Os tumores de glândula mamária, à semelhança do que ocorre na espécie humana, são as neoplasias que mais comumente acometem as fêmeas caninas, sendo os cães apontados como importante modelo de estudo desta doença. Com cerca da metade dos tumores mamários caninos considerados malignos, um problema crucial no manejo deste tipo de neoplasia é a busca por fatores prognósticos que auxiliem na escolha do tratamento adjuvante e na predição do curso clínico da doença, uma vez que neoplasias de baixo grau de malignidade , podem apresentar curso agressivo, contrariando os indicadores prognósticos clínicos usuais. Este trabalho teve por objetivo estudar alterações genéticas e epigenéticas em neoplasias mamárias de fêmeas caninas, buscando também avaliar seu valor prognóstico de sobrevida. Para tanto, neoplasias mamárias espontâneas de cães foram colhidas e classificadas de acordo com o tipo e grau histológico, além do imunofenótipo, obtido da marcação de ERα, PR, HER2 e Ki67. O padrão de metilação global do DNA e o perfil de expressão gênica dos marcadores tumorais BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram correlacionados com aqueles parâmetros. Para o estudo do padrão de metilação global do DNA foram utilizados 109 fragmentos de tecido mamário neoplásico, conservados em parafina, oriundos do arquivo do Hospital Veterinário da Universidade Metropolitana de Santos. Para imunofenotipagem e estudo imunoistoquímico da expressão de BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram colhidos em estudo prospectivo 78 fragmentos de tecido mamário neoplásico e não neoplásico, provenientes de 70 fêmeas da espécie canina com diagnóstico clínico de neoplasia mamária e que foram submetidas a tratamento cirúrgico. O material assim obtido foi conservado em nitrogênio líquido, para os estudos de expressão de RNAm por qPCR e em blocos de parafina, para os estudos histopatológicos e imunoistoquímicos. O estadiamento clínico mostrou-se fator prognóstico importante, assim como diâmetro tumoral, grau histológico do tumor, uso de quimioterapia adjuvante e recorrência. Os estudos epigenéticos demonstraram que o padrão de metilação do DNA independe do tipo histológico do tumor e de seu grau histológico, guardando correlação apenas com o grau de malignidade dos tumores; no entanto, este marcador demonstrou-se interessante previsor de recidiva tumoral, com diferença estatística significativa entre os animais que apresentaram recidiva e aqueles que não a apresentaram. Nos estudos de imunofenotipagem, foi possível observar por meio da técnica de imunoistoquímica que, tanto a expressão de ERα quanto de PR nas fêmeas caninas guardam, à semelhança da mulher, relação com o estado reprodutivo e hormonal das pacientes. Também foi observado que os marcadores ERα, PR e HER2 em sua maioria se correlacionam com o tipo e grau histológico quando transformados em variável categórica; porém, não apresentam valor prognóstico de sobrevida. No entanto, Ki67 demonstrou forte correlação com tipo e grau histológico dos tumores, com a presença de linfonodos positivos e metástase pulmonar, apresentando-se como fator prognóstico independente nas neoplasias mamárias caninas. Na busca por candidatos a marcadores tumorais, observou-se que, em sua maioria, os marcadores BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 não apresentaram correlação com tipo e grau histológico do tumor; porém, FGFR2 mostrou-se fator prognóstico de sobrevida para as fêmeas caninas portadoras de neoplasia. A finalidade de estudos integrados que correlacionem aspectos clínicos, morfológicos e moleculares das neoplasias é avançar em seu conhecimento e obter novas perspectivas para o sucesso no tratamento destas doenças. Esperamos que, com este trabalho, tenhamos contribuído para atingir estes objetivos. / Tumors of the mammary gland, similar to what occurs in the human species, are the most common cancers that affect the female dogs, being this species pointed out as an important model for the study of this disease. With about half of canine mammary tumors considered malignant, a crucial issue in the management of this type of cancer is the search for prognostic factors that assist in the choice of adjuvant therapy and in predicting the clinical course of the disease, since low-grade neoplasms malignancy can present aggressive course, contrary to the usual clinical prognostic indicators. This work aimed to study genetic and epigenetic changes in mammary tumors in female dogs, seeking also to evaluate its prognostic value for survival. For this purpose , spontaneous mammary tumors of dogs were collected and classified according to the histological type and grade, plus the immunophenotype obtained by evaluating ERα, PR , HER2 and Ki67 . The pattern of global DNA methylation and gene expression of tumor markers BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 profile were correlated with those parameters . Pattern of DNA global methylation was studied in 109 formalin-fixed paraffin-embedded neoplastic mammary tissue, obtained from the archives of the Veterinary School Hospital of the Universidade Metropolitana de Santos. Immunophenotyping and immunohistochemical study of the expression of BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 were performed in a prospective study with 78 fragments of neoplastic and non-neoplastic mammary tissue from 70 female dogs, with clinical diagnosis of mammary cancer and that underwent surgical treatment. The material was stored in liquid nitrogen for studies of mRNA expression by qPCR and in paraffin for histopathological and immunohistochemical studies. Clinical staging was an important prognostic factor, as well as tumor size, histological and tumor grade, use of adjuvant chemotherapy and recurrence. Epigenetic studies have shown that the pattern of DNA methylation is independent of the histological and tumor grade, keeping, however, correlation with the degree of malignancy of the tumors and interesting predictor value for tumor recurrence. Immunophenotyping studies showed that both ERα and PR expression, like in women, presented correlation with reproductive and hormonal status of the patients. It was also observed that ERα, PR and HER2 tumor markers mostly correlate with histological type and grade when considered a categorical variable, but they have not shown any prognostic survival value. However Ki67 showed strong correlation with histological type and grade of the tumors, the presence of positive lymph nodes and lung metastasis, and can be considered an independent prognostic factor in canine mammary tumors. In search for candidates for tumor markers, we found that, mostly BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 markers showed no correlation with histological type and grade of the tumor, although FGFR2 showed prognostic survival value for female dogs affected by breast cancer. The purpose of integrated studies correlating clinical, morphological and molecular aspects of cancer is to gain further knowledge and to glimpse new perspectives for success in treating these diseases. We hope that with this work, we have contributed to achieve these goals.

Os tumores de glândula mamária, à semelhança do que ocorre na espécie humana, são as neoplasias que mais comumente acometem as fêmeas caninas, sendo os cães apontados como importante modelo de estudo desta doença. Com cerca da metade dos tumores mamários caninos considerados malignos, um problema crucial no manejo deste tipo de neoplasia é a busca por fatores prognósticos que auxiliem na escolha do tratamento adjuvante e na predição do curso clínico da doença, uma vez que neoplasias de baixo grau de malignidade , podem apresentar curso agressivo, contrariando os indicadores prognósticos clínicos usuais. Este trabalho teve por objetivo estudar alterações genéticas e epigenéticas em neoplasias mamárias de fêmeas caninas, buscando também avaliar seu valor prognóstico de sobrevida. Para tanto, neoplasias mamárias espontâneas de cães foram colhidas e classificadas de acordo com o tipo e grau histológico, além do imunofenótipo, obtido da marcação de ERα, PR, HER2 e Ki67. O padrão de metilação global do DNA e o perfil de expressão gênica dos marcadores tumorais BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram correlacionados com aqueles parâmetros. Para o estudo do padrão de metilação global do DNA foram utilizados 109 fragmentos de tecido mamário neoplásico, conservados em parafina, oriundos do arquivo do Hospital Veterinário da Universidade Metropolitana de Santos. Para imunofenotipagem e estudo imunoistoquímico da expressão de BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 foram colhidos em estudo prospectivo 78 fragmentos de tecido mamário neoplásico e não neoplásico, provenientes de 70 fêmeas da espécie canina com diagnóstico clínico de neoplasia mamária e que foram submetidas a tratamento cirúrgico. O material assim obtido foi conservado em nitrogênio líquido, para os estudos de expressão de RNAm por qPCR e em blocos de parafina, para os estudos histopatológicos e imunoistoquímicos. O estadiamento clínico mostrou-se fator prognóstico importante, assim como diâmetro tumoral, grau histológico do tumor, uso de quimioterapia adjuvante e recorrência. Os estudos epigenéticos demonstraram que o padrão de metilação do DNA independe do tipo histológico do tumor e de seu grau histológico, guardando correlação apenas com o grau de malignidade dos tumores; no entanto, este marcador demonstrou-se interessante previsor de recidiva tumoral, com diferença estatística significativa entre os animais que apresentaram recidiva e aqueles que não a apresentaram. Nos estudos de imunofenotipagem, foi possível observar por meio da técnica de imunoistoquímica que, tanto a expressão de ERα quanto de PR nas fêmeas caninas guardam, à semelhança da mulher, relação com o estado reprodutivo e hormonal das pacientes. Também foi observado que os marcadores ERα, PR e HER2 em sua maioria se correlacionam com o tipo e grau histológico quando transformados em variável categórica; porém, não apresentam valor prognóstico de sobrevida. No entanto, Ki67 demonstrou forte correlação com tipo e grau histológico dos tumores, com a presença de linfonodos positivos e metástase pulmonar, apresentando-se como fator prognóstico independente nas neoplasias mamárias caninas. Na busca por candidatos a marcadores tumorais, observou-se que, em sua maioria, os marcadores BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 e GATA3 não apresentaram correlação com tipo e grau histológico do tumor; porém, FGFR2 mostrou-se fator prognóstico de sobrevida para as fêmeas caninas portadoras de neoplasia. A finalidade de estudos integrados que correlacionem aspectos clínicos, morfológicos e moleculares das neoplasias é avançar em seu conhecimento e obter novas perspectivas para o sucesso no tratamento destas doenças. Esperamos que, com este trabalho, tenhamos contribuído para atingir estes objetivos. / Tumors of the mammary gland, similar to what occurs in the human species, are the most common cancers that affect the female dogs, being this species pointed out as an important model for the study of this disease. With about half of canine mammary tumors considered malignant, a crucial issue in the management of this type of cancer is the search for prognostic factors that assist in the choice of adjuvant therapy and in predicting the clinical course of the disease, since low-grade neoplasms malignancy can present aggressive course, contrary to the usual clinical prognostic indicators. This work aimed to study genetic and epigenetic changes in mammary tumors in female dogs, seeking also to evaluate its prognostic value for survival. For this purpose , spontaneous mammary tumors of dogs were collected and classified according to the histological type and grade, plus the immunophenotype obtained by evaluating ERα, PR , HER2 and Ki67 . The pattern of global DNA methylation and gene expression of tumor markers BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 profile were correlated with those parameters . Pattern of DNA global methylation was studied in 109 formalin-fixed paraffin-embedded neoplastic mammary tissue, obtained from the archives of the Veterinary School Hospital of the Universidade Metropolitana de Santos. Immunophenotyping and immunohistochemical study of the expression of BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 were performed in a prospective study with 78 fragments of neoplastic and non-neoplastic mammary tissue from 70 female dogs, with clinical diagnosis of mammary cancer and that underwent surgical treatment. The material was stored in liquid nitrogen for studies of mRNA expression by qPCR and in paraffin for histopathological and immunohistochemical studies. Clinical staging was an important prognostic factor, as well as tumor size, histological and tumor grade, use of adjuvant chemotherapy and recurrence. Epigenetic studies have shown that the pattern of DNA methylation is independent of the histological and tumor grade, keeping, however, correlation with the degree of malignancy of the tumors and interesting predictor value for tumor recurrence. Immunophenotyping studies showed that both ERα and PR expression, like in women, presented correlation with reproductive and hormonal status of the patients. It was also observed that ERα, PR and HER2 tumor markers mostly correlate with histological type and grade when considered a categorical variable, but they have not shown any prognostic survival value. However Ki67 showed strong correlation with histological type and grade of the tumors, the presence of positive lymph nodes and lung metastasis, and can be considered an independent prognostic factor in canine mammary tumors. In search for candidates for tumor markers, we found that, mostly BRCA1, BRCA2, ERRα, ERRβ, ERRγ, FGFR2 and GATA3 markers showed no correlation with histological type and grade of the tumor, although FGFR2 showed prognostic survival value for female dogs affected by breast cancer. The purpose of integrated studies correlating clinical, morphological and molecular aspects of cancer is to gain further knowledge and to glimpse new perspectives for success in treating these diseases. We hope that with this work, we have contributed to achieve these goals.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Medicine. Title from title page of PDF (viewed 2008/05/09). Includes bibliographical references.

Early prosensory specification to develop competence in the otic epithelium is disrupted by mutations of Eya1, Pax2, Sox2, Jag1, and Gata3. Mutations in these genes apparently disrupt sensory competence and may affect Atoh1 upregulation, a gene known to be necessary for sensory cell differentiation within the ear. How these genes interact with each other and other factors within the genetic network of the ear to refine and restrict sensory specification and impart competence to the developing organ of Corti is not known. These genes also interact with other factors expressed adjacent to or within the developing organ of Corti and provide the context to allow prosensory cells, after cell cycle exit, to appropriately respond to Atoh1 expression and differentiate as hair cells. Gata3 is expressed throughout the early placode. As ear development continues Gata3 is restricted to all prosensory areas except that of the saccule. In addition, it is expressed in a subset of delaminating neuroblasts. Gata3 continues to be highly expressed in the cochlear sensory epithelia as cells differentiate, and is expressed in all cells of the organ of Corti through adult. The human disorder caused by haploinsufficiency of Gata3 is known as Hypoparathyriodism, Deafness, and Renal dysplasia syndrome, and has been linked in mice to early hair cell death. I investigated the role of Gata3 in cochlear neurosensory specification utilizing a mouse Gata3 knockout model and a conditionally deleted Gata3 line combined with two cre driver lines (Foxg1cre and Pax2cre). Although both cre lines are expressed in the inner ear with only a slight difference in onset of expression there are major phenotypic differences. While the Foxg1cre:Gata3f/f deletion resulted in an ear closely matching that of the null mutant with a cochlear duct devoid of neurosensory cells, the Pax2cre:Gata3f/f cochlear duct contained patches of partially differentiated hair cells. Through the use of qRT-PCR and in situ hybridization of both mutants I was able to paint a picture of how Gata3 interacts with other prosensory genes to upregulate downstream genes. In particular, Atoh1, was downregulated but not absent with the loss of Gata3. Indicating that Gata3 is one of a set of factors necessary for the proper upregulation of Atoh1 in the cochlea.

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-12. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:14:17Z : No. of bitstreams: 1 000866541.pdf: 1198385 bytes, checksum: 265d4dc3d78da2996e89f94af5e66b2d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundação Paulista Contra a Hanseníase / hanseníase é uma doença de caráter complexa causada pelo Mycobacterium leprae, que é um patógeno intracelular obrigatório com predileção por macrófagos na pele e células de Schwann nos nervos periféricos. O genoma altamente conservado do bacilo sugere que o patógeno não seja o responsável pela variedade de fenótipos clínicos e biológicos observada na doença, atribuindo grande importância aos fatores genéticos do hospedeiro. Estudos de ligação do tipo genome-wide apontaram um locus de susceptibilidade para a doença na região cromossômica 10p13 e o gene GATA3, localizado na região 10p15, é um forte candidato a fazer parte dessa associação devido à sua localização no genoma e ao seu papel na resposta imune. O GATA-3 é um fator de transcrição clássico na diferenciação de células Th2, no entanto, sabe-se hoje que essa proteína possui outras funções importantes para o sistema imune. Nós empregamos a estratégia de estudo de associação do tipo caso-controle em série, utilizando duas amostras populacionais do Brasil com 1.633 indivíduos, para testar sete variantes genéticas do GATA3. Um estudo funcional também foi conduzido para avaliar o efeito dos polimorfismos associados sobre a expressão de GATA-3 e produção de citocinas. O alelo A do polimorfismo rs10905284 foi associado com resistência para a hanseníase em ambas as amostras. Na análise combinando as duas amostras este efeito do alelo A foi confirmado (OR 0,67; IC95%: 0,54-0,84; p=0,0004). A análise funcional mostrou que os indivíduos portadores do genótipo AA expressam altos níveis da proteína GATA-3 nos linfócitos. Portanto, nós confirmamos que o marcador rs10905284 está associado à hanseníase na população brasileira e influencia os níveis de expressão do fator de transcrição GATA-3 / Leprosy outcome is a complex trait and the host-pathogen-environment interaction defines the emergence of the disease. The causative agent of the disease, Mycobacterium leprae, exhibits a conserved genome and could not be accountable for the variety of outcomes observed from exposition, infection and disease. Thus, host genetic risk factors have been successfully associated to leprosy. The 10p13 chromosomal region was linked to leprosy in familial studies and the GATA3 gene is a strong candidate to be part of this association due to its locus and the role that exerts in the immune response. The GATA-3 is a transcription factor involved in the Th2 cell differentiation, however, today it is recognized the ample role of this protein in the immune response. Here, we applied a stepwise strategy to test genetic variants at GATA3 in two case-control samples from Brazil comprising a total of 1,633 individuals. A functional investigation was also conducted to evaluate the effect of the polymorphisms on the GATA-3 protein and the cytokines production. The A allele of rs10905284 marker was associated to leprosy resistance in both samples. In the analysis combining the two samples this effect was reinforced (OR 0,67; CI95%: 0,54-0,84; p=0,0004). The functional analysis showed that individuals carrying AA genotype express higher levels of GATA-3 protein in lymphocytes. So, we confirmed that the rs10905284 is a locus associated to leprosy in the Brazilian population and influences the levels of this transcription factor.

Orientador: Ana Carla Pereira Latini / Coorientador: Vânia Nieto Brito de Souza / Banca: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Banca: Milton Ozório Moraes / Resumo: hanseníase é uma doença de caráter complexa causada pelo Mycobacterium leprae, que é um patógeno intracelular obrigatório com predileção por macrófagos na pele e células de Schwann nos nervos periféricos. O genoma altamente conservado do bacilo sugere que o patógeno não seja o responsável pela variedade de fenótipos clínicos e biológicos observada na doença, atribuindo grande importância aos fatores genéticos do hospedeiro. Estudos de ligação do tipo genome-wide apontaram um locus de susceptibilidade para a doença na região cromossômica 10p13 e o gene GATA3, localizado na região 10p15, é um forte candidato a fazer parte dessa associação devido à sua localização no genoma e ao seu papel na resposta imune. O GATA-3 é um fator de transcrição clássico na diferenciação de células Th2, no entanto, sabe-se hoje que essa proteína possui outras funções importantes para o sistema imune. Nós empregamos a estratégia de estudo de associação do tipo caso-controle em série, utilizando duas amostras populacionais do Brasil com 1.633 indivíduos, para testar sete variantes genéticas do GATA3. Um estudo funcional também foi conduzido para avaliar o efeito dos polimorfismos associados sobre a expressão de GATA-3 e produção de citocinas. O alelo A do polimorfismo rs10905284 foi associado com resistência para a hanseníase em ambas as amostras. Na análise combinando as duas amostras este efeito do alelo A foi confirmado (OR 0,67; IC95%: 0,54-0,84; p=0,0004). A análise funcional mostrou que os indivíduos portadores do genótipo AA expressam altos níveis da proteína GATA-3 nos linfócitos. Portanto, nós confirmamos que o marcador rs10905284 está associado à hanseníase na população brasileira e influencia os níveis de expressão do fator de transcrição GATA-3 / Abstract: Leprosy outcome is a complex trait and the host-pathogen-environment interaction defines the emergence of the disease. The causative agent of the disease, Mycobacterium leprae, exhibits a conserved genome and could not be accountable for the variety of outcomes observed from exposition, infection and disease. Thus, host genetic risk factors have been successfully associated to leprosy. The 10p13 chromosomal region was linked to leprosy in familial studies and the GATA3 gene is a strong candidate to be part of this association due to its locus and the role that exerts in the immune response. The GATA-3 is a transcription factor involved in the Th2 cell differentiation, however, today it is recognized the ample role of this protein in the immune response. Here, we applied a stepwise strategy to test genetic variants at GATA3 in two case-control samples from Brazil comprising a total of 1,633 individuals. A functional investigation was also conducted to evaluate the effect of the polymorphisms on the GATA-3 protein and the cytokines production. The A allele of rs10905284 marker was associated to leprosy resistance in both samples. In the analysis combining the two samples this effect was reinforced (OR 0,67; CI95%: 0,54-0,84; p=0,0004). The functional analysis showed that individuals carrying AA genotype express higher levels of GATA-3 protein in lymphocytes. So, we confirmed that the rs10905284 is a locus associated to leprosy in the Brazilian population and influences the levels of this transcription factor. / Mestre

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The first definitive haematopoietic stem cells (HSCs) produced during embryonic development are generated from a specialised subset of endothelial cells known as haemogenic endothelium. Recently, it was reported that Gata3 plays a dual role in the development of sympathetic nervous system and haematopoietic system. In fact, Gata3 has proven to be crucial for the production of HSCs through regulation of catecholamine production from the co-developing sympathetic nervous system. Also, it was recently shown that Gata3 is expressed in the haemogenic endothelium and haematopoietic progenitor cells. Here, I will specifically examine the role of Gata3 in the production of HSCs; if it is expressed and plays a role in the precursors from which HSCs arise. Using a Gata3-GFP reporter mouse line, we found that Gata3 is expressed in various cell types in the HSCs microenvironment, including mesenchymal cells, endothelial cells, haematopoietic cells and sympathetic nervous system, and this expression was stage dependant. In the endothelial cells, we have found that the haemogenic endothelium activity is enriched in Gata3 expressing cells. Within the haematopoietic cells, we have found that Gata3 marks a specific stage along the developmental pathway towards the generation of definitive haematopoietic stem cells, and that Gata3 expressing haematopoietic cells are enriched for the most immature and stem cell like progenitors. Moreover, Gata3 will be specifically knocked out in haemogenic endothelial cells to determine whether it plays an essential role in the production of HSCs from the endothelium using the Vec-Cre system. We found that Gata3 within the haemogenic endothelium plays a major role in haematopoietic progenitors formation, and possibly haematopoietic stem cell formation. Finally, we used molecular assay (RNA seq) to identify the role of Gata3 in the haematopoietic stem cell microenvironment and found that Gata3 plays a major role in the development and differentiation of various cells and systems, and implicated Gata3 as cell cycle regulator. In summary, we found that Gata3 expressing cells is enriched for haemogenic endothelium, crucial for the haematopoietic progenitors formation, plays and important role in endothelial to haematopoietic transition, and plays a key developmental role in both haematopoietic stem cell and its microenvironment.