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Identificación global de genes de Salmonella enterica serovar Gallinarum requeridos para la colonización sistémica de un hospedero murinoMardones Acuña, Paula Carolina 12 1900 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímico / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas, hasta diciembre de 2014 / Salmonella enterica es un patógeno intracelular Gram negativo capaz de infectar un amplio rango de hospederos. En particular, S. enterica serovar Gallinarum infecta aves de corral causando una enfermedad sistémica que puede provocar la muerte. Una vez que entra al organismo, Salmonella utiliza una serie de factores de virulencia que le permiten sobrevivir al pH ácido del estómago, resistir a sales biliares y péptidos antimicrobiales, invadir y traspasar la barrera epitelial intestinal, sobrevivir y replicarse dentro de macrófagos y diseminarse dentro de los órganos del hospedero, principalmente a nivel del bazo e hígado.
Hasta el momento, se desconoce gran parte de los factores de virulencia que utiliza S. Gallinarum para infectar un hospedero. Es por eso que en este trabajo se propuso identificar los genes de S. Gallinarum involucrados en la colonización sistémica en un modelo murino a través de un análisis global de mutantes bajo selección negativa in vivo. Para ello, se utilizó una genoteca de ~48.000 mutantes por inserción del transposón EZ-Tn5<T7/KAN-2>, la que se inyectó en ratones BALB/c por vía intraperitoneal. La comparación entre la población de bacterias inyectadas (input) y la población de bacterias recuperadas a partir del bazo de los animales (output) mediante hibridaciones competitivas en un microarray genómico nos permitió obtener una base de datos en la que identificamos 280 mutantes bajo selección negativa in vivo.
La lista de mutantes bajo selección negativa incluye genes descritos previamente como necesarios para la virulencia de S. enterica, como los sistemas de secreción tipo III codificados en la SPI-1 y SPI-2, genes que codifican efectores de estos sistemas (sseB, sseE), genes relacionados a la síntesis y modificación del LPS (rfaL, rfaJ, rfbK, rfbM), genes que codifican reguladores globales de la virulencia (phoP, phoQ, ompR, envZ), genes que codifican proteínas de respuesta a estrés (oxyR, rpoE, htrA), entre otros. La lista también incluye genes no reportados previamente como necesarios para la virulencia de S. Gallinarum, pero si para la virulencia de otros serovares de S. enterica, como tatB y tatC que codifican proteínas del sistema Twin-Arginine Transport; y genes con funciones desconocidas como la región génica STM3118 a STM3121 perteneciente a la SPI-13.
El sistema Twin-Arginine Transport es un sistema que transporta proteínas plegadas hacia el periplasma de bacterias Gram negativo. Por otra parte, aún se desconoce la función exacta de SPI-13, pero se ha visto que es necesaria para la replicación de S. Typhimurium dentro de macrófagos murinos. A través de ensayos de competencia y complementación in vivo entre la cepa silvestre y las mutantes ΔtatABC o ΔSPI-13, se confirmó la participación de estas regiones génicas en la colonización sistémica de ratones BALB/c.
Cabe destacar que la lista de mutantes bajo selección negativa in vivo no incluye ciertos genes previamente descritos como necesarios para la virulencia de S. enterica, como el gen aroA que codifica una proteína involucrada en la síntesis de compuestos aromáticos. Se realizó un ensayo de competencia con una mutante ΔaroA y se determinó que presenta una colonización sistémica deficiente en ratones BALB/c, confirmando la participación de aroA en la virulencia de esta bacteria.
Finalmente, mediante este análisis global de mutantes bajo selección negativa in vivo logramos identificar genes de S. Gallinarum requeridos para la colonización sistémica eficiente de un hospedero murino, comprobando de forma independiente la participación del operón tatABC, la isla de patogenicidad SPI-13 y el gen aroA en este proceso. El análisis individual de los genes identificados en esta base de datos permitirá ampliar el conocimiento sobre los mecanismos de patogenicidad de S. Gallinarum / Salmonella is a Gram negative intracelular pathogen able to infect a broad range of hosts. Specifically, S. enterica serovar Gallinarum infects poultry leading to a systemic illness that may cause death. Once Salmonella enters the organism, it uses a variety of virulence factors which allows it to survive in the gastric acid, resist bile salts and antimicrobial peptides, invade and cross the intestinal epithelium, survive and grow within macrophages, and colonize internal organs of the host, mainly spleen and liver.
The main virulence factors that S. Gallinarum uses to infect a host remained unknown until know. In this work we proposed to identify genes involved in the systemic colonization of S. Gallinarum in the murine model through a genome-wide screening of mutants under negative selection in vivo. To accomplish this, we used a pool of ~48.000 mutants generated by random insertion of the EZ-Tn5<T7/KAN-2> transposon to inoculate BALB/c mice intraperitoneally. The comparison between the pool of inoculated bacteria (input) and the pool of bacteria recovered from the spleen of the animals (output) through high-throughput microarray-based screening of mutants allowed us to obtain a database of 280 mutants under negative selection in vivo.
Within this database we found mutants in several genes known to be required for Salmonella enterica virulence, like those related to the type III secretion system encoded in SPI-1 and SPI-2, genes encoding efectors secreted by these systems (sseB, sseE), genes related to LPS synthesis and modification (rfaL, rfaJ, rfbK, rfbM), genes encoding global virulence regulators (phoP, phoQ, ompR, envZ), and genes encoding proteins involved in response to stress (oxyR, rpoE, htrA), among others. We also found genes not previously reported as required for S. Gallinaum virulence, like tatB and tatC, encoding components of the Twin-Arginine Transport system; and genes with unknown function like the genetic region comprised by STM3118 to STM3121, belonging to SPI-13.
The Twin-Arginine Transport system transports a number of folded proteins to the periplasma of Gram-negative bacteria. Besides, the exact function of SPI-13 is still unknown, but has been seen that is necessary for the growth of S. Typhimurium inside murine macrophages. Through in vivo competition and complementation assays between wild type and ΔtatABC or ΔSPI-13 mutants, we were able to confirm the important role of these genes in the systemic colonization of BALB/c mice by S. Gallinarum.
Noteworthly, there were genes that we didn’t observe on our database that have been reported as required S. enterica virulence like aroA, a gene involved in the synthesis of aromatic coumpounds. Using an in vivo competition assay we observed a systemic colonization defect for the ΔaroA mutant in BALB/c mice, indicating that this gene is indeed required for S. Gallinarum virulence in this host.
Overall, our genome-wide screening of mutants under negative selection in vivo allowed us to identify 280 genes of S. Gallinarum required for the systemic colonization of a murine host. Also, we confirmed the role played by the tatABC operon, SPI-13 and aroA in the systemic colonization by this serovar. The in-depth analysis of the genes identified in our screening will expand our current knowledge on the mechanisms of S. Gallinarum pathogenesis / FONDECYT
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Evaluación del uso combinado de exclusión competitiva y vacunación en la prevención de infecciones producidas por Salmonella gallinarum en gallinas de posturaCruz Ramírez, Paola Teresa January 2004 (has links)
Se evaluó el efecto protectivo del uso combinado de exclusión competitiva (EC) y vacunación en gallinas de postura desafiadas experimentalmente con una cepa de campo de S.gallinarum. En dos ensayos se emplearon 200 pollitas de postura de la línea Hyline Brown de 1 día de edad provenientes de aves reproductoras libres de Salmonella sp. Para cada ensayo las aves fueron distribuídas en cinco grupos de 20 aves cada uno. En el primer ensayo, 100 aves fueron desafiadas a las 18 semanas de edad con 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum y en el segundo ensayo con 1 x 10 8 UFC/ ml de la misma cepa a las 28 semanas de edad Los grupos A y C recibieron tres aplicaciones de una vacuna conteniendo la cepa 9R de S. gallinarum (Vacuna 9R) a la 4ta, 8va y 10ma semana de edad, mientras que los grupos B y D recibieron una aplicación de una vacuna inactivada de S. enteritidis en emulsión oleosa (Bacterina) a la 13va semana de edad. Adicionalmente los grupos A y B recibieron un producto de EC al día de edad en planta de incubación. En cada ensayo un grupo de aves que no recibió ninguna protección fue usado como control. El experimento se inició con la crianza de las aves en una granja comercial al norte de Lima bajo condiciones normales de manejo y bioseguridad. Las aves fueron trasladadas a la unidad experimental del Laboratorio de Patología Aviar de la FMV-UNMSM para el desafío y evaluación clínica por un periodo de observación de 22 días post reto. Fueron evaluados signos clínicos, mortalidad, lesiones, respuesta serológica y recuperación de la cepa de desafío. Para el análisis estadístico se usó la curva de supervivencia de Kaplan Meier y las diferencias estadísticas fueron evaluadas por Regresión de Cox. En ambos ensayos la mejor protección fue obtenida en los grupos vacunados con vacuna 9R sola o combinada con Exclusión competitiva (p<0.05). Diferencias estadísticas fueron observadas entre el grupo control y grupo A (vacuna 9R más EC) y grupo C (vacuna 9R). En ambos ensayos los grupos vacunados con bacterina sola o combinada con EC no fueron protegidos, no existiendo diferencias estadísticas con el grupo control (p>0.05). En el primer y segundo ensayo las aves del grupo A tuvieron una media de supervivencia significativamente diferente comparada con el grupo control y los grupos con bacterina y EC más bacterina (p<0.05). / The protective effect of the combined use of vaccination and competitive exclusion (CE) in layer hens experimentally challenged with a S. gallinarum field strain was evaluated. Two hundred Hyline Brown pullets since one day old and obtained from salmonella- free breeders were used. We divided this study in two trials in order to do two challenges in two different ages. Half of the birds were challenged at 18 weeks old (Trial 1) with 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum and half remained were challenged at 25 weeks old (Trial 2) with 1 x 108 UFC/ ml . The birds were divided in five groups of 20 birds each. The groups A and C received three applications of a live Salmonella gallinarum 9R strain vaccine (9R vaccine) at 4th , 8th and 10th weeks old subcutaneously. Groups B and D received a Salmonella enteritidis oil emulsion commercial bacterine (bacterine SE) at 13 weeks old, subcutaneously. Group E unvaccinated and without competitive exclusion was the control group. The study started with the birds breed in a commercial poultry farm at the north of Lima under normal management and bio security conditions .The birds were moved to the Avian Pathology Laboratory of the College of Veterinary Medicine, San Marcos University to challenge and clinic evaluation about 22 days post-challenge. Clinical signs, mortality rates, lesions, serologic response and field strain recovery were evaluated. Kaplan Meier design and Cox regression were used to determine statistical differences. In both trials the best protection was performed in 9R vaccine groups single or combined with CE. (p<0.05). Statistical differences were observed between the control group and group A (9R vaccine plus CE) and group C (9R vaccine) .In both trials the bacterine SE vaccinated groups were not protected and there were no differences with the control group (p>0.05). In trial 1 and 2 the group A had a higher survival mean than the control group and bacterine SE group and bacterine plus CE (p<0.05).
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Evaluación del uso combinado de exclusión competitiva y vacunación en la prevención de infecciones producidas por Salmonella gallinarum en gallinas de posturaCruz Ramírez, Paola Teresa January 2004 (has links)
Se evaluó el efecto protectivo del uso combinado de exclusión competitiva (EC) y vacunación en gallinas de postura desafiadas experimentalmente con una cepa de campo de S.gallinarum. En dos ensayos se emplearon 200 pollitas de postura de la línea Hyline Brown de 1 día de edad provenientes de aves reproductoras libres de Salmonella sp. Para cada ensayo las aves fueron distribuídas en cinco grupos de 20 aves cada uno. En el primer ensayo, 100 aves fueron desafiadas a las 18 semanas de edad con 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum y en el segundo ensayo con 1 x 10 8 UFC/ ml de la misma cepa a las 28 semanas de edad Los grupos A y C recibieron tres aplicaciones de una vacuna conteniendo la cepa 9R de S. gallinarum (Vacuna 9R) a la 4ta, 8va y 10ma semana de edad, mientras que los grupos B y D recibieron una aplicación de una vacuna inactivada de S. enteritidis en emulsión oleosa (Bacterina) a la 13va semana de edad. Adicionalmente los grupos A y B recibieron un producto de EC al día de edad en planta de incubación. En cada ensayo un grupo de aves que no recibió ninguna protección fue usado como control. El experimento se inició con la crianza de las aves en una granja comercial al norte de Lima bajo condiciones normales de manejo y bioseguridad. Las aves fueron trasladadas a la unidad experimental del Laboratorio de Patología Aviar de la FMV-UNMSM para el desafío y evaluación clínica por un periodo de observación de 22 días post reto. Fueron evaluados signos clínicos, mortalidad, lesiones, respuesta serológica y recuperación de la cepa de desafío. Para el análisis estadístico se usó la curva de supervivencia de Kaplan Meier y las diferencias estadísticas fueron evaluadas por Regresión de Cox. En ambos ensayos la mejor protección fue obtenida en los grupos vacunados con vacuna 9R sola o combinada con Exclusión competitiva (p<0.05). Diferencias estadísticas fueron observadas entre el grupo control y grupo A (vacuna 9R más EC) y grupo C (vacuna 9R). En ambos ensayos los grupos vacunados con bacterina sola o combinada con EC no fueron protegidos, no existiendo diferencias estadísticas con el grupo control (p>0.05). En el primer y segundo ensayo las aves del grupo A tuvieron una media de supervivencia significativamente diferente comparada con el grupo control y los grupos con bacterina y EC más bacterina (p<0.05). / The protective effect of the combined use of vaccination and competitive exclusion (CE) in layer hens experimentally challenged with a S. gallinarum field strain was evaluated. Two hundred Hyline Brown pullets since one day old and obtained from salmonella- free breeders were used. We divided this study in two trials in order to do two challenges in two different ages. Half of the birds were challenged at 18 weeks old (Trial 1) with 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum and half remained were challenged at 25 weeks old (Trial 2) with 1 x 108 UFC/ ml . The birds were divided in five groups of 20 birds each. The groups A and C received three applications of a live Salmonella gallinarum 9R strain vaccine (9R vaccine) at 4th , 8th and 10th weeks old subcutaneously. Groups B and D received a Salmonella enteritidis oil emulsion commercial bacterine (bacterine SE) at 13 weeks old, subcutaneously. Group E unvaccinated and without competitive exclusion was the control group. The study started with the birds breed in a commercial poultry farm at the north of Lima under normal management and bio security conditions .The birds were moved to the Avian Pathology Laboratory of the College of Veterinary Medicine, San Marcos University to challenge and clinic evaluation about 22 days post-challenge. Clinical signs, mortality rates, lesions, serologic response and field strain recovery were evaluated. Kaplan Meier design and Cox regression were used to determine statistical differences. In both trials the best protection was performed in 9R vaccine groups single or combined with CE. (p<0.05). Statistical differences were observed between the control group and group A (9R vaccine plus CE) and group C (9R vaccine) .In both trials the bacterine SE vaccinated groups were not protected and there were no differences with the control group (p>0.05). In trial 1 and 2 the group A had a higher survival mean than the control group and bacterine SE group and bacterine plus CE (p<0.05). / Tesis
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Characterization of the type VI protein secretion system encoded in the Salmonella pathogenicity island 19 and its role in the pathogenicity of serotypes Gallinarum and EnteritidisBlondel Buijuy, Carlos José January 2011 (has links)
Thesis Submitted in Partial Fulfillment for the Requirements to
achieve the Degree of PhD in Biochemistry / El genero Salmonella comprende a mas 2,500 serotipos conocidos distribuidos
en dos especies: enterica y bongori. Estos serotipos difieren mucho en términos de
patogenicidad y especificidad hospedero. Dos serotipos de Salmonella entérica son de
especial relevancia: los serotipos Gallinarum y Enteritidis.
S. Gallinarum presenta un rango hospedero restringido a aves y causa una
severa enfermedad sistémica conocida como tifoidea aviar, la que causa grandes
perdidas económicas en la producción aviar en distintas partes del mundo. S.
Enteritidis, en cambio, infecta a un amplio rango de hospederos incluyendo humanos,
ratones y aves. A diferencia de S. Gallinarum, S. Enteritidis genera una infección
subclinica en los pollos, y las aves infectadas pueden convertirse en portadores
crónicos, poniendo huevos contaminados por Salmonella. El consumo humano de
productos aviares o huevos resulta en un cuadro de gastroenteritis aguda autolimitante,
la cual es responsable por ~61% del 1.5 millones de casos de salmonelosis reportados
entre los años 1995 y 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country
Databank).
Existen pocos trabajos realizados sobre los mecanismos moleculares detrás de
la adaptación al hospedero aviar y sobre las implicancias clínicas de las infecciones
causadas por los serotipos Enteritidis y Gallinarum, sin embargo evidencia reciente
sugiere que estos serotipos poseen factores de virulencia no descritos que pueden ser
responsables de estas diferencias. La interación entre las bacterias y sus hospederos
es guiada por una comunicación dinámica que busca influenciar la respuesta del
hospedero. Dentro de las herramientas utilizadas por las bacterias para influir la
respuesta de sus hospederos, las maquinas secretoras que entregan proteínas y
toxinas hacia el ambiente intracelular de sus blancos eucariontes son cruciales para la
supervivencia y virulencia bacteriana. El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es un nuevo mecanismo de
translocación de proteínas que existe en la mayoría de bacterias Gram-negativo que se
encuentran en contacto íntimo con células eucariontes, incluyendo a aquellas que son
patógenos humanos y de plantas. El papel preciso que cumplen estos T6SS todavía es
desconocido pero es claro que cumple un papel importante en la virulencia bacteriana.
En Salmonella enterica, solo se ha descrito un T6SS el cual esta codificado en
la Isla de Patogenicidad 6 de Salmonella (SPI-6). En esta tesis, a través de análisis
bioinformaticos y de genomica comparativa se determinó que el genero Salmonella
codifica 5 T6SS, distribuidos diferencialmente entre distintos serotipos y con historias
evolutivas diferentes. Los nuevos T6SS fueron identificados en islas genómicas
designadas SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. Ademas de la identificación de estas
islas, una nueva proteína VgrG “evolucionada” con un dominio del tipo S-Piocina fue
identificado en SPI-21. La presencia de este dominio sugirió por primera vez un papel
de los T6SS en muerte bacteriana, abriendo un nuevo capitulo en el estudio de T6SS y
su papel en relaciones interbacterianas.
El T6SS de SPI-19 fue de especial relevancia debido a su amplia distribución
dentro de serotipos virulentos de Salmonella y porque análisis bioinformaticos
mostraron que mientras Gallinarum codifica un T6SS completo, el serotipo Enteritidis
solo codifica para remanentes de este sistema. A pesar de estar estrechamente
relacionados, los serotipos Gallinarum y Enteritidis presentan diferencias profundas en
su rango de hospederos y patogenicidad. Por lo tanto, es posible especular que la
presencia de un T6SS activo esta relacionada de alguna manera con las diferencias en
especificidad hospedero y patogenicidad presentada por estos dos serotipos. Para
resolver esta hipótesis y determinar la contribución de SPI-19 a la patogenicidad de
Salmonella, el objetivo de esta tesis fue determinar si la isla genomica SPI-19 codifica
un T6SS funcional que contribuye a la patogenicidad de Gallinarum y Enteritidis en el
hospedero aviar.
De manera de caracterizar el T6SS de SPI-19, fusiones génicas y de operon
fueron construidas y la expresión, producción y secreción de componentes del T6SS fueron evaluadas bajo diferentes condiciones de crecimiento in vitro. El análisis mostro
que la mayoría de los componentes se mantienen reprimidos bajo las condiciones
analizadas. Infección de macrófagos murinos con una cepa de Gallinarum con una
fusión entre el componente estructural/secretado VgrG al reportero GFP, mostró que
los componentes del T6SS son preferencialmente producidos al interior de células
infectadas. Mutantes por deleción no polares de la isla SPI-19 y componentes
específicos del T6SS reveló que este T6SS es necesario para la supervivencia de
Salmonella Gallinarum al interior de macrófagos a tiempos tardios de infección. Sin
embargo, el T6SS de SPI-19 no pudo ser asociado muerte celular o citotoxicidad de
macrófagos inducida por Salmonella.
Para determinar la contribución del T6SS de SPI-19 a la patogenicidad de
Salmonella, mutantes del T6SS fueron analizadas en ensayos de competencia contra
la cepa silvestre de Gallinarum. Infección oral de pollos White Leghorn de cuatro días
de edad, reveló que las mutantes del T6SS colonizaron pobremente el ileo, ciego,
hígado y bazo comparado a la cepa silvestre. Restitución de SPI-19 a la mutante SPI-
19, utilizando el sistema VEX-Capture, complementó este defecto en colonización.
Para analizar el impacto de poseer un T6SS completo en la habilidad de S. Enteritidis
para colonizar al hospedero aviar, la SPI-19 de Gallinarum fue transferida a Enteritidis.
Experimentos in vivo mostraron que la presencia de una SPI-19 completa aumento
significatvamente la habilidad de Enteritidis para colonizar el ileo, hígado y bazo de
pollos infectados al dia 1 post-infección. Sin embargo, esa ventaja en la colonización
no fue duradera ya que esta cepa mostró un fuerte defecto en la colonización desde el
día 3 post-infección hasta el final de los experimentos. Estos resultados sugieren que
transferencia de SPI-19 desde S. Gallinarum tiene un impacto negativo en la habilidad
de S. Enteritidis para colonizar el hospedero aviar. De esta forma podemos especular
que perdida del T6SS de SPI-19 corresponde a un evento patoadaptativo durante la
evolución de S. Enteritidis. Del mismo modo, este es el primer trabajo en el que se
utiliza el método VEX-Capture para determinar el efecto de la transferencia de islas
genómicas en un modelo animal de infección bacteriana. El reciente descubrimiento de Sistemas de Secreción Tipo VI (T6SS) ha abierto
un nuevo capitulo en el estudio de la adaptación de Salmonella hacia sus hospederos y
el medio ambiente. Si Salmonella codifica T6SS y si aquellos pueden ser considerados
eventos evolutivos cuanticos, fueron algunas de las preguntas que el descubrimiento
de los T6SS en los genomas bacterianos generó. En esta tesis, hemos expandido el
actual conocimiento sobre los T6SS bacterianos y el potencial patogénico de
Salmonella mediante: i) la identificación y descripción de 4 nuevas Islas de
Patogenicidad de Salmonella (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) que codifican para
T6SS filogenéticamente distintos, ii) el descubrimiento de una nueva “VgrG”
evolucionada que sugirió por primera vez un papel de los T6SS en relaciones
interbacterianas, iii) identificando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la supervivencia
intracelular de Salmonella en macrófagos y iv) determinando que el T6SS de SPI-19
contribuye a la colonización de pollos por S. Gallinarum. / The Salmonella genus includes over 2,500 known serotypes distributed between
the two species: enterica and bongori. These serotypes differ greatly in terms of
pathogenicity and host specificity. Two Salmonella enterica serotypes are of significant
relevance: serotypes Gallinarum and Enteritidis.
S. Gallinarum has a host range restricted to birds and causes a severe systemic
disease called fowl typhoid, which causes major economic losses in poultry production
in several parts of the world. S. Enteritidis on the other hand, infects a broad range of
hosts including humans, mice and avian species. In contrast to S. Gallinarum, S.
Enteritidis generates a subclinical infection in poultry, and infected hens can become
chronic carriers laying Salmonella contaminated eggs. Human consumption of
contaminated poultry or egg products results in an acute self-limiting gastroenteritis,
being responsible for ~61% of the estimated 1.5 million human salmonellosis cases
reported between 1995 and 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country
Databank).
There is little work done on the molecular mechanisms behind the differential
host-adaptation and clinical outcomes of infections caused by serotypes Enteritidis and
Gallinarum in their susceptible hosts, including birds, but recent evidence suggests that
these serotypes might possess undescribed virulence factors that may account for
these differences. Interaction between bacteria and hosts is guided by a
communication/signaling interplay which aims to influence the host response. Among
the tools used by bacteria to influence the host response, secretion machines that
deliver proteins and toxins into the environment and within eukaryotic target cells are
crucial for bacterial virulence and survival.
The Type VI Secretion System (T6SS) is a newly described mechanism for
protein translocation that exists in most Gram-negative bacteria that come into close
contact with eukaryotic cells, including plant and animal pathogens. The precise role and mode of action of T6SS is still unknown, but it is clear that plays an important role
in bacterial virulence.
In Salmonella enterica, only one T6SS encoded in Salmonella Pathogenicity
Island 6 (SPI-6) has been described. In this thesis, through bioinformatics and
comparative genomic analyzes it was determined that the genus Salmonella encodes 5
T6SS loci, differentially distributed among different serotypes and with distinct
phylogenetic histories. The novel T6SS loci were identified in genomic islands
designated SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. In addition of the identification of these
T6SS loci, a novel “evolved” VgrG protein with a S-Type Pyocin containing-domain, was
identified in SPI-21. The presence of this protein domain suggested for the first time a
role for T6SSs in bacterial killing opening a new chapter in the study of T6SS and its
role in inter-bacterial relationships.
The SPI-19 T6SS was of significant relevance due to its wide distribution among
virulent Salmonella serotypes and because bioinformatics analyzes showed that while
Gallinarum encodes a complete T6SS, serotype Enteritidis only encodes for remnants
of this system. Despite being closely related, serotypes Gallinarum and Enteritidis
present profound differences in their host-range and pathogenicity. Therefore, it is
tempting to speculate that the presence of an active T6SS is somehow related to the
host-adaptation and pathogenicity differences presented by these serotypes. To resolve
this hypothesis and assess the contribution of SPI-19 to Salmonella pathogenicity, the
objective of this thesis was to determine whether the SPI-19 genomic island encodes a
functional T6SS contributing to the pathogenicity of Gallinarum and Enteritidis in the
avian host.
In order to characterize the SPI-19 T6SS, gene and operon fusions were
constructed and expression, production and secretion of T6SS components were
evaluated under different in vitro growth conditions. The analysis showed that most
T6SS components remain repressed under the conditions tested. Infection of murine
macrophages with a Gallinarum strain harboring the structural/secreted T6SS
component VgrG fused to the GFP reporter showed that T6SS components are preferentially produced inside infected cells. Non-polar deletion mutants of the whole
SPI-19 and specific T6SS core components revealed that this T6SS was necessary for
Salmonella Gallinarum survival within macrophages at late time points after infection.
Furthermore, the SPI-19 T6SS function could not be linked to Salmonella-induced
cytotoxicity or cell death of infected macrophages.
To determine the contribution of SPI-19 T6SS to Salmonella pathogenesis,
T6SS mutants were tested in competitive infection assays against the wild-type
Gallinarum parental strain. Oral infection of four-day-old White Leghorn chicks revealed
that T6SS mutants colonized the ileum, ceca, liver and spleen poorly compared to the
wild-type strain. Restitution of SPI-19 to the ΔSPI-19 mutant, using VEX-Capture,
complemented this colonization defect. Altogether, the data indicate that SPI-19 and the
T6SS encoded therein contributes to macrophage intracellular survival and colonization
of chicks infected by S. Gallinarum. To assess the impact of carrying a complete T6SS
locus on the ability of S. Enteritidis to colonize the avian host, the SPI-19 from
Gallinarum was transferred to Enteritidis. In vivo experiments showed that presence of
a complete SPI-19 significantly increased the ability of Enteritidis to colonize the ileum,
liver and spleen of infected chicks by day 1 post-infection. This colonization advantage
was not lasting however, as this strain presented a strong colonization defect for each
organ analyzed from day 3 post infection to the conclusion of the experiment. These
results suggest that transfer of SPI-19 from S. Gallinarum has a negative impact on the
ability of S. Enteritidis to colonize the avian host. In this context is tempting to speculate
that loss of the SPI-19 T6SS corresponds to a pathoadaptative event during S.
Enteritidis evolution. In addition, this is the first report of the use of Vex-Capture method
to assess the effect of Genomic Island transfer in an animal model of bacterial infection.
The recent discovery of Type VI Secretion Systems (T6SS) has opened a new
chapter in the study of Salmonella host and environmental adaptation. Whether
Salmonella encodes T6SSs and whether they could be considered as quantum leap
evolution events are some of the questions that the discovery of T6SS in bacterial
genomes generated. In this thesis, we have expanded the current knowledge on
bacterial T6SSs and Salmonella virulence potential by: i) the identification and description of 4 novel Salmonella Pathogenicity Islands (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and
SPI-22) encoding phylogenetically distinct T6SS loci, ii) the discovery of a novel
“evolved” VgrG protein, which suggested for the first time a role for T6SSs in interbacterial
relationships, iii) identifying that the SPI-19 T6SS contributes to Salmonella
intracellular survival in macrophages and iv) determining that the SPI-19 T6SS
contributes to chicken colonization by S. Gallinarum.
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Rol del sistema de secreción tipo seis (T6SS) codificado en la isla SPI-19 de Salmonella enterica serovares Enteritidis y Gallinarum, en la interacción con macrófagosJiménez Romaguera, Juan Cristóbal January 2010 (has links)
Salmonella Enteritidis y Salmonella Gallinarum son dos patógenos importantes para el hospedero aviar. El primero causa infecciones silentes en aves de postura, lo que le permite infectar los huevos y tras el consumo de éstos, llegar al hospedero humano. El segundo, causa en el ave un cuadro de gastroenteritis severa y posterior tifoidea aviar, generando graves consecuencias económicas y productivas. Previamente, mediante herramientas bioinformáticas, identificamos una nueva isla de patogenicidad no caracterizada en cuatro serotipos distintos de Salmonella, entre ellos Gallinarum y Enteritidis. Esta fue nombrada isla de patogenicidad 19 de Salmonella (SPI-19), y codificaría para un sistema de secreción tipo VI (T6SS), un sistema de secreción de proteínas el cual se encuentra ampliamente distribuido entre las bacterias Gram negativo. S. Gallinarum posee codificado en la SPI-19 todos los genes esenciales para un T6SS funcional, mientras que S. Enteritidis posee una versión trunca de la isla, y sólo posee algunos genes del T6SS. Este sistema cumpliría una serie de funciones en los procesos patogénicos dependiendo de la bacteria, y hasta el momento se ha descrito su participaciòn en adherencia, invasión, citotoxicidad y proliferación intracelular. Al analizar filogenéticamente el T6SS codificado en SPI-19 se descubrió que se encontraba cercano a los sistemas codificados en bacterias como Vibrio cholerae y Aeromonas hydrophila. En estos patógenos ya se ha descrito un rol del T6SS en la interacción con células del sistema inmune, particularmente en la sobrevida y citotoxicidad en líneas celulares de macrófagos. Debido a que la capacidad de Salmonella para sobrevivir dentro de macrófagos es un proceso fundamental para su diseminación sistémica y colonización de órganos blanco, en esta memoria se propuso determinar el papel que cumple el T6SS codificado en SPI-19 en la interacción con macrófagos murinos. Para esto se estudió la capacidad de sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de mutantes en genes estructurales y efectores del T6SS. A su vez, se analizó la capacidad citotóxica de estas cepas. Los resultados muestran que mutantes de S. Gallinarum presentan una supervivencia menor a tiempos tardíos de infección. En S. Enteritidis la mutante para SPI-19 no presenta una disminución significativa de la sobrevida. En ambos serotipos no se presentan cambios en la citotoxicidad. También se estudió la expresión en la infección de macrófagos del efector VgrG mediante una fusión con el fluoróforo GFP. Esto reveló una rápida expresión de la fusión, lo que sugiere que el contacto bacteria-macrófago gatilla la expresión del efector. Estos resultados demuestran que la isla SPI-19 codifica para un T6SS funcional, que participa en un proceso esencial de la infección por Salmonella.
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Comparative population dynamics of wild and reared pheasants (Phasianus colchicus)Woodburn, Maureen I. A. January 1999 (has links)
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OriC vektorių kūrimas Mycoplasma gallinarum / Development of oric vectors for mycoplasma gallinarumRimavičiūtė, Reda 23 December 2014 (has links)
Mikoplazmų tyrimus apsunkina genetinių įrankių trūkumas. Ne išimtis ir Mycoplasma gallinarum – platų šeimininkų ratą turinti silpno patogeniškumo bakterija. Šiame darbe aprašomas pirmųjų M. gallinarum skirtų vektorių, į kurių sudėtį įeina chromosominė replikacijos pradžios sritis (oriC), kūrimas. Be to, šio tyrimo metu pirmą kartą pademonstruota sėkminga šios mikoplazmų rūšies transformacija. Iš šešių sukonstruotų vektorių penki replikavosi M. gallinarum ląstelėse, o šeštasis nebuvo funkcionalus dėl AT turtingoje srityje pasroviui nuo antrosios DnaA dėžutės atsiradusios mutacijos. Kai kurie vektoriai, kultivuojant transformantus in vitro, integravosi į chromosomą. Homologinės rekombinacijos dažnis dar labiau padidėjo po transformacijos ilgą laiką gaivinant ląsteles augimo terpėje be antibiotiko. Sukurti oriC vektoriai galėtų būti naudojami genetiniams M. gallinarum tyrimams, ypač genams inaktyvuoti ir ekspresuoti, bei suteiktų daugiau žinių apie molekulines šios bakterijos savybes. / Genetic studies of mycoplasmas are limited by the lack of a replicable vector system. Mycoplasma gallinarum, an opportunistic pathogen having a wide range of hosts, is not the exception. This study describes the identification and cloning of the M. gallinarum origin of replication (oriC) in order to construct the first vectors for this species. Additionally, this report provides the first evidence of the successful transformation of M. gallinarum. Five out of six developed vectors have been functional. The replication of the sixth vector has not been supported due to the mutation in the AT rich region downstream the second DnaA box. During in vitro passages, some vectors have been integrated into the chromosome. The rate of chromosomal integration has been even further increased by the lack of antimicrobial selection pressure during cultivation. Hence developed oriC plasmids are useful for genetic studies, including inactivation or expression of selected genes, in M. gallinarum, and lead to a better understanding of its molecular biology.
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Analyse des différences d'invasion cellulaire entre Salmonella gallinarum et Salmonella enteritidis, deux sérotypes génétiquement proches / Analysis of cellular invasion differences between Salmonella gallinarium and Salmonella enteridis, two genetically closed serotypesRossignol, Aurore 30 October 2014 (has links)
Salmonella Gallinarum (SG) et Salmonella Enteritidis (SE) sont deux sérotypes génétiquement proches. Pourtant, chez la volaille, SG induit une infection systémique létale tandis que SE est responsable d’une infection systémique transitoire et d’un portage intestinal asymptomatique. De plus, SE est un sérotype ubiquiste tandis que SG est spécifique d’hôte. Outre ces différences in vivo, ces deux sérotypes présentent des différences in vitro. Nous avons montré que SG est in vitro moins invasif que SE. Ce phénotype est indépendant de l’origine aviaire ou non-aviaire des cellules en dépit du tropisme de SG pour la volaille. LeT3SS-1, le facteur d’invasion majeur chez Salmonella, est composé d’un appareil de sécrétion et des effecteurs transloqués par celui-ci. Nous avons montré que les composants du T3SS-1 sont autant exprimés chez SG que chez SE et que tous deux possèdent un appareil de sécrétion fonctionnel. Pourtant, l’étude des capacités d’invasion dépendantes du T3SS-1 suggère que ce facteur est impliqué dans le défaut d’invasion de S. Gallinarum. L’analyse des gènes codant les effecteurs transloqués par le T3SS-1 a montré qu’il existe des mutations chez SG pouvant être à l’origine de ce défaut d’invasion. / Salmonella Gallinarum and Salmonella Enteritidis are genetically closed. However, whereas SG induces lethal systemic infection in poultry, SE is responsible for transient systemic infection and asymptomatic intestinal carriage. Moreover, SE is ubiquitous whereas SG is poultry specific. These serotypes also present in vitro differences. We have shown that SG is in vitro less invasive than SE whatever the avian or non-avian cell origin, in spite of SG’s tropism for avian species. T3SS-1, the main invasion factor in Salmonella, is composed of a secretion apparatus and its translocated effectors. We have shown that T3SS-1 components a expressed in a similar way by SE and SG and both harbor a functional secretion apparatus. However, study of T3SS-1 dependent invasion abilities suggested that T3SS-1 is involved in SG’s invasion defect. Sequence analysis has revealed that SG possesses several mutations in genes encoding main T3SS-1 effectors, that could explain the low invasive phenotype.
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Patogenicidade de Salmonella Gallinarum com deleção dos genes phoP e phoQ (SG∆phoPQ) em aves comerciais /Rodrigues Alves, Lucas Bocchini January 2017 (has links)
Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas Neto / Banca: Terezinha Knöbl / Banca: Marita Vedovelli Cardozo / Resumo: RESUMO - Salmonella Gallinarum (SG) é um patógeno hospedeiro-específico que causa o tifo aviário, doença sistêmica severa que é considerada uma das principais preocupações da indústria avícola mundial. Quando infecta a ave, SG utiliza mecanismos de evasão para sobreviver e replicar no interior de macrófagos. Nesse contexto, os genes phoPQ codificam o sistema regulatório de dois componentes (PhoPQ) que regula genes de virulência responsáveis pela adaptação de Salmonella spp. a fatores antimicrobianos como baixo pH, peptídeos antimicrobianos e baixas concentrações de cátions bivalentes. No presente estudo, objetivou-se investigar a função desses genes para SG. Assim, uma estirpe de SG com genes phoPQ defectivos (SG ∆phoPQ) foi construída e sua patogenicidade avaliada em aves poedeiras de 20 dias de vida susceptíveis ao tifo aviário. SG ∆phoPQ não causou sinais clínicos nem mortalidade em aves desafiadas oralmente, sendo não-patogênica. Ademais, essa estirpe não foi recuperada de fígados e baços. Por outro lado, aves desafiadas subcutaneamente com a estirpe mutante tiveram alterações patológicas discretas a moderadas e baixas contagens bacterianas em tecidos de fígado e baço. A partir dos dados, observa-se que SG ∆phoPQ é atenuado para aves o que sugere que ambos os genes são importantes durante a infecção sistêmica em aves por SG. / Abstract: ABSTRACT - Salmonella Gallinarum (SG) is a host-restrict pathogen that causes fowl typhoid, a severe systemic disease that is one of the major concerns to the poultry industry worldwide. When infecting the bird, SG makes use of evasion mechanisms to survive and to replicate within macrophages. In this context, phoPQ genes encode a two-component regulatory system (PhoPQ) that regulates virulence genes responsible for adaptation of Salmonella spp. to antimicrobial factors such as low pH, antimicrobial peptides and deprivation of bivalent cations. Herein, we aimed to investigate the role of the mentioned genes to SG. Thus, a phoPQ-depleted SG strain (SG ∆phoPQ) was constructed and its virulence assessed in twenty-day-old laying hens susceptible to fowl typhoid. SG ∆phoPQ did cause neither clinical signs nor mortality in birds orally challenged, being non-pathogenic. Furthermore, this strain was not recovered from livers or spleens. On the other hand, chickens challenged subcutaneously with the mutant strain had discreet to moderate pathological changes and also low bacterial counts in liver and spleen tissues. These findings show that SG ∆phoPQ is attenuated to susceptible chickens and suggest that both genes are important during chicken systemic infection by SG. / Mestre
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Importância do flagelo para a patogenicidade de Salmonella enterica subespécie Enterica Sorovar Gallinarum biovar GallinarumFreitas Neto, Oliveiro Caetano de [UNESP] 23 February 2012 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0
Previous issue date: 2012-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:05:16Z : No. of bitstreams: 1
freitasneto_oc_dr_jabo.pdf: 1961940 bytes, checksum: 7291da4800867b31fbd9a7d43c4a44cd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / S. Gallinarum (SG) provoca o tifo aviário, doença sistêmica com alta mortalidade em aves. Esse biovar é imóvel devido à falta de flagelos. Foi sugerido que a ausência de flagelo resultaria na indução de resposta pró-inflamatória de menor intensidade na mucosa intestinal, favorecendo o desenvolvimento da infecção sistêmica. Para investigar essa hipótese, um mutante de SG capaz de produzir flagelos (SG Fla+) foi construído. Analisou-se a capacidade deste mutante de invadir células epiteliais renais (CRGs), sobreviver em macrófagos da linhagem HD 11 e induzir a expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune nestas células, em conjunto com outras estirpes de Salmonella spp. Aliado a isso, comparou-se a patogenicidade de SG Fla+ e SG para aves de uma linhagem para postura comercial, avaliando-se a mortalidade e as alterações macroscópicas. Os resultados demonstraram que o flagelo aumentou a capacidade de invasão das estirpes para CRGs, mas não alterou a sobrevivência de SG Fla+ no interior dos macrófagos HD 11. SG Fla+ induziu a maior aumento da expressão de CXCLi2, IL-6 e de iNOS em CRGs que as estirpes sem flagelos (p<0,05). A expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune em macrófagos HD11 não esteve ligada a presença de flagelo. SG Fla+ provocou menores taxas de mortalidade que SG (p<0,05). Após 28 dias do desafio, SG Fla+ foi isolada no conteúdo de alguns cecos com alterações sugestivas de inflamação / S. Gallinarum (SG) is the causative agent of fowl typhoid, a systemic disease responsible for high mortality rates in birds. This biovar is non-motile due to the lack of flagella. It has been proposed that the absence of flagellum would provoke less pro-inflammatory immune response in the gut, favoring the development of systemic infection. In order to investigate this, a SG mutant strain capable of producing flagella (SG Fla+) was constructed. The capability of this mutant and other Salmonella spp. strains in invading chicken kidney cells (CKCs), surviving in HD 11 macrophages and inducing inflammatory responses in these cells were assessed. In adittion, the pathogenicity of SG Fla+ and SG was comparatively assessed in commercial laying hens. Mortality rates and gross lesions were evaluated. The results shown that flagellum increased the invasiveness of strains to CKCs while its presence did not change the survival of SG Fla+ in HD11 macrophages. SG Fla+ induced higher levels of CXCLi2, IL- 6 and iNOS gene expression than non-flagellated strains did (p<0.05). The expression of genes responsible for mediators of immune responses in infected HD11 macrophages were not related to the presence of flagella. SG Fla+ caused lower mortality rates than SG (p<0.05). SG Fla+ was recovered from the contents of caeca which presented inflammation-like macroscopic alterations not observed in birds infected with SG
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