Diss.--Phil. Fak.--Göttingen--Georg-August-Univ., 1997. / Bibliogr. p. 351-365. Index.

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In der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts lebte in St. Petersburg Johann Christian Leopold Fuchs (im Russischen: Iogann Leopol’d Fuks, auch: Ivan Ivanovič Fuks). Aus Anhalt-Dessau stammend, verbrachte er mehr als fünfzigJahre im russischen Zarenreich und ist auch in St. Petersburg gestorben.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 janvier 2024) / La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est une pathologie qui touche la couche postérieure de la cornée, l'endothélium cornéen. Ce dernier fait office de barrière physique entre l'humeur aqueuse et le reste de la cornée. De ce fait, lorsqu'il est défectueux, une accumulation de l'humeur aqueuse dans le stroma entraîne l'apparition d'un œdème stromal et de bulles épithéliales. Il s'en suit une opacification cornéenne menant à une perte de vision irréversible. Cliniquement, la pathologie est associée à l'épaississement de la membrane de Descemet (DM) dû à un dépôt accru de matrice extracellulaire (MEC), entraînant la formation d'excroissances, appelées guttae. Puis, une perte de densité des cellules endothéliales cornéennes (CECs) se produit contribuant aux difficultés de maintenir la déturgescence du stroma. En Amérique du Nord, la FECD est la principale cause de transplantation de cornées qui représente son seul traitement. De nouveaux traitements sont à l'étude mais nécessitent une bonne compréhension de la maladie et des dérégulations de l'endothélium cornéen. La FECD étant une pathologie multifactorielle, son étiologie reste difficile à déterminer. La recherche a mené à la proposition de différentes hypothèses d'explications au développement de la maladie. Parmi elles, la transition endothélio-mésenchymateuse ou épithélio-mésenchymateuse (TEM). Ce processus cellulaire consiste au passage d'un phénotype endothélial ou épithélial vers un phénotype mésenchymateux. Malgré quelques mises en évidence de la TEM dans la FECD, des signes clés de cette transition manquent dans la maladie, tels que le passage à une morphologie fibroblastique et un changement de cadhérines. C'est pourquoi notre laboratoire a décidé de clarifier la présence de la TEM dans la FECD. L'objectif de ce projet est de comprendre comment la TEM est activée dans la FECD et son impact sur les CECs. De ce fait, notre laboratoire a étudié la TEM à un niveau intracellulaire et extracellulaire en utilisant aussi bien des CECs primaires que des modèles tissulaires. Notre attention s'est d'abord portée sur l'étude des protéines impliquées dans les voies TGF-β/Smad et Wnt/β-caténine (connues pour activer la TEM) dans les CECs *ex vivo* et *in vitro*. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressées au dépôt anormal de MEC, un des signes d'une TEM. En effet, nous avons proposé que les protéines matricielles anormalement déposées seraient impliquées dans la perte cellulaire endothéliale dans la FECD. Nous avons donc étudié l'expression de protéines matricielles dans les stades précoces et avancés de la FECD et leur influence sur l'adhésion et la migration des CECs en culture. Pour répondre au premier objectif, des données transcriptomiques et l'expression des protéines liées à la TEM ont été étudiées *ex vivo*. Les protéines d'intérêt ont également été étudiées *in vitro* avec ou sans irradiation chronique d'UVA. Nos travaux en *ex vivo* FECD ont révélé l'absence de l'activité des voies Wnt/β-caténine et TGF-β/Smad. *In vitro*, ces deux voies de signalisations étaient actives et une augmentation de TGF-β2 a également été observée. Néanmoins, l'exposition aux UVA n'a pas modifié le profil d'expression des protéines. Pour le deuxième objectif, les données transcriptomiques du matrisome de CECs *ex vivo* et *in vitro* ont été analysées. Nous avons ensuite étudié la morphométrie des guttae en *ex vivo* et l'expression de nos protéines d'intérêt en *ex vivo* et sur les endothélia cornéens reconstruits sains et pathologiques. Des tests d'adhésion et de migration ont ensuite été réalisés. Les gènes *SPP1* (Ostéopontine), *FN1* (Fibronectine) et *TNC* (Ténascine-C) étaient régulés à la hausse en *ex vivo* et SPP1 était régulé à la hausse aussi bien *ex vivo* qu'*in vitro*. La fibronectine (FN), ténascine-C (TN-C), ostéopontine (OPN) et le collagène de type XIV (COL XIV) étaient exprimés dans les DM FECD mais seules la TN-C et la FN se retrouvaient dans les endothélia reconstruits FECD. La FN et la TN-C n'ont pas modifié l'adhésion des CECs mais l'OPN l'a diminuée. La FN et la combinaison de FN et TN-C ont augmenté significativement la migration des CECs. Les travaux de cette thèse permettent d'apporter plus de connaissances sur l'activation de la TEM dans la FECD et mettent en évidence une chronologie du dépôt de MEC anormale dans la pathologie ainsi que la façon dont les CECs y réagissent. Une meilleure compréhension du développement de la FECD pourrait apporter des clés pour la conception de nouveaux traitements. / Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD) is a pathology that affects the posterior layer of the cornea, the corneal endothelium. The endothelium acts as a physical barrier between the aqueous humor and the rest of the cornea, so when it is defective, an accumulation of aqueous humor in the stroma leads to stromal edema and epithelial bullae. This leads to corneal opacification and irreversible vision loss. Clinically, the pathology is associated with thickening of Descemet's membrane (DM) due to an increase of extracellular matrix (ECM), leading to the formation of outgrowths known as guttae. This is followed by a loss of corneal endothelial cell (CEC) density, making it difficult to maintain stromal deturgescence. In North America, FECD is the leading cause of corneal transplantation, which is its only treatment. New treatments are under study but require a good understanding of the disease and corneal endothelium dysregulation. As FECD is a multifactorial pathology, its etiology remains difficult to determine. Research has led to the proposal of various hypothesis to explain the development of the disease. One of these is endothelial to mesenchymal or epithelial to mesenchymal transition (EMT). This cellular process is characterized by the transition from an endothelial or epithelial phenotype to a mesenchymal one. Despite some evidence of EMT in FECD, key signs of this transition are missing in the disease, such as the transition to a fibroblastic morphology or the cadherins switch. Therefore, our laboratory decided to clarify the presence of EMT in FECD. The aim of this project is to understand how EMT is activated in FECD and its impact on CECs. Accordingly, our laboratory has studied EMT at both intracellular and extracellular levels, using both primary CECs and tissue models. Our first focus was on the study of proteins involved in the TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin pathways (known to activate EMT) in *ex vivo* and *in vitro* CECs. In a second step, we focused on abnormal ECM deposition, one of the key signs of EMT. Indeed, we proposed that abnormally deposited matrix proteins would be involved in endothelial cell loss in FECD. We therefore studied the expression of matrix proteins in the early and late stages of FECD and their influence on the adhesion and migration of cultured CECs. To address the first objective, transcriptomic data and the expression of EMT-related proteins were studied *ex vivo*. Proteins of interest were also studied *in vitro* with or without chronic UVA irradiation. Our *ex vivo* FECD work revealed the absence of Wnt/β-catenin and TGF-β/Smad pathway activity. *In vitro*, both signaling pathways were active, and an increase in TGF-β2 was also observed. Nevertheless, UVA exposure did not alter the protein expression profile. For the second objective, transcriptomic data from the *ex vivo* and *in vitro* matrisome were analyzed. We then studied guttae morphometry in *ex vivo* specimens and the expression of our proteins of interest in *ex vivo* specimens and on healthy and pathological tissue engineered corneal endothelia. Adhesion and migration assays were then performed. *SPP1* (Osteopontin), *FN1* (Fibronectin) and *TNC* (Tenascin-C) genes were up-regulated *ex vivo*, and *SPP1* was up-regulated both *ex vivo* and *in vitro*. Fibronectin (FN), tenascin-C (TN-C), osteopontin (OPN) and collagen type XIV (COL XIV) were expressed in FECD DMs, but only TN-C and FN were found in reconstructed FECD endothelia. FN and TN-C had no impact on CEC adhesion, but OPN did. FN and the combination of FN and TN-C significantly increased CEC migration. The studies of this thesis provide further insight into the activation of EMT in FECD, highlight the chronological abnormal ECM deposition in the pathology and how CECs respond to it. A better understanding of the FECD development could bring keys to design new treatments.

Le stress oxydatif peut provenir de sources exogènes comme les UVA ou de sources endogènes comme la chaîne respiratoire (OXPHOS). L'oxydation des composants cellulaires a été associée avec la dégénération, des phénotypes de vieillissement et des pertes de fonctionnalités des tissus. Les UVA sont les plus efficaces des rayons UV à induire de l’oxydation, tel que démontré par la formation de dommages oxydatifs à l'ADN et par l'apparition de délétions mitochondriales qui en résultent. La délétion mitochondriale de 4977 pb (ADNmtCD4977), la plus commune, et celle de 3895 pb (ADNmt3895) sont deux délétions reliées au photovieillissement cutané et à l'exposition au stress oxydant. Le phénomène de vieillissement dans la peau est bien documenté et se traduit par une dégradation de la matrice extracellulaire, une perte d'élasticité et la formation de rides. Toutefois, peu d'études portent sur la cornée humaine alors qu'elle est un tissu exposé directement aux rayonnements UV au même titre que la peau. Nous avons donc tenté mieux comprendre l'effet de l'oxydation exogène et endogène sur cette structure. L'analyse de la localisation des délétions ADNmtCD4977 et ADNmtCD4977 dans l'oeil humain a permis de révéler qu'elles se concentrent principalement dans le stroma cornéen et s'accumule avec l'âge. Le stroma cornéen est la couche cellulaire qui confère la transparence et la rigidité à la cornée humaine. Ces résultats nous ont suggéré une implication des UVA dans le photovieillissement de la cornée. Nous avons donc entrepris de vérifier les changements liés à l'exposition aux UVA dans le stroma cornéen puisque les UVA sont connus pour causer des altérations à la matrice extracellulaire (ECM) au niveau cutané. Nous avons donc créé un modèle de photovieillisement par une exposition chronique aux UVA sur des kératocytes avec lesquels nous avons fait sécréter une ECM. Nos résultats nous ont démontré qu'une exposition chronique aux UVA cause des altérations à l'ECM cornéen semblable à des phénotypes de photvieillissement. En effet, nous avons dénoté des changements transcriptomiques et protéomiques pour certains collagènes et protéoglycans. Une atteinte aux collagènes par le vieillissement cornéen se traduit entre autres par une rigidification, une opacification et un changement dans son pouvoir réfractif qui mène à une perte de la vision. Par ailleurs, notre avons également investigué l'implication du stress oxydatif dans la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD), une maladie dégénérative de l'endothélium cornéen, qui mène à une perte de vision et est une cause principale de greffe cornéenne. L'étiologie de la maladie est encore inconnue, mais le stress oxydatif est soupçonné de jouer un rôle important dans la pathogenèse. Nos résultats ont amené de nouvelles évidences de l'implication de l'oxydation dans la maladie par l'augmentation de la quantité d'ADN mitochondrial et un raccourcissement des télomères dans des explants de cornées pathologiques. Nos résultats nous ont également démontré que la mise en culture de cellules FECD permettait la sélection de cellules fonctionnelles et comparables à des cellules saines en termes de quantité d'ADN mitochondrial et de son intégrité, de sensibilité à l'oxydation et de longueur télomérique. Les résultats obtenus soutiennent ainsi la possibilité d'employer les cellules FECD fonctionnelles sélectionnées pour utilisation en génie tissulaire afin de créer des cornées autologues pour pallier aux manques de greffes cornéennes. Enfin, nos résultats apportent de nouvelles évidences quant à l'implication du stress oxydatif dans le photovieillissement cornéen et dans l'étiologie de la FECD. / Oxidative stress can arise from exogenous sources like UVA or endogenous source like the respiratory chain (OXPHOS). Oxidation of cellular components is associated with degenerative disease, aging phenotypes and loss of tissue functions. UVA is the most efficient components of UV light to induce oxidation, like it have been shown by the formation of oxidative damage on DNA and the appearance of resulting mitochondrial deletions. The mitochondrial deletion of 4977 bp (mtDNACD4977), the most common, and the 3895 bp (mtDNA3895) are both connected to skin photoaging and exposition to oxidative stress. Skin photoaging is well documented and is portrayed by a degradation of the extracellular matrix, a loss of elasticity and formation of wrinkles. However, few studies have been done on the human cornea even if this structure is directly exposed to UV light like the skin. Thus, we have tried to understand the effect of exogenous and endogenous oxidative stress on this eye structure. Analysis of mtDNACD4977 and mtDNA3895 in the human eye has shown that these deletions are localized in the corneal stroma and accumulate with age. The corneal stroma is the cellular layer conferring transparency and rigidity to the human cornea. Our results have suggested that UVA is implicated in the photoaging of the cornea. Thus, we checked for changes linked to UVA exposure in the corneal stroma since UVA are known to cause alteration to the extracellular matrix (ECM). Thereby, we created a photoaging model by exposing keratocytes to chronic UVA doses and then making them secrete an ECM. Our results have shown that chronic UVA exposure causes changes similar to photoaging phenotypes. We noted changes in the transcriptomic and proteomic expression of collagen and proteoglycans. Alteration to collagens composition by aging leads to corneal rigidity, cloudening and a loss of refractive power of the cornea, which can result in a loss of vision. On the other hand, we also investigated the implication of oxidative stress in the Fuch’s Endothelial Corneal Dystrophy, a degenerative disease of the corneal endothelium, which leads to a vision loss and is the leading cause of corneal transplantation. The etiology of the disease is not well known, but oxidative stress is suspected of playing an important role in the pathogenesis. Our results have shown new evidences of oxidative stress in the pathology by displaying an increase in mitochondrial DNA and a telomeric shortening in cells from corneal explants. Our results have also shown that using cell culture on FECD cells can allow the selection of functional cells that can compare to healthy cells terms of mitochondrial amount and integrity, sensitivity to oxidation and telomere length. Our results support the fact that functional FECD cells could be used to create autologous cornea by tissue engineering to solve the lack of corneal graft. Thus, our findings bring new evidences to the implication of oxidative stress in corneal photoaging and in the etiology of FECD.

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques. / Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is a primary disease of the corneal endothelium. Its pathogenesis is poorly understood. No medical treatment is effective. Surgical treatment (the only available treatment) carries 10% of immunogenic rejection. Experimental models are needed in order to better understand the disease and to investigate potential autologous treatments (to prevent immunogenic rejection). The overall goal of this thesis is to develop an experimental model for FECD using tissue engineering. This was achieved in three steps. 1) An in vitro tissue-engineered FECD model was created and characterized. Briefly, Descemet’s membranes from patients with late-stage FECD undergoing Descemet’s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK) were used to isolate and culture FECD endothelial cells. Second or third-passaged FECD endothelial cells were seeded on a previously decellularized human cornea. After 2 weeks in culture, TE-FECD corneas (n=6) were assessed using histology, transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence labeling of various proteins. TE-FECD endothelium yielded a monolayer of polygonal cells well adhered to Descemet’s membrane. The TE-FECD corneal endothelium expressed the function-related proteins Na+-K+/ATPase α1 and Na+/HCO3-. Clusterin expression was faint and uniform. 2) In order to determine the best surgical procedure to transplant the TE-FECD corneas in the feline model, a DSAEK procedure was evaluated and compared to penetrating keratoplasty technique. DSAEK assessments included surgical challenges and clinical outcomes. DSAEK technique was challenging to perform in the feline model. Rapid fibrin formation was observed in all DSAEK cases (n=5). 3) The in vivo functionality of the TE-FECD corneas was assessed. TE-FECD corneas were grafted in the feline model (n=7) using penetrating keratoplasty procedure and observed for seven days. In vivo assessments included transparency, pachymetry, optical coherence tomography, endothelial cell morphometry, TEM and immunostaining of function-related proteins. After transplantation, pachymetry gradually decreased and transparency gradually increased. Seven days after transplantation, 6 out of 7 grafts were clear. Post-mortem TEM showed subendothelial loose fibrillar material deposition in all TE-FECD grafts. The TE grafted endothelium expressed Na+-K+/ATPase and Na+/HCO3-. This thesis demonstrates that endothelial cells from late-stage FECD corneas can be used to engineer a corneal endothelium. Compared to DSEAK, penetrating keratoplasty is a more appropriate procedure for corneal transplantation in the feline model, since the DSAEK procedure in the feline model presently yields inconsistent clinical results. Restoration of corneal thickness and transparency demonstrates that the TE-FECD grafts are functional in vivo. This novel FECD living model suggests a potential role of tissue engineering for FECD cell rehabilitation. Potential applications are numerous, including pathophysiological and pharmacological studies.

Le but est de développer un chargeur d’aérosols submicroniques à décharge couronne pour la mesure de concentration atmosphérique (10^3-10^5 cm^-3) avec un temps de réponse de 100 ms.Deux sources d’ions, pointe-Trou et fil-Fente ont été caractérisées. L’augmentation du flux d’ions extrait en post-Décharge par confinement EHD des ions tant dans l’espace inter-Électrodes que dans l’extracteur a été mis en évidence.L’étude expérimentale de deux configurations de mélange, concentrique et face-À-Face, a d’abord permis de confirmer la loi de charge des aérosols par diffusion d’ions qui dépend du diamètre des particules et du produit Ni.t, avec Ni, la densité d’ions et t, le temps de charge. L’originalité de ce chargeur repose sur l’hétérogénéité des densités d’ions unipolaires (Ni0>10^9cm^-3) requises pour compenser le temps de charge inférieur à 50 ms. Dans ces conditions hétérogènes, nous avons montré que la taille et la dynamique de charge qui en dépend, contrôlent la trajectoire de l’aérosol.Les différents chargeurs ont ensuite été comparés selon les conditions de fonctionnement, principalement en termes de charge maximale et pertes minimales. Dans le chargeur retenu (source d’ions pointe-Trou et mélange concentrique), les relations charge/mobilité et les pertes en fonction du diamètre d’aérosol ont ensuite été caractérisées. Nous avons montré la linéarité du courant de particules chargées avec la concentration qui permet l’inversion de données. Le système préliminaire de mesure comprend le chargeur, le séparateur et la mesure du courant répond aux objectifs de l’étude en termes de limite de détection en concentration (<10^3 cm^-3) et de temps de réponse (< 100 ms). Nous avons donc démontré la faisabilité d’un système de mesure de concentration d’aérosol atmosphérique à 10 Hz, a l’aide d’un chargeur à décharge couronne, sous réserve d’améliorer le pouvoir de séparation. En outre, aux vues des pertes d’aérosol négligeables et de l’abaissement de la limite de charge partielle, le chargeur développé est compatible avec d’autres applications. / The goal is to develop an aerosol charger based on a corona discharge for atmospheric concentration measurements (10^3-10^5 cm^-3) within a response time of 100 ms.Two ion sources, point-To-Hole and wire-To-Slit have been characterized. The increase of the ion flow in the post-Discharge by EHD ion confinement in both the discharge gap and the hole has been shown.At first, using an experimental survey driven in two mixing configurations, concentric and face-To-Face, we have confirmed the aerosol diffusion charging law which depends on aerosol diameter and Ni.t product, with Ni, the ions concentration and t, the charging time. Thus, the originality of this charger relies on the very high heterogeneity of unipolar ion densities (Ni0 >10^9 cm^-3) required to compensate the charging time of 50 ms. In these conditions, we have shown that aerosol diameter and the charging dynamic (which depends also on the diameter) control the aerosol trajectory.The chargers have, next, been compared in different operating conditions, mainly in terms of the maximal charging and the minimal losses. In the chosen charger (point-To-Hole ion source and concentric mixing), the relations charge/mobility and losses according to diameter have been characterized. We have also shown the linearity of the charged particles current with the aerosol concentration which allows the current-Concentration data inversionThe preliminary measurement system composed by the charger, the separator and the particle current measurements, satisfies the objectives of the study in terms of the concentration detection limit (10^3 cm^-3) and the response time (100 ms). We have thus shown the feasibility of an atmospheric aerosol concentration measurement system at 10 Hz using a corona discharge charger provided that the separation power is improved. Furthermore, knowing that aerosol losses are negligible and the lower limit of the partial charging, the developed charger is adaptable with other applications.

En France, les dysfonctions endothéliales représentent environ la moitié des indications de greffes de cornée réalisées chaque année. Cependant, les problématiques liées à la pénurie de greffon, aux difficultés des techniques chirurgicales de greffes endothéliales ainsi qu’aux risques d’échec ou de rejet de greffe poussent les chercheurs à développer de nouvelles thérapies moins invasives et plus efficaces. La thérapie cellulaire cornéenne endothéliale est une des voies de recherche actuellement explorées dont le but est de s’affranchir des aléas de la greffe de cornée. La cornée humaine est un tissu idéal pour la thérapie cellulaire. Grâce à ses caractéristiques d’organe à la fois avasculaire et immunitairement privilégié, les cellules transplantées sont ainsi bien mieux tolérées par rapport aux autres tissus et organes vascularisés. Les avancées dans le domaine des cellules souches, de l'ingénierie, particulièrement avec l’arrivée des greffes de cellules souches épithéliales pour le traitement des pathologies sévères de la surface oculaire, ont suscité un intérêt massif afin d’adapter ces techniques aux cellules endothéliales / In France, around half of all corneal keratoplasties are performed to treat corneal endothelial dysfunction each year. However, the use of endothelial keratoplasty is limited by the technical difficulty of the procedure, a shortage of available grafts, and the potential for graft failure or rejection. These limitations are driving researchers to develop new, less invasive, and more effective therapies. Corneal endothelial cell therapy is being explored as a potential therapeutic measure, to avoid the uncertainty associated with grafting. The human cornea is an ideal tissue for cell therapy as owing to its avascular characteristics, transplanted cells are better tolerated compared with other vascularized tissues and organs. Advances in the field of stem-cell engineering, particularly the development of corneal epithelial stem cell therapy for the treatment of severe diseases of the ocular surface, have aroused a massive interest in adapting cell-therapy techniques to corneal endothelial cells

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques. / Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is a primary disease of the corneal endothelium. Its pathogenesis is poorly understood. No medical treatment is effective. Surgical treatment (the only available treatment) carries 10% of immunogenic rejection. Experimental models are needed in order to better understand the disease and to investigate potential autologous treatments (to prevent immunogenic rejection). The overall goal of this thesis is to develop an experimental model for FECD using tissue engineering. This was achieved in three steps. 1) An in vitro tissue-engineered FECD model was created and characterized. Briefly, Descemet’s membranes from patients with late-stage FECD undergoing Descemet’s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK) were used to isolate and culture FECD endothelial cells. Second or third-passaged FECD endothelial cells were seeded on a previously decellularized human cornea. After 2 weeks in culture, TE-FECD corneas (n=6) were assessed using histology, transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence labeling of various proteins. TE-FECD endothelium yielded a monolayer of polygonal cells well adhered to Descemet’s membrane. The TE-FECD corneal endothelium expressed the function-related proteins Na+-K+/ATPase α1 and Na+/HCO3-. Clusterin expression was faint and uniform. 2) In order to determine the best surgical procedure to transplant the TE-FECD corneas in the feline model, a DSAEK procedure was evaluated and compared to penetrating keratoplasty technique. DSAEK assessments included surgical challenges and clinical outcomes. DSAEK technique was challenging to perform in the feline model. Rapid fibrin formation was observed in all DSAEK cases (n=5). 3) The in vivo functionality of the TE-FECD corneas was assessed. TE-FECD corneas were grafted in the feline model (n=7) using penetrating keratoplasty procedure and observed for seven days. In vivo assessments included transparency, pachymetry, optical coherence tomography, endothelial cell morphometry, TEM and immunostaining of function-related proteins. After transplantation, pachymetry gradually decreased and transparency gradually increased. Seven days after transplantation, 6 out of 7 grafts were clear. Post-mortem TEM showed subendothelial loose fibrillar material deposition in all TE-FECD grafts. The TE grafted endothelium expressed Na+-K+/ATPase and Na+/HCO3-. This thesis demonstrates that endothelial cells from late-stage FECD corneas can be used to engineer a corneal endothelium. Compared to DSEAK, penetrating keratoplasty is a more appropriate procedure for corneal transplantation in the feline model, since the DSAEK procedure in the feline model presently yields inconsistent clinical results. Restoration of corneal thickness and transparency demonstrates that the TE-FECD grafts are functional in vivo. This novel FECD living model suggests a potential role of tissue engineering for FECD cell rehabilitation. Potential applications are numerous, including pathophysiological and pharmacological studies.

Die Arbeit geht einem Rezeptionsgeschehen zwischen Theologie und Philosophie im 20.Jahrhundert nach, das nach dem Verhältnis von Sprache und Wirklichkeit fragt. Rudolf Bultmanns Kerygma und Martin Heideggers Ereignis versuchen zu beschreiben, wie Sprache auf die Wirklichkeit und die Existenz wirkt. Ernst Fuchs und Gerhard Ebeling gehen in ihrer Hermeneutischen Theologie von einer christologischen Verhältnisbestimmung aus: Weil Gott im Wort wirkt, ist der Mensch sprachlich bestimmt. Ihr Konzept Wortgeschehen verbindet die sprachliche mit der existentialen Ebene, um das Wort Gottes als dynamisch und rechtfertigend wirkmächtig zu interpretieren. Der Philosoph Paul Ricœur rezipiert diese theologische Verhältnisbestimmung. Er versucht mit seiner Hermeneutik des Symbols, der Metapher und des Textes, existentiale Strukturen und Wirkweisen von Sprache zu beschreiben und setzt sich dazu auch mit dem Wortgeschehen auseinander. Allerdings weist Ricœurs Rezeption des theologischen Konzeptes auf strukturelle und hermeneutische Probleme hin. Ricœurs eigener Entwurf eines hermeneutischen Prozesses bezieht Struktur und Bedeutung des Textes, sowie Kritik und Glaube des Verstehenden in den Interpretationsvorgang ein und öffnet sich für bibelhermeneutische Überlegungen. Der Philosoph Ricœur wird daher theologisch vielfach rezipiert. Eine konkrete Schnittstelle stellt die Gleichnisdiskussion ab den 1970er Jahren dar, an der Ricœur sich beteiligt und in der seine Hermeneutik theologisch rezipiert wird. Gleichzeitig vertieft diese Diskussion das Konzept Wortgeschehen, weil sie sprachliche Mechanismen und deren existentiale Wirkung genauer beschreibt. Nachdem das Wortgeschehen philosophisch wie theologisch weiterentwickelt wurde, erweist es sich in der Frage nach einer Hermeneutik des Wortes Gottes als dienliches Konzept, weil es die sprachliche Ebene des Wortes Gottes mit hermeneutischen und theologischen Begründungen seiner existentialen Wirkung verbindet. / This dissertation investigates a mutual reference between theology and philosophy in the 20th century dealing with the issue of the relation between language and reality. Rudolf Bultmann‘s Kerygma and Martin Heidegger‘s Ereignis try to describe, how language effects reality and existence. In their Hermeneutical Theology, Ernst Fuchs and Gerhard Ebeling define a christological relation: Because God acts through the word, human existence is defined through language. Their concept Wortgeschehen relates linguistic to existential layers of meaning in order to interpret the word of God as dynamic and justifying. The philosopher Paul Ricœur refers to this theological relation. In his hermeneutics of symbols, metaphors and texts, he tries to describe existential structures and effects of language and concerning this question also discusses the Wortgeschehen. Yet, Ricœur‘s reference to the theological concept points out structural and hermeneutical problems. Ricœur‘s own concept of a hermeneutic process integrates structure and meaning of a text, as well as the critical and faithful understanding into the process of interpretation. His position is open for hermeneutics of the Bible. Thus, there are several theological references to the philosopher. The discussion on parables in the 1970s represents a concrete intersection of both disciplines, involving Ricœur and the theological reception of his hermeneutics. At the same time the discussion elaborates the concept Wortgeschehen describing language mechanisms and existential effects more precisly. Through its continuing philosophical and theological development the Wortgeschehen proves a helpful concept concerning the question of hermeneutics of the word of God, because it connects the linguistic layer of the Word of God to hermeneutic and theological reasons of its existential effect.