L’un des principaux défis de la thérapie génique est d’identifier un vecteur sûr capable d’assurer un transfert efficace et une expression soutenue d’un gène d’intérêt thérapeutique dans les cellules cibles. L’émergence de vecteurs plasmidiques de nouvelles générations a permis d’atteindre ces objectifs et de considérer la thérapie génique non virale comme une alternative prometteuse aux vecteurs viraux pour le traitement de maladies génétiques ou acquises. Appartenant à ces nouvelles générations, les dérivés du vecteur pFAR4 sont des miniplasmides dépourvus de gène de résistance à un antibiotique. Leur propagation dans les cellules d’Escherichia coli est basée sur la suppression d’une mutation non-sens de type ambre introduite dans un gène essentiel de la souche productrice, permettant ainsi d’éliminer les risques associés à l’utilisation de gène de résistance à un antibiotique tout en diminuant la taille du vecteur. Le but de cette thèse est d’étudier le potentiel de ces vecteurs dans deux contextes de thérapie génique non virale : Dans une première approche, le potentiel du vecteur pFAR4 a été évalué pour l’expression d’un gène thérapeutique dans le foie de souris. Pour ce faire, un dérivé de ce vecteur exprimant le gène Sgsh à partir d’un promoteur spécifique des hépatocytes et codant la protéine sulfamidase, protéine défectueuse chez les patients souffrant de la maladie de Sanfilippo de type A, a été administré par injection hydrodynamique à des souris. Nous avons montré que le vecteur pFAR4 promeut dans le foie une expression élevée et soutenue de la sulfamidase, qui décline rapidement lorsque le gène Sgsh est administré par un vecteur contenant un gène de résistance à la kanamycine. Dans le cadre de cette étude, il a été établi que le profil d’expression obtenu avec le vecteur pFAR4 n’est pas lié à son insertion dans le génome des hépatocytes mais résulte, de par sa taille réduite, d’une protection contre les phénomènes d’extinction de transgène couramment observés in vivo avec les vecteurs conventionnels. Dans une seconde approche, le vecteur pFAR4 a été combiné à la technologie Sleeping Beauty (SB), dont l’un des constituants majeurs est la transposase hyperactive SB100X qui promeut la transposition d’un transgène, en l’excisant du plasmide qui le porte et en l’insérant dans le génome des cellules hôtes. Cette combinaison a été étudiée in vitro dans des cellules HeLa, en utilisant un transposon contenant soit le gène de résistance à la néomycine soit le gène codant la protéine fluorescente Vénus. Nous avons ainsi montré que le plasmide pFAR4 constituait un vecteur efficace pour les composants du système SB et que la combinaison pFAR4/SB conduisait à un taux de transgénèse augmenté par rapport à une association avec des plasmides conventionnels. Cette efficacité élevée résulte d’un niveau de transfection et d’un taux d’excision augmentés, tous deux favorisés par la taille réduite du plasmide. La combinaison pFAR4/SB devrait prochainement être utilisée pour transférer le gène codant le facteur anti-angiogénique PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) à des cellules primaires de l’épithélium pigmentaire de la rétine ou de l’iris dans deux essais cliniques (Phase I/II) de thérapie génique ex vivo pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). / One of the main challenges in gene therapy is to identify safe vectors that promote an efficient gene delivery and a sustained therapeutic transgene expression level in targeted cells. The development of novel plasmid vectors allowed to reach these objectives and to consider non-viral gene therapy approaches as attractive alternatives to treat genetic and acquired disorders. The pFAR4 vector is a novel antibiotic-free mini-plasmid. In Escherichia coli, its propagation is based on the suppression of an amber nonsense mutation introduced into an essential gene, thus eliminating safety concerns classically attributed to antibiotic resistance markers present on conventional plasmid DNA vectors and allowing a reduction in plasmid size. The aim of this work was to investigate the potential of pFAR4 as a gene vector in two different non-viral gene therapy approaches. In a first approach, the potential of the pFAR4 vector was assessed for the expression of a therapeutic gene in mouse liver. To this end, a pFAR4 derivative expressing the Sgsh gene from a liver-specific promoter and coding the sulfamidase, an enzyme deficient in patients suffering from the Sanfilippo A disease, was tail vein hydrodynamically injected into mouse liver. We showed that the pFAR4 derivative promoted a high and prolonged sulfamidase expression which rapidly declined when the same expression cassette was delivered by a conventional plasmid containing a kanamycin resistance marker. It was established that the superior expression profile obtained with the pFAR4 derivative did not result from its integration in host genome but seemed to benefit from protection against transcriptional silencing. In a second approach, the pFAR4 vector was combined to the Sleeping Beauty transposon system that mediates transgene integration into host genomes, after its excision from a plasmid donor by the hyperactive SB100X transposase, in order to obtain a long-term expression in dividing cells. This combination was studied in vitro, delivering either the neomycin resistance gene or the fluorescent Venus protein-encoding gene into HeLa cells. We showed that the combination pFAR4/SB led to an increased transgenesis rate in comparison to the association of SB with conventional plasmids. The pFAR4/SB combination seemed to benefit from an elevated transfection efficiency and a higher excision rate, resulting from the reduced size of the pFAR4 vector. The two technologies should be soon used for the delivery of the anti-angiogenic pigment epithelium-derived factor (PEDF) gene into autologous primary pigment epithelial cells, in the context of two PhaseI/II clinical trials based on an ex vivo gene therapeutic approach for the treatment of neovascular age-related macular degeneration (nAMD).

La pression sur les quotas de pêche et l’augmentation de la production aquacole ont contribué à une substitution importante des farines et des huiles de poisson incorporées dans les aliments pour poissons carnivores, par des farines et des huiles végétales. La truite arc-en-ciel, qui est un poisson carnivore, est affectée par ce changement de régime. Ainsi un retard de croissance apparaît dès le plus jeune stade si certaines transformations et supplémentations ne sont pas apportées aux végétaux. L’objectif de ce travail a été d’évaluer, aux stades alevins et juvéniles, l’impact d’une substitution totale des huiles et farines de poisson sur le tractus digestif de la truite arc-en-ciel, et plus particulièrement sur ses capacités digestives et sur la composition de son microbiote intestinal. Le but in fine étant de déterminer si certaines enzymes de la digestion, transporteurs intestinaux, ou sous-communautés bactériennes sont impactés par le changement de régime et peuvent expliquer le retard de croissance observé. Chacun de ces facteurs ont été étudiés via une approche de métagénomique par séquençage de nouvelle génération NGS pour la caractérisation du microbiote, et via de la PCR quantitative et des mesures d’activités enzymatiques pour la comparaison des capacités digestives. Des lignées isogéniques de truites, identifiées comme divergentes dans leur réponse à l’alimentation végétale (capables d’adaptation ou réfractaires) ont permis de disposer d’un matériel biologique pertinent pour répondre à cette question. Une modification du microbiote intestinal associé à la muqueuse digestive pourrait également contribuer à la baisse de l’homéostasie intestinale. Le changement de régime conduit en effet à une équitabilité plus faible chez les truites ayant reçue un aliment végétal, ce qui reflète un changement dans la représentativité de certains OTUs. Ce changement de régime s’est également traduit par des communautés dissimilaires en moyenne à 70 %, d’après l’estimation de la β-diversité entre les communautés de truites nourries avec l’aliment marin et celles nourries avec l’aliment végétal. La sélection opérée par l’aliment a conduit à un remplacement des OTUs rencontrés au sein des Firmicutes, c’est-à-dire que différentes espèces bactériennes de Firmicutes sont rencontrées suivant le régime considéré. La comparaison de communautés bactériennes entre les différentes lignées isogéniques a montré que la sélection opérée par le génotype de l’hôte a davantage eu lieu sur le remplacement des β-Protéobactéries. Enfin, les comparaisons d’abondances en certaines espèces bactériennes particulières suggèrent que les bactéries Cetobacterium somerae, capables de synthétiser de la vitamine B12, et Shewanella, dont l’implication dans la stimulation des cellules β du pancréas endocrine a déjà été observée chez d’autres espèces, pourraient être impliquées dans la réponse métabolique des truites aux végétaux. Les modifications identifiées dans ce travail constituent des indicateurs biologiques qui pourront être mis à profit pour évaluer la réponse du tractus digestif des truites à de nouvelles formules alimentaires. / Over-fishing pressure and increasing aquaculture production led to an important substitution of fish oil and fish meal with oil and meal from plant origin in feed meant for farming fish. However this replacement has some deleterious incidence on fish. For rainbow trout, which are carnivorous fish, some growth delay often appears from the early life stages when they are fed with plant based diet. The aim of this work was to assess, at alevin and juvenile stages, the impact of a total replacement of fish meal and oil on rainbow trout gastrointestinal tract, and more particularly on the digestive capacity and the associate microbiota. The objective, in fine, being to determine if some digestive enzymes, intestinal transporters, or bacterial communities are impacted by the dietary replacement and if these biological factors can be related to the observed growth delay. Metagenomic approach using next generation sequencing was used to characterize the gut bacterial communities, while digestive capacity was assessed through quantitative PCR and enzymatic measurements in order to compare rainbow trout responses to a plant-based diet. In our investigations, rainbow trout isogenic lines that diverge in their response to this alternative diet (tolerant or rather reluctant) were adopted because they constitute a pertinent biological material for answering this question.In alevin rainbow trout, a plant-based diet led to an increase of pepsinogen, trypsinogen, and chymotrypsinogen genes which codes for proteolitic enzymes. Two main assumptions can explain this response, and their effectivness remains to investigate: wether this is a physiological response due to a lower weight of trout fed with the plant-based diet, or so it is due to an increase transcritpion of pancreatic enzymes to compensate for a reduction of protein digestibility. In the intestine, it appears that an increase transcription of IAP, SGLT1, CCK-t, and PEPT1 genes, and a decrease transcription of GLUT2 gene under a plant-based diet could reflect a disability to grow under a vegetable diet.In juvenile rainbow trout, a plant-based diet led to a decrease of lipid digestibility, and of triglycerides and total amino acid plasmatic levels. These perturbations could be explained in part by a decrease of the phosphatase alkaline activity, which suggest perturbancesof intestinal homeostasis, and by a decrease of phospholipase A2 activity. Transcriptional decrease of the triglycerides transporter MTP and of the prolidase, which is a peptidase from intestinal cell cytosol, has also been observed. Some modification of the microbiota associated to the intestinal mucosa could also contribute to the decrease of the intestinal homeostasis. The dietary replacement effectively led to reduce evenness of the bacterial communities in trout fed with a plant-based diet, which reflected a shift in the representativeness of some OTUs. Bacterial community from trout fed with a marine diet and trout fed with a plant-based diet were on average 70 % dissimilar. Dietary substitution led to the replacement of OTUs from the Firmicutes class, different bacterial species being observed according to the considered diet. The comparison of bacterial community between the isogenic lines showed that the genotype led to the replacement of β-Proteobacteria. Finally, abundance comparison suggested that Cetobacterium somerae, which is able to synthesise vitamin B12, and Shewanella, which has already been reported to stimulate pancreatic β cells, could be implicated in the trout response to vegetable.Modifications observed in this work constitute biological indicator that could be used to assess the response of the digestive tract to future feed formulations.

Les vecteurs viraux dérivés du virus adéno-associé (AAV) apparaissent depuis deux décennies, comme des outils efficaces pour le transfert de gène in vivo. Cependant, malgré une faible immunogénicité et une absence de toxicité in vivo, leur optimisation requiert encore un effort important vers une meilleure compréhension de leur biologie et, en particulier, de leur interaction avec le système immunitaire. Au cours de ce travail de thèse, nous avons utilisé une méthode de sélection dirigée in vitro dans le but d’obtenir un variant de capside capable de transduire efficacement un type cellulaire non-permissif aux vecteurs AAV : les cellules dendritiques (DC). En effet, ces cellules jouent un rôle primordial dans l’établissement de la réponse immunitaire et, par conséquent, dans la persistance de l’expression du transgène in vivo. Cette technologie, très répandue dans la communauté AAV, a permis de sélectionner un variant de capside aux propriétés très intéressantes. La mutation sélectionnée, caractérisée in vitro comme induisant une instabilité de la capside, a permis d’identifier et de surmonter un point de blocage majeur dans le processus de transduction des DC par les vecteurs AAV consistant dans l’étape de décapsidation du génome du vecteur dans le noyau cellulaire. De manière intéressante, le variant obtenu exhibe un avantage en terme de transduction non seulement dans les DC mais aussi dans différents modèles de cellules primaires humaines (e.g. HUVEC) ou animales (OBC), peu ou pas permissive à l’AAV. De plus, des expériences de transfert de gène in vivo réalisées dans un modèle murin, indiquent que le variant sélectionné conduit à une meilleure expression du transgène, possiblement due à la mise en place d’un processus de tolérisation. Les propriétés remarquables de ce variant de capside, font de lui un candidat intéressant pour des applications médicales. / Vectors derived from the Adeno-associated virus (AAV) have emerged as an efficient system for in vivo gene transfer. However, despite their low immunogenicity and good tolerance in vivo, a better characterization of the host-AAV interaction is required to be able to fully exploit AAV’s potential fora gene therapy or gene vaccination. In this PhD project, we have used an in vitro directed evolution strategy to select an AAV capsid variant able to transduce human dendritic cell (DC), a non-permissive cell type which plays a critical role in the initiation of immune responses and, consequently, on the persistence of the expression of transgene in vivo. This procedure allowed us to identify an AAV variant characterized by a decreased stability of the capsid in vitro. The use of this mutant as a vector to transduce human DC resulted in an improved uncoating of the vector genome in the cell nucleus, thus identifying this step as major barrier toward DC transduction. Interestingly, the selected variant also displayed an increased transduction efficiency not only in DC but also in different primary human and animal cell types, poorly or non-permissive to AAV. Finally, when injected in mice, this AAV variant resulted in a higher expression of the transgene, associated to a low level of immune responses, suggesting the induction of tolerant state. The remarkable features suggest that our selected variant capsid is a promising candidate for medical applications.

No description available.

Nous avons produit des CART-cells et des LT-mock ont été produits ex-vivo. L'efficacité de transduction est mesuré par l'expression CD3+/CD19+ (82% en moyenne, n=S), en cytométrie en flux. L'expression protéique de CAR a été vérifiée par western blot et en cytométrie en flux attestant de son expression membranaire. Nous avons testé la fonctionnalité de la cassette suicide iCaspase9/ AP1903 sur CART-cells après 48h de traitement à I' AP1903. Nous avons montré que plus de 90% des CART-cells entrent en apoptose (Marquage 7-AAD en cytométrie en flux). Nous avons ensuite réalisé des tests fonctionnels in-vitro des CART-cells contre des lignées LMC exprimant naturellement IL-lRAP ou contre des lignées transfectées pour exprimer la forme membranaire d'IL-lRAP. Après co­culture des CART-cells en présence des cellules cibles IL-lRAP+ nous avons montré qu'ils prolifèrent (test CFSE), qu'ils sécrètent de l'interféron y et des cytokines inflammatoires. Enfin, par marquage 7-AAD, nous avons démontré la cytotoxicité des CART-cells contre les cellules ILl-RAP+. Finalement, nous avons montré l'efficacité des CART-cells in vivo, dans un modèle de xénogreffe tumorales dans des souris immunodéficiences NSG greffées par la lignée K562-IL1RAP+ / Luciférase +. On constate une diminution de la masse tumorale 4 jours après injection des CART-cells, jusqu'à disparition totale. Cette preuve de concept laisse entrevoir des perspectives thérapeutiques alternatives dans le traitement de la LMC ou LAM, qui devront être optimiser dans des modèles murins (séquence et nombres d'injection, nombres de cellules, associations avec ITKS ou autres chimiothérapies) afin de conduire un essai clinique de phase I, pour démontrer la faisabilité et la sécurité de l'approche pour envisager une démonstration d'efficacité chez l'homme. La sécurisation par la cassette suicide permet d'envisager l'utilisation des CART-cells en situation autologue ou allogénique (Donor Lymphocytes infusion, DU) / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder and is characterized by the presence of a Philadelphia chromosome (Phl) encoding the BCR-ABL fusion protein with constitutive tyrosine kinase activity. The treatment by Tyrosine Kinase lnhibitors (ITK) is not curative. The problem today is ta target leukemic stem cells (HSCs) to prevent relapse of patients after stopping treatment with TKI and permanently eradicate the disease. Studies have identified the interleukin-1 accessory protein receptor (IL-lRAP) as a potential target for killing CSL (BCR-ABL1 positive) in CML or in acute myeloid leukemia (AML). We therefore propose to develop a cell therapy approach targeting IL-lRAP, using T cells (LT) redirected by a CAR (Chimeric Antigen Receptor) in the treatment of CML and AML. We produced a specific anti-lL-1RAP murine monoclonal antibody (mAb) called # A3C3. We tested the specificity of the antibody # A3C3 in flow cytometry, in Western blot, by immunohistochemistry or confocal microcopy, on positive human cell lines IL-1RAP (KU812) or IL-1RAP negative (Raji). Moreover, by using this antibody, we have demonstrated by immunohistochemistry, on 20 different normal tissues that our antibody does not recognize or very few non-specific (off-target) targets. Finally, we demonstrated that this antibody is able to detect positive IL-1RAP CSLs in primary bone marrow or peripheral blood samples of LMC patients at diagnosis or after ITK treatment. By molecular biology, we have sequenced and identified rearrangements of the heavy (lgH) and light {lgL) chains coding region for hypervariable regions of# A3C3. The coding sequence for the "single chain variable fragment" (scFv), lin king the 2 lgH and lgl chains, was cloned into a 3rd generation lentiviral skeleton securised by a suicide gene, inducible caspase 9 (iCASP9). We produced CART-cells and LT-mock ex-vivo. The transduction efficiency is measured by CD3 + / CD19 + expression (82% on average, n = 5), in flow cytometry. The functionality of the suicide cassette iCaspase9/AP1903 on CART-cells after 48h treatment with AP1903 was tested. We have shown the death of more than 90% of CART-cells (7-AAD labeling in flow cytometry). We then performed in-vitro functional tests of CART-cells against LMC lines naturally expressing IL-1RAP or against transfected lines to express the membrane form of IL-1RAP. After co-culture of CART-cells in the presence of IL-1RAP + target cells, we have shown that they proliferate (CFSE test), that they secrete interferon y and inflammatory cytokines (intracellular labeling and Cytokines Bead Array assay). They are able to degranulate (CD107a & b labeling). Finally, by 7 AAD labeling, we demonstrated the cytotoxicity of CART-cells against IL1-RAP + cells. Finally, we showed the effectiveness of CART-cells in vivo, in a tumor xenograft model in NSG immunodeficiency mice engrafted by the K562-IL1RAP+/Luciferase+ line. There is a decrease in the tumor load 4 days after injection of CART-cells, until complete disappearance.This proof of concept suggests alternative therapeutic perspectives in the treatment of CML or AML, which should be optimized in murine models (sequence and injection numbers, cell numbers, associations with ITKS or other chemotherapies) in order to Phase I clinical trial, to demonstrate the feasibility and safety of the approach to consider a demonstration of efficacy in human. Securing by the suicide cassette makes it possible to consider the use of CART-cells in an autologous or allogeneic situation (Donor Lymphocytes infusion, DU)

Les gènes ING (Inhibitor of Growth) sont des gènes candidats suppresseurs de tumeurs conservés de la Levure à l'Homme. Les protéines ING ont des fonctions suppressives de tumeurs de type I ou « caretaker » car elles participent aux processus de maintien de la stabilité du génome en régulant la réplication et la réparation de l'ADN. Elles ont aussi des fonctions suppressives de tumeurs de type II ou « gatekeeper » puisqu'elles sont impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire de façon dépendante et indépendante de p53 et car elles contrôlent la transcription génique en participant au remodelage de la chromatine. L'objectif de ma thèse est de mieux comprendre l'implication de ING1, ING2 et ING3 dans les voies de suppression des tumeurs. Nos travaux montrent que ING1 est sumoylée sur la lysine 193 principalement par l'E3 SUMO ligase PIAS4, afin de réguler l'ancrage de ING1 sur le promoteur de gènes cibles pour réguler leur transcription. Nous avons aussi décrit pour la première fois l'implication de ING2 et de ING3 dans la réponse aux cassures double brin de l'ADN. Nous montrons que cette fonction est conservée entre ING2, ING3 et leur orthologues, respectivement, Pho23 et Yng2 chez la Levure Saccharomyces cerevisiae. ING2 contrôle l'accumulation de PIAS4 au niveau des sites de dommages et régule la sumoylation de l'E3 ubquitine ligase RNF168, afin de permettre la signalisation et la réparation des cassures double brin de l'ADN. ING3 est nécessaire à l'accumulation de 53BP1 et contrôle la réparation de ces dommages. Ces travaux contribuent donc à une meilleure connaissance du rôle des ING dans les voies de suppression des tumeurs. Ils permettent de mieux comprendre comment ING1 régule la transcription génique et décrivent une nouvelle fonction suppressive de tumeur de type I ou « caretaker » pour ING2 et ING3 dans le maintien de la stabilité du génome. / ING (Inhibitor of Growth) genes are tumor suppressor gene candidates conserved from Yeast to Humans. ING proteins have type I tumor suppressive functions or "caretaker" because they participate in the maintenance of genome stability by regulating DNA replication and repair processes. They have also tumor suppressive functions of type II or "gatekeeper" because they are involved in the regulation of cell proliferation in p53 dependent and independent manners. They also participate in the regulation of gene transcription by regulating chromatin remodeling. The aim of my thesis was to better understand how ING1, ING2 and ING3 are involved in tumor suppressive pathways. Our work shows that ING1 is sumoylated on lysine 193 mainly by the SUMO E3 ligase PIAS4 to regulate ING1 anchoring on target gene promoters to control gene transcription. We have also described the involvement of ING2 and ING3 in the DNA double strand breaks response. We show the conservation of this function between ING2, ING3 and their orthologs, respectively, Pho23 and Yng2 in Yeast Saccharomyces cerevisiae. ING2 controls the accumulation of PIAS4 at DNA damage sites and regulates the sumoylation of the E3 ubiquitin ligase RNF168, to regulate DNA double strand break signaling and repair. ING3 is necessary for the accumulation of 53BP1 and promotes DNA damage repair. This work contributes to a better understanding of the role of ING proteins in tumor suppression. It thus provides new insights of how ING1 regulates gene transcription and emphasizes a new tumor suppressive function of type I or "caretaker" for ING2 and ING3 in the genome stability maintenance.

Les maladies humaines les plus fréquentes sont complexes avec plusieurs facteurs génétiques et environnementaux qui interagissent. Ce travail propose deux nouvelles méthodes statistiques pour étudier les interactions gène-environnement. La première méthode utilise la récurrence familiale de la maladie pour identifier une interaction entre un facteur environnemental et la composante génétique impliquée dans la maladie. La seconde méthode permet de prendre en compte ces interactions dans les études d'associations pangénomiques lorsque l'information sur le facteur d'exposition n'est pas disponible chez les témoins. Cette situation est devenue fréquente avec l'utilisation de panels de témoins de référence. Ces deux méthodes apportent de nouveaux outils pour étudier simultanément les facteurs génétiques et environnementaux dans les maladies complexes. Elles ont été appliquées sur deux jeux de données concernant le diabète de type 2 et les réactions cutanées sévères aux médicaments.

Les petits ARN interférents (siRNA) sont encore rarement utilisés chez les vertébrés transgéniques pour inhiber l'expression de gènes. En effet, les vecteurs contenant un promoteur de type ARN polymérase III comme ceux des gènes U6 et H1 qui permettent une expression élevée des gènes codant pour des ARNi dans des cellules sont souvent silencieux in vivo. Dans cette thèse, divers vecteurs exprimant des petits ARN double brins (shRNA) ont été testés dans des cellules en culture et chez des souris transgéniques pour inhiber l'ARN m du gène précoce IE du virus de la pseudo rage porcine responsable de la maladie d'Aujeszky. La quantité et la séquence des si RNA produits ont été étudiées par qPCR. Dans des cellules CHO transfectées pour une expression transitoire, les vecteurs contenant les gènes U6-shRNA ont été de loin les plus efficaces pour inhiber le gène IE en raison du niveau élevé de siRNA produit. Par ailleurs, deux constructions contenant le promoteur de type ARN polymérase II, le promoteur du gène eF1-α etune séquence de shRNA bordée par 5T ou introduite dans un gène de microARN (miRNA) le miR30 ont permis d'obtenir une inhibition significative mais limitée de l'ARNm du gène IE. Ceci parait être du au niveau relativement faible de siRNA produit. Le siRNA produit par le gène du miRNA s'est avéré aussi efficace que ceux obtenus à partir des constructions U6-shRNA bien que ces derniers soient un peu plus longs. Ces diverses constructions ont été utilisées pour obtenir des souris transgéniques. Des souris contenant la séquence du shRNA n'ont pu être obtenues qu'à partir de la construction miRNA. Ceci peut être du au fait que les siRNA produits par les autres constructions ont exercé un effet inhibiteur sur des cibles aspécifiques (off-targeting) qui ne s'est pas produit avec le siRNA provenant de la construction miRNA car il contient quelques nucléotides en moins. Les souris transgéniques contenant la construction miRNA ont été soumises à une infection par le virus de la pseudo rage porcine. Bien que les souris exprimaient le gène shRNA qu'à un faible niveau. Quelques souris transgéniques ont résisté à l'infection. La seconde partie de la thèse a consisté à sélectionner d'autres séquences de shRNA capables d'inhiber l'expression du gène IE sans exercer des effets aspécifiques. Deux séquences de shRNA ont permis une telle inhibition. L'une est dirigée contre la région 5'UTR du gène IE et l'autre contre la région 3'UTR. Ces données suggèrent que (1) l'efficacité d'un shRNA n'est pas déterminée par sa séquence d'une manière totalement prévisible (2) l'efficacité d'un siRNA est d'autant plus élevé que sa séquence cible dans l'ARNm est en structure double brin (3) un effet inhibiteur intense et optimum peut être obtenu avec des concentrations faibles d'un siRNA (4) les effets secondaires et en particulier le off-targeting peuvent avoir lieu à faible concentration du siRNA mais ils ont d'autant plus de chance de se produire que la concentration du si RNA est plus élevée (5) un siRNA destiné à être utilisé chez des animaux transgéniques devrait être choisi pour sa capacité à inhiber efficacement un gène à faible concentration pour réduire ses effets secondaires.

Objectif : Ce travail s'inscrit dans le cadre d'une recherche étiologique sur les leucémies aigues (LA) de l'enfant, pathologies dont les facteurs de risque sont peu connus. Plusieurs hypothèses ont été testées : 1) le rôle protecteur d'une supplémentation maternelle en acide folique avant et pendant la grossesse et l'investigation par une approche gène-candidat du rôle de polymorphismes communs rs1801133 et 1801131 de MTHFR et rs1801394 et rs1532268 de MTRR supposés modifier le métabolisme des folates, 2) l'association entre la profession et des expositions professionnelles maternelles lors de la grossesse, 3) l'existence d'un lien positif avec l'exposition des enfants au trafic routier. Matériel et méthodes : Les données analysées proviennent d'une étude cas-témoins française, ESCALE, basée sur le Registre National des Hémopathies malignes de l'Enfant et réalisée en population générale sur la période 2003-2004. L'échantillon comportait 648 cas de leucémie aiguë lymphoblastique [LAL], 116 cas de leucémie aiguë non lymphoblastique [LANL], et 1681 témoins de moins de 15 ans. L'échantillonnage a été stratifié sur l'âge et le sexe. Les données ont été recueillies auprès des mères à l'aide d'un questionnaire téléphonique standardisé, identique pour les cas et les témoins. Les génotypes ont été obtenus par génotypage à haut débit, pangénomique pour les cas et à façon pour les témoins, et par imputation pour les polymorphismes non génotypés. Le géocodage des adresses et des indicateurs dérivés de données d'émission de trafic ont permis d'estimer l'exposition des enfants au trafic routier. Les odds ratios (OR) ont été estimés à l'aide de modèles de régression logistique non conditionnelle, incluant les facteurs de confusion potentiels. Résultats : Le risque de LA était significativement inversement associé à une supplémentation maternelle en acide folique avant ou pendant la grossesse (OR=0.4 [0.3-0.6]). Aucun des polymorphismes génétiques de MTHFR et de MTRR n'était associé au risque de LA. Cependant, le fait d'être à la fois porteur homozygote des allèles variants de l'un des polymorphismes de MTHFR, et porteur de deux allèles variants des polymorphismes de MTRR était positivement associé au risque de LA (OR=1.6 [0.9-3.1]). Nous n'observions pas d'interaction entre MTHFR, MTRR et une supplémentation maternelle en acide folique. Des associations positives et significatives on été mises en évidence entre le risque de LA et des expositions auto-déclarées professionnelles maternelles pendant la grossesse, aux teintures de cheveux (OR=3.0 [1.7-5.2]), à des peintures ou vernis et/ou colles (OR=1.5 [1.1-2.2]), et à des rayonnements ionisants (OR=2.4 [1.3-4.6]). Cependant, ces associations étaient limitées aux fréquences d'exposition de moins d'1 heure par semaine et peuvent refléter une sur-déclaration chez les cas. L'exposition maternelle professionnelle aux pesticides n'était pas associée aux LA dans notre étude.Les LA étaient significativement associées à des concentrations élevées de NO2 de fond liées au trafic estimées au lieu de résidence (OR=1.2 [1.0-1.5]) et avec la présence de routes à fort trafic dans un rayon de 500 m centré sur ce lieu (OR=2.0 [1.0-3.6]). Nous observions une association significative entre les LA et une densité élevée de routes à fort trafic dans un rayon de 500 m (OR=2.2 [1.1-4.2]), avec une tendance linéaire positive significative de l'association des LAL avec la longueur totale de routes à fort trafic dans un rayon de 500 m.Conclusion : Cette thèse apporte des arguments en faveur du rôle protecteur d'une supplémentation maternelle périconceptionnelle en acide folique. Elle suggère également un rôle des polymorphismes de MTHFR et MTRR dans le risque des LA, sans interaction toutefois avec la supplémentation. Enfin, elle renforce l'hypothèse que vivre près de routes à fort trafic pourrait augmenter le risque de LA.

Des études présentées dans cette thèse ont permis de démontrer que le gène du groupe Polycomb (PcG) Bmi1 est essentiel à l’auto-renouvellement des progéniteurs rétiniens immatures et pour le développement rétinien après la naissance. Ce travail illustre chez l’embryon que Bmi1 est hautement enrichie dans une sous-population de progéniteurs rétiniens exprimant le marqueur de surface SSEA-1 et différents marqueurs de cellules souches. À tous les stades de développement analysés, l’absence de Bmi1 résulte en une diminution de la prolifération et de l’auto-renouvellement des progéniteurs immatures. Pour mieux comprendre la cascade moléculaire en absence de Bmi1, nous avons inactivé p53 dans les colonies Bmi1-/-. Cette inactivation a permis une restauration partielle du potentiel d’auto-renouvellement. De plus, en absence de Bmi1, la prolifération et la maintenance de la population de progéniteurs rétiniens immatures localisés dans le corps ciliaire sont aussi affectées après la naissance. Bmi1 permet donc de distinguer les progéniteurs immatures de la population principale de progéniteurs, et est requis pour le développement normal de la rétine. Nous avons également démontré que l’oncogène Bmi1 est requis dans les neurones pour empêcher l’apoptose et l’induction d’un programme de vieillissement prématuré, causé par une baisse des défenses anti-oxydantes. Nous avons observé dans les neurones Bmi1-/- une augmentation des niveaux de p53, de la concentration des ROS et de la sensibilité aux agents neurotoxiques. Nous avons démontré ainsi que Bmi1 contrôle les défenses anti-oxydantes dans les neurones en réprimant l’activité pro-oxydante de p53. Dans les neurones Bmi1-/-, p53 provoque la répression des gènes anti-oxydants, induisant une augmentation des niveaux de ROS. Ces résultats démontrent pour la première fois que Bmi1 joue un rôle critique dans la survie et le processus de vieillissement neuronal. / The studies presented in this thesis establish that the Polycomb Group (PcG) gene Bmi1 is required for the self-renewal of immature retinal progenitor cells (RPCs) and for postnatal retinal development. Work performed in mouse embryos reveals that Bmi1 is highly enriched in a RPC subpopulation expressing the cell surface antigen SSEA-1 and different stem cell markers. Furthermore, at all developmental stages analysed, Bmi1 deficiency resulted in reduced proliferation and self-renewal of immature RPCs. To better understand the molecular cascade leading to this phenotype, we inactivated p53 in Bmi1-deficient colonies. p53 inactivation partially restored RPCs self-renewal potential. Moreover, the proliferation and the postnatal maintenance of an immature RPC population located in the ciliary body was also impaired in absence of Bmi1. Thus, Bmi1 distinguishes immature RPCs from the main RPC population and is required for normal retinal development. We have also shown that the oncogene Bmi1 is required in neurons to prevent apoptosis and the induction of a premature aging-like program characterized by reduced antioxidant defenses. We observed in Bmi1-deficient neurons an increased p53 and ROS levels, and a hypersensitivity to neurotoxic agents. We demonstrated that Bmi1 regulate antioxidant defenses in neurons by suppressing p53 pro-oxidant activity. In Bmi1-/- neurons, p53 induces antioxidant genes repression, resulting in increased ROS levels. These findings reveal for the first time the major role of Bmi1 on neuronal survival and aging.