La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire liée au chromosome X. Elle est principalement causée par la délétion d’un ou plusieurs exons du gène DMD, ce qui entraine un changement du cadre de lecture et l’obtention d’une protéine dystrophine tronquée et inactive. L’édition de génome par les systèmes TALEN ou CRISPR/Cas9 est devenue dans les dernières années un grand espoir pour le développement de traitements pour ce type de maladie. Dans ce travail, nous illustrons la faisabilité d’un traitement pour la DMD en utilisant les protéines TALENs ou le complexe CRISPR/Cas9 purifiés. Ces protéines sont donc transduites afin de générer des cassures double brin dans l’ADN génomique. Ainsi, la correction de cette mutation par recombinaison non homologue pourra corriger le cadre de lecture du gène codant pour la protéine dystrophine, produisant ainsi une protéine tronquée, mais active, telle que pour les patients Becker. Bien que les protéines TALENs montrent une bonne activité in vitro, l’efficacité de coupure n’a pas pu être observée dans les cellules, ce qu’indiquerait un défaut lors de la transduction protéique. Toute fois, dans le cas du système CRISPR/Cas9, l’essai surveyor a permis d’observer les produits de coupure attendus lors de la transduction de ce système avec des lipides cationiques. Ceci indique donc que le système CRISPR/Cas9 peut être utilisé de façon efficace sous forme protéique tout en ciblant le gène DMD. Finalement, l’utilisation de ce système a été confirmée in vivo chez la souris hDMD, où il a été possible d’observer la présence des délétions ciblées. La transduction de protéines en utilisant le système CRISPR/Cas9 illustre donc une approche thérapeutique prometteuse dans le but de développer un traitement pour les maladies génétiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an hereditary disease linked to chromosome X. It is mainly caused by the deletion of one or more exons of the DMD gene, which causes a change in the reading frame, obtaining a truncated and inactive protein. Genome editting by TALEN or CRISPR/cas9 systems has become in the recent years a powerfull tool for developing treatments for this type of disease. However, the use of plasmids encoding these systems leads to a prolonged expression, which may increase the off-target risk. Thus, it is important to note that today, viruses vectors remain the most effective delivery system for these plasmids, which always entails a risk of integration into the genome, increasing the probability of side effects for a treatment. In this work, we illustrate the development of a genome edditing treatment for DMD, but using purified protein TALENs or Cas9. These proteins are transduced in order to generate double strand breaks in the genomic DNA. Thus, the correction of this mutation by non-homologous end joining can correct the reading frame of the gene, producing a functional Dystrophin protein, as for Becker patients. Although TALEN proteins show a good activity in vitro, the cut-effectiveness has not been observed in the cells. It would indicate a defect in the protein transduction. However, in the case of CRISPR/cas9 system, we have obtained the expected cleavage products during the transduction with cationic lipids in both cell lines. These results are similar with those obteined when the plasmids coding for both systems were transfected. This indicates that the CRISPR/cas9 system can be used effectively in protein form while targeting a gene specifically. Protein therapy using the CRISPR/cas9 system can be a promising method in order to develop an alternative treatment for genetic diseases. Finally, in order to confirm that this system can be used in vivo, we will soon test it in the hDMD mouse model, containing the complete human DMD gene.

La purification par affinité couplée à l’analyse par spectrométrie de masse (AP-MS) est une méthode de choix pour l’étude des interactions protéines-protéines chez les cellules humaines. Par contre, cette technique est sensible aux perturbations causées par la surexpression ectopique des protéines cibles. Des effets anormaux, tels que la formation d’agrégats et la délocalisation des protéines cibles, peuvent mener à des conclusions erronées. Il est donc important de reproduire le plus précisément possible les niveaux physiologiques normaux des protéines à l’étude. Les travaux présentés dans ce mémoire décrivent le développement d’un système robuste et rapide couplant l’édition du génome et la protéomique permettant l’isolation de complexes protéiques natifs exprimés à des niveaux quasi physiologiques. L’approche a servie de tremplin afin d’atteindre l’objectif ultime qui est de caractériser les protéines exprimées à partir de leur contexte génomique naturel. À l’aide des outils d’édition génomique, nous avons introduit de façon ciblée au locus AAVS1 une cassette permettant l’expression de protéines d’intérêt étiquetées avec une séquence permettant la purification par affinité. Ainsi, nous avons purifié de nombreuses holoenzymes impliquées dans la réparation de l’ADN et la modification de la chromatine. Nous avons identifié de nouvelles sous-unités et interactions au sein de complexes déjà bien caractérisés et rapportons l’isolation de MCM8/9, soulignant ainsi l’efficacité et la robustesse de notre approche. La technique présentée dans ce mémoire améliore et simplifie l’exploration des interactions protéiques ainsi que l’étude de leur activité biochimique, structurelle et fonctionnelle. / Conventional affinity purification followed by mass spectrometry (AP-MS) analysis is a broadly applicable method to decipher molecular interaction networks and infer protein function. However, it is sensitive to perturbations induced by ectopically overexpressed target proteins and does not reflect multilevel physiological regulation in response to diverse stimuli. Here, we developed an interface between genome editing and proteomics to isolate native protein complexes produced from their natural genomic contexts. We used CRISPR/Cas9 and ZFNs to insert cDNA of interest in the endogenous genomic safe harbor locus AAVS1 and purified several DNA repair and chromatin modifying holoenzymes to near homogeneity. We uncovered novel subunits and interactions amongst well-characterized complexes and report the isolation of MCM8/9, highlighting the efficiency and robustness of the approach. These methods improve and simplify both small and large-scale explorations of protein interactions, as well as the study of biochemical activities and structure-function relationships.

La plus grande sensibilité des souris TLR9-/- a révélé le rôle de ce récepteur dans l'infection par Leishmania major. Les cellules dendritiques (DCs) sont activées de manière TLR9-dépendante par l'ADN du L. major et d'autres Trypanosomatidae et non par l'ADN de vertébré. La nature de l'ADN capable d'activer le TLR9 reste controversée quant à la séquence/charpente de l'ADN et l'implication de cofacteurs se liant avec le TLR9 ou l'ADN. Nous avons démontré l'importance de la séquence d'ADN. Contrairement aux génomes de parasites, l'ADN de vertébré présente une contre-sélection des motifs activateurs du TLR9 au profit des motifs inhibiteurs. De plus, l'activation du TLR9 par l'ADN du parasite est augmentée en présence de la protéine HMGB1, qui se fixe mieux sur l'ADN de parasite que de vertébré. La maturation du TLR9 requiert un clivage protéolytique par des protéases endosomales, dont les cathepsines (Cat) B, S, L et l'asparagine endopeptidase (AEP) qui interviennent différemment dans les macrophages et les DCs. Après infection par L. major, nous avons montré que les souris AEP-/-, CatS-/- et CatL-/- ont une pathologie identique aux souris WT, ce qui peut être dû à la redondance de leur fonction. Etonnamment, les souris CatB-/- sont plus résistantes. Leurs lésions et la charge parasitaire dans les ganglions se résolvent plus rapidement, reflétant une réponse immune plus précoce et un contrôle plus rapide de la réaction inflammatoire.En conclusion, ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes permettant au TLR9 de discriminer entre l'ADN de pathogène et de vertébré et soulèvent le rôle non protecteur de la cathepsine B dans l'infection par L. major. / As TLR9-deficient mice are more sensitive to Leishmania major infection, we have shown previously that TLR9 receptor mediates this parasite infection. Dendritic cells (DCs) are activated by L. major and other Trypanosomatidae DNA and not by vertebrate DNA. There is an ongoing controversy concerning the properties of DNA required for TLR9 activation, regarding the DNA sequence or backbone or the implication of a cofactor interacting with TLR9 or DNA. We have established the importance of DNA sequences. In contrast to parasite genome, vertebrate genome have counter-selected stimulatory sequences and over-represented inhibitory motifs for TLR9. In addition, host proteins contribute to TLR9-dependent DC activation. HMGB1 enhances TLR9 activation only in the presence of L. major DNA and, surprisingly, HMGB1 binds more abundantly L. major than vertebrate DNA. TLR9 activation requires a proteolytic cleavage by endosomal proteases, as cathepsins (Cat) B, S and L and asparagine endopeptidase (AEP) that have a differential activity in macrophages and DCs. After L. major infection, we have showed that AEP-/-, CatS-/- and CatL-/- mice have a similar pathology than WT mice, likely due to their functionnally redundant activites. In contrast, CatB-/- mice are more resistant to the infection. Their lesion sizes and the parasite burdens in lymph nodes are significantly decreased, reflecting an earlier immune response and a more rapid control of the inflammatory response. In conclusion, our results bring further insights into how TLR9 discriminates between Trypanosomatidae and vertebrate DNA and reveal a non protective role of cathepsin B in L. major infection.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le virus de l'hépatite B (VHB) est un virus enveloppé composé d'un ADN partiellement double brin (ADNrc) contenu dans une capside icosahédrique. Le VHB est responsable d'infections aiguës et chroniques. VHB est non cytopathique mais l’inflammation chronique entraîne une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Le VHB se réplique via un intermédiaire à ARN. La transcription nécessite que l'ADNrc soit convertit en un ADN circulaire clos de manière covalente (ADNccc). Cet ADNccc sert de matrice pour la transcription de l'ARN prégénomique (ARNpg), qui est spécifiquement encapsidé grâce aux interactions entre la polymérase virale, l'ARNpg et la protéine core (Cp) qui forme la capside. La polymérase rétrotranscrit l'ARNpg en ADN monocaténaire puis en ADNrc, conduisant à des matrices de capside matures (MatC). Cp avec 185 aa contient un domaine N-terminal structuré, et un domaine C-terminal (CTD) flexible. Le CTD comprend deux signaux de localisation nucléaire (NLS) et un domaine de liaison avec l’importin β (IBB). Le CTD est orienté vers l'intérieur de la capside de part son interaction avec les acides nucléiques simples brins tandis qu'il est exposé vers l'extérieur dans les capsides vides (EmpC) et les MatC. De plus Cp étant surexprimée, cela conduit à l'assemblage des EmpC. Le VHB doit délivrer son génome dans le noyau des cellules infectées pour sa réplication. Le transport nucléaire est médié par la capside qui interagit avec les récepteurs d'import. L’équipe a démontré préalablement que ce transport a besoin des récepteurs Importin α (Imp.α) et Importin β (Imp.β) en induisant le transport des capsides au panier nucléaire où elle est stoppée par l'interaction avec la nucléoporine 153 (Nup153). Nous avons démontré que l’Imp.α, mais pas l'Imp.β, se lie aux MatC suggérant que seule la partie du CTD qui contient les NLS est exposée à l’extérieur des MatC. En comparaison, nous avons analysé les EmpC en collaboration avec Adam Zlotnick (Université d'Indiana, États-Unis) et démontré que les EmpC sont capables de lier directement l'Imp.β. Cette interaction qui est plus forte que l’interaction avec l'Imp.α s'effectue via la reconnaissance du domaine IBB du CTD, ce qui implique une exposition totale du CTD à l'extérieur de la capside. Nous avons aussi montré que la liaison avec l'Imp.β à des concentrations très élevées fournit des forces de déstabilisation menant au désassemblage des EmpC. La libération du génome dans le panier nucléaire implique que l’interaction entre les MatC et Nup153 participe au désassemblage de la capside. Afin de valider cette hypothèse, nous avons exposé des MatC dont le génome est radiomarqué avec un fragment de Nup153 contenant le domaine clé, montré pour interagir avec la capside, en présence de nucléases. Nous avons mis en évidence qu'en présence de ce fragment, les MatC restent stables. Cela suggère la nécessité de facteurs cellulaires additionnels pour le désassemblage des MatC. Cette conclusion est conforme avec nos résultats sur noyaux isolés, dans lesquels nous avons observé une localisation nucléaire des capsides laissant supposer que les facteurs cellulaires nécessaires au désassemblage des MatC sont nucléaires. Afin d'étudier plus en détail l'étape de désassemblage et la libération du génome viral, nous avons mis au point un système permettant de suivre en temps réel le devenir du génome viral. / The Hepatitis B Virus (HBV) is an enveloped virus containing a partially double stranded DNA genome (rcDNA). HBV causes acute and chronic infections. HBV is not cytotoxic but chronic inflammation leads to liver fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV replicates via an RNA intermediate, which is transcribed from a covalently closed circular form of the viral DNA (cccDNA). This pregenomic RNA is specifically encapsidated into the capsid by interaction with the viral polymerase, which also interacts with the core protein (Cp), forming the capsid. The polymerase retrotranscribes the pregenomic RNA into single stranded DNA and subsequently partially double stranded DNA resulting in mature capsids (MatC). Cp is an 185 aa long polypeptide comprising a N-terminal assembly domain, and a flexible C-terminal domain (CTD). The CTD includes two overlapping nuclear localization signals (NLS) of eight aa and an Importin ß Binding Domain (IBB) of 34 aa. The CTD is fixed in the interior of the capsid by interacting with single stranded nucleic acids but translocates to the exterior in MatC and empty capsids (EmpC). Cp is over expressed leading to assembly of EmpC. The virus has to deliver its genome into the nucleus of infected cells for replication. Nuclear transport is mediated by the capsid that interacts with nuclear import receptors. The group has recently shown that MatC need either both, importin  (Imp.) and importin ß (Imp.ß), or Imp.ß alone for transport of the capsids into the nuclear basket. In this structure where genome liberation likely occurs, the transport of the capsid is arrested by interaction between the capsid and the nucleoporin Nup153. In the thesis we demonstrate that MatC binds to Imp.α but not Imp.ß, suggesting that only the part of the CTD, which contains the NLSs is exposed on capsids’ surface. In collaboration with the Adam Zlotnick (Indiana University, U.S.A.) we showed that EmpC, in contrast, bind Imp.β directly without Imp.α acting as an adaptor. This interaction, which is stronger than the one of Imp. occurs needs IBB exposure, meaning that the entire CTD becomes externalized. Furthermore, exposure to very high Imp.ß concentration led to EmpC destabilization. The genome release within the nuclear basket implies that Nup153 is involved in genome liberation from MatC. To verify this hypothesis we used MatC with a radioactively labeled genome, which were exposed to the capsid binding-Nup153 fragment. Investigating the accessibility of the genome to nucleases we found that the Nup153 fragment had no impact on capsids stability, suggesting the need of cellular factors driving disassembly. This conclusion is in agreement with our observation that MatC added to isolated nuclei resulted in nuclear capsid entry, which requires disassembly. To further study the disassembly step and the consequent release of the viral genome, we developed a system to directly visualize the viral genome allowing investigations of genome uncoating in real time. The system is based on the cooperative binding of a fluorescent fusion protein between the bacterial protein OR with GFP to a double stranded DNA sequence called Anch. Using this model we showed that infection of OR-GFP-expressing hepatoma cells with HBV containing a modified Anch genome allowed monitoring genome release into the nucleus. In future, this system may help identifying factors involved in genome release and repair and to decipher their molecular interactions.

Hevea brasiliensis, un arbre tropical, est la source principale de caoutchouc naturel commercialement viable. La biosynthèse de caoutchouc se passe dans les cellules spécialisées appelées laticifères. Il représente jusqu’à 90% de la matière sèche du latex. Le latex, laiteux, s’écoule de l’encoche faite sur l’écorce de l’arbre jusqu’aux cellules laticifères. La collecte de latex, faite par saignée régulière tous 2-3 jours, est vraiment stressante pour l’arbre. Pour stimuler la production de latex, un générateur d’éthylène peut être appliqué sur le panneau de saignée. Le stress s’intensifie avec l’application hormonale. La production d’espèces activées de l’oxygène (ROS) se fait en réponse aux stress environnementaux ainsi que lors de l’exploitation de l’arbre. Au-delà d’un certain seuil, la production de ROS est massive dans les laticifères. De nombreuses études ont montré que les ROS entraîne une dégradation par peroxydation des lipides insaturés des membranes et ensuite une déstabilisation et lyse des organites. La lyse des lutoïdes permet la libération des facteurs de coagulation dans le latex entraînant la coagulation in situ des particules de caoutchouc dans l’écorce des arbres stressés. Ce syndrome physiologique, appelé syndrome de l’encoche sèche (TPD), est un des facteurs limitant la production de caoutchouc.Ce travail de thèse vise à identifier les gènes associés à la production et la neutralisation des ROS ainsi que leurs caractérisations dans les laticifères. Premièrement, nous avons fait une analyse bibliographique complète sur les gènes associés à la production et la neutralisation des ROS chez l’hévéa et les plantes modèles. La NADPH oxydase a été décrite comme la source principale de ROS chez les arbres stressés. Les enzymes antioxydantes et les antioxydants constituent le système de neutralisation des ROS. Deuxièmement, à partir d’une analyse à l’échelle du génome, 407 gènes impliqués dans la production des ROS et dans leur neutralisation ont été identifiés. Troisièmement, à partir d’une analyse du transcriptome, 164 gènes redox ont été détectés dans le latex du clone SP 217 et 161 dans celui du clone PB 260. Quatrièmement, à partir des petits ARNs et d’une analyse dégradome, 13 gènes ont été identifiés pour être clivés par 11 microARNs et 15 gènes clivés par 16 petits ARNs phasés dans le latex. Enfin, cette étude a mis en évidence des régulations spécifiques de la production des ROS et du système antioxydant dans le latex. HbRBOH2 a été identifié comme la source principale de ROS dans le latex. HbCuZnSOD4 pourrait être le contributeur majeur de la neutralisation des ROS dans le latex des arbres atteints de TPD. / Hevea brasiliensis, a tropical tree, is the main commercial source of nature rubber. The rubber biosynthesis occurs in specialized latex cells of rubber tree. Up 90% dry weight of latex is nature rubber. The milky latex flows out from cut latex cells by tapping rubber tree trunk bark. Rubber exploitation by tapping every several days is very stressful for the bark of rubber tree. To stimulate latex production, ethylene releaser is applied during rubber exploitation in some cases. The stress is increased after hormone stimulation. Reactive oxygen species (ROS) is generated when plant suffers stresses from environment and harvesting activity. Over a certain limit of stress, ROS bursting is motivated in latex cell. A lots of the evidences showed that the ROS lead to the peroxidatic degradation of the unsaturated lipids of the membrane and then to destabilisation and lysis of the organelles. Lysis of the lutoids results in liberation of coagulating factors into latex and coagulation in situ of rubber particles in stressed trees. This serious physiology syndrome is tapping panel dryness (TPD) which is one of main factor limiting rubber production.This PhD aims at identifying ROS production and scavenging genes and their characterizations in latex cell. Firstly, we made a comprehensive bibliography study on ROS production and scavenging genes both in rubber tree and model plant. The NADPH oxidase was considered as the main source of ROS in the stressed trees. ROS scavenging enzymes and antioxidants constituted the ROS scavenging systems in latex. Secondly, based on a genome-wide analysis, 407 genes involved in ROS production and scavenging were identified. Thirdly, based on a transcriptome analysis, 164 redox-related genes were detected expressing in latex of clone SP217 and 161 genes expressing in latex of clone PB260. Fourthly, based on small RNA and degradome analysis, 13 genes were shown to be targeted by 11 microRNAs and 15 genes by 16 phased siRNA in latex. Lastly, this study illustrated specific regulation systems of ROS production and scavenging in latex. HbRBOH2 was identified as the main source gene of ROS in latex. HbCuZnSOD4 might be the most important ROS scavenging gene to detoxify the ROS in latex of TPD tolerant tree.

L'évolution des espèces est régie par les modifications stochastiques qui ont eu lieu au niveau du code génétique -l'ADN -composé d'une suite de petites molécules (les nucléotides). Selon l'ampleur de ces évènements, il y a d'abord des modifications à petite échelle, impliquant quelques nucléotides -les insertions, délétions et substitutions. Due à l'impossibilité actuelle de différencier les insertions des délétions, on les appelle communément indels. D'un autre coté, il ya des modifications à grande échelle -impliquant parfois des grandes régions génomiques ou des chromosomes. Les modifications à grande échelle les plus fréquentes sont: les duplications, translocations, inversions et délétions. Au cours de ce projet, nous avons développé une méthode de génomique comparée, capable de relier l'information épidémiologique, comme la carcinogenicité et l'invasivité des souches, aux séquences génomiques. Cette méthode permet de détecter des régions statistiquement significatives à analyser plus en détail par des biologistes, tout en étant capable de discriminer ce seuil à l'aide du calcul des p-values. Nous avons utilisé cette méthode dans l'étude du virus du papillome humain et de la bactérie Neisseria Meningitidis, bactérie responsable de la méningite. Pour le virus du papillome humain, notre méthode a été capable de détecter le domaine PDZ, une région du gène E6, qui est une condition sine qua non de la carcinogenicité du produit de ce gène. Au cours des analyses phylogénétiques de cette famille nous avons trouvé une corrélation statistiquement significative entre les événements à petite échelle et les données épidémiologiques. Par la suite nous avons proposé une séquence de tests pour orienter l'analyse statistique de cette corrélation. Nous avons également remarqué que la carcinogenicité est généralement monophylétique, donc issue d'un ancêtre commun. L'arbre phylogénétique inféré est le premier basé sur les génomes entiers, ce qui a permis d'étudier la variabilité des topologies de gènes par rapport à celle du génome. Pour la bactérie Neisseria Meningitidis nous avons montré qu'il est possible de syntoniser les fonctions de discrimination, pour établir la différence entre les régions responsables du maximum d'invasivité et celles qui ont un rôle structural dans ce processus, détection des structures moléculaires connues (i.e. les anses extra cellulaires, dans notre cas). Les résultats de nos travaux ont permis la mise à la disposition de la communauté internationale de deux bases de données, pour le VPH et le Neisseria, respectivement. Ces bases contiennent des régions candidates à être analysées en laboratoire par des biologistes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Algorithme pour la détection des régions carcinogènes, Événements évolutionnaires, Analyse de redondance, Arbre phylogénétique, Conception de vaccin, Mutations, Invasivité, Neisseria Meningitidis, Virus du papillome humain.

Les différentes composantes des génomes et leur agencement sont issus de divers processus moléculaires. L'activité des éléments transposables (i.e. séquences d'ADN capables de se déplacer et se multiplier dans le génome) et l'augmentation du niveau de ploïdie (i.e. ensemble du nombre de chromosomes du noyau cellulaire) semblent avoir eu des rôles importants dans l'évolution de l'architecture des génomes des eucaryotes pluricellulaires. La polyploïdie se rencontre principalement chez les plantes mais elle se rencontre épisodiquement aussi dans des taxons animaux. De plus, plusieurs évènements de doublement de génome semblent avoir eu un impact sur la diversification des vertébrés. Les éléments transposables et la polyploïdie auraient des impacts non négligeables sur la diversification phénotypique des êtres vivants. Leur variation serait alors soumise à des processus sélectifs. Ces deux phénomènes pourraient interagir pour structurer les génomes. Selon différentes théories, l'augmentation du niveau de ploïdie aurait pour conséquence une augmentation du nombre d'insertions d'éléments transposables dans le génome. La plupart des études empiriques sont principalement basées sur des plantes allopolyploïdes et peu d'études se sont focalisées sur l'interaction entre la polyploïdie et les éléments transposables chez les animaux. Cette thèse de doctorat avait plusieurs objectifs. D'une part, cette thèse devait éclaircir l'histoire évolutive du complexe d'espèces Daphnia pulex. D'autre part, cette thèse avait pour but de tester l'effet du niveau de ploïdie sur un élément transposable de classe II, Pokey, en nature dans le complexe Daphnia pulex. Daphnia pulex est un petit crustacé d'eau douce. Les espèces de ce complexe se retrouvent dans les étangs et les lacs d'Amérique du Nord et d'Europe. Il existe une variation du mode de reproduction dans les populations (parthénogénétique cyclique ou obligatoire). Des lignées hybrides diploïdes et polyploïdes ont des origines multiples. Ce complexe présente un patron de polyploïdie géographique avec des diploïdes dans les régions tempérées et des polyploïdes dans les régions subarctiques et arctiques. L'importance de l'hybridation et le niveau de ploïdie dans ce complexe ont été réévalués. L'impact de la polyploïdie sur la densité de Pokey a été évalué en utilisant une technique de « TE display ». L'évolution des séquences de l'élément Pokey dans les lignées hybrides a été décrite avec des analyses phylogénétiques. Les données récoltées grâce à la cytométrie en flux combinées à l'analyse microsatellite ont révélé que la plupart des clones polyploïdes dans le complexe D. pulex sont triploïdes et non tétraploïdes comme le suggéraient les études antérieures. Les clones triploïdes sont probablement issus d'interactions entre des populations sexuées et asexuées. Diverses analyses sur les données microsatellites ont permis de séparer les populations hybrides des espèces dont elles sont issues. Les populations hybrides sont composées d'hybrides diploïdes et polyploïdes avec des mitochondries D. pulex et certaines lignées avec des mitochondries D. pulicaria. Les analyses conjuguées des données microsatellites et d'un gène nucléaire ont permis d'éclaircir les relations évolutives entre un groupe d'espèces où le maintien du polymorphisme ancestral et l'hybridation affectent les relations phylogénétiques observées en n'analysant qu'un seul gène. Cette étude montre que l'hybridation et l'introgression ont joué un rôle important dans l'évolution de ce complexe. Le nombre d'insertions TE a été comparé entre des diploïdes (14) et des polyploïdes (13) hybrides en utilisant une technique de « TE display ». Bien que le nombre moyen de sites d'insertion était plus élevé chez les polyploïdes que chez les diploïdes cette différence n'était pas statistiquement significative. De nombreux évènements de recombinaisons ont été révélés dans des allèles de Pokey dans des lignées diploïdes et polyploïdes du complexe pulex. Des analyses phylogénétiques et de recombinaison ont montré que la recombinaison est une force majeure qui façonne l'évolution du transposon Pokey. Cette thèse de doctorat présente donc divers patrons et processus génétiques se déroulant lors de la formation du complexe d'espèces Daphnia pulex. L'hybridation et la polyploïdie semblent avoir eu un impact significatif sur la diversification et possiblement sur l'adaptation de populations à différents environnements. L'absence d'augmentation du nombre d'insertions d'éléments transposables pourrait être expliquée par une augmentation de ceux-ci dans les lignées diploïdes hybrides parentes. L'intégration d'une vision écosystémique du génome pourrait permettre de mieux comprendre comment les génomes se structurent au cours de l'évolution. Des études en écologie évolutive et expérimentales permettraient de répondre à différentes hypothèses proposées lors de cette étude. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Polyploïdie, hybridation, transposon, complexe d'espèces, Daphnia pulex

La voie Wnt/β-caténine est impliquée dans la prolifération et le contrôle du destin cellulaire de nombreux tissus à la fois au cours du développement et pour le maintien de l’homéostasie chez l’adulte. L’équipe a montré qu’une activation aberrante de la β-caténine conduisait au développement de carcinomes hépatocellulaires (CHC), alors que son activation physiologique dans une souspopulation d'hépatocytes du foie adulte (les hépatocytes éricentraux) permet la mise en place et le maintien du zonage métabolique. Ce zonage hépatique peut être considéré comme une différenciation terminale des hépatocytes, et permet au foie d'être pleinement fonctionnel. L’objet de ma thèse a été d’identifier les déterminants moléculaires expliquant la diversité d’action de la β-caténine dans le foie. J'ai tiré profit de modèles génétiques développés au laboratoire d'activation ou d'inactivation inductibles de la voie β-caténine dans le foie. A partir d'hépatocytes isolés de ces modèles, j'ai recherché par ChIp-seq (immunoprécipitation de chromatine couplée à un séquençage haut-débit) les sites de fixation sur l’ADN de la β-caténine et de Tcf4, que j'ai identifié comme principal médiateur de l’activité nucléaire de la β-caténine dans le foie. Ces données, couplées à des études d’accessibilité de la chromatine et de transcriptome ont permis d’identifier la structure de la chromatine et Hnf4a comme déterminants majeurs permettant à la beta-caténine de contrôlerpositivement et négativement des programmes génétiques spécifiquement hépatiques, qui luipermettent d'assurer le zonage métabolique du foie. En effet, Hnf4a a un rôle antagoniste de la β-caténine, contrôlant positivement la transcription des gènes réprimés par la β-caténine. Ce contrôles'exerce grâce à un dialogue d'Hnf4a avec Tcf4 et la β-caténine, qui s'opère majoritairement via des interactions entre ces protéines. Nous proposons ainsi que la β-caténine coopère avec le facteur de transcription Hnf4a, connu pour contrôler les gènes du métabolisme hépatocytaire, pour assurer la différenciation terminale hépatique. J'ai également recherché les partenaires protéiques nucléaires de la β-caténine par coimmunoprécipiatation couplée à de la spectrométrie de masse. Plusieurs protéines jouant un rôle dans l'épissage des ARN ont pu être identifiées de cette manière. La quantification exon par exon des transcrits séquencés par RNA-Seq m'ont également permis d'identifier une possible régulation directede l’épissage des gènes SLC39A14 et NDRG2 par la β-caténine. Enfin, nous nous sommes attachés à comprendre comment la β-caténine jouait un rôle prolifératif suite à son activation aberrante dans le foie d'une part (par l'utilisation d'un modèle transgénique prénéoplasique) et lors de la régénération hépatique d'autre part. Nous avons pu démontré que ce rôle prolifératif était complexe, seulement partiellement autocrine, mettant en jeu la Cycline D1 et le facteur de croissance Tgfa, que nous avons définis comme étant des cibles directes de la β-caténine dans le foie. Ces derniers résultats évoquent également un dialogue fonctionnel entre la voie β-caténine et la cascade de signalisation Tgfa-Egf/Egfr/Erk pour assurer la prolifération hépatocytaire. / The Wnt/β-catenin pathway is involved in proliferation and cell fate control and regulatesdevelopmental stages as well as adult tissue homeostasis. Our team has previously shown that aberrantB-catenin signaling induced Hepatocellular Carcinoma (HCC) development, whereas physiologicalactivation in a subpopulation of adult liver hepatocytes (pericentral hepatocytes) patterns liverzonation. This hepatic zonation can be considered as hepatocytes terminal differenciation.My thesis aimed to identify key molecular determinants allowing diversity upon β-catenin activation.I took advantage of genetically engineered mice models of activation or inactivation of β-catenin,developped in the laboratory. Using hepatocytes obtained from these models I identified β-catenin andTcf4, that I previously identifed as the main effector of nuclear β-catenin in liver, binding sites byChIp-seq (Chromatin Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing). Couplingbinding site localization to transcriptomic and chromatin accessibility studies allowed to identifychromatin structure and tissue specific transcription factor HNF4A as key modulators of β-cateninsignaling in the liver and therefore modulators of metabolic zonation. Indeed, β-catenin negativelyregulates Hnf4a target genes. This negative control exerts essentially via protein interactions. Wepropose that β-catenin and Hnf4a cooperates to ensure terminal hepatic differenciation.I also searched for nuclear β-catenin partners by co-immunoprecipitation followed by massspectrometry. This approach revealed many splicing factors as beta-catenin partners. RNA seqanalysis revealed a possible direct regulation of splicing of SL39A14 and NDRG2 genes.Finally we tried to understand the proliferative role of β-catenin during liver regeneration. Wedemonstrated a complex and partially autocrine role of B-catenin. We defined CyclinD1 and thegrowth factor Tgfa as β-catenin direct targets in the liver. These latest results also imply a functionnaldialog between the β-catenin pathway and Tgfa-Egf/Egfr/Erk signalisation cascade to allowhepatocytes proliferation.