calculated. The photosensitizer was tested at four concentrations between 6 an 75 g/ml and illumination at exposure times between 60 and 240 minutes. Long exposure times were needed due to the low irradiances of about dozens of W/cm².The results showed that the experiment long procedure did not result in microbial reduction, which was verified at the individual effect of light and of photosensitizer. On the other hand, the photodynamic effect produced by the combination of the photosensitizer and chemiluminescence resulted in 98% microorganism reduction for the higher Photogem® concentrations and light dose. This study shows the viability of the chemiluminescence as a light source for the microbial control by PDT, associated with the characteristics of a portable and flexible illumination device.

A Terapia Fotodinâmica (PDT) é a uma modalidade terapêutica promissora para o tratamento do câncer e outras doenças, que visa a destruição do tecido alterado. A PDT se caracteriza por um conjunto de processos físicos, químicos e biológicos que ocorrem após a administração de uma droga, retida preferencialmente nos tecidos tumorais, seguida pela irradiação com luz visível. Quando as células tumorais tratadas são irradiadas, o fotossensibilizador absorve luz e inicia uma reação em cadeia produzindo espécies reativas de oxigênio que destroem as células tumorais. Neste trabalho procuramos avaliar os principais aspectos da PDT para o desenvolvimento de uma dosimetria baseada em conceitos fundamentais tais como: a estabilidade do Photogem ®, a farmacocinética, a penetração da luz no tecido e os mecanismos de morte celular. Com esse propósito realizamos quatro experimentos distintos nos quais esses aspectos foram investigados. Realizamos experimentos in vitro para averiguar a estabilidade do Photogem ®. As soluções foram submetidas a condições extremas de irradiação, onde variamos comprimentos de onda e potência de irradiação. Analisamos também a variação de pH, concentração e solvente. A farmacocinética, a profundidade de penetração da luz em tecido biológico e os processos de morte celular foram realizados in vivo. Os resultados obtidos foram os seguintes: o fotossensibilizador é degradado ao variarmos o comprimento de onda e a potência de irradiação; ele não sofre degradação ao ser aquecido até 60°C. No estudo da farmacocinética verificamos que os tecidos estudados apresentaram tempos de acúmulo e eliminação diferente, com o fígado apresentando menores tempos. Na avaliação da penetração da luz verificamos que para tecidos menos pigmentados obtivemos maior penetração. Os nossos resultados estão em concordância com os encontrados na literatura. Finalmente para a respiração mitocondrial observamos que para maiores tempos de irradiação a razão de controle respiratório foi elevada, indicando modificações no ciclo respiratório. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem subsídios importantes para auxiliar a determinação de um protocolo controlado de dosimetria para PDT, aumentando a eficiência e conseqüentemente a taxa de sucesso da terapia. / The Photodynamic Therapy (PDT) is a promising therapeutical modality for the treatment of cancer and other diseases, seeking the altered tissue destruction. The PDT is characterized by a set of physical, chemical and biological processes, which occur after a drug injection and selective retention in tumoral tissues, followed by visible light irradiation. When the tumoral cells are irradiated, the photosensitiser absorbs light and begins a chain reaction with the formation of reactive species of oxygen leading to the destruction of the tumoral cells. In this study we evaluate important PDT aspects for the development of a dosimetry based in some fundamental concepts such as Photogem ® stability, pharmacokinetics, light penetration in tissue and all death mechanisms. Four experiments were done to investigate these aspects. In vitro studies were performed to evaluate the Photogem ® stability under different wavelength and light power parameters. It were also investigated the dependence under pH, concentration and solvent type variation. The pharmacokinetics, light penetration in biological tissue and cell death mechanisms were studied in vivo experiments. The results showed that the photosensitiser is degradeted depending on the was no degradation until 60 °C. In the pharmacokinetics study we verified that the investigated tissues present different accumulation and elimination times, the hepatic tissue showing the smallest times. In the light penetration evaluation we verified that the less pigmented ones showed the greater penetration in accordance with the literature results. Finally in mitochondrial study we observed that for longer irradiation times the respiratory cicle. Our results give important data to aid the establishment of a controlled PDT dosimetry protocol, improving the efficiency and consequently the success rate of this therapy.

O fotoenvelhecimento é uma condição dérmica decorrente da sobreposição do envelhecimento cronológico e dos efeitos da exposição crônica à radiação ultravioleta (UV) solar. A pele fotodanificada é um local propício para o desenvolvimento de lesões pré-cancerosas que podem evoluir para casos de câncer de pele. Logo, o tratamento dessa condição não é apenas de cunho estético, mas também preventivo. A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica que se baseia na fotoativação de uma molécula fotossensível, que na presença de oxigênio, produz espécies citotóxicas que levam à morte da célula e tecido alvo. Esta técnica tem sido utilizada em estudos clínicos para o tratamento da pele fotoenvelhecida, e tem apresentado bons resultados funcionais e cosméticos. São muitas as variações em parâmetros como fonte de luz, dose e tipo de fotossensibilizador. A TFD fracionada utiliza um tempo de escuro entre frações da dose total e mostra-se mais eficiente que a iluminação em uma única dose, porém seu efeito no tratamento da pele fotoenvelhecida ainda é desconhecido. Neste trabalho, um protocolo de TFD foi desenvolvido para comparar o resultado da terapia com iluminação dose única e fracionada aplicada no fotoenvelhecimento. A avaliação foi através de histologia e espectroscopia de fluorescência e tempo de vida de fluorescência. Camundongos hairless foram fotoenvelhecidos e tratados com luz LED violeta (404 nm) e creme 20% ALA (1h de incubação) com dose única (1 J.cm-2) e fracionada (duas frações de 0,5 J.cm-2 e 10 min de escuro). O efeito da TFD fracionada foi mais intenso, causando ulcerações na pele e alterações histológicas características. Esse resultado mostrou que a TFD com iluminação fracionada não foi adequada para o tratamento da pele fotoenvelhecida. A análise por tempo de vida de fluorescência foi capaz de mostrar alterações durante as semanas de recuperação. Acredita-se que essa informação venha da epiderme devido ao remodelamento observado nessa camada. / Photoaging is a skin condition resulting from the overlap of chronological aging and the effects of chronic exposure to sunlight ultraviolet (UV). Photodamaged skin is more susceptible for the development of pre-cancerous lesions, which can become skin cancer. Therefore, the treatment of this condition is not only of aesthetic concern but it is also of preventive nature. Photodynamic therapy (PDT) is a technique based on the photoactivation of a light-sensitive molecule, which, in the presence of oxygen produce cytotoxic species that lead to cell death and tissue destruction. This technique has been used in clinical trials for the treatment of photoaged skin, and it has presented good functional and cosmetic results. There are many variations on PDT parameters such as the light source, dose and type of photosensitizer. Fractionated PDT is one these variations which uses a dark interval between light fractions. Studies show that this illumination scheme enhances the therapeutic efficacy, although its effects in the treatment of photoaged skin are still unknown. In this work, a protocol was developed to compare the outcome of PDT with single and fractionated illumination applied in photoaging. The assessments were made by histology and by the optical technics: steady state and lifetime fluorescence spectroscopy. Photoaging was induced in hailess mice skin which were then treated with violet LED (404 nm) and 20% ALA cream (1h of incubation) with either single (1 J.cm-2) or fractionated (2 fractions of 0.5 J.cm-2 and 10 min of dark interval) doses. The effect of fractionated PDT was more intense, causing ulcerations on the skin and distinctive histological changes. This result shows that PDT with fractionated illumination was not suitable for the treatment of photoaged skin. The analysis by fluorescence lifetime spectroscopy was able to reveal changes during the recovery weeks. It is believed that this information comes from the epidermis due to the remodeling observed in this layer.

A Terapia Fotodinâmica (do inglês, Photodynamic Therapy - PDT) é uma técnica indicada para o tratamento local de câncer que vem tendo grandes avanços ao longo dos anos. A PDT consiste na interação entre luz e uma substância fotossensibilizadora, resultando na transformação do oxigênio molecular em oxigênio singleto, altamente reativo e tóxico para a célula, levando à destruição do tecido. Nesse contexto, o uso do modelo de Membrana Corioalantóica (CAM) é uma opção para o estudo dos efeitos vasculares envolvidos nessa terapia, além de permitir o estudo na variação de diversos parâmetros associados com a PDT e seus efeitos. Nesse estudo foram investigados um composto derivado de porfirina e um derivado de clorina. Esses fotossensibilizadores foram administrados topicamente e por via intravenosa, sendo variados diversos parâmetros. No primeiro caso, o tempo de incubação foi variado entre 20 e 80 minutos e a concentração de área da droga foi variada entre 0,1 e 100 g/cm2. Quanto à dose de luz, o intervalo foi entre 4,8 e 60 J/cm2, empregando lasers de diodo em 635 nm para Photogem&reg e 660 nm para Photodithazine&reg. Depois de estabelecido 30 J/cm² para a aplicação tópica, foi usada a aplicação intravenosa com essa dose, a fim de comparar os resultados. Após iluminação, foram feitas imagens da membrana imediatamente após a iluminação até 300 minutos pós-terapia. Com ajuda de softwares de processamento de imagem, foi feita a transformação da imagem: os pixels referentes aos vasos sanguíneos foram transformados em preto e o restante (clara, gema e embrião) em branco. Esse processo levou à obtenção de um valor relacionado à área de vasos sanguíneos em função do tempo pós-terapia, quantificando e mostrando o comportamento do efeito vascular da PDT. A comparação entre os dois fotossensibilizadores mostrou que o uso da mesma concentração (1 g/cm²) pode levar à destruição da rede vascular tratada para a porfirina e à dilatação dos vasos periféricos com destruição dos vasos mais calibrosos, para a clorina. Entretanto, variando as concentrações de ambos, obtemos respostas contrárias. A análise dos resultados obtidos, observando a diferença de ação dos fotossensibilizadores, permitiu a obtenção de uma relação quantitativa do comportamento vascular além do estudo individualizado do efeito da terapia fotodinâmica para análise do dano tecidual induzido. / Photodynamic Therapy is a local treatment of cancer that has great advances over the years. To obtain an efficient process that leads to tissue destruction, a dynamic interaction of three factors is required: photosensitizing agent, light, and molecular oxygen. When there is the appropriate illumination of tissue with photosensitizer, this molecule is excited and produces singlet oxygen. This product is reactive and cytotoxic, and it results in cell death. In this context, the CAM model allows studies with variation in many parameters linked with PDT and its effects and it is an option to study of vascular effects. A compound of porphyrin (Photogem&reg) and a compound of chlorine (Photodithazine&reg) were investigated in this study. These fotosensitizers were topically administrated and the parameters were ranged between 20-80 minutes for incubation, and 0.1-100 g/cm2 for concentration. About light dose, the range was between 4.8-60 J/cm2, with diode laser at 635 nm (Photogem&reg) and 660 nm (Photodithazine&reg). After established that light dose of 30J/cm² as ideal for topical application, intravenous application was used with that dose in order to compare the results. After illumination, the membrane images were made from zero to 300 minutes. At image processing, the pixels corresponding to vessels were defined as black and the remaining structures as white pixels. Calculating the percentage area of the black pixels as a function of the treatment time, it is possible to quantify the vascular effect of this therapy. The comparison between two fotosensitizers (1 g/cm²) can lead to vascular network destruction to porphyrin and can lead to dilation of peripheral vessels with destruction to larger vessels, for chlorine. However, increasing the porphyrin concentration and decreasing the chlorine concentration, we have opposite responses. With varying PDT parameters, it was possible to obtain the best assay for PDT. The results obtained by observing the difference of action of photosensitizers, allows obtaining a quantitative relationship of vascular behavior in addition to individual study of the effect of photodynamic therapy for analysis of tissue damage induced.

O tratamento do câncer e de lesões pré-malignas é uma importante aplicação da terapia fotodinâmica. A base da técnica é o uso da luz associada a um fotossensibilizador, na presença de oxigênio, de forma a promover a formação de espécies reativas de oxigênio que culminam na morte celular. Esta técnica é altamente seletiva, e apresenta poucos efeitos colaterais. A efetividade da terapia pode ser avaliada com base na emissão de fluorescência do fotossensibilizador, uma vez que o grau de fotodegradação deste indica uma terapia mais ou menos efetiva. No caso de tumores, a reincidência de lesões, causada por células malignas remanescentes, é um problema importante e que pode piorar as condições clínicas de um paciente. Este estudo propõe, portanto, um modelo matemático baseado na aferição da fluorescência do fotossensibilizador in situ para previsão da extensão do dano promovido pela terapia fotodinâmica em tempo real. Esta aferição é feita em comparação com o parâmetro experimental de profundidade de necrose, de modo a avaliar se uma lesão pode ser completamente eliminada numa dada aplicação. O estudo utilizou fígados de ratos Wistar machos, saudáveis, como modelo inicial dada sua relativa homogeneidade óptica com relação a lesões tumorais, visando minimizar variáveis. Os fígados foram irradiados com diferentes intensidades (150, 250 e 350 mW/cm2) e com diferentes fluências (50-450 J/cm2) de luz com comprimento de onda de 630 nm, CW, para avaliação das necroses e da fluorescência (avaliada usando 532 nm para excitação). A primeira versão do modelo utilizou o conjunto de dados de 250 mW/cm2 para obtenção de um modelo inicial baseado na fotodegradação avaliada por fluorescência. Este modelo foi alterado com base em modificações biológicas observadas na literatura durante a terapia. Tais alterações estão relacionadas à modificação de aporte de oxigênio causada por vasoconstricção, pela farmacocinética do fotossensibilizador e pelas modificações nas propriedades ópticas intrínsecas ao tecido. Foi possível encontrar equivalência entre modelo e experimentação ao final das modificações propostas ao modelo inicial, embora tenha sido evidente o efeito da variação no fracionamento da fluência entregue sobre os resultados da previsão. Como forma de mostrar a capacidade do modelo não apenas para previsão da profundidade de necrose (e, portanto, da extensão do dano), mas também para avaliações de dosimetria, foi proposta uma situação hipotética onde se entrega a mesma fluência de luz com intensidades diferentes (variando linearmente). Este teste mostrou o potencial do modelo não apenas para avaliar a extensão do dano causado pela terapia em tempo real, mas também para estimar os resultados de protocolos clínicos não-testados e, portanto, para a proposta de melhorias a protocolos de terapia fotodinâmica. / Malignant and pre-malignant cancer lesions treatment is an important application of photodynamic therapy. It is based on the use of light associated to a photosensitizer, in the presence of oxygen, so that reactive oxygen species may be formed, resulting in cell death. This is a highly selective technique, and few side effects are reported. The therapy efficacy may be evaluated through the photosensitizer fluorescence emission, since its level of bleaching indicates a more or less effective therapy application. Concerning cancer, recurrent lesions, caused by remaining malignant cells, is an important problem which may cause the worsening of patient´s clinical condition. Therefore, this study proposes a mathematical model based on the assessment of photosensitizer fluorescence in situ for prediction of the damage extent caused by photodynamic therapy. This evaluation is performed by comparison with the experimental parameter of depth of necrosis, as to evaluate if a lesion can be completely eliminated during an application. This study used male Wistar rats healthy livers as an initial model due to its relative optical homogeneity when compared to tumor lesions, hence minimizing variables. Livers were irradiated using different light fluence rates (150, 250 and 350 mW/cm2) and fluences (50-450 J/cm2) with 630 nm wavelength, CW, to perform evaluation of fluorescence (wit 532 nm excitation) and depth of necrosis. A first model was obtained from the 250 mW/cm2 dataset, based on fluorescence-assessed photobleaching. Such model was modified according to literature observations on biological changes during therapy. Those changes are related to the oxygen arrival, promoted by vessels shutdown, by the photosensitizer pharmacokinetics and by the changes in the intrinsic optical properties of liver tissue. Correspondence between model and experimentation was achieved after the changes proposed to the initial model, although the effect of different fractioning of light fluences on prediction has become evident. To show the model ability not only to predict depth of necrosis (and, hence, damage extent), but also for dosimetry studies, an hypothetical situation in which the same fluence has been delivered in different (linearly varying) fluence rates. This test result showed the potential of the model not only to evaluate the damage extension by the therapy in real-time, but also to investigate untested clinical protocols results and, therefore, to allow proposals of improvement to photodynamic therapy protocols.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica baseada na interação entre uma substância fotossensibilizadora e luz, na presença do oxigênio, para causar morte celular. Sob iluminação de comprimento de onda específico, o fotossensibilizador é excitado e reage com oxigênio celular, dando origem a espécies reativas de oxigênio capazes de promover danos a biomoléculas da célula-alvo. O mesmo processo ocorre para micro-organismos, como bactérias, vírus e fungos. A Pitiose é uma doença causada por um micro-organismo semelhante a fungo denominado Pythium insidiosum. Por não ser um fungo verdadeiro, o agente não apresenta ergosterol em sua membrana plasmática e por isso, não responde à maioria das drogas antifúngicas disponíveis. Procedimentos cirúrgicos extensos, como amputação de membros, são indicados; porém as recidivas são frequentes. Neste trabalho, foi avaliado o efeito da TFD em modelo in vitro, em infecção experimental de pitiose e em pitiose equina. Além disso, foram realizados ensaios de cinética dos fotossensibilizadores utilizados, porfirina, clorinas e azuleno. As taxas de inibição de crescimento in vitro do P. insidiosum foram superiores a 95% para os ensaios com Photodithazine&reg. Photogem&reg apresentou inativação satisfatória e o azul de metileno se mostrou ineficiente para a inativação do patógeno. A cinética comprova os resultados obtidos in vitro, e revelou possível afinidade das clorinas com o oomiceto. Dez minutos após a incubação em solução de Photodithazine&reg e clorina e6 foi possível observar os compostos em estruturas intracelulares específicas. Para maiores tempos de incubação, a distribuição destes compostos se dá por toda a hifa e parede celular. O Photogem&reg mostrou distribuição heterogênea na cultura. Este fato explica o crescimento de algumas hifas após a TFD. O azul de metileno não penetrou na célula microbiana e por isso não foi eficiente na inativação do patógeno. Ao observar a estrutura morfológica da hifa do patógeno após a TFD com diferentes tempos de incubação, ficou evidente que a TFD é mais eficiente para maiores tempos de incubação. Apenas o azul de metileno não inativou o patógeno em nenhum dos parâmetros avaliados. Os estudos em pitiose experimental mostraram que o Photodithazine&reg concentra-se na lesão 4 horas após a administração por via endovenosa, o que não foi observado para o Photogem®. Altas fluências e intensidades luminosas foram necessárias para o tratamento das lesões. Foram avaliados 21 coelhos com aproximadamente 95% de cura. O tratamento de equinos naturalmente infectados mostrou resultados animadores. Foram avaliados quatro cavalos, realizando-se apenas duas sessões de TFD em cada animal e foi possível observar regiões de cicatrização tecidual e recuperação da função motora dos animais. Mais uma vez as clorinas mostraram maior eficiência quando comparadas aos outros fotossensibilizadores. Além disso, observou-se a relação entre os tempos de incubação e resposta tecidual que condizem aos observados no estudo farmacocinético. O protocolo para o tratamento da pitiose, provavelmente basear-se-á em tempos de incubação do composto maiores que 1 hora, altas fluências e intensidades luminosas e clorinas como agente fotossensibilizador. Neste trabalho, a TFD mostrou potencial terapêutico e pode vir a se tornar uma importante ferramenta no tratamento da pitiose. / Photodynamic Therapy (PDT) is a therapy based on the interaction of photosensitizer and light, in the presence of oxygen, to induce cellular death. Under the incidence of light, at an appropriated wavelength, these chemical compounds produce reactive oxygen species which affects the biomolecules of the target-cells. Pythiosis is a lifethreatening emerging disease caused by a fungus-like organism called Pythium insidiosum. Since it is not a true fungus, this microorganism does not present ergosterol in its plasmatic membrane, and so, does not respond satisfactorily to most antifungal drugs. Extensive surgical debridements are required, such as limb amputation, however, reccurence frequently occurs. In this study the PDT effect was investigated in an in vitro model, experimental in vivo infection and naturally occurred equine pythiosis. Besides, pharmacokinetic assays with chlorine, porphyrin and methylene blue were also carried out. It was observed inhibition rates greater than 95% for chlorine, while porphyrin showed satisfactory inhibition and methylene blue was inefficient to inactivate the pathogen. Pharmacokinetics assays corroborate with obtained in vitro results and demonstrated a possible affinity between chlorine and oomicetes. After ten minutes of incubation, for both chlorine and clorin e6 solutions, it was observed that these compounds were concentrated in intracellular specific structures. For longer incubation times the distribution of these compounds was observed along the hyphae and cellular wall. Porphyrin has shown heterogeneous distribution on cell culture. This fact may explain hyphal growth observed after PDT with this photossensitizer. Methylene blue was present only in the cell surface and so, did not inhibit the pathogen. By observing the morphological structure of the pathogen after PDT with different incubation times, it was evident that PDT is more efficient when employing longer incubation times. Only methylene blue did not inactivate the pathogen in none of the evaluated protocols. Concerning experimental infection, it was observed that chlorine concentrates in lesion 4 hours after intravenous administration, while the same was not observed for porphyrin. High light doses and irradiances were necessary for treating the lesions. It was evaluated 21 rabbits with complete response around 95%. The treatment of naturally infected equines showed promising results. Four horses were treated with two PDT sessions. Treated regions of healing and recovery of motor function of the animals were observed. Once again, chlorins showed improved results when compared to the other photosensitizers. Besides, it was observed the relation between incubation time and tissue response correlated to those observed in the kinetics study. The protocol for treating pythiosis, probably will be based on chlorine incubation time greater than 1 hour, high light dose and irradiance, that the results of the present study demonstrate that PDT is a potential treatment option for pythiosis.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma promissora técnica para o tratamento de câncer e de outras patologias. O tratamento baseia-se na ação de uma fonte de luz com o agente fotossensibilizador (FS) e o oxigênio molecular presente nas células, gerando espécies reativas de oxigênio que causam a morte celular. Uma das limitações atuais da técnica é a penetração da luz no tecido biológico. Entre os fotossensibilizadores mais empregados, estão os derivados de hematoporfirina, que são excitados da região do vermelho do espectro eletromagnético. Fotossensibilizadores vêm sendo desenvolvidos para iluminação com comprimentos de onda maiores, com o potencial de aumentar a profundidade de penetração e em conseqüência, o volume tecidual tratado. Outra opção para aumentar o volume tecidual de resposta utilizando derivados de hematoporfirina é a utilização de fontes de luz pulsada que, em comparação com a contínua, vem apresentado resultados significativos no estudo da TFD. Neste estudo, foi realizada a fotodegradação in vitro do fotossensibilizador comercial Photogem® (Moscou, Rússia) com tempos variando entre 0 e 40 minutos. Como fonte de luz contínua foi utilizado um laser de diodo (Eagle Heron Quantum Tech, Brasil), e como fonte de luz pulsada, foi utilizado um laser em regime de femtossegundos emitindo em 630 nm, 1 kHz, pulso < 70 fs (Ti:Sapphire Libra-S, Opera-VIS Coherent, USA). Para a coleta dos dados, foi utilizado um sistema de espectroscopia por fluorescência portátil composto por um espectrometro USB 2000, um laptop e sonda em Y para excitação e coleta da fluorescência do FS. Também foi realizada a TFD em fígados normais de ratos. Foram utilizados 18 animais, pesando entre 180 e 250g. Os animais foram divididos em 2 grupos. Ambos os grupos receberam 1,5 mg/kg de FS, e após 30 minutos foram iluminados com dose de energia de 150 J/cm2 e intensidade de 74 mW/cm2. Também foi realizado o estudo da penetração da luz utilizando macerado de figado de rato, e o mapeamento térmico durante a TFD com a fonte de luz CW e o laser pulsado. O estudo da taxa de fotodegradação do FS nos mostrou uma maior eficiência da fonte de luz pulsada para a degradação da molécula de Photogem®, enquanto que a taxa de degradação para o CW foi 6 vezes menor. O macerado mostrou que o coeficiente de penetração da luz CW e a luz pulsado são praticamente os mesmos, o que sustenta a análise com a intensidade média. O estudo in vivo mostra, através de uma análise histológica do perfil de necrose, que a fonte de luz pulsada alcança uma profundidade de necrose cerca de 2 vezes maior, em comparação com a fonte em regime contínuo, além de um melhor resultado em uma avaliação qualitativa da morfologia da região de necrose. Isto está relacionado com a alta intensidade dos pulsos emitidos pela fonte de luz pulsada com o tecido e o FS presente, promovendo o aumento na profundidade de necrose. / Photodynamic therapy (PDT) is a useful technique for the treatment of cancer lesions and other diseases. The treatment is based on the interaction of light with a photosensitizer agent (PS) and with molecular oxygen that is present in cells, which generates reactive oxygen species that promote cell death. One of the limitation factors of this technique is limited light penetration in biological tissue. Hematoporphyrin derivatives are among the most used photosensitizers. They are excited on the red region of the electromagnetic spectrum. New photosensitizers has been developed for the use with longer wavelengths, potentializing the increase of penetration depth and, hence, the volume of treated tissue. Another option to increase the volume of responding tissue in PDT studies is to use pulsed light sources, which has presented satisfactory results when compared to continuous (CW) light sources. In this study, in vitro photodegradation of Photogem® (commercial photosensitizer, Moscow, Russia) was performed, during irradiation times between 0 and 40 minutes. A diode laser (Eagle Heron Quantum Tech, Brazil) was used as CW light source, and a femtosecond laser (Ti:Sapphire Libra-S, Opera-VIS Coherent, USA) emitting in 630 nm (1 kHz, < 70 fs pulse) was used as a pulsed light source. Data collection was performed using a portable fluorescence spectroscopy system, including a spectrometer USB 2000 (Ocean Optics®, Palo Alto, CA), a laptop and a Y-type optical fiber probe for PS fluorescence excitation and collection. Photodynamic response was investigated in eighteen animals, weighting between 180 g and 250 g, which were divided in two groups. Both groups received 1.5 mg/kg of body mass of PS, and after thirty minutes were irradiated with light dose of 150 J/cm2 and 74 mW/cm2 for fluence rate. Light penetration was also investigated using rat liver macerate, and thermal monitoring during PDT as well, for both pulsed and CW light sources. The photodegradation rate study allowed us to observe a greater efficiency in Photogem® molecules degradation for the pulsed light source. For the CW irradiation, the degradation rate was 6 times lower. Macerate study showed that light penetration coefficient values for CW and pulsed were similar, which corroborates with the average intensity analysis. The depth of necrosis histological analysis showed that the pulsed light source allows depth of necrosis to be about 2x deeper when compared to CW source. Additionally, the pulsed source showed a better result in the qualitative evaluation of necrotic tissue morphology. This is related to the high intensity of the pulses emitted from the pulsed light source on the photosensitized tissue, promoting an increase in depth of necrosis.