Konstanz, Univ., Diplomarb., 2006.

Thesis (M. Sc.), Memorial University of Newfoundland, 1999. / Bibliography: p. 98-103.

3 ABSTRACT Freshwateramphipodsarepoordispersersduetothefragmentarynatureoftheir habitat,benthiclife-styleandlackofresistantpropagules.Consequently,mostspeciesare narrowlyendemic,andwidespreadmorphospeciesconsistofnumerousdivergentlineages. Assuch,thesepatternsareconsideredrelict, mainlyreflectinghistoricalratherthan contemporaryfactors.TheCarpathian Mountainsunderwentadramaticgeomorphological evolutionduringthelast20millionyears,risingfromtheParatethysSeathroughaseriesof islandsthateventuallycoalescedintooneofthelongest mountainchainsinEurope. Moreover,these mountainsandsurroundingbasinsareinhabitedbyaubiquitousand diverseamphipodfauna,providinganidealsettingfortestinghistoricalbiogeographical hypotheses.OurresultshaveshownthatinthesouthernhalfoftheCarpathians,montane Gammarus taxadisplayfragmentedandallopatricdistributionpatterns whilelowland speciesbelongingtothegeneraNiphargus andSynurella are mostlysympatricand widespreadoverlargedistances.Subsequent molecularinvestigationsrevealedthatthe patchydistributionofG.fossaruminthewesternandsouthwesternCarpathianshaslikely resultedfromthebreakupofaformerlycontiguouslandmass16 millionyearsago, suggestingthatgeologicalsubsidencecanplayanimportantroleinshapingbiogeographical patterns. Moreover,the WesternCarpathianlineagesineasternCzechiaandSlovakiaare...

Dans le cadre de l'évaluation de la qualité des écosystèmes aquatiques, les réponses en lien avec l'énergie semblent particulièrement pertinentes pour appréhender l'état physiologique des êtres vivants et prévoir des effets populationnels. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail a été de proposer un biomarqueur de l'assimilation de l'énergie chez un amphipode d'eau douce Gammarus fossarum. La caractérisation des activités enzymatiques digestives (amylase, cellulase et trypsine) et des réserves énergétiques (glycogène, lipides et protéines) soumises à l'influence de divers facteurs biotiques et abiotiques (sexe, stade reproducteur, température, conductivité et quantité de nourriture) a permis d'identifier l'amplitude des réponses étudiées afin d'améliorer l'interprétation des réponses obtenues en milieu naturel. Ces résultats ont également validé l'utilisation d'organismes mâles standardisés et nourris ad libitum dans le cadre d'approche active. D'autre part, la pertinence écologique des enzymes digestives en tant que biomarqueur a été évaluée en étudiant le lien existant entre une perturbation des réponses enzymatiques digestives au niveau sub-individuel et ses conséquences au niveau individuel sur le succès reproducteur des gammares. Par ailleurs, dans le cadre de deux campagnes de terrain, les mesures des activités enzymatiques digestives réalisées chez les organismes transplantés ont permis de discriminer les sites en fonction de leur qualité chimique et de proposer pour chaque marqueur une valeur référence et seuil traduisant un effet. Ainsi les activités enzymatiques digestives peuvent être utilisées comme outil pour établir un diagnostic de risque environnemental. / For the assessment of the aquatic ecosystems health, responses related to energy metabolism seem particularly relevant to understanding the physiological state of living organisms and provide population- effects. In this context, the objective of this work was to propose a biomarker of energy assimilation in a freshwater amphipod Gammarus fossarum. The characterization of digestive enzymes activities ( amylase , cellulase and trypsin) and energy reserves (glycogen , lipids and proteins) submited to the influence of various biotic and abiotic factors (sex, reproductive stage , temperature, conductivity and amount of food ) determine the range of responses studied to improve the interpretation of data obtained in the field. These results can also validate the use of standardized male fed ad libitum in caging approach. On the other hand, the ecological relevance of digestive enzymes was assess, the link between digestive enzyme impairments at sub -individual level and its consequences on the fitness of the gammarid population at individual level was established. Furthermore, in the context of two field campaigns, measures of digestive enzyme activities in organisms transplanted allowed to discriminate sites according to their chemical quality and to propose for each marker a benchmarck and a threshold value reflecting an effect. Thus, digestive enzyme activities can be used as diagnostic tool for environmental risk assessment.

Parmi les outils existants pour l'évaluation de la qualité des milieux aquatiques, les biomarqueurs permettent de détecter précocement l'exposition et/ou les effets d'une contamination. Toutefois, en raison du manque de connaissance fondamentale de leur régulation au niveau moléculaire, peu de biomarqueurs ont été spécifiquement développés chez les invertébrés, alors que ces derniers représentent 95% de la biodiversité animale. Grâce aux récentes avancées technologiques dans le domaine du séquençage de l'information génétique et protéique, la découverte de nouvelles protéines chez ces organismes est à présent possible. Centré sur l'utilisation d'une espèce d'intérêt en écotoxicologique, l'amphipode d'eau douce Gammarus fossarum, et sur la problématique de la perturbation endocrine, ce travail doctoral a pour objectif de découvrir de nouvelles protéines impliquées dans la reproduction du gammare et de proposer des biomarqueurs spécifiques de reprotoxicité. Par une première approche protéogénomique, un important catalogue de protéines a été généré. Puis, afin d'identifier de nouvelles protéines impliquées dans la reproduction, une comparaison entre les protéomes des tissus reproducteurs mâle et femelle a été réalisée, suivi de l'étude de la dynamique du protéome au cours de différents processus physiologiques : ovogénèse, embryogénèse et spermatogénèse. Enfin, une dernière expérience sur des organismes mâles exposés à différents perturbateurs endocriniens a permis d'identifier différents candidats biomarqueurs de reprotoxicité. Cette étude ouvre la voie à des développements rapides de biomarqueurs spécifiques d'une espèce animale d'intérêt en écotoxicologie / Among the tools for assessing biologic quality of aquatic ecosystems, biomarkers are ideally suited for the early detection of contaminant exposure and/or effects. Yet, because of the lack of fundamental knowledge of their molecular regulation, few specific developments have been carried out on invertebrates even though they account for more than 95% of animal biodiversity. Thanks to recent technological advances in nucleic and proteic information sequencing, discovery of new proteins is now possible for these organisms. Focussed on the use of an ecotoxicologically relevant species, the freshwater amphipod Gammarus fossarum and the problem of endocrine disruption, this doctoral thesis aims to discover new proteins involved in gammarid reproductive function and to propose specific biomarkers of endocrine disruption. With a first proteogenomic approach, an important protein catalogue was generated. Next, to identify proteins involved in gammarid reproduction, male and female reproductive tissue proteomes were compared, followed by the study of proteome dynamics in several physiological processes: oogenesis, embryogenesis and spermatogenesis. Finally, a last experiment on male gammarids challenged with different endocrine disrupter chemicals identified several candidate biomarkers of reprotoxicity. This study paves the way for quick developments of specific biomarkers for organisms of interest in ecotoxicology

Predator avoidance behaviors are a critical defense mechanism that can increase the chances of survival for potential prey species. We tested the avoidance behavior of the freshwater amphipod, Gammerus sp., under two different chemical predation cues. The first was the presence of kairomone, which was derived from a species of fish, Gambusia affinis, that was fed a diet exclusively of amphipods. The second predation cue was potential alarm cue derived from macerated conspecific amphipods from the same population as the test species. Response variables included time spent moving after the introduction to the signal as well as the time spent in refuge. Movement of amphipods significantly decreased and time spent in refuge significantly increased when amphipods were exposed to alarm cue as compared to control organisms that received no exposure to predation cues. Exposure to the fish kairomone treatments significantly increased time spent in the refuge but did not significantly influence time spent moving during the trials. These results suggest that amphipods exhibit predator avoidance behavior primarily when there is evidence that an attack has occurred (evidenced by the death of conspecifics within the population), but will also demonstrate avoidance behaviors to a lesser degree when a predator is detected.

L'utilisation en routine de biomarqueurs pour la biosurveillance environmentale présente plusieurs limitations, en particulier chez les invertébrés. Parmis ces limitations, la manque de biomarqueurs spécifiques et de approches multibiomarqueurs sont des contraintes majeurs. En se basant sur les catalogues de gènes et protéines obtenus à partir des études proteogénomiques réalisées antérieurement chez l'espèce clé en écotoxicologie Gammarus fossarum, cette thèse a visé l'identification et validation de biomarqueurs moléculaires pour le diagnostic de perturbations toxiques chez cette espèce. À la suite des méthodologies récentes pour le développement de biomarqueurs en santé humaine, nous avons mis en place un dosage multiplexé rapide et spécifique (en utilisant la spectrométrie de masse Selected Reaction Monitoring) pour quantifier simultanément des dizaines de candidats biomarqueurs protéiques. L'éssai a été appliqué pour l'évlauation de l'importance physiologique des candidats et de sa pertinence comme biomarqueurs à travers des expositions à des polluants chimiques au laboratoire et sur le terrain. Le deuxième axe de cette thèse a visé le développement de biomarqueurs spécifiques d'une perturbation endocrinienne via deux approches. La première approche, basée sur un étude de protéomique comparative avec un perturbateur endocrinien connu chez les arthropodes, a permis d'augmenter l'exhaustivité dans le suivi du protéome avec la détection d'environ 4000 protéines (dont 53 modulés par l'exposition). La deuxième approche a compris des recherches d'homologies de séquence, des analyses phylogénétiques, et des études d'expression de gènes pour proposer des candidats biomarqueurs / The routine use of biomarkers in environmental biomonitoring faces several drawbacks, especially in invertebrates. Among these limitations, the lack of validated species-specific biomarkers and multibiomarker methodologies comprise major constraints. Based on gene and protein catalogs obtained from proteogenomics experiments previously performed on the ecotoxicological-relevant species Gammarus fossarum, this thesis aimed at identifying and validating molecular biomarkers for the diagnostic of toxic perturbations in this species. Following recent methodologies for the development of biomarkers in human disease diagnosis, we implemented a fast, specific, quantitative multiplexed targeted proteomics assay (using Selected Reaction Monitoring mass spectrometry) to study dozens of protein biomarker candidates simultaneously. The assay was applied to assess the physiological importance of protein candidates, and to assess their pertinence as biomarkers after laboratory and field exposures to chemical contamination. The second part of this thesis aimed at the development of specific endocrine disruption biomarkers, through two complementary approaches. The first approach, based on a comparative shotgun proteomic analysis using a known endocrine disruptor for arthropods, allowed exhaustively increasing the whole-proteome analysis through the detection of roughly 4000 proteins (53 modulated by the exposure). The second comprised sequence homology searches, phylogenetic analyses, and gene expression studies for proposing new biomarker candidates identified from literature searches

Parmi les substances polluantes, les perturbateurs endocriniens (PE) sont au coeur des préoccupations scientifiques en raison du risque de ces composés pour l'environnement, et en particulier les écosystèmes aquatiques. L'étude de la disponibilité et de l'impact des PE sur les vertébrés aquatiques, en particulier les poissons, a fait l'objet de nombreux projets et publications. Ces travaux ont conduit au développement d'outils de diagnostic pouvant être utilisés in situ, comme par exemple l'induction de la vitellogénine (Vg) chez les mâles, l'inhibition de la croissance ovarienne et testiculaire, le retard dans la maturité sexuelle, la présence d'individus intersexués et les concentrations anormales en hormones stéroïdiennes. En revanche, peu d'attention a été portée aux invertébrés qui représentent pourtant plus de 95 % des espèces animales et jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement et la santé des écosystèmes aquatiques. Par conséquent, il en résulte un manque d'outils spécifiques de la perturbation endocrinienne chez ces espèces. Dans ce contexte, le travail proposé se focalise tout d'abord sur l'intérêt et la pertinence de la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) pour développer ou transférer entre espèces une méthode de mesure de la Vg chez les invertébrés, incluant les crustacés, les mollusques et les insectes. Ensuite, ce travail s'est intéressé à un crustacé amphipode modèle (Gammarus fossarum) et avait pour objectifs (1) de développer le biomarqueur Vg, via la validation de son rôle fonctionnel dans la reproduction (vitellogenèse, embryogenèse et différences inter-sexe), de sa sensibilité à des composés modèles et jusqu'à son utilisation dans le cadre d'études de terrain à l'aide d'organismes encagés et (2) de développer l'utilisation d'une approche chez la femelle permettant de caractériser le potentiel PE de composés et des systèmes aquatiques, à partir de l'étude de marqueurs individuels / Among pollutants, endocrine disruptors (ED) are in central scientific preoccupation because of the risks of these compounds to the environment, in particular for aquatic ecosystems. The availability and impact study of ED on aquatic vertebrates, in particular fishes, was the subject of many projects and papers. These studies led to the development of diagnostic tools, such as vitellogenin (Vg) induction in male organisms, inhibition of ovarian and testicular growth, delayed sexual maturity, presence of intersex individuals and abnormal concentrations of steroid hormones. However, little attention was paid to invertebrates which account for more than 95% of animal species and play an essential role in functioning and health of aquatic ecosystems. Therefore, the result is a lack of specific tools for endocrine disruption assessment in these species. In this context, the proposed work focuses first on the interest and relevance of mass spectrometry (LC-MS/MS) to develop and to transfer among species a method for measuring Vg in invertebrates species, including crustaceans, molluscs and insects. Then, this work has focused on a model amphipod crustacean (Gammarus fossarum) and aims were (1) to develop the Vg biomarker, through the validation of its functional role in reproduction (vitellogenesis, embryogenesis and inter-sex differences), its sensitivity towards model compounds and to its use in field monitoring, using caged organisms and (2) develop a biotest in the female to assess the ED risk of chemical compounds and aquatic systems, by studying and measuring individual markers

In recent years, due to the development of molecular methods, a great level of cryptic diversity across multiple taxa was discovered. One of these groups are freshwater amphipods. Amphipods due to lower dispersal and recolonization abilities present a suitable model system for studying potential ecological interactions among genetically distant lineages during their secondary contact. In this thesis, I studied the cryptic species complex Gammarus fossarum in a contact zone of several genetically divergent lineages known from the previous research in the Vsetin region. I focused on two main questions: Firstly, whether there are preferences among individuals from different lineages for sexual partners from the same lineage rather than from the different one (i.e., I test for the potential existence of prezygotic reproduction barrier between the lineages). I tested this hypothesis by collecting pairs from natural contact zone and also (in a limited extent) by an aquarium experiment. Secondly, I tested whether these lineages differ in mesohabitat (pool versus riffle) distribution in syntopy, which may indicate competition among lineages and potential diversification of their ecological niches. Animals from nine localities (with expected contact of two lineages per locality) were examined. In more than...

L'utilisation du biote dans le suivi de la contamination métallique des milieux aquatiques est aujourd'hui une approche pertinente, car elle permet (i) de répondre aux difficultés analytiques liées à la présence des métaux à faible dose dans l'eau, (ii) d'intégrer la contamination dans le temps et (iii) de renseigner sur la biodisponibilité des métaux et leur potentiel toxique. Toutefois, l'interprétation des niveaux de contamination des organismes en termes de contamination biodisponible des milieux est difficile car elle dépend de facteurs confondants (physicochimiques et biologiques). Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse est d'étudier la variabilité des capacités de bioaccumulation des métaux par voie dissoute chez le gammare, en s'appuyant sur un modèle cinétique. Des expérimentations en laboratoire ont permis d'étudier l'influence de facteurs physicochimiques (cations majeurs de l'eau) et biologiques (histoire de vie) sur les constantes d'accumulation et d'élimination du modèle pour le Cd, le Cu, le Ni et le Pb. Les résultats de ces travaux ont montré l'importance de prendre en compte l'influence des teneurs calciques du milieu et la pré-exposition des gammares à certains métaux dans l'interprétation de la bioaccumulation. Des suivis de la contamination dans des gammares transplantés in situ à l'échelle de la France ont montré les limites du modèle pour relier la contamination du milieu à celle des organismes. Ainsi, pour une meilleure caractérisation de la contamination biodisponible des milieux, il est nécessaire d'approfondir les connaissances sur l'influence d'autres facteurs physicochimiques et sur l'importance de la voie trophique comme source de contamination biodisponible pour les gammares / The use of biota in order to monitor metallic contamination in freshwaters is a relevant tool to (i) overcome difficulties of measuring low concentrations in water, (ii) integrate metal fluctuations over time and, (iii) quantify the bioavailable fraction of metals, considered as potentially toxic. However, the interpretation of metal contents in aquatic organisms in terms of bioavailable contamination in freshwaters remains complex because it depends on confounding factors (physicochemical and biotic factors). In this context, the aim of this work was to study the variability of waterborne metal bioaccumulation abilities in gammarids, using the kinetic model. In the laboratory, the influence of water chemistry (major ions) and biological factors (local acclimation) on the accumulation and elimination rate constants of the kinetic model was assessed. The results showed that the consideration of calcium concentrations in water and the pre-exposure of gammarids to some metals were crucial for a reliable interpretation of bioaccumulation. Meanwhile, metal contamination was followed in transplanted gammarids at the national-scale (France) and showed the limits of kinetic modelling to link metal contamination in water to bioaccumulation. Therefore, to better characterize the bioavailable contamination in freshwaters, it is necessary to further study the influence of other physicochemical factors, such as temperature, and the importance of food as a source of bioavailable metals for gammarids