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Einleitung: Bei der Dystonie handelt es sich um eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Sie ist charakterisiert durch ungewollte, dauerhafte oder wiederkehrende Muskelkontraktionen, die zu abnormalen Bewegungsabläufen und Haltungen führen. Sie ist die dritthäufigste Bewe-gungsstörung beim Menschen. Bisherige Befunde beim Menschen und Untersuchungen an Tier-modellen weisen u.a. auf eine besondere Bedeutung der Basalganglien-Thalamus-Schleife hin, die an der Kontrolle von willkürlichen und unwillkürlichen Bewegungen beteiligt ist. So konnten bei unterschiedlichen Tiermodellen Veränderungen im Striatum (STR), der Eingangsstruktur der Basalganglien, nachgewiesen werden. Beim dtsz Hamster, einem gut etablierten Tiermodell für die paroxysmale Dystonie, konnte neben vielen striatalen Veränderungen eine Reduktion der GABAergen Interneurone (IN), wie Parvalbumin-positive (PV+) IN, zum Zeitpunkt der maximalen Ausprägung der Dystonie gezeigt werden. Ziele der Untersuchung: Die Gründe für den Mangel an striatalen GABAergen IN bei der dtsz Hamstermutante sollten weiter untersucht werden, indem der Frage nachzugehen war, ob beim dtsz Hamster eine Migrations- oder Ausreifungsstörung der IN vorliegt. Dazu wurde das Homöodomänprotein Nkx 2.1, als Marker für aus dem medialen Ganglienhügel eingewanderte IN, im STR der dtsz Hamstermutante untersucht. Die Expression des Brain-derived neurotrophic factors (BDNF), des Kalium-Chlorid-Kotransporters 2 (KCC2) und die zytosolische Carboanhydrase vom Isotyp 7 (CAH7) wurden als Indikatoren für die Ausreifung von GABAergen IN herangezogen. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen wurden vergleichend an dtsz Hamstern und Kontrollhamstern durchgeführt. Beim dtsz Hamster zeigt die Dystonie einen altersabhängigen Verlauf (Beginn: ca. 16. Lebenstag (LT); Maximum: 30.-42. LT; Remission: 70. LT). Deshalb wurden als Untersuchungszeitpunkte der 18. LT und der 33. LT gewählt. Um die Migration der striatalen IN zu untersuchen, wurde im STR bei 33 Tage alten Hamsterns die Dichte der immun-histochemisch markierten Nkx 2.1-positiven Zellen stereologisch ermittelt. Der mRNA-Gehalt wurde relativ mittels „quantitativer Echtzeit-PCR“ (qPCR) bestimmt. Zusätzlich wurde die mRNA-Expression von Nkx 2.1 bei 18 Tage alten Tieren untersucht. Von KCC2 und CAH7 wurde die mRNA mittels qPCR bei 18 und 33 Tage alten Hamstern im STR untersucht. Die Expression von BDNF wurde mittels ELISA-System im Kortex (Cx), STR und im restlichen Gehirngewebe („R“) bei 33 und 18 Tage alten Tieren bestimmt. Der BDNF-mRNA Gehalt wurde im Cx (18. und 33. LT) und im STR (33. LT) untersucht. Des Weiteren sollte BDNF bei 33 Tage alten Hamstern mittels immunhistochemischer Markierung im Cx und STR untersucht werden. Die Untersuchung von BDNF im Cx ist deshalb wichtig, weil BDNF vom Cx in das STR trans-portiert wird. Zusätzlich wurde Parvalbumin (PV) zusammen mit Nkx 2.1 immunhistochemisch markiert und die mRNA-Expression von PV bei 18 und 33 Tage alten Tieren bestimmt. Ergebnisse: Für Nkx 2.1 konnte kein Unterschied in der Zelldichte zwischen dtsz- und Kontroll-hamstern gefunden werden. Ebenfalls gab es weder bei 18 noch bei 33 Tage alten Tieren einen Unterschied in der Nkx 2.1-mRNA-Expression. Unterschiede in der mRNA-Expression von KCC2 und CAH7 im STR (18. und 33. LT) lagen auch nicht vor. Die Expression der PV-mRNA im STR bei 33 Tage alten Tieren war jedoch erwartungsgemäß vermindert. Auf mRNA-Ebene konnte im Cx für BDNF kein Unterschied zwischen dtsz- und Kontrolltiergruppe gefunden wer-den. Bei beiden Tiergruppen wurde mittels ELISA im STR mehr BDNF nachgewiesen als im Cx und im R (18. und 33. LT) nachweisbar. Entgegen der Hypothese war nach Analyse der Daten mittels Zwei-Wege ANOVA eine geringe Erhöhung der BDNF-Expression im Cx und STR bei 33 Tage alten dtsz Hamstern nachweisbar. Dies lag daran, dass die BDNF-Expression nur bei den Kontrolltieren am 33. LT im Vergleich zum 18. LT herunterreguliert war. Die Ergebnisse der BDNF-Immunhistologie waren in Hinblick auf die Spezifität zweifelhaft. Schlussfolgerung: Die Nkx 2.1 Daten lassen auf eine ungestörte Migration striataler IN bei der dtsz Mutante schließen. Wahrscheinlich ist eine Ausreifungsstörung für den Mangel an GABAer-gen IN verantwortlich. Die Ergebnisse von KCC2 und CAH7 zeigen, dass keine generelle Ausreifungsstörung von GABAergen Neuronen vorliegt, wobei dies für kleinere Subpopulationen nicht ausgeschlossen werden kann. Entgegen der Arbeitshypothese konnte keine Verringerung sondern eine leichte Erhöhung von BDNF zum 33. LT bei der dtsz Hamstermutante festgestellt werden. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass BDNF auf Grund der verzögert einsetzenden Entwicklung der IN nicht herunterreguliert wird. Die Gründe für diese Erhöhung wie auch weitere Marker für die neuronale Ausreifung werden durch weiterführende Studien untersucht.

Dans le cortex visuel des mammifères, une cellule à panier (BC) qui représente un sous-type majoritaire d’interneurones GABAergiques, innerve une centaine de neurones par une multitude de synapses localisées sur le soma et sur les dendrites proximales de chacune de ses cibles. De plus, ces cellules sont importantes pour la génération des rythmes gammas, qui régulent de nombreuses fonctions cognitives, et pour la régulation de la plasticité corticale. Bien que la fonction des BC au sein des réseaux corticaux est à l'étude, les mécanismes qui contrôlent le développement de leur arborisation complexe ainsi que de leurs nombreux contacts synaptiques n’ont pas été entièrement déterminés. En utilisant les récepteurs allatostatines couplés aux protéines G de la drosophile (AlstR), nous démontrons in vitro que la réduction de l'excitation ainsi que la réduction de la libération des neurotransmetteurs par les BCs corticales individuelles des souris, diminuent le nombre de cellules innervées sans modifier le patron d'innervation périsomatique, durant et après la phase de prolifération des synapses périsomatiques. Inversement, lors de la suppression complète de la libération des neurotransmetteurs par les BCs individuelles avec l’utilisation de la chaîne légère de la toxine tétanus, nous observons des effets contraires selon le stade de développement. Les BCs exprimant TeNT-Lc pendant la phase de prolifération sont caractérisées par des arborisations axonales plus denses et un nombre accru de petits boutons homogènes autour des somas innervés. Toutefois, les cellules transfectées avec TeNT-Lc après la phase de la prolifération forment une innervation périsomatique avec moins de branchements terminaux d’axones et un nombre réduit de boutons avec une taille irrégulière autour des somas innervés. Nos résultats révèlent le rôle spécifique des niveaux de l’activité neuronale et de la neurotransmission dans l'établissement du territoire synaptique des cellules GABAergiques corticaux. Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) est un modulateur puissant de la maturation activité-dépendante des synapses GABAergiques. Grâce à l'activation et à la signalisation de son récepteur tyrosine kinase B (TrkB), la liaison de mBDNF module fortement la prolifération des synapses périsomatiques GABAergiques formés par les BCs. Par contre, le rôle du récepteur neurotrophique de faible affinité, p75NTR, dans le développement du territoire synaptique des cellules reste encore inconnu. Dans ce projet, nous démontrons que la suppression de p75NTR au niveau des BCs individuelles in vitro provenant de souris p75NTRlox induit la formation d'une innervation périsomatique exubérante. BDNF est synthétisé sous une forme précurseur, proBDNF, qui est par la suite clivée par des enzymes, y compris la plasmine activée par tPA, pour produire une forme mature de BDNF (m)BDNF. mBDNF et proBDNF se lient avec une forte affinité à TrkB et p75NTR, respectivement. Nos résultats démontrent qu’un traitement des cultures organotypiques avec la forme résistante au clivage de proBDNF (mut-proBDNF) réduit fortement le territoire synaptique des BCs. Les cultures traitées avec le peptide PPACK, qui inactive tPA, ou avec tPA altèrent et favorisent respectivement la maturation de l’innervation synaptique des BCs. Nous démontrons aussi que l’innervation exubérante formée par les BCs p75NTR-/- n’est pas affectée par un traitement avec mut-proBDNF. L’ensemble de ces résultats suggère que l'activation de p75NTR via proBDNF régule négativement le territoire synaptique des BCs corticaux. Nous avons ensuite examiné si mut-proBDNF affecte l’innervation périsomatique formée par les BCs in vivo, chez la souris adulte. Nous avons constaté que les boutons GABAergiques périsomatiques sont significativement diminués dans le cortex infusé avec mut-proBDNF par rapport à l’hémisphère non-infusé ou traité avec de la saline. En outre, la plasticité de la dominance oculaire (OD) est rétablie par ce traitement chez la souris adulte. Enfin, en utilisant des souris qui ne possèdent pas le récepteur p75NTR dans leurs BCs spécifiquement, nous avons démontré que l'activation de p75NTR via proBDNF est nécessaire pour induire la plasticité de la OD chez les souris adultes. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle critique de l'activation de p75NTR dans la régulation et le maintien de la connectivité des circuits GABAergiques, qui commencent lors du développement postnatal précoce jusqu’à l'âge adulte. De plus, nous suggérons que l'activation contrôlée de p75NTR pourrait être un outil utile pour restaurer la plasticité dans le cortex adulte. / Cortical GABAergic basket cells (BC) innervate hundreds of postsynaptic targets with synapses clustered around the soma and proximal dendrites. They are important for gamma oscillation generation, which in turn regulate many cognitive functions, and for the regulation of developmental cortical plasticity. Although the function of BC within cortical networks is being explored, the mechanisms that control the development of their extensive arborisation and synaptic contacts have not been entirely resolved. By using the Drosophila allatostatin G-protein-coupled receptors (AlstR), we show that reducing excitation, and thus neurotransmitter release, in mouse cortical single BC in slice cultures decreases the number of innervated cells without changing the pattern of perisomatic innervation, both at the peak and after the proliferation phase of perisomatic synapse formation. Conversely, suppressing neurotransmitter release in single BCs by using the tetanus toxin light-chain can have completely opposite effects depending on the developmental stage. Basket cells expressing TeNT-Lc during the peak of the proliferation were characterized by denser axonal arbors and an increased number of smaller, homogenous boutons around the innervated somatas compared with control cells. However, after the peak of the synapse proliferation, TeNT-Lc transfected BCs formed perisomatic innervation with fewer terminal axon branches and fewer irregular-sized boutons around innervated somatas. Our results reveal a remarkably specific and age-dependent role of neural activity and neurotransmission levels in the establishment of the synaptic territory of cortical GABAergic cells. Brain derived neurotrophic factor (BDNF) has been shown to be a strong modulator of activity-dependent-maturation of GABAergic synapses. Through the activation and signaling of their receptor Tropomyosin-related kinase B (TrkB), mBDNF binding strongly modulates the proliferation of GABAergic perisomatic synapses formed by BCs. Whether the low-affinity neurotrophin-receptor p75NTR also play a role in the development of basket cell synaptic territory is unknown. Here, we show that single-cell deletion of p75NTR in BCs in cortical organotypic cultures from p75NTRlox mice induce the formation of exuberant perisomatic innervations by the mutant basket cells, in a cell-autonomous fashion. BDNF is synthesized as a precursor, proBDNF, which is cleaved by enzymes, including tPA-activated plasmin, to produce mature (m)BDNF. mBDNF and proBDNF bind with high-affinity to TrkB and p75NTR, respectively. Our results show that treating organotypic cultures with cleavage-resistant proBDNF (mut-proBDNF) strongly reduces the synaptic territory of BCs. Treating cultures with the tPA-inactivating peptide PPACK or with tPA impairs and promotes the maturation of BC synaptic innervations, respectively. We further show that the exuberant innervations formed by p75NTR-/- basket cells are not affected by mut-proBDNF treatment. All together, these results suggest that proBDNF-mediated p75NTR activation negatively regulates the synaptic territory of BCs. We next examined if mut-proBDNF affects perisomatic innervation formed by BCs in vivo, in the adult mouse. We found that perisomatic GABAergic boutons are significantly decreased in the cortex infused with mut-proBDNF as compared to non-infused or saline-treated hemispheres. Further, ocular dominance (OD) plasticity is restored by this treatment in adult mice. Finally, we found that proBDNF-mediated activation of p75NTR is necessary to induce OD plasticity in the adult mice, by using mice that lack p75NTR specifically in BCs. All together, these results demonstrate a critical role of p75NTR activation in regulating and maintaining GABAeric circuit connectivity from early postnatal development to adulthood. Further, we suggest that controlled activation of p75NTR could be a useful tool to restore plasticity in adult cortex.

La déficience intellectuelle affecte de 1 à 3% de la population mondiale, ce qui en fait le trouble cognitif le plus commun de l’enfance. Notre groupe à découvert que des mutations dans le gène SYNGAP1 sont une cause fréquente de déficience intellectuelle non-syndromique, qui compte pour 1-3% de l’ensemble des cas. À titre d’exemple, le syndrome du X fragile, qui est la cause monogénique la plus fréquente de déficience intellectuelle, compte pour environ 2% des cas. Plusieurs patients affectés au niveau de SYNGAP1 présentent également des symptômes de l’autisme et d’une forme d’épilepsie. Notre groupe a également montré que SYNGAP1 cause la déficience intellectuelle par un mécanisme d’haploinsuffisance. SYNGAP1 code pour une protéine exprimée exclusivement dans le cerveau qui interagit avec la sous-unité GluN2B des récepteurs glutamatergique de type NMDA (NMDAR). SYNGAP1 possède une activité activatrice de Ras-GTPase qui régule négativement Ras au niveau des synapses excitatrices. Les souris hétérozygotes pour Syngap1 (souris Syngap1+/-) présentent des anomalies de comportement et des déficits cognitifs, ce qui en fait un bon modèle d’étude. Plusieurs études rapportent que l’haploinsuffisance de Syngap1 affecte le développement cérébral en perturbant l’activité et la plasticité des neurones excitateurs. Le déséquilibre excitation/inhibition est une théorie émergente de l’origine de la déficience intellectuelle et de l’autisme. Cependant, plusieurs groupes y compris le nôtre ont rapporté que Syngap1 est également exprimé dans au moins une sous-population d’interneurones GABAergiques. Notre hypothèse était donc que l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones contribuerait en partie aux déficits cognitifs et au déséquilibre d’excitation/inhibition observés chez les souris Syngap1+/-. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré un modèle de souris transgéniques dont l’expression de Syngap1 a été diminuée uniquement dans les interneurones dérivés des éminences ganglionnaires médianes qui expriment le facteur de transcription Nkx2.1 (souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1). Nous avons observé une diminution des courants postsynaptiques inhibiteurs miniatures (mIPSCs) au niveau des cellules pyramidales des couches 2/3 du cortex somatosensoriel primaire (S1) et dans le CA1 de l’hippocampe des souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1. Ces résultats supportent donc l’hypothèse selon laquelle la perte de Syngap1 dans les interneurones contribue au déséquilibre d’excitation/inhibition. De manière intéressante, nous avons également observé que les courants postsynaptiques excitateurs miniatures (mEPSCs) étaient augmentés dans le cortex S1, mais diminués dans le CA1 de l’hippocampe. Par la suite, nous avons testé si les mécanismes de plasticité synaptique qui sous-tendraient l’apprentissage étaient affectés par l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones. Nous avons pu montrer que la potentialisation à long terme (LTP) NMDAR-dépendante était diminuée chez les souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1, sans que la dépression à long terme (LTD) NMDAR-dépendante soit affectée. Nous avons également montré que l’application d’un bloqueur des récepteurs GABAA renversait en partie le déficit de LTP rapporté chez les souris Syngap1+/-, suggérant qu’un déficit de désinhibition serait présent chez ces souris. L’ensemble de ces résultats supporte un rôle de Syngap1 dans les interneurones qui contribue aux déficits observés chez les souris affectées par l’haploinsuffisance de Syngap1. / Intellectual disability affects 1-3% of the world population, which make it the most common cognitive disorder of childhood. Our group discovered that mutation in the SYNGAP1 gene was a frequent cause of non-syndromic intellectual disability, accounting for 1-3% of the cases. For example, the fragile X syndrome, which is the most common monogenic cause of intellectual disability, accounts for 2% of all cases. Some patients affected by SYNGAP1 also showed autism spectrum disorder and epileptic seizures. Our group also showed that mutations in SYNGAP1 caused intellectual disability by an haploinsufficiency mechanism. SYNGAP1 codes for a protein expressed only in the brain which interacts with the GluN2B subunit of NMDA glutamatergic receptors (NMDAR). SYNGAP1 possesses a Ras-GAP activating activity which negatively regulates Ras at excitatory synapses. Heterozygote mice for Syngap1 (Syngap1+/- mice) show behaviour abnormalities and learning deficits, which makes them a good model of intellectual disability. Some studies showed that Syngap1 affects the brain development by perturbing the activity and plasticity of excitatory neurons. The excitatory/inhibitory imbalance is an emerging theory of the origin of intellectual disability and autism. However, some groups including ours, showed that Syngap1 is expressed in at least a subpopulation of GABAergic interneurons. Therefore, our hypothesis was that Syngap1 happloinsufficiency in interneurons contributes in part to the cognitive deficits and excitation/inhibition imbalance observed in Syngap1+/- mice. To test this hypothesis, we generated a transgenic mouse model where Syngap1 expression was decreased only in GABAergic interneurons derived from the medial ganglionic eminence, which expresses the transcription factor Nkx2.1 (Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mouse). We showed that miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) were decreased in pyramidal cells in layers 2/3 in primary somatosensory cortex (S1) and in CA1 region of the hippocampus of Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mice. Those results suggest that Syngap1 haploinsufficiency in GABAergic interneurons contributes in part to the excitation/inhibition imbalance observed in Syngap1+/- mice. Interestingly, we also observed that miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) were increased in cortex S1 but decreased in CA1 region of the hippocampus. We further tested whether synaptic plasticity mechanisms that are thought to underlie learning and memory were affected by Syngap1 haploinsufficiency in GABAergic interneurons. We showed that NMDAR-dependent long-term potentiation (LTP) but not NMDAR-dependent long-term depression (LTD) was decreased in Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mice. We also showed that GABAA receptor blockade rescued in part the LTP deficit in Syngap1+/- mice, suggesting that a disinhibition deficit is present in these mice. Altogether, the results support a functional role of Syngap1 in GABAergic interneurons, which may in turn contributes to the deficit observed in Syngap1+/- mice.

Les encéphalopathies épileptogènes sont des maladies graves de l’enfance associant une épilepsie, souvent réfractaire, et un retard de développement. Les mécanismes sous-tendant ces maladies sont peu connus. Cependant, nous postulons que ces épilepsies puissent être causées par une dysfonction du réseau inhibiteur. En effet, des défauts de migration ou de maturation des interneurones GABAergiques (INs) corticaux induisent l’épilepsie, tant chez l’humain que chez la souris. Dans le but d’étudier les causes génétiques des encéphalopathies épileptogènes sporadiques inexpliquées, le laboratoire de la Dre Rossignol a procédé au séquençage d’exome entier d’une cohorte d’enfants atteints. Cela a permis d’identifier, chez un patient, une nouvelle mutation de novo, possiblement pathogène, dans le gène MYO9b. MYO9b est impliqué dans la migration de cellules immunitaires et cancéreuses et est exprimée durant le développement cérébral. Nous émettons l’hypothèse voulant que MYO9b puisse être importante pour la migration des INs corticaux. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que Myo9b est exprimé dès le stade embryonnaire par les progéniteurs des INs corticaux et que son expression se restreint aux INs dans le cortex mature. De plus, nous démontrons que la répression ex vivo de Myo9b sélectivement dans les INs au sein de tranches corticales organotypiques embryonnaires mène à des défauts morphologiques majeurs de ces cellules en migration. En effet, ces cellules présentent une morphologie multipolaire et des neurites rostraux plus longs et plus complexes. Ces changements morphologiques pourraient avoir un impact majeur sur la migration des INs et ainsi perturber le développement des réseaux inhibiteurs. / Epileptic encephalopathies are early-onset diseases characterized by refractory epilepsy with developmental delay. To identify the underlying genetic cause of these disorders, Dr Rossignol’s laboratory has performed whole-exome sequencing in children with sporadic epileptic encephalopathies. They have identified a novel de novo mutation in the MYO9B gene in one patient. Myo9b is known to regulate cell migration in the immune system and in cancer cells. It is expressed in the developing rodent brain, but its roles during brain development are largely unknown. Recent evidence suggests that epilepsy can be caused by an imbalance between inhibition and excitation in cortical circuits. Indeed, defects in the development or the functions of cortical GABAergic interneurons (INs) have been associated with epilepsy in human and in mouse models. Therefore, we postulated that Myo9b might play a role in the development of INs. In this thesis, I show that Myo9b is expressed in INs from early embryonic ages to post-natal ages. Furthermore, I demonstrate that the ex vivo downregulation of Myo9b in INs in cortical embryonic organotypic cultures causes morphological defects in migrating INs, including aberrant polarization of these cells. These morphological changes might result in aberrant IN migration, which would be expected to perturb the cortical inhibitory-excitatory ratio.

Hippokampale Sharp Wave-Ripples (SWRs) sind elektrografische Ereignisse, die für die Konsolidierung von Erinnerungen eine Rolle spielen. Eine SWR ist durch eine schnelle Oszillation (>90 Hz, ''ripple'') charakterisiert, die sich mit der langsameren ''sharp wave'' ( / Hippocampal sharp wave-ripples (SWRs) are electrographic events that have been implicated in memory consolidation. A SWR is characterized by a fast (> 90 Hz) oscillation, the ripple, superimposed on a slow (< 30 Hz) sharp wave. In vivo, the fast component can express frequencies either in the ripple range (140-200 Hz) or fast-gamma range (90-140 Hz). Episodes in both bands exhibit intra-ripple frequency accommodation (IFA). In vitro, ripples are frequency-resistant to GABA modulators. These features constrain the type of mechanisms underlying the generation of the fast component. A prominent hypothesis proposes that a recurrent network of parvalbumin-immunoreactive basket cells (PV+BC) is responsible of setting the ripple frequency. The focus of the present thesis is on testing to which extent the PV+BC network can account for the aforementioned features of SWRs, which remain unexplained. Here, I simulated and analyzed a physiologically constrained in silico model of the PV+BC network in CA1 under different conditions of excitatory drive. The response of the network to transient excitation exhibits both IFA in the ripple band and frequency resistance to GABA modulators. The expression of IFA in the fast gamma band requires the involvement of pyramidal cells in a closed loop with the PV+BC network. The model predicts a peculiar relationship between the instantaneous frequency of ripples and the time course of the excitatory input to CA1. This prediction was confirmed in an in vitro model of SWRs. Additionally, I study the involvement of oriens lacunosum-moleculare interneurons (O-LM) during SWRs in vitro. I characterize the excitatory currents received by O-LM cells during SWRs and investigate the factors that determine their recruitment.

Le virus de la maladie de Borna (BDV) est un virus persistant dans le système nerveux central responsable de troubles du comportement chez l’animal et possiblement chez l’homme. En utilisant des cellules progénitrices neurales humaines, des travaux antérieurs à mon arrivée au laboratoire ont montré que BDV altère la neurogenèse humaine. Les objectifs de ma thèse étaient d’identifier les déterminants viraux responsables de cette altération et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avons montré que la phosphoprotéine (P) et la nucléoprotéine (N), mais pas la protéine X, induisent une inhibition spécifique de la neurogenèse humaine, la genèse des astrocytes n’étant pas altérée. Ensuite, focalisant notre étude sur P, nous avons montré qu’elle affectait particulièrement la genèse des neurones GABAergiques. La caractérisation moléculaire a ensuite révélé une diminution de l’expression de gènes impliqués dans la spécification (ApoE et Noggin) et dans la maturation (SCG10/Stathmin2 et TH) neuronale. En conclusion, nos résultats démontrent, pour la première fois, qu’une protéine virale perturbe la neurogenèse GABAergique humaine, un processus connu pour être dérégulé dans certaines maladies psychiatriques. Ils améliorent ainsi notre compréhension de la pathogenèse de ce virus persistant et de son rôle possible dans les maladies psychiatriques chez l’homme. / Borna disease virus (BDV) is a persistent neurotropic virus causing neurobehavioral disorders in animals and possibly humans. Using human neural progenitor cells, it had been shown, before my arrival in the laboratory, that BDV induces an alteration in human neurogenesis. Here, we aimed at identifying the viral determinants involved in BDV-induced impairment of neurogenesis and at characterizing the underlying molecular mechanisms. We demonstrated that the phosphoprotein (P) and the nucleoprotein (N), but not the X protein, reduce neurogenesis. Focusing on the role of P, we evidenced an impairment of GABAergic neurogenesis. Then, seeking for the molecular mechanisms responsible for P-induced inhibition of neurogenesis, we showed that it induces a decrease in the expression of cellular factors involved in either neuronal specification (ApoE, Noggin) or maturation (SCG10/Stathmin, TH). Thus, in this study, we demonstrated for the first time that a viral protein is capable of inhibiting GABAergic neurogenesis, a process that is dysregulated in some psychiatric diseases. Our results improve our understanding of the pathogenesis of this persistent neurotropic virus and of its possible role in psychiatric disorders.

Au cours de ma thèse, mes projets de recherche ont visé à mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules progénitrices dans la rétine du xénope à travers trois projets principaux. Le réseau de régulation qui contrôle la spécification des cellules progénitrices vers les sous-types neuronaux est à ce jour très peu connu. C’est dans ce contexte que j’ai étudié le rôle du facteur de transcription à domaine bHLH, Ascl1, dans la détermination des sous-types rétiniens au cours du développement. Par des approches in vivo de gain et perte de fonction d’Ascl1, des expériences d’épistasie et la recherche de ses cibles transcriptionnelles, j’ai pu mettre en évidence qu’Ascl1 (i) est impliqué dans la genèse des neurones GABAergiques rétiniens, (ii) qu’il est épistatique sur des facteurs glutamatergiques tels que Neurog2, NeuroD1 ou Atoh7, (iii) que son activité GABAergique est conférée par son domaine basique de liaison à l’ADN et (iv) que cette activité implique la régulation directe du facteur de transcription Ptf1a. Ces données ajoutent donc une nouvelle pièce au réseau transcriptionnel gouvernant la spécification des sous-types GABAergiques au cours du développement de la rétine. La mise en place correcte des types et sous-types cellulaires de la rétine nécessite une coordination avec le moment de sortie du cycle cellulaire des progéniteurs rétiniens. Dans ce contexte, j’ai contribué à l’avancée d’un projet visant à étudier le réseau de signalisation contrôlant la prolifération des précurseurs de la rétine. Par des approches in vivo, génétiques et pharmacologiques, cette étude a montré que les voies Wnt et Hedgehog s’antagonisent pour réguler l’activité proliférative des cellules souches et progénitrices rétiniennes. Nos données préliminaires suggèrent que ces voies agissent de façon opposée à la fois sur la sortie et sur la cinétique du cycle cellulaire. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle selon lequel ces voies Wnt et Hedgehog réguleraient la balance entre prolifération et différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Enfin, dans le but d’élargir nos connaissances sur les réseaux de signalisation et les réseaux transcriptionnels impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la détermination cellulaire dans la rétine, j’ai également contribué à la recherche de nouveaux marqueurs spécifiques des différentes populations cellulaires rétiniennes au travers d’un crible à grande échelle par hybridation in situ. De nombreux gènes spécifiquement exprimés dans les cellules souches ou les cellules progénitrices constituent des gènes candidats pour de futures approches fonctionnelles. / My thesis research work aimed to better understand the molecular mechanisms underlying proliferation and specification of retinal progenitors in Xenopus through three main projects. As the mechanisms governing specification of retinal progenitors towards the different neuronal subtypes are still poorly understood, I focused my work on the role of Ascl1, a bHLH transcription factor, in cell-subtype determination during retinogenesis. Using in vivo gain- and loss-of-function experiments, I have investigated Ascl1’s epistatic relationships with other bHLH factors and identified its transcriptional targets. My results indicate that Ascl1 (i) is implicated in the genesis of retinal GABAergic neurons (ii) is epistatic to glutamatergic factors such as Neurog2, NeuroD1 and Atoh7 (iii) that its basic DNA-biding domain is sufficient for its GABAergic-inducing activity (iv) and that this activity involves a direct regulation of the Ptf1a transcription factor. The correct order of neural cell types and subtypes formation is tightly coordinated with the timing of cell-cycle exit of retinal progenitors. Ongoing work in the laboratory, to which I have contributed, was therefore investigating the role of signaling pathways controlling retinal precursor proliferation in this process. Using in vivo genetic and pharmacological tools, we have shown that an antagonistic cross-regulation between Wnt and Hedgehog signaling governs stem cell and progenitor proliferation in post-embryonic retina. Preliminary data shows that Wnt and Hedgehog have opposite effects on both cell cycle exit and kinetics and may therefore regulate the proliferation/differentiation balance in the post-embryonic retina. Lastly, in order to broaden our knowledge on the transcriptional and signaling networks which govern proliferation and cell fate determination in the retina, I have participated in a large scale screen by in situ hybridization aiming to identify new molecular markers of different retinal cell population. Many genes that are exclusively expressed in retinal stem cells or progenitors are promising candidates for future functional studies.

Les glucocorticoïdes (GC) sont des hormones stéroïdes synthétisées par les glandes surrénales. La production de ces GC est une des réponses de l’organisme pour rétablir l’homéostasie grâce à différentes actions comprenant des effets centraux sur le comportement et la douleur. C’est ce dernier qui a fait l’objet de mes travaux dans le cadre de cette thèse.Les afférences sensorielles primaires véhiculent les informations de la périphérie dans les cornes dorsales de la moelle épinière. Ces informations qui peuvent être nociceptives sont modulées par un réseau de neurones spinal avant d’être transmises et intégrées. Nous avons montré que les GC sont impliqués dans la maturation et le fonctionnement de la transmission inhibitrice faisant intervenir le neurotransmetteur GABA. Dans les cornes dorsales, cette inhibition est cruciale pour limiter les mécanismes de transmission de l’information nociceptive. / Glucocorticoids (GC) are steroid hormones synthesized in adrenals following HPA axis activation. GC production is a response of the organism to alleviate homeostasis perturbations through different actions. One of them involves central neuronal modulation of behavior and pain perception.Primary afferents convey peripheral sensory information in the dorsal horns of the spinal cord. This information can be nociceptive and are modulated by a spinal neuronal network before being transmitted and integrated. We showed that GC are implied in the maturation and functioning of the inhibitory transmission involving GABA neurotransmitter. In the dorsal horns this inhibitory transmission is of major importance, limiting the processing of nociceptive information.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Experimental models of seizure in animals have represented an important role for the understanding of the physiological and behavioural alterations associated with the human epilepsy. The induction of partial or generalized seizures is an efficient method for evaluating both the susceptibility to seizures and to investigate new anticonvulsant agents. In this sense, studies showed that the convulsive actions of the diphenyl diselenide (PhSe)2 and 2,3-dimercaptopropanol (BAL) compounds are inhibited by diazepam and phenobarbital, two classic allosteric modulators of the GABAergic system. Therefore, arises the interest of to investigate the interaction of the (PhSe)2 and BAL compounds with convulsive agents that act via blockade and/or modulation of the GABAergic system. This is the case of the pentylenetetrazol (PTZ), which exerts its convulsive action by blocking of Cl- channel of the GABAA receptor complex. Taking into account these facts, the present study had as first objective to investigate the effects of the pre-administration of (PhSe)2 and BAL in the model of chemical seizure PTZ-induced in mice (Article 1). For this purpose, mice were pretreated with (PhSe)2 (150 μmol/kg, i.p.) or BAL (250, 500, or 1000 μmol/kg, i.p.) 10 minutes prior to administration of PTZ. The obtained results showed that the pretreatment with (PhSe)2 reduced the latency for seizure PTZ-induced at doses of 40 and 60 mg/kg, beyond to cause a decrease in the latency for death PTZ-induced at dose of 60 mg/kg. However, the convulsive and lethal action PTZ-induced at dose of 80mg/kg was not affected by the pretreatment with (PhSe)2. Similarly, the pretreatment of the animals with BAL reduced the latency for seizure induced by 40 and 50 mg/kg PTZ. In addition, the latency for death PTZ-induced at dose of 40 mg/kg was significantly decreased by the pretreatment with BAL in all doses tested. Particularly, in the dose of 50 mg/kg of PTZ, a significant decrease in the latency for death occurred only when the mice were pretreated with 500 and 1000 μmol/kg of BAL. These results show that (PhSe)2 and BAL act in synergysm with PTZ potentializing its convulsive action, possibly through a modulation of the GABAergic system. Tacking into account the structural similarities between (PhSe)2 and diphenyl ditelluride (PhTe)2 compounds, our further objective was to investigate the effects of the (PhSe)2 and (PhTe)2 compounds on a model of chemical seizure 4-aminopyridine (4-AP)-induced in mice (Article 2). The convulsive action of this agent occurs through a blockade of K+ channels and activation of Ca2+ channels, with consequent release of neurotransmitters, predominantly the glutamate. Moreover, it was investigated the brain lipid peroxidation level after treatment of the animals with 4-AP, as well the effect of the pretretament with the (PhSe)2 and (PhTe)2 compounds on this level. For this purpose, mice were pretreated with (PhSe)2 and (PhTe)2 (50, 100, or 150 μmol/kg, s.c.) 30 minutes before administration of 4-AP (12 mg/kg, i.p.). The obtained results showed that the pretreatment with (PhSe)2 and (PhTe)2 (50, 100, and 150 μmol/kg) significantly increased the latency for clonic and tonic seizure, as well as inhibited the death 4-AP-induced. In addition, it was observed a significant increase in the brain lipid peroxidation levels after treatment with 4-AP, which was significantly inhibited by pretreatment with the (PhSe)2 and (PhTe)2 compounds. Therefore, these results show that (PhSe)2 and (PhTe)2 increase the latency for seizures, as well as inhibit the death 4-AP-induced. It is possible that this effect result of the modulation of redox sites of NMDA receptors, and/or modulation in the Ca2+ channels activity with consequent alteration in the neurotransmitters release. Moreover, the work provided evidences for the anticonvulsant and antioxidant properties of the (PhSe)2 and (PhTe)2 compounds, which point out for its neuroprotective properties in this model. Of general model, the utilization of the models of chemical seizure PTZ- or 4-AP-induced in mice was a useful method in the investigation of the actions on central nervous system of the (PhSe)2, (PhTe)2, and BAL compounds. The use of these convulsive models provided evidences about the convulsive actions, as well as possible mechanisms of action of the evaluated compounds. / Modelos experimentais de convulsão em animais têm representado um papel importante para a compreensão das alterações fisiológicas e comportamentais associadas com a epilepsia humana. A indução de convulsões parciais ou generalizadas é um método eficiente para avaliar tanto a susceptibilidade às convulsões quanto investigar novos agentes anticonvulsivantes. Neste sentido, estudos demonstraram que as ações convulsivantes dos compostos disseleneto de difenila (PhSe)2 e 2,3-dimercaptopropanol (BAL) são inibidas por diazepam e fenobarbital, dois moduladores alostéricos clássicos do sistema GABAérgico. Logo, surge o interesse de investigar os efeitos da interação dos compostos (PhSe)2 e BAL e agentes convulsivantes que ajam através do bloqueio e/ou modulação do sistema GABAérgico. Este é o caso do agente pentilenotetrazol (PTZ), o qual exerce sua ação convulsiva por meio de um bloqueio do canal de Cl- do complexo do receptor GABAA. Considerando estes fatos, o presente estudo teve como primeiro objetivo investigar os efeitos da pré-administração de (PhSe)2 e BAL no modelo de convulsão química induzida por PTZ em camundongos (Artigo 1). Para este propósito, camundongos foram pré-tratados com (PhSe)2 (150 μmol/kg, i.p.) ou BAL (250, 500 ou 1000 μmol/kg, i.p.) 10 minutos antes da administração de PTZ. Os resultados obtidos demonstraram que o pré-tratamento com (PhSe)2 reduziu a latência para a convulsão induzida por PTZ nas doses de 40 e 60 mg/kg, além de causar um decréscimo na latência para a morte induzida por PTZ na dose de 60 mg/kg. Entretanto, a ação convulsivante e letal induzida por PTZ na dose de 80 mg/kg não foi afetada pelo pré-tratamento com (PhSe)2. Similarmente, o pré-tratamento dos animais com BAL reduziu a latência para a convulsão induzida por 40 e 50 mg/kg de PTZ. Além disso, a latência para a morte induzida por PTZ na dose de 40 mg/kg foi significativamente diminuída pelo pré-tratamento com BAL em todas as doses testadas. Particularmente, na dose de 50 mg/kg de PTZ, decréscimo significativo na latência para a morte ocorreu somente quando os camundongos foram pré-tratados com 500 e 1000 μmol/kg de BAL. Estes resultados demonstram que o (PhSe)2 e BAL agem em sinergismo com o PTZ potencializando sua ação convulsiva, possivelmente através de uma modulação do sistema GABAérgico. Tendo em vista as similaridades estruturais entre os compostos (PhSe)2 e ditelureto de difenila (PhTe)2, nosso próximo objetivo foi investigar o efeito dos compostos (PhSe)2 e (PhTe)2 sobre um modelo de convulsão química induzida por 4-aminopiridina (4-AP) em camundongos (Artigo 2). A ação convulsiva deste agente ocorre através do bloqueio de canais de K+ e ativação de canais de Ca2+, com conseqüente liberação de neurotransmissores, predominantemente o glutamato. Além disso, foram investigados os níveis de peroxidação lipídica cerebral após o tratamento dos animais com 4-AP, bem como o efeito do pré-tratamento com os compostos (PhSe)2 e (PhTe)2 sobre esses níveis. Para este fim, camundongos foram pré-tratados com (PhSe)2 e (PhTe)2 (50, 100 ou 150 μmol/kg, s.c.) 30 minutos antes da administração de 4-AP (12 mg/kg, i.p.). Os resultados obtidos demonstraram que o pré-tratamento com (PhSe)2 e (PhTe)2, nas doses de 50, 100 e 150 μmol/kg, aumentou significativamente a latência para a convulsão clônica e tônica, bem como inibiu a morte induzida por 4-AP. Além disso, observamos um significativo aumento nos níveis de peroxidação lipídica cerebral após o tratamento com 4-AP, o qual foi significativamente inibido pelo pré-tratamento com os compostos (PhSe)2 e (PhTe)2. Portanto, estes resultados demonstram que (PhSe)2 e (PhTe)2 aumentam a latência para as convulsões, bem como inibem a morte induzida por 4-AP. É possível que este efeito resulte da modulação de sítios redox de receptores NMDA, e/ou modulação na atividade de canais de Ca2+ com conseqüente alteração na liberação de neurotransmissores. Além disso, o trabalho forneceu evidências para as propriedades anticonvulsivas e antioxidantes dos compostos (PhSe)2 e (PhTe)2, as quais apontam para suas propriedades neuroprotetoras neste modelo. De forma geral, a utilização dos modelos de convulsão química induzida por PTZ e 4-AP em camundongos foi um método útil na investigação das ações sobre o sistema nervoso central dos compostos (PhSe)2, (PhTe)2 e BAL. O emprego destes modelos convulsivos forneceu evidências acerca das ações convulsivas, bem como possíveis mecanismos de ação dos compostos avaliados.