[pt] O ciclofenil é um medicamento antiestrogênico usado em tratamentos de distúrbios ovarianos. Por outro lado, esse efeito em homens resulta em aumento de massa muscular, sendo seu uso proibido para atletas do sexo masculino pelo código mundial antidoping estabelecido pela WADA. Os métodos de espectrofotometria de absorção e de fluorescência permitem quantificar direta ou indiretamente o ciclofenil, porém não são adequados para a análise de amostras mais complexas. Este trabalho propõe o desenvolvimento de um método baseado na cromatografia líquida de alta eficiência para determinação de ciclofenil usando detecção por fluorescência, após a fotoderivação do ciclofenil. A separação utiliza eluição isocrática (tampão borato 10 mmol/L(-1), pH 10/metanol/ 60/40 por cento v/v), e coluna C18 mantida a 35 graus Celsius. Após a fotoderivação com UV, formaram-se fotoderivados luminecentes, como previsto na literatura, sendo que o fotoderiado com tempo de retenção igual a 2,7 min foi o escolhido para fins quantitativos por ser estável ao longo de 96 h após o processo de derivatização. Foram obtidos os limites de detecção de 6,6 x 10(-8) mol/L(-1) e de quantificação de 7,3 x 10(-7) mol/L(-1). A faixa de resposta linear se extendeu até 5 x 10(-5) mol/L(-1) (de ciclofenil). As recuperações obtidas em formulações farmacêuticas se apresentaram entre 94 e 105 por cento. Os resultados indicaram que a homogeneidade e estabilidade dos medicamentos de ciclofenil são satisfatórias. As fontes que mais contribuiram para a incerteza de medição estão associadas ao preparo das soluções e à construção da curva analítica. / [en] Cyclofenil is an anti-estrogen used in treatments of ovarian disorders. On the other hand, its effect in men results in the increasing of muscle mass, being its use, by male athletes, banned by the World Anti-Doping Code established by World Anti-Doping Agency. Absorption and fluorescence spectrophotometries allow direct or indirect quantification of cyclofenil, however, they are not suitable for the analysis of complex samples. This work proposes the development of a method based on high performance liquid chromatography to determine cyclofenil using photochemical induced fluorescence detection. The separation using isocratic elution (10 mmol/L(-1) borate buffer at pH 10/methanol (60/40 per cent v/v), and column C18 maintained at 35 degrees celsius. After exposing cyclofenil to the UV, fluorescent photoderivatives were formed, as indicated in the literature, with the photoderivative with the retention time of 2.7 min used for quantitative purposes since it is stable for over 96 h after the photoderivatization procedure. The detection limit was 6.6 x 10(-8) mol/L(-1) and the limit of quantification was 7.3 x 10(-7) mol/L(-1). The linear response range extended up to 5 x 10(-5) mol/L(-1) (as cyclofenil). Recoveries in pharmaceutical formulations were between 94 and 105 per cent. The results indicated that the homogeneity and stability of cyclofenil tablets are satisfactory. The uncertainty sources that present the greatest contributions to the measurement uncertainty were the ones associated with the preparation of the solutions and the analytical curve.

[pt] Os glicocorticóides sintéticos tais como a triancinolona acetonido e a prednisolona não possuem fluorescência natural e nem são induzidos a fluorescer por meio do procedimento padrão para glicocorticóides naturais, que consiste no tratamento com ácido sulfúrico concentrado. No presente trabalho, um procedimento de derivação fotoquímica para triancinolona acetonido e prednisolona foi desenvolvido e cuidadosamente otimizado com o intuito de se obter derivados fluorescentes estáveis que permitiram elaborar um método espectrofluorimétrico para determinação dos mesmos em formulações farmacêuticas. Este procedimento consistiu na exposição à radiação ultravioleta (300 nm) de soluções ácidas dos glicocorticóides sintéticos em reator fotoquímico. Parâmetros experimentais, tais como tipo e concentração do ácido, temperatura e tempo de aquecimento, sistema de solventes e tempo de exposição ao UV se mostraram críticos e por isso foram cuidadosamente estudados. As características do reator também se mostraram importantes para o sucesso do procedimento. A intensidade da fluorescência (excitação em 240 nm e emissão em 350 nm) e a estabilidade dos fotoprodutos se mostraram apropriados para permitir o desenvolvimento de um método espectrofluorimétrico. Parâmetros instrumentais importantes, tais como banda espectral de passagem e a velocidade de varredura foram otimizados, visando à obtenção da melhor razão sinal do analito/sinal do branco e da melhor resolução espectral. Parâmetros analíticos de mérito, obtidos a partir das curvas analíticas, revelaram limites de detecção de 5 e 6 ng mL-1 para triancinolona acetonido e prednisolona, respectivamente; e limites de quantificação de 17 ng mL-1 para a triancinolona acetonido e 19 ng mL-1 para a prednisolona. As faixas lineares dinâmicas, nos dois casos, se estenderam por três ordens de grandeza com coeficientes de linearidade (r2) de 0,99. Este método espectrofluorimétrico foi testado em formulações farmacêuticas, obtendo-se os melhores resultados para os comprimidos e soluções injetáveis. Estudos para avaliar o efeito de dois potenciais interferentes (polimixina B e benzocaína) também foram realizados. Resultados de recuperação foram avaliados tomando como referência os valores indicados na bula do medicamento e também valores obtidos com o procedimento de referência (HPLC com detecção fotométrica UVvis) utilizado no Jockey Club Brasileiro, obtendo resultados entre 97 ± 14 e 104 ± 6 %. / [en] The synthetic glucocorticoid such as triamcinolone acetonide and prednisolone neither present natural fluorescence nor fluorescence can be induced by means of the standard procedure used for natural glucocorticoids which consists on a treatment with concentrated sulfuric acid. In the present work, a photochemical derivatization procedure for these two synthetic glucocorticoids was developed and carefully optimized aiming the obtantion of fluorescent derivatives stable enough to allow the development of a spectrofluorimetric method for determination of these analytes in pharmaceutical formulations. The photochemical derivatization procedure consisted on the exposure of acidic solutions of these synthetic glucocorticoids to the ultraviolet radiation (300 nm) in a photochemical reactor. Experimental parameters such as type and concentration of the acid, temperature and heating time, solvent system and UV exposition time have shown to be critical and therefore they were carefully studied. The design of the photochemical reactor) has also shown to be relevant for the success of the procedure. The intensity of the fluorescence (with maximum excitation and emission wavelenghts at 240 nm and 350 nm respectively) and the stability of these photoproducts, have shown to be appropriated for the development of a spectrofluorimetric method. Important instrumental parameters such as spectral bandpass and scan velocity have been optimized aiming the achievement of best signal-to-blank ratio and spectral resolution. Analytical parameters of merit, obtained from the analytical curve, have indicated limits of detention of 5 and 6 ng mL-1 for triamcinolone acetonide and prednisolone, respectively, and limits of quantification of 17 ng mL-1 for triamcinolone acetonide and 18 ng mL-1 for prednisolone. The linear dynamic range for both analytes extended over three orders of magnitude with linear coefficients (r2) of 0,99. The spectrofluorimetric method was tested by the analysis of pharmaceutical formulations, with best performance for tablets and injectable solutions. A study to evaluate the effect of two potential interferents (polimixine B and benzocaine) has also been made. Recovery results were evaluated using both, the reference values indicated in the medicine instructions and concentration values obtained using the reference procedure (HPLC with UV-visible photometric detection) used in the Brazilian Jockey Club. Satisfactory recovery results were achieved (between 97 ± 14 and 104 ± 6 %).

[pt] A derivatização fotoquímica foi utilizada para induzir ou amplificar a fluorescência de três substâncias utilizadas como princípios ativos em medicamentos: tetrabenazina (TBZ), amitriptilina (AMT) e vareniclina (VRN). Com o aumento de fluorescência após o tratamento com radiação UV, métodos espectrofluorimétricos foram desenvolvidos para determinar a concentração de TBZ, a AMT e a VRN em medicamentos e em matrizes biológicas. A avaliação da abordagem por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção por fluorescência tambme foi avaliada para a AMT e VRN. Para a determinação de TBZ, a irradiação por 60 min em meio de NaOH (0,45 mol L-1) permitiu a sua quantificação espectrofluorimétrica com um limite de detecção (LD) de 1,4 x 10-8 mol L-1 e faixa linear até 1,0 x 10-5 mol L-1. O método espectrofluorimétrico foi aplicado para determinar TBZ no medicamento com recuperações entre 88 e 95%. A TBZ também foi determinada em saliva fortificada com o analito em concentração próxima ao do limite de quantificação (LQ) com recuperações maiores que 87%. Estudos usando espectrometria de massas com desorção de plasma estimulada por uma fonte de 252Cf foram realizados para identificar a estrutura do fotoderivado, indicando a fotólise da TBZ via reação de Norrish tipo I e II. Para a determinação de AMT, duas abordagens de derivatização fotoquímica permitiram determinar a substância por espectrofluorimetria e por HPLC. Para o método espectrofluorimétrico, a derivatização foi realizada expondo ao UV por 60 min uma solução de AMT, preparada em HCl 0,027 mol L-1. A faixa de resposta linear se estendeu até 1,0 x 10-5 mol L-1 de AMT com um LD de 4,8 x 10-8 mol L-1. Na abordagem cromatográfica, o processo de derivatização da AMT foi ajustado utilizando 30 min de UV em tampão fosfato pH 3. O método permitiu um LD de 6,9 x 10-9 mol L-1 com faixa linear até 2,5 x 10-6 mol L-1 de AMT. Os métodos desenvolvidos foram aplicados na determinação de AMT em medicamento e em material de referência farmacopéico com recuperações entre 94 e 105% para o método fluorimétrico e entre 99 e 111% para a abordagem cromatográfica. A aplicação na determinação da AMT em plasma humano fortificado na concentração de 1,0 x 10-6 mol L-1 forneceram resultados aceitáveis. Os fotoderivados fluorescentes foram separados e identificados por GC-MS, sendo proposto um mecanismo de fotólise da AMT. Para a determinação de VRN, a derivatização fotoquímica em meio básico permitiu a determinação da substância por espectrofluorimetria, sendo também avaliada uma abordagem por HPLC. A derivatização da VRN, realizada expondo o analito ao UV por 23 min em solução de NaOH 0,64 mol L-1, permitiu um LD de 1,5 x 10-8 mol L-1 e uma faixa linear até 1,0 x 10-6 mol L-1. As condições de fotoderivatização também foram adaptadas para a determinação cromatográfica do analito, irradiando-o por 10 min em meio de tampão borato (0,01 mol L-1 pH 10). A aplicação na determinação da VRN no medicamento com recuperações entre 93 e 102% foi alcançada. Para todos os métodos desenvolvidos foi realizada uma análise metrológica simplificada contemplando as fontes de incerteza mais relevantes para o processo de medição dos analitos: o preparo de soluções; a repetibilidade; a precisão intermediária e a curva analítica. As incertezas de medição para cada um dos métodos propostos foram estimadas em três concentrações distintas, no início, no meio e no fim da faixa linear. Os resultados obtidos foram entre 5,8 e 36% de incerteza do valor nominal das concentrações próximas ao LQ e entre 3,1 e 16% para as concentrações dentro na faixa linear dos métodos. Em todos os métodos desenvolvidos foram utilizados procedimentos de derivatização seguros, energeticamente eficientes e com redução de uso de solventes e substâncias tóxicas, em concordância com os princípios da química verde. / [en] Photochemical derivatization was employed to induce or amplify the fluorescence from three substances with pharmacological activities: tetrabenazine (TBZ); amitriptyline (AMT) and varenicline (VRN). The substantial fluorescence enhancement after UV irradiation allowed the development of methods based on spectrofluorimetry for TBZ, AMT and VRN. The approach was also evaluated in high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorimetric detection for the determination of the concentration AMT and VRN in drugs or in biological matrices. For the determination of TBZ, 60 min of UV irradiation of the analyte prepared in NaOH (0.45 mol L-1) allowed its indirect quantification using spectrofluorimetry, with a limit of detection (LOD) of 1.4 x 10-8 mol L-1 and a linear response up to 1.0 x 10-5 mol L-1. Pre-concentration using solid phase extraction improved the LOD in one order of magnitude. The spectrofluorimetric method was applied for the determination of TBZ in a commercial drug, with recoveries between 88 and 95%. TBZ was also determined in analyte fortified saliva at a concentration near the limit of quantitation (LOQ) with recoveries greater than 87%. Studies using plasma desorption mass spectrometry with a 252Cf source, indicated that the photoderivatives of TBZ were obtained through a Norrish Type I and II TBZ photolysis. For the determination of AMT, two photochemical derivatization approaches allowed the determination of the substance by spectrofluorimetry. The approach using HPLC coupled to fluorescence detection was also tested. For the spectrofluorimetric method, the derivatization was achieved after 60 min of UV exposure of a solution of AMT prepared in HCl 0.027 mol L-1. The linear response of the method was up to 1.0 x 10-5 mol L-1 of AMT, with a LOD of 4.8 x 10-8 mol L-1. For the chromatographic method, the derivatization process was adjusted (30 min of UV irradiation in phosphate buffer, pH 3) in order to adapt the reaction for HPLC. The method allowed an LOD of 6.0 x10-9 mol L-1 with a linear range up to 2.5 x 10-6 mol L-1 of AMT. The determination of AMT in drugs and in a pharmacopeial reference material was performed, with recoveries between 94 and 105% for the fluorimetric method and between 99 and 111% using HPLC. The analysis of human plasma was also made using AMT (1.0 x 10-6 mol L-1) fortified samples. The fluorescent photoderivatives were separated and identified by GC-MS, which allowed the proposal of a photolysis mechanism of AMT. For the determination of VRN, the photochemical derivatization in basic medium allowed the determination of the substance by spectrofluorimetry. The derivatization of VRN, performed by exposing the analyte to the UV during 23 minutes in NaOH 0.64 mol L-1, allowed a LOD of 1.5 x10-8 mol L-1 and a linear range extending up to 1.0 x10-6 mol L-1. The derivatization condition were also adapted for the determination of the analyte using HPLC with fluorimetric detection, by irradiating VRN for 10 min in borate buffer (0.01 mol L-1 pH 10). Both methods were applied for the determination of VRN in a commercial drug, with recoveries between 93 and 102%. For all the developed methods, a simplified metrological evaluation was performed, considering the most relevant sources of uncertainty during the measurement process of the analytes studied in this thesis: solution preparation, intra and inter-day precision and the analytical curve. The uncertainty sources for each of the proposed methods were estimated in three different concentrations within the linear range. Measurement uncertainty estimations were between 5.8 and 36% of the nominal concentration in the concentrations near the LOQ and between 3.1 and 16% in the concentrations within the linear range of the methods. Safer, energetically efficient procedures with solvent reduction and without the use of toxic reagents were proposed, in agreement to green chemistry principles.

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Foram selecionados, aleatoriamente, 12 fungos para serem reativados em placas de Petri contendo meio BDA. Após a reativação, foram obtidos os micro-extratos dos 12 fungos conforme a metodologia adaptada de Smedsgaar. Os micro-extratos foram avaliados por CLAE-DAD para determinação do perfil cromatográfico e, também, submetidos a ensaios antimicrobianos. O fungo FSF12 (Trichoderma sp.), selecionado após a triagem do perfil químico e biológica foi cultivado em escala ampliada em meio sólido (arroz) e levou ao isolamento de cinco substâncias: ácido graxo poliinsaturado (E1), 5’-inosil (E2), tirosol (E3), harzialactona A (E4) e 2-anidromevalônico (E5). Já em relação ao fungo EJCP13 (S. apiospermum), foram isolados os compostos triacil (J1), peróxido de ergosterol (J2), ergosterol (JA19), cerivisterol (JA29) e éster metílico (JA24), dulcitol (D) e Brefeldina A (JA). O composto brefeldina A apresentou importante atividade antimicrobiana e, também, mostrou ser o metabolito secundário majoritário nos extratos de S. apiospermum. Assim, resolveu-se quantificar essa substância nos extratos, o que corroboraram com os resultados, indicando a presença da brefeldina A somente nos extratos AcOEt e hexânico. O isolamento das substâncias foi realizado através de técnicas cromatográficas, como CCVU e, monitoramento, por CCDA. As estruturas químicas foram elucidadas com auxílio de técnicas espectroscópicas (RMN de 1H e 13C, HMQC, HMBC) e espectrométrica (ESI-MS). / Endophytic fungi are microorganisms that lives in association with the host species, and they're a promising source of important natural products. With a equal importance, the soil fungi also are capable of producing so many substances of economic value. Thus, the following work was objective to obtain bioactive composts produced by endophytic fungi M. acutistipula var. ferrea and soil Carajás Saw, besides the endophytic S. apiospermium from liana of Bauhinia guianensis Auble. The species M. acutistipula var. ferrea, were isolated 56 endophytic and 64 soil fungi. They were randomly, selected, 12 fungi to be reactivated in Petri dishes containing PDA medium. After reactivating the micro-extracts of 12 fungi were obtained as the adapted methodology Smedsgaar. The micro-extracts were evaluated by HPLC-DAD to determine the chromatographic profile and, also, submitted antimicrobial testing. The FSF 12 (trichoderma sp.), selected after the screening of chemical and biological profile was grown on a large scale in a solid medium (rice) and led to the isolation of five substances: fatty acid polyunsaturated (E1), 5'-inosil (E2), tyrosol (E3), harzialactone A (E4) and 2-anhydro mevalonic (E5). In relation to the fungus EJCP13 (S. apiospermium) where compounds isolated, triacyl (J1), ergosterol peroxide (J2), ergosterol (JA19), cerivisterol (JA29), methylester (JA24), dulcitol (D), and brefeldin A (JA). The compound Brefeldin A showed significant antimicrobial activity and, also, proved to be the major secondary metabolite in extracts from S. apiospermium. Thus, it decides to quantify a substance in the extract, which corroborate results, which indicate the presence of brefeldin A only in AcOEt and the hexane extracts. The isolation of the substances was performed by chromatographic techniques, such as CCVU and, monitoring, by ADCC. The chemical structures were elucidated with the aid of spectroscopic (1H and 13C NMR, HMQC, HMBC), and spectrometric (ESI-MS).