Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / En las últimas dos décadas se ha registrado un incremento significativo en la detección de cepas hipervirulentas y multi-resistentes del patógeno bacteriano Klebsiella pneumoniae, lo cual estaría ligado con el alto dinamismo y la rápida evolución de su genoma. Dentro de los elementos genéticos móviles (EGMs) que determinan dicho dinamismo se encuentran las islas genómicas (IGs), que corresponden a fragmentos de DNA de hasta 200 kb que se integran preferentemente en genes que codifican tRNAs (tDNAs). Se ha demostrado que las IGs de K. pneumoniae y otras enterobacterias portan una gran variedad de genes relacionados con virulencia y resistencia a antibióticos, por lo que su identificación y caracterización a partir del creciente número de genomas secuenciados de esta especie resulta altamente relevante. En esta dirección, el presente trabajo describe el desarrollo de una herramienta para identificar IGs asociadas a tDNAs que se basa en el análisis del contexto genómico de dichos genes, es decir, la organización e identidad de los genes que se encuentran adyacentes en el cromosoma. En una primera etapa, el programa identifica los tDNAs y su contexto para luego clasificarlos y nombrarlos. En una segunda etapa, el programa analiza la continuidad del contexto genómico conservado de cada tDNA y determina la presencia de IGs cuando una disrupción es identificada. El programa creado, se utilizó para analizar el genoma de 50 cepas de K. pneumoniae, donde los resultados obtenidos fueron comparados con la identificación de IGs realizada manualmente y curada en un estudio previo realizado por nuestro grupo. Como resultado, se logró identificar correctamente un 99,3% de todos los tDNAs presentes en dichas cepas, además de 303 IGs de un total de 308 IGs detectadas manualmente. Adicionalmente, el programa mostró un desempeño satisfactorio, aunque mejorable en la detección de integrasas y repetidos directos, detectando ambos elementos en 148 de las IGs identificadas. Finalmente, se comparó el desempeño del programa desarrollado y otros programas para la identificación de IGs en la detección y delimitación de la isla GIE492 caracterizada experimentalmente en un trabajo previo de nuestro grupo, determinando que la detección hecha por el programa desarrollado por nuestro grupo es más sensible y precisa que cualquiera de los otros programas utilizados. / In the last two decades, there has been a significant increase in the detection of hypervirulent and multi-resistant strains of the bacterial pathogen Klebsiella pneumoniae, which would be related to the high dynamism and rapid evolution of its genome. Within the mobile genetic elements (EGMs) that determine this dynamism are Genomic Islands (IGs), which correspond to DNA fragments up to 200 kb that are preferentially integrated into genes encoding tRNAs (tDNAs). It has been shown that IGs from K. pneumoniae and other species from Enterobacteriaceae carry a wide variety of genes related to virulence and antimicrobial drug resistance. Thus, their identification and characterization among the increasing number of sequenced genomes from this species is highly relevant. In this direction, this work describes the development of a bioinformatics tool intended to identify IGs associated to tDNAs based on the analysis of the genomic context of these genes, that is, the organization and identity of the genes that are adjacent to tDNAs in the chromosome. In the first step, the program identifies all the tDNAs and their contexts to classify and name them. In a second step, the program analyzes the continuity of the conserved genomic context for each tDNA, determining the presence of a putative IG when a disruption of such continuity is detected. Our program was used to analyze the genome of a set of 50 K. pneumoniae strains, where the results obtained were compared with the identification of IGs performed and cured manually in a previous study conducted by our group. As a result, 99.3% of all the tDNAs present in the strains were correctly identified. Also, the software predicted 303 IGs from a total of 308 IGs detected manually. Additionally, the program showed a good performance in the identification of integrases and direct repeats, detecting both elements in 148 of the IGs, although there is still room for improvement. Finally, we compared the performance of our software and other programs for the identification of IGs, in the detection and precise delimitation of the xi GIE492 island, which was characterized experimentally in a previous work of our group. We determined that the detection made by our program was more sensitive and precise than any of the other programs tested.

Barrantes Santamaría, W. (2014). Desarrollo de una genoteca de líneas de introgresión entre Solanum lycopersicum y Solanum pimpinellifolium utilizando herrramientas genomicas de alto rendimiento y detección de QTLs implicados en calidad de fruto [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/39102 / TESIS

El melón (Cucumis melo) y el calabacín (Cucurbita pepo) son especies cucurbitáceas de gran importancia económica a nivel nacional y mundial. Para optimizar su producción se requiere de la obtención de nuevas variedades mejor adaptadas a los sistemas de cultivo, más resistentes frente a nuevas enfermedades o plagas y con mejores características organolépticas, que respondan a las cada vez mayores exigencias del mercado. La mejora debe realizarse de una forma eficiente y competitiva, apoyándose en los crecientes conocimientos genéticos en estas dos especies y en los últimos avances biotecnológicos. El desarrollo de herramientas genómicas con el fin de impulsar la mejora de estos cultivos es el principal objetivo de la presente Tesis doctoral. El desarrollo de marcadores moleculares es esencial para la construcción de mapas genéticos, para la realización de una selección más eficiente, para el análisis y cartografía de QTLs (Quantitative trait loci) y para el desarrollo de líneas de premejora, además de ser una herramienta fundamental para el análisis de la biodiversidad. En esta Tesis se han desarrollo y/o validado marcadores de alta calidad, de tipo microsatélite (Simple Sequence Repeats, SSRs) y SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), para estas dos especies. La generación de información de secuencia, necesaria para el desarrollo de este tipo de marcadores, ha cambiado en el transcurso de los trabajos presentados en la Tesis, habiéndose abordado finalmente la secuenciación del transcriptoma de melón mediante técnicas de secuenciación de alto rendimiento (NGS, Next generation sequencing). La obtención de grandes colecciones de SSRs y SNPs en ambas especies, resultado del ensamblaje de ESTs (Expressed Sequence Tags) procedentes de secuencias Sanger previamente disponibles y de las nuevas secuencias obtenidas por secuenciación masiva, ha supuesto un gran avance para estas especies no modelo, permitiendo la construcción de mapas más densos en melón y del primer mapa ba / Esteras Gómez, C. (2012). Desarrollo y aplicación de herramientas genómicas para la mejora de especies cucurbitáceas por calidad y resistencia a enfermedades [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/17046 / Palancia

Entender el genoma es un desafío de primer nivel, y esto se debe en gran parte a la gran cantidad de información existente en el dominio. Gracias a la aplicación de tecnologías NGS (Next-Generation Sequencing) se han generado enormes cantidades de datos -nuevos-, por lo que es fundamental construir estructuras que permitan organizar, procesar y explorar los datos con el fin de lograr un máximo provecho de la información y mejorar la comprensión del genoma humano. En este estudio se define un marco de trabajo centrado en el uso del Modelado Conceptual como estrategia esencial para la búsqueda de soluciones. En el campo médico este enfoque de desarrollo de software está ganando impulso por su impacto en el trabajo realizado por genetistas, laboratorios clínicos y bioinformáticos. Entender el genoma es un dominio de aplicación muy interesante debido a dos aspectos fundamentales: 1) en primer lugar, por las implicaciones sociológicas que supone plantearse la posibilidad de entender el lenguaje de la vida. 2) y, en segundo lugar, desde una perspectiva más práctica de aplicación en el ámbito clínico, debido a su repercusión en la generación de diagnósticos genómicos, los cuales juegan un papel importante dentro de la Medicina de Precisión. En esta Tesis Doctoral se propone utilizar un Modelo Conceptual del Genoma Humano (MCGH) como base fundamental para la generación de Sistemas de Información Genómicos (GeIS), con el objetivo de facilitar una conceptualización del dominio que permita i) alcanzar un conocimiento preciso del dominio y ii) ser capaces de llegar a una medicina de precisión (personalizada). Es importante resaltar que este Modelo Conceptual debe permanecer en constante crecimiento debido a los nuevos aportes que surgen en la comunidad científica. En este trabajo de investigación se presenta la evolución natural del modelo, así como un ejemplo de extensión del mismo, lo que permite comprobar su extensibilidad conservando su definición inicial. Además, se aplica el uso de una metodología (SILE) sistemática para la obtención de los datos desde los distintos repositorios genómicos, los cuales serán explotados a través herramientas software basadas en modelos conceptuales. Mediante el uso de este Modelo Conceptual holístico del Genoma Humano se busca comprender y mejorar el compromiso ontológico con el dominio -genómico-, y desarrollar Sistemas de Información Genómicos apoyados en Modelo Conceptuales para ayudar a la toma de decisiones en el entorno bioinformático. / Understanding the genome is a first level challenge, and this is due in large part to a large amount of information in the domain. Thanks to the application of NGS (Next-Generation Sequencing) technologies, enormous amounts of -new- data have been generated, so it is essential to building structures that allow organizing, processing and exploring the data in order to obtain maximum benefit from the information and improve the understanding of the human genome. In this study we define a framework focused on the use of Conceptual Modeling as an essential strategy for finding solutions. In the medical field, this approach to software development is gaining momentum due to its impact on the work carried out by geneticists, clinical laboratories, and bioinformatics. Understanding the genome is a domain of very interesting application due to two fundamental aspects: 1) firstly, because of the sociological implications of considering the possibility of understanding the language of life. 2) secondly, from a more practical perspective of application in the clinical field, due to its repercussion in the generation of genomic diagnoses, which play an important role within Precision Medicine. In this PhD, it is proposed to use a Conceptual Model of the Human Genome (CMHG) as the fundamental basis for the generation of Genomic Information Systems (GeIS), with the aim of facilitating a conceptualization of the domain that allows i) to achieve a precise knowledge of the domain and ii) be able to increase and improve the adaptation of genomics in personalized medicine. It is important to highlight that this Conceptual Model must remain in constant growth due to the new contributions that arise in the scientific community. In this research work the natural evolution of the model is presented, as well as an example of its extension, which allows verifying its extensibility while preserving its initial definition. In addition, the use of a systematic methodology is applied to obtain the data from the different genomic repositories, which will be exploited through software tools based on conceptual models. Through the use of this Holistic Conceptual Model of the Human Genome, we seek to understand and improve the ontological commitment to the -genomic- domain, and develop GeIS supported in Conceptual Model to help decision making in the bioinformatic environment in order to provide better treatment to the patients. / Entendre el genoma és un desafiament de primer nivell, i açò es deu en gran part a la gran quantitat d'informació existent en el domini. Gràcies a l'aplicació de tecnologies NGS (Next-Generation Sequencing) s'han generat enormes quantitats de dades - nous-, per la qual cosa és fonamental construir estructures que permeten organitzar, processar i explorar les dades a fi d'aconseguir un màxim profit de la informació i millorar la comprensió del genoma humà. En este estudi es definix un marc de treball centrat en l'ús del Modelatge Conceptual com a estratègia essencial per a la busca de solucions. En el camp mèdic este enfocament de desenvolupament de programari està guanyant impuls pel seu impacte en el treball realitzat per genetistes, laboratoris clínics i bioinformàtics. Entendre el genoma és un domini d'aplicació molt interessant a causa de dos aspectes fonamentals: 1) en primer lloc, per les implicacions sociològiques que suposa plantejar-se la possibilitat d'entendre el llenguatge de la vida. 2) i, en segon lloc, des d'una perspectiva més pràctica d'aplicació en l'àmbit clínic, a causa de la seua repercussió en la generació de diagnòstics genòmics, els quals juguen un paper important dins de la Medicina de Precisió. En esta Tesi Doctoral es proposa utilitzar un Model Conceptual del Genoma Humà (MCGH) com a base fonamental per a la generació de Sistemes d'Informació Genòmics (GeIS), amb l'objectiu de facilitar una conceptualització del domini que permeta i) aconseguir un coneixement precís del domini i ii) ser capaços d'arribar a una medicina de precisió (personalitzada). És important ressaltar que este Model Conceptual ha de romandre en constant creixement degut a les noves aportacions que sorgixen en la comunitat científica. En este treball d'investigació es presenta l'evolució natural del model, així com un exemple d'extensió del mateix, la qual cosa permet comprovar la seua extensibilitat conservant la seua definició inicial. A més, s'aplica l'ús d'una metodologia (SILE) sistemàtica per a l'obtenció de les dades des dels distints reposadors genòmics, els quals seran explotats a través ferramentes de programari basades en models conceptuals. Per mitjà de l'ús d'este Model Conceptual holístic del Genoma Humà es busca comprendre i millorar el compromís ontològic amb el domini -genòmic-, i desenvolupar Sistemes d'Informació Genòmics recolzats en Model Conceptuals per ajudar a la presa de decisions en l'entorn bioinformàtic. / Reyes Román, JF. (2018). DISEÑO Y DESARROLLO DE UN SISTEMA DE INFORMACIÓN GENÓMICA BASADO EN UN MODELO CONCEPTUAL HOLÍSTICO DEL GENOMA HUMANO [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/99565 / TESIS

Esta tesis se interesa por distinguir entre los efectos directos de los receptores nucleares y aquellos mediados por las rutas de transducción de señales en la transcripción de genes en respuesta a hormona y proliferación celular. Para esto, nosotros hemos expresado establemente en una línea celular T47Dy desprovista de PR, formas variantes marcadas de la isoforma B del PR en regiones involucradas bien en la unión al DNA(PRB-DBD), en su habilidad para interaccionar con ER y activar la cascada c-Src/Erk (PRB-ERID), o la incapacidad de reclutar coactivadores. La expresión génica en respuesta a progesterona en líneas celulares expresando los PRB salvaje y mutantes ha sido estudiada un microarray con 750 genes de cáncer de mama. Los resultados definen conjuntos de genes regulados en respuesta a hormona por los diferentes modos de acción del PRB, también genes dónde las rutas nucleares y no genómicas cooperan. Por último, se ha centrado la atención en la participación del gen Ciclina D1 (CCND1) en proliferación celular por hormona, el modo de acción del PR en su activación y el análisis de las regiones promotoras dónde PR se une. / This these is interested on distinguishing between direct effects of nuclear receptors and those mediated by signal transduction pathways on transcription of hormone-responsive genes and cell proliferation. For this, it stablies expressed in the PR-negative T47Dy breast cancer cell line, tagged forms of the PRB mutated at regions involved either in DNA binding, in its ability to interact with ER and activate the c-Src/Erk cascade, or the recruitment of coactivators. Gene expression in response to progestins in cell lines expressing wild type or mutant PRB has been studied by a 750 genes-containing breast cancer customized cDNA microarray. Our results define the subsets of hormoneresponsive genes regulated by the different modes of action of PRB, as well as genes where the nuclear and nongenomic pathways of PRB cooperate. Finally, it has focused the attention on the involvement of Cyclin D1 gene (CCND1) activation by hormone on cell proliferation, the mode of action of PR on its activation and the analysis of promoter regions where PR binds.

Tesis por compendio / [ES] La longevidad de las semillas, o el tiempo durante el cual permanecen las semillas viables, es de gran importancia para la conservación de la biodiversidad, la agricultura y la economía. Además, el estudio de este parámetro puede contribuir a conocer mejor los mecanismos moleculares comunes a todos los organismos para prevenir el envejecimiento. Una de las principales estrategias de las semillas para ralentizar su envejecimiento consiste en detener su metabolismo, a través de su deshidratación. Otros mecanismos moleculares para evitar daños son el aislamiento frente al entorno a través de la cubierta de la semilla, y la producción de antioxidantes y otras moléculas para evitar el daño oxidativo, uno de los principales causantes del envejecimiento de las semillas. Los mecanismos de reparación mitigan parte del daño acumulado. El organismo modelo de plantas Arabidopsis thaliana brinda la oportunidad de la realización de estudios genómicos para el estudio de, en este caso, la longevidad de las semillas para descubrir nuevos factores genéticos y mecanismos moleculares determinantes. Este conocimiento servirá para entender mejor los procesos de deterioro de las semillas y que también será clave para aumentar la longevidad de estas. Mediante el uso de variedades naturales genotipadas de Arabidopsis thaliana y un estudio de asociación del genoma conocido como GWAS, seguido de estudios de genética reversa, se han identificado 12 nuevos genes relacionados con la longevidad de las semillas, relacionados con la protección del embrión, el control del daño oxidativo, y la permeabilidad de la cubierta de la semilla. El desarrollo de la cubierta de la semilla está determinado por factores de transcripción. Plantas mutantes en diversos factores de transcripción involucrados en el desarrollo de la cubierta de la semilla presentan una longevidad alterada. La sobreexpresión de los factores de transcripción AtHB25 y COG1 provoca que las semillas presenten una mayor longevidad debido a una incrementada deposición de poliésteres lipídicos. Estas barreras de poliésteres lipídicos son la cutícula, formada por cutina, y la suberina. Ambas participan positivamente en la protección del embrión frente al ambiente exterior. Estudios genómicos de ambos factores de transcripción han demostrado que AtHB25 regula directamente a enzimas biosintéticos de los monómeros de suberina y cutina, y COG1 regula la expresión de enzimas relacionados con la polimerización de poliésteres lipídicos y lignina. La regulación en la que participa AtHB25 es muy importante debido a la alta conservación de las secuencias genómicas y funciones de AtHB25 en angiospermas, y parece involucrado en la respuesta a bajas temperaturas. Por otra parte, COG1, que está involucrado en la percepción de luz, regula parte del desarrollo del tegumento externo a través de la regulación de AP2, un factor clave en el establecimiento de la identidad de tejido de este tegumento de la cubierta de la semilla, donde se localiza la suberina. AtHB25 y COG1 están involucrados en la adaptación de la longevidad de la semilla a través de señales ambientales como la temperatura y la luz, respectivamente, regulando la deposición de poliésteres lipídicos. / [CAT] La longevitat de les llavors, o el temps que romanen les llavors viables, es de gran importància per la conservació de la biodiversitat, l'agricultura i l'economia. A més a més, l'estudi d'aquest paràmetre pot contribuir a conèixer millor els mecanismes moleculars comuns a tots els organismes per prevenir l'envelliment. Una de les principals estratègies de les llavor per retardar el seu envelliment consisteix detenir el seu metabolisme, mitjançant la seua deshidratació. Altres mecanismes moleculars per evitar danys son el seu aïllament de l'entorn per mitjan de la coberta de la llavor, i la producció d'antioxidants i altres molècules per evitar el dany oxidatiu, un dels principal causants del envelliment de les llavors. Els mecanismes de reparació mitiguen part del dany acumulat. L'organisme model Arabidopsis thaliana brinda la oportunitat de la realització d'estudis genòmics per a l'estudi de, en aquest cas, la longevitat de les llavors per descobrir nous factors genètics y mecanismes moleculars determinants. Aquest coneixement servirà per entendre millor els processos de deteriorament de les llavor i serà clau per augmentar la longevitat d'aquestes. Mitjançant l'ús de varietats naturals genotipades d'Arabidopsis thaliana i un estudi d'associació del genoma conegut com GWAS, seguits d'estudis de genètica inversa, s'han identificat 12 nous gens relacionats amb la longevitat de les llavors, relacionats amb la protecció de l'embrió, el control del dany oxidatiu, y la permeabilitat de la coberta de la llavor. El desenvolupament de la coberta de la llavor està determinada per factors de transcripció. Plantes mutants a diversos factors de transcripció involucrats al desenvolupament de la coberta de les llavors presenten una longevitat alterada. La sobreexpressió dels factors de transcripció AtHB25 i COG1 provoca que les llavors presenten una major longevitat degut a una deposició de polièsters lipídics incrementada. Aquestes barreres de polièsters lipídics son la cutícula, formada per cutina, i la suberina. Ambdues participen positivament la protecció de l'embrió enfront de l'entorn exterior. Estudis genòmics d'ambdós factors de transcripció han demostrat que AtHB25 directament regula a enzims biosintètics dels monòmers de suberina i cutina i COG1 regula enzims relacionats amb la polimerització de polièsters lipídics i lignines. La regulació en la que participa AtHB25 es molt important degut a l'alta conservació de les seqüències genòmiques i funcions de AtHB25 en angiospermes, i parteix estar involucrat en la resposta a baixes temperatures. Per altra banda, COG1, que està involucrat en la percepció de la llum, regula part del desenvolupament del integument extern mitjançant la regulació de AP2, un factor clau en l'establiment de la identitat de teixit de aquest integument de la coberta de la llavor, on es localitza la suberina. AtHB25 i COG1 estan involucrats en l'adaptació de la longevitat de la llavor per mitjan de senyals ambientals com la temperatura i la llum, respectivament, regulant la deposició de polièsters lipídics. / [EN] Seed longevity, or period that seeds remain viable, is important for biodiversity conservation, agriculture and economy. In addition, the study of this parameter could ease the knowledge about molecular mechanisms common to all organisms to prevent aging. One of the main strategies of seeds to reduce their aging consists to stop their metabolism, through drying. Other molecular mechanisms to avoid damages are the isolation from the environment with the seed coat, and the production of antioxidants and other molecules to avoid oxidative damage, one of the main seed aging causes. Repair mechanisms relieve part of the accumulated damage. The model plant Arabidopsis thaliana provides the opportunity to carry out genomic studies for the research of, in this case, seed longevity to discover determinant genetic factors and molecular mechanisms. This will serve to better understand seed deterioration processes and it will be key to increase seed longevity. Using natural genotyped varieties of Arabidopsis thaliana and a genome-wide association study (GWAS) followed by reverse genetic studies, 12 new genes related to seed longevity have been identified. They are related to embryo protection, oxidative damage control, and seed coat permeability. Seed coat development is determined by transcription factors. Mutant plants in some transcription factors involved in the seed coat development present altered seed longevity. The over-expression of the transcription factors AtHB25 and COG1 resulted in seeds with increased longevity due to an increased lipid polyester deposition. These lipid polyesters barriers are the cuticle, formed by cutin, and the suberin layer. Both participate positively in the embryo protection from the external environment. Genomic studies of both transcription factors have revealed that AtHB25 directly regulates biosynthetic enzymes of suberin and cutin monomers, and COG1 regulates the expression of enzymes related to the polymerization of lipid polyesters and lignin. The regulation involving AtHB25 is crucial due to the high conservation of genomic sequences and functions of AtHB25 in angiosperms, and it seems to be involved in the response to low temperatures. On the other hand, COG1, which is involved in light perception, regulates part of the development of the external integument through its regulation by AP2, a key factor in establishing the tissue identity of this seed coat integument, where suberin is located. AtHB25 and COG1 are involved in seed longevity adaptation through environmental signals such as temperature and light, respectively, regulating lipid polyesters deposition. / Agradezco a las instituciones públicas la inversión en investigación. Gracias a ella, los laboratorios, el personal y los distintos equipos se han podido financiar. Gaetano fue quien me ayudó enormemente conseguir la beca FPI del Ministerio de Economía y Competitividad BES-2015-072096, asociada al proyecto de investigación nacional BIO2014-52621-R-AR / Renard Meseguer, J. (2021). Identification of genes related to seed longevity in Arabidopsis thaliana using genomic molecular techniques [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/170554 / TESIS / Compendio