Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-07T17:05:41Z No. of bitstreams: 1 2016_MariellaGuimarãesLacerda_Parcial.pdf: 695400 bytes, checksum: 931fc2db604d882e4490459f2b57037d (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-24T16:47:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MariellaGuimarãesLacerda_Parcial.pdf: 695400 bytes, checksum: 931fc2db604d882e4490459f2b57037d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T16:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MariellaGuimarãesLacerda_Parcial.pdf: 695400 bytes, checksum: 931fc2db604d882e4490459f2b57037d (MD5) / Os organoestânicos são um grupo de compostos formados por um átomo de estanho ligado covalentemente a um ou mais grupamentos orgânicos. Dentre estes, o mais estudado é o cloreto de tributilestanho (TBT), um poluente ambiental com atividade desreguladora endócrina. No entanto, há poucos estudos com outros organoestânicos, como por exemplo, os dibutilestanho (DBT). O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do diacetato, dicloreto, dilaurato e maleato de DBT sobre a atividade transcricional dos receptores nucleares PPARγ e RXRα e sobre a adipogênese e a inflamação em cultura de células de mamíferos. De forma semelhante ao cloreto de TBT, em ensaios de gene repórter, foi observado que o diacetato, o dicloreto, o dilaurato e o maleato de DBT são agonistas parciais do PPARγ. Ao contrário do cloreto de TBT, agonista total do RXRα, o dicloreto e o dilaurato de DBT são agonistas parciais do RXRα. Além disso, a introdução da mutação C285S, que impede a ligação do cloreto de TBT ao PPARγ, aboliu a atividade transcricional deste receptor induzida por todos os compostos, sugerindo que eles se ligam ao PPARγ de modo similar ao cloreto de TBT. Em pré-adipócitos 3T3-L1, todos os DBTs induziram a adipogênese via PPARγ, embora em menor intensidade que a rosiglitazona e o cloreto de TBT. Este efeito foi confirmado pela expressão dos marcadores adipogênicos Fabp4, Adipoq e Glut4. O co-tratamento das células 3T3-L1 com os DBTs e o T0070907, antagonista específico de PPARγ, reduziu o acúmulo lipídico, sugerindo que este efeito adipogênico ocorre via PPARγ. Além disso, o dicloreto, o dilaurato e o maleato de DBT reprimiram a expressão de genes associados à resposta inflamatória, tais como o Dcn, Fn1 e Vcam1, apesar desses efeitos terem sido menos intensos que o da rosiglitazona e do cloreto de TBT. De maneira interessante, em células RAW 264.7, apenas o cloreto de TBT e o dilaurato de DBT diminuíram a expressão de TNFα induzida por LPS. Esses achados mostram que o diacetato, o dicloreto, o dilaurato e o maleato de DBT são agonistas parciais do PPARγ. Ainda, o cloreto de TBT e os compostos de DBT induzem a adipogênese e reprimem genes associados à resposta inflamatória em cultura de células de mamíferos. / Organotins is a group of different chemical compounds that have a tin atom covalently bound to one or more organic groups. The best studied organotin is tributyltin chloride (TBT chloride) which is environmental pollutant and an endocrine disruptor. However, there are few studies with other organotin compounds, such as dibutyltin (DBT). The aim of this study was to investigate the effect of DBTs diacetate, dichloride, dilaurate, and maleate on the transcriptional activity of the nuclear PPARγ and RXRα receptors, and on adipogenesis and inflammation in mammalian cell cultures. Analogous to TBT chloride, in reporter gene assay, it was observed that DBTs diacetate, dichloride, dilaurate, and maleate are partial agonists of PPARγ. Unlike TBT chloride, which is a full agonist of RXRα, DBTs dichloride, and dilaurate are partial RXRα agonists. Additionally, the introduction of the C285S mutation, which disrupts TBT chloride binding to PPARγ, abrogated the DBTs compounds transcription activity, suggesting that these compounds binds to PPARγ in the same binding pocket as TBT chloride. In preadipocytes 3T3-L1 cells, all DBTs induced adipogenesis in a PPARγ-dependent manner, although slighter than rosiglitazone and TBT chloride. This effect was confirmed by the expression of adipogenic markers such as Fabp4, Adipoq, and Glut4. Co-treatment of 3T3-L1 cells with DBTs and T0070907, a specific PPARγ antagonist, reduced fat accumulation, suggesting that this adipogenic effect occurs through PPARγ. Furthermore, DBTs dichloride, dilaurate, and maleate inhibited the expression of inflammatory response-related genes such as Dcn, Fn1, and Vcam1, even though these effects were weaker than rosiglitazone and TBT chloride. Interesting, in RAW 264.7 cells, TNFα expression induced by LPS was diminished only by TBT chloride and DBT dilaurate. These findings indicate that DBTs diacetate, dichlorate, dilaurate, and maleate are PPARγ partial agonists. Furthermore, TBT chloride and DBTs compounds induce adipogenesis and repress inflammatory response-related genes in mammalian cell cultures.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-08T19:05:49Z No. of bitstreams: 1 2017_SimoneBatistaPiresSinoti_PARCIAL (2).pdf: 2462859 bytes, checksum: 39e1c4881cdc7de4274ac75c5279b0d9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-06T20:34:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_SimoneBatistaPiresSinoti_PARCIAL (2).pdf: 2462859 bytes, checksum: 39e1c4881cdc7de4274ac75c5279b0d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-06T20:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_SimoneBatistaPiresSinoti_PARCIAL (2).pdf: 2462859 bytes, checksum: 39e1c4881cdc7de4274ac75c5279b0d9 (MD5) Previous issue date: 2017-10-06 / A obesidade afeta grande parte da população mundial, tornando-se um fator de risco para doenças como hipertensão, doenças cardiovasculares e diabetes tipo 2. Além da alimentação, fatores genéticos e estilo de vida, a obesidade pode estar associada à exposição de poluentes químicos capazes de funcionar como desreguladores endócrinos (DE). O cloreto de tributilestanho (TBTC) caracterizado como DE é capaz de ativar os receptores nucleares PPARy e RXR, promovendo a adipogênese. Neste contexto, este estudo investigou os efeitos diretos do TBTC no metabolismo de camundongos C57Bl/6 submetidos à dieta normolipídica ou dieta hiperlipídica. Os camundongos alimentados com dieta normolipídica foram tratados com TBTC – diluído na água de beber, nas concentrações de 1, 5, ou 25 μg/Kg, e apresentaram tendência de maior ganho de massa corporal com o tratamento de TBTC na concentração de 5 μg/kg. Os animais alimentados com a dieta hiperlipídica e induzidos à hiperglicemia foram tratados com rosiglitazona 10 mg/Kg ou GQ-16 40 mg/Kg (ambos compostos sensibilizantes de insulina), ou TBTC nas concentrações de 1 ou 5 μg/kg. Os animais tratados com rosiglitazona e GQ-16 apresentaram os níveis glicêmicos reduzidos, porém o mesmo não foi observado para os animais tratados com TBTC. Não houve diferença estatística significante entre os grupos no que se refere às massas do tecido adiposo branco e ao consumo de água e dieta, tanto nos animais alimentados com a dieta normolipídica quanto hiperlipídica. No tecido adiposo marrom dos animais alimentados com a dieta hiperlipídica, o grupo tratado com rosiglitazona apresentou um aumento na massa enquanto o grupo tratado com GQ-16 apresentou uma redução na massa quando comparados ao controle. Neste mesmo tecido, rosiglitazona e TBTC 5 μg/kg, na análise morfológica, mostraram um maior acúmulo de lipídios. Também foi observado no tecido hepático dos animais alimentados com dieta hiperlipídica, uma maior quantidade de gotas lipídicas nos hepatócitos dos grupos tratados com rosiglitazona e TBTC 5 μg/Kg. Estes resultados sugerem que o TBTC na concentração de 5 μg/kg pode induzir esteatose hepática em camundongos C57Bl/6. / Obesity affects large part of the world's population, becoming a risk factor for diseases such as hypertension, cardiovascular disease and type 2 diabetes. In addition to diet, genetic factors and lifestyle, obesity may be associated with exposure of chemical pollutants, capable of functioning as endocrine disrupters (ED). Tributyltin chloride (TBTC) characterized as ED can activate nuclear receptors PPARy and RXR, promoting adipogenesis. In this context, this study investigated the direct effects of TBTC on the metabolism of C57Bl/6 mice submitted to the normolipid diet or hyperlipidic diet. The mice fed a normolipid diet were treated with TBTC - diluted in the drinking water - at concentrations 1, 5, or 25 μg/Kg, showing a trend of greater body mass gain with TBTC treatment at 5 μg/Kg. Animals fed with hyperlipidemic diet and hyperglycemia-induced were treated with rosiglitazone 10 mg / kg or GQ-16 40 mg/Kg (both insulin sensitizing compounds), or TBTC at concentrations of 1 or 5 μg / kg. Animals treated with rosiglitazone and GQ-16 had reduced glycemic levels, but this was not observed for the animals treated with TBTC. There was no statistically significant difference between the groups related with the masses of white adipose tissue and the consumption of water and diet, both in animals fed with normolipid diet and hyperlipid. In brown adipose tissue of the animals fed with hyperlipid diet, the rosiglitazone group showed a mass increase while the group treated with GQ-16 presented a mass reduction when compared to the control. In this same tissue, rosiglitazone and TBTC 5 μg / kg in the morphological analysis, showed a greater lipid accumulation. A higher amount of lipid droplets in the hepatocytes of the rosiglitazone and TBTC 5 μg / kg treated groups, was also observed in the hepatic tissue of the animals fed with hyperlipid diet. These results suggest that TBTC at 5 μg / kg concentration may induce hepatic steatosis in C57Bl / 6 mice.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-02T21:31:07Z No. of bitstreams: 1 2017_RilvaGrigórioPinhoSoares_Parcial.pdf: 1974750 bytes, checksum: c82423d41fe8c42186f2c33214461f19 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-06T21:12:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RilvaGrigórioPinhoSoares_Parcial.pdf: 1974750 bytes, checksum: c82423d41fe8c42186f2c33214461f19 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-06T21:12:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RilvaGrigórioPinhoSoares_Parcial.pdf: 1974750 bytes, checksum: c82423d41fe8c42186f2c33214461f19 (MD5) Previous issue date: 2017-10-06 / O hormônio tireoideano (HT) regula a transcrição de redes complexas de genes e controlam diversos aspectos do desenvolvimento em humanos. Seus efeitos são mediados pelos receptores do hormônio tireoideano (TR), que são fatores de transcrição que se ligam ao DNA, em regiões denominadas de elementos responsivos ao TR (TRE), regulando positivamente e negativamente a transcrição. Comparação entre a isoforma alfa 1 (TRα1) e beta 1 (TRβ1) indicam que, com exceção do domínio N-terminal (NTD), estas isoformas possuem alta homologia em sua estrutura primária, especificamente 85% no domínio de ligação ao DNA (DBD), 64% na Hinge e 84% no domínio de ligação ao ligante (LBD). Dos 370 aminoácidos (aa) que compõem o DBD, Hinge e LBD, apenas 61 aa os tornam diferentes entre si, dos quais 17 aa estão localizados no DBD, 04 aa na Hinge e 40 aa no LBD. Ainda, o que difere TRβ1 da isoforma beta 2 (TRβ2) é somente o domínio NTD. Apesar de possuírem alta homologia de sequência, evidências bioquímicas mostram que essas isoformas desempenham papéis específicos ao mediar a ação dos HT. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos de cada domínio das isoformas TRα1 e TRβ1 e TRβ2 na atividade transcricional do TR, fazendo a correlação entre os diferentes domínios e sua função em TRE positivamente e negativamente regulados, F2 e TSHA, respectivamente. Para tanto, foram utilizadas 11 construções de quimeras contendo sequências alternadas das regiões dos domínios NTD, DBD e LBD de TRα1, TRβ1 e TRβ2 e 2 construções de deleções do NTD de TRα1 e TRβ1. Transfecções e ensaios de gene repórter foram realizados para estudar o papel dos diferentes domínios. A atividade transcricional das quimeras mostrou os efeitos dos domínios na ativação e repressão. Em F2, o NTD de TRβ2 mostrou ser responsável por maior ativação. Os resultados sugeriram ainda um sinergismo entre DBD de TRα1 e LBD de TRβ1, que pôde ser observado tanto na presença como na ausência de T3. Tanto o NTD de TRα1 quanto o de TRβ1 parecem inibir a ativação. O LBD de TRα1 parece exercer importante papel repressor, sugerindo que este possa ser o domínio responsável por TRα1 apresentar menor ativação que TRβ1, enquanto o LBD de TRβ1 parece ser o responsável por sua maior ativação. Em TSHA, observou-se sinergismo entre DBD de TRβ1 e LBD de TRα1, diferente daquele observado em F2. As maiores repressões foram observadas nas quimeras que apresentavam LBD de TRβ1 e DBD de TRα1, sugerindo que estes interagem sinergisticamente entre si. As maiores respostas de ativação independente do ligante ocorreram nas quimeras com a presença de qualquer um dos domínios de TRα1. Nestes, contudo, os NTDs do TRα1 e TRβ1 exerceram papeis distintos. Assim, o NTD de TRβ1 atua na ativação independente do ligante e na repressão dependente do ligante, enquanto o NTD de TRα1 não parece exercer influência em ambas as condições. Em conclusão, a relação entre os domínios observada na atividade transcricional do TR é de fundamental importância para a compreensão das características funcionais das isoformas do TR. O uso das quimeras poderá ser uma ferramenta importante para auxiliar na compreensão da ação do TR em promotores naturais, e no desenvolvimento de tiromiméticos seletivos. / Thyroid hormone (HT) regulates the transcription of complex gene networks and controls various aspects of development in humans. Its effects are mediated by thyroid hormone receptors (TRs), which are transcription factors that bind to DNA, in regions called TR-responsive elements (TRE), regulating the transcription in positively and negatively ways. Comparison between TRα1 and TRβ1 isoforms indicates that, except for the N-terminal domain (NTD), these isoforms present high homology in its primary structure, specifically 85% in the DNA binding domain (DBD), 64% in the Hinge domain and 84% in the ligand binding domain (LBD). Among the 370 amino acids (aa) only 61aa differed from each other, 17aa in DBD, 4aa in Hinge, and 40aa in LBD. Further, what differs from TRβ1 of the β2 isoform (TRβ2) is only the NTD domain. Despite this high homology, biochemical evidence shows that they exert isoform specific roles in mediating the action of HT. The aim of this study was to investigate the effects of each domain of TRα1 e TRβ1 e TRβ2 on TR transcriptional activity, correlating the different domains to transcription activity function on positively and negatively regulated TREs, F2 and TSHA, respectively. For this, 11 constructions of chimeras which contained alternate sequences of the NTD, DBD, and LBD of TRα1, TRβ1 and TRβ2 and 2 constructions of NTD deletions of TRα1 and TRβ1 were used. Transfections and reporter gene assays were carried out to study the role of different domains. Transcriptional activity of chymeras showed the effects of the different domains on activation and repression. In F2, TRβ2-NTD showed the highest transcriptional activation. The results also suggested a synergism between TRα1-DBD and TRβ1-LBD that could be observed in the presence and absence of T3. The NTD of TRα1 and TRβ1 appears to inhibit activation. TRα1-LBD seems to play an important repressor role, suggesting that it may be the domain responsible for the lower activation exhibited by TRα1 to in comparison to TRβ1, whereas TRβ1-LBD seems to be responsible for its higher activation. In TSHA, synergism was observed between TRβ1-DBD and TRα1-LBD, different from that observed in F2. The major values obtained for repression were observed in the chymeras which contained TRβ1-LBD and TRα1-DBD, suggesting that they synergistically interact with each other. The highest ligand-independent activation responses occurred in the chimeras which contained any of the TRα1 domains. In these, however, the NTDs of TRα1 and TRβ1 played different roles. Thus, TRβ1-NTD acts on ligand-independent activation and binding-dependent repression, whereas NTD-α does not appear to exert influence on both conditions. In conclusion, the relationship between TR domains and its effect on the transcriptional activity of TR are of fundamental importance for understanding the functional characteristics of TR isoforms. The use of chimeras may be an important tool to aid in the understanding of TR action in natural promoters, and in the development of selective thyromimetics.

Os receptores nucleares compreendem uma superfamília de proteínas intracelulares reguladas relacionados estruturalmente, capazes de reconhecer sequências específicas de DNA e regulam a transcrição de genes alvos respondendo a sinais metabólicos, hormônios e outras moléculas regulatórias integrando muitas vias de sinalização. Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) são receptores nucleares que regem a transcrição de vários genes envolvidos principalmente no metabolismo de ácidos graxos e energia. A ativação do PPARY possui um amplo aspecto de funções biológicas, regulando o metabolismo, reduzindo a inflamação, influenciando o equilíbrio das células imunes, inibindo a apoptose e o estresse oxidativo e melhorando a função endotelial. Estes efeitos parecem ser benéficos não apenas em diabetes e aterosclerose, mas também em várias outras condições. Os agonistas do PPARY são utilizados como sensibilizadores de insulina para o tratamento da diabetes II, sendo um alvo molecular dos fármacos tiazolidinadionas. Diversos efeitos colaterais severos associados ao uso dos fármacos desta classe e à importância do PPARY no metabolismo de glicose e na sensibilização da insulina, o presente trabalho justifica-se como um esforço para avançar na compreensão da interação entre ligantes sintéticos com o receptor PPARY e a proposição de moléculas mais seguras e mais eficazes para a manutenção de níveis euglicêmicos. Foi realizada a expressão, a purificação, seguida de estudos cristalográficos em cinco ligantes selecionados a partir de etapas de docking realizados anteriormente pelo nosso grupo de Biotecnologia Molecular do Instituto de Física de São Carlos. Os ensaios de cristalização do PPARY complexado a ligantes sintéticos resultaram em duas estruturas cristalográficas que apresentaram uma conformação em que os ligantes não interagiram diretamente na hélice 12 como descritos para agonistas totais do PPARY, adotando características de agonistas parciais. Esses ligantes apresentaram interações hidrofóbicas que estabilizam as fitas-β. Este conjunto de informações estruturais apresentados neste trabalho para o PPARY proporcionou um entendimento das interações que esse receptor é capaz de fazer na presença de um ligante, além de que poderão ser úteis no desenvolvimento de novos moduladores seletivos do PPARY semelhante ao que já se encontram no mercado, porém com efeitos colaterais reduzidos. / Nuclear receptors comprise a superfamily of structurally-related regulated intracellular proteins capable of recognizing specific DNA sequences and regulating the transcription of target genes responding to metabolic signals, hormones and other regulatory molecules integrating many signaling pathways. Peroxisome proliferator-activating receptors (PPARs) are nuclear receptors that govern the transcription of several genes involved primarily in fatty acid and energy metabolism. Activation of PPARY has a broad aspect of biological functions, regulating metabolism, reducing inflammation, influencing immune cell balance, inhibiting apoptosis and oxidative stress, and improving endothelial function. These effects appear to be beneficial not only in diabetes and atherosclerosis, but also in several other conditions. PPARY agonists are used as insulin sensitizers for the treatment of diabetes II, being a molecular target of the thiazolidinediones drugs. A number of severe side effects associated with the use of drugs of this class and the importance of PPARY in glucose metabolism and insulin sensitization, the present work is justified as an effort to advance the understanding of the interaction between synthetic ligands with the PPARY receptor and proposing safer and more effective molecules for the maintenance of euglycemic levels. The expression, purification, followed by crystallographic studies in five ligands selected from docking steps previously performed by our Molecular Biotechnology group of the Physics Institute of São Carlos. The crystallization assays of PPARY complexed to synthetic ligands resulted in two crystallographic structures that exhibited a conformation in which the ligands did not interact directly in helix 12 as described for total PPARY agonists, adopting characteristics of partial agonists. These ligands showed hydrophobic interactions that stabilize the β-ribbons. This set of structural information presented in this work for the PPARY was of great value for the understanding of the interactions that this receptor is able to make in the presence of a ligand, besides that they could be useful in the development of new selective modulators of the PPARY similar to that are already on the market, but with reduced side effects.

O espalhamento de raios X a baixo ângulo tem se mostrado uma poderosa ferramenta na ánalise estrutural de proteínas em solução. Estudos em condições próximas ao estado nativo podem ser realizados, permitindo a visualização tridimensional de proteínas ou complexos formados. A tese apresentada aborda a teoria envolvida para utilização desta ferramenta. Uma nova metodologia foi proposta para a determinação da massa molecular de proteínas em solução, utilizando apenas uma curva de SAXS em unidades arbitrárias, visto que até o momento, este procedimento era realizado em comparação com outra proteína padrão de peso molecular conhecido. Com relação à instrumentação científica, um equipamento de SAXS foi desenvolvido no Instituto de Física de São Carlos, permitindo agora que medidas de SAXS em proteínas em solução sejam realizadas no instituto. Clonagem, expressão e purificação foram realizadas para o domínio de ligação ao DNA da isoforma do receptor tireoideano humano, a caracterização experimental desta proteína foi realizada por anisotropia de fluorescência, crosslink e SAXS. Após formação do complexo DNA-proteína, F2-DBD hTR, o mesmo foi submetido a cristalização, os cristais obtidos para o complexo não apresentaram padrão de difração e modelos de baixa resolução foram gerados utilizando SAXS. Além disso, estudos de baixo ângulo foram realizados linha de SAXS do LNLS para a enzima ferredoxina redutase de leptospira interrogans e para o complexo formado por interleucina-22 e pelo receptor interleucina-22, sendo seus modelos tridimensionais resolvidos. / Small angle X-ray scattering has been proven to be a powerful tool in the structural analysis of proteins in solution. This technique permits the three-dimensional visualization of native proteins envelop at the level of nanometers. In this study we discuss the small angle X-ray scattering theory and we proposed a new methodology to determine the molecular weight of proteins in solution, using only SAXS curve in arbitrary units. Prior the development of this method, the proteins molecular weighs were calculated by comparison with another of known size, usually bovine serum albumin. We also assembled SAXS equipment at the Physics Institute of São Carlos, which will permits in house measurements; as well as the cloning, expression and purification of DBD hTR, followed by the characterization of this protein by fluorescence anisotropy, crosslink and SAXS. The DNA-protein complex, F2-DBD hTR, was subjected to crystallization assays. Although, the crystals obtained for the complex showed no pattern of diffraction we were able to generate low-resolution models for the F2-DBD hTR using SAXS analysis. Moreover, the studies of the protein LepFNR and the complex IL-22/IL-22R1 by small angle X-ray scattering were performed in the line of SAXS of the LNLS, and their threedimensional models were resolved

Foi definido que elementos regulatórios da expressão atrial-específica do promotor da SMyHC3 estão contidos em um elemento complexo de resposta a receptores nucleares (ECRRN). Ensaios de transativação celular indicam que alguns receptores nucleares se ligam nesta região. A partir destes ensaios verificamos a ativação do promotor por um receptor nuclear, o COUP-TFII. Ele regula muitos processos biológicos, como angiogênese e o próprio desenvolvimento atrial. Através da deleção do ECRRN observamos que o promotor não era ativado por COUP-TFII, indicando a sua ligação nessa região. Verificamos ainda que somente o domínio de ligação ao ligante do COUP-TFII é capaz de ativar o promotor, sugerindo a necessidade de uma interação com outros RNs para ativar o promotor. Uma análise proteômica indica que a maioria dos interactores de COUP-TFII está relacionada com complexos reguladores da transcrição e com a via de sinalização do receptor de andrógenos (AR). Ensaios de transativação celular mostram que juntos, COUP-TFII e AR, são capazes de aumentar a ativação do promotor. / It was determined that regulatory elements of the atrial-specific expression of the promoter SMyHC3 are contained in a complex nuclear receptor response element (CNRRE). Cellular transactivation assays indicated certain nuclear receptors (NR) can bind in this region. From these trials, was observed the promoter activation by a nuclear receptor, COUP-TFII. It regulates many biological processes such as angiogenesis and atrial development. Deletion of CNRRE resulted in no activation of the promoter by COUP-TFII, indicating their connection in this region. We also verified that only the ligand binding domain of COUP-TFII is able to activate the promoter, suggesting interaction with other NRs to activate it. A proteomic analysis revealed that most of COUP-TFII partners relates to complexes of transcription regulators and the androgen receptor (AR) signaling pathway. Cell transactivation assays showed that together, COUP - TFII and AR, are able to increase promoter activation.

Os receptores nucleares constituem uma superfamília de fatores de transcrição regulados pela interação com hormônios. Esta superfamília inclui, por exemplo, os receptores de hormônio tireoidiano, estrogênio, androgênio, glicocorticóide e mineralocorticóide. Neste trabalho, empregamos técnicas de biologia estrutura e bioinformática para estudar as interações entre alguns dos membros da família de receptores nucleares e seus respectivos ligantes. Para o receptor de hormônio tireoidiano, foi demonstrado, através da análise das estruturas cristalográficas das duas isoformas do receptor ligados aos tiromimético Triac, que os componentes entálpicos visíveis nas estruturas não explicam a seletividade do ligante. Dados de dinâmica molecular confirmaram que a seletividade do hormônio tem um importante componente entrópico. Empregando a técnica de dinâmica molecular, estudamos a ligação do receptor de mineralocorticóide humano à aldosterona, ao cortisol, à espironolactona e à cortisona e simulamos ainda o efeito da mutação S810L, conhecida por converter a atividade antagonista da cortisona e da espironolactona em agonista. A análise das simulações revelou um perfil de ligações de hidrogênio similar na ligação do receptor selvagem ao cortisol e à aldosterona. A cortisona perde, por conta da inserção de uma hidroxila na posição 11, uma ligação de hidrogênio importante com a Asn770 e, por isso, tem menor energia potencial de ligação. A espironolactona perde a mesma ligação de hidrogênio ao mesmo tempo em que aumenta o número de contatos de van der Waals pela inserção do grupo tioacetil na posição 7. A mutação S810L simulada no complexo com cortisona, cortisol e espironolactona não interfere no padrão de ligações de hidrogênio estabelecidas entre o receptor e os ligantes, mas altera a mobilidade de uma das regiões propostas como rota de dissociação. Propomos, portanto, que a mutação interfere na cinética de dissociação dos ligantes e não no padrão de interações estabelecidas no equilíbrio. Simulações de dissociação induzida do ligante confirmam esta proposição. Na última etapa, utilizamos os modelos experimentalmente determinados para o receptor ativado por proliferadores peroxissomais gama para a busca de novos ligantes através da técnica de docking molecular. Neste trabalho, utilizamos uma base de dados com aproximadamente um milhão de compostos. Destes, quatro foram selecionados após o docking molecular e testados experimentalmente. Um dos compostos testados se mostrou ativo neste receptor, apresentando uma atividade de 60-70% da atividade da rosiglitazona, conhecido agonista total do PPARg. / Nuclear receptors are a superfamily of hormone-regulated transcriptional factors. This superfamily includes, for example, the receptor for thyroid hormone, estrogen, androgen, gluco and mineralocorticoid. In this work, we used structural biology and bioinformatic tools to study the interactions between some members of the nuclear receptor superfamily and its respective ligands. We showed by the analysis of the crystal structures of both thyroid hormone receptor isoforms bound to the thyromimetic Triac that the enthalpic components visible in the structures do not explain the ligand selectivity. Molecular dynamics simulation data confirmed later that the hormone selectivity has an important entropic component. Using the molecular dynamics simulation, we studied, in a second stage, the interaction between the human mineralocorticoid receptor bound to aldosterone, cortisol, spironolactone and cortisone and also simulated the effects of the mutations S810L, known to convert the antagonist properties of spironolactone and cortisone in an agonist activity. The analysis of the simulations showed a similar profile in hydrogen bonds established between the wild type receptor bound to cortisol and aldosterone. Cortisone looses an important hydrogen bond with Asn770 because of the insertion of a carbonyl group in the 11 position and shows a decreased binding potential energy. Spironolactone loses the same interaction but has an increased number of van der Waals contacts because of the insertion of a tioacetyl group in the 7 position. The mutant S810L simulated in complex with cortisol, cortisone and spironolactone showed that the mutation do not interfere with the hydrogen bond profile established between the receptor and the ligands but changes the mobility of a region in the receptor previously proposed as a ligand dissociation route. Ligand unbinding simulations through steered molecular dynamics (SMD) confirm that aldosterone and cortisol unbind differentially and the mutation S810L alters the unbinding profile. We then propose that the mutation changes the kinetics of ligand association/dissociation without changing the profile of the interactions established in the equilibrium. In the last stage, we used the experimentally determined structural model of the peroxissome proliferator-activated receptor gamma to search for novel ligands using the molecular docking technique. For this work, we used a database containing about 1 million compounds. Among those, four compounds were selected after the docking computation and experimentally tested. One of these compounds was found to be active in the receptor, showing about 60-70% of the agonistic activity of rosiglitzone, a known PPARg total agonist.

Os receptores nucleares compreendem uma superfamília de proteínas intracelulares reguladas relacionados estruturalmente, capazes de reconhecer sequências específicas de DNA e regulam a transcrição de genes alvos respondendo a sinais metabólicos, hormônios e outras moléculas regulatórias integrando muitas vias de sinalização. Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) são receptores nucleares que regem a transcrição de vários genes envolvidos principalmente no metabolismo de ácidos graxos e energia. A ativação do PPARY possui um amplo aspecto de funções biológicas, regulando o metabolismo, reduzindo a inflamação, influenciando o equilíbrio das células imunes, inibindo a apoptose e o estresse oxidativo e melhorando a função endotelial. Estes efeitos parecem ser benéficos não apenas em diabetes e aterosclerose, mas também em várias outras condições. Os agonistas do PPARY são utilizados como sensibilizadores de insulina para o tratamento da diabetes II, sendo um alvo molecular dos fármacos tiazolidinadionas. Diversos efeitos colaterais severos associados ao uso dos fármacos desta classe e à importância do PPARY no metabolismo de glicose e na sensibilização da insulina, o presente trabalho justifica-se como um esforço para avançar na compreensão da interação entre ligantes sintéticos com o receptor PPARY e a proposição de moléculas mais seguras e mais eficazes para a manutenção de níveis euglicêmicos. Foi realizada a expressão, a purificação, seguida de estudos cristalográficos em cinco ligantes selecionados a partir de etapas de docking realizados anteriormente pelo nosso grupo de Biotecnologia Molecular do Instituto de Física de São Carlos. Os ensaios de cristalização do PPARY complexado a ligantes sintéticos resultaram em duas estruturas cristalográficas que apresentaram uma conformação em que os ligantes não interagiram diretamente na hélice 12 como descritos para agonistas totais do PPARY, adotando características de agonistas parciais. Esses ligantes apresentaram interações hidrofóbicas que estabilizam as fitas-β. Este conjunto de informações estruturais apresentados neste trabalho para o PPARY proporcionou um entendimento das interações que esse receptor é capaz de fazer na presença de um ligante, além de que poderão ser úteis no desenvolvimento de novos moduladores seletivos do PPARY semelhante ao que já se encontram no mercado, porém com efeitos colaterais reduzidos. / Nuclear receptors comprise a superfamily of structurally-related regulated intracellular proteins capable of recognizing specific DNA sequences and regulating the transcription of target genes responding to metabolic signals, hormones and other regulatory molecules integrating many signaling pathways. Peroxisome proliferator-activating receptors (PPARs) are nuclear receptors that govern the transcription of several genes involved primarily in fatty acid and energy metabolism. Activation of PPARY has a broad aspect of biological functions, regulating metabolism, reducing inflammation, influencing immune cell balance, inhibiting apoptosis and oxidative stress, and improving endothelial function. These effects appear to be beneficial not only in diabetes and atherosclerosis, but also in several other conditions. PPARY agonists are used as insulin sensitizers for the treatment of diabetes II, being a molecular target of the thiazolidinediones drugs. A number of severe side effects associated with the use of drugs of this class and the importance of PPARY in glucose metabolism and insulin sensitization, the present work is justified as an effort to advance the understanding of the interaction between synthetic ligands with the PPARY receptor and proposing safer and more effective molecules for the maintenance of euglycemic levels. The expression, purification, followed by crystallographic studies in five ligands selected from docking steps previously performed by our Molecular Biotechnology group of the Physics Institute of São Carlos. The crystallization assays of PPARY complexed to synthetic ligands resulted in two crystallographic structures that exhibited a conformation in which the ligands did not interact directly in helix 12 as described for total PPARY agonists, adopting characteristics of partial agonists. These ligands showed hydrophobic interactions that stabilize the β-ribbons. This set of structural information presented in this work for the PPARY was of great value for the understanding of the interactions that this receptor is able to make in the presence of a ligand, besides that they could be useful in the development of new selective modulators of the PPARY similar to that are already on the market, but with reduced side effects.

Los sensores y dispositivos basados en nanomateriales ofrecen ventajas que se derivan de su tamaño nanométrico y de las propiedades que los identifican, lográndose bajar en muchos casos los límites de detección, con tiempos más cortos de análisis y sin necesidad de pretratamientos de las muestras. En la presente tesis se desarrolla un transistor efecto campo basado en nanotubos de carbono (CNTFET) para la detección del bisfenol A (BFA) (compuesto xenobiótico) en agua. Por primera vez se usa un receptor nuclear, el receptor de estrógenos alfa (RE-α) para la funcionalización de los nanotubos de carbono de pared sencilla (SWCNTs), debido a la gran afinidad del RE-α y los compuestos xenobióticos. De esta manera se obtiene un biosensor que transforma la interacción selectiva biomolécula-analito en una señal eléctrica cuantificable, permitiendo detecciones de BFA por debajo de la dosis de referencia y de los límites de detección obtenidos por otros métodos de detección, con muy bajos tiempos de análisis (0.5 - 2 minutos). / Sensors and devices based on nanomaterials have advantages arising from their nanometric size and the properties that identify them, resulting in many cases in lower limits of detection, shorter times of analysis and the need for no pretreatment of samples. This thesis shows the development of a field effect transistor based on carbon nanotubes (CNTFET) for the detection of bisphenol A (BFA) (a xenobiotic compound) in water. For the first time we used a nuclear receptor, the estrogen receptor alpha (ER-α) for the functionalization of single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) due to the high affinity of ER-α and xenobiotic compounds. We obtained a biosensor that transforms the selective interaction biomolecule-analyte in a measurable electrical signal, allowing detection of BFA below the reference dose and with lower detection limits than other detection methods in the literature, with very low time of analysis (0.5 - 2 minutes).

Os receptores nucleares constituem uma superfamília de fatores de transcrição regulados pela interação com hormônios. Esta superfamília inclui, por exemplo, os receptores de hormônio tireoidiano, estrogênio, androgênio, glicocorticóide e mineralocorticóide. Neste trabalho, empregamos técnicas de biologia estrutura e bioinformática para estudar as interações entre alguns dos membros da família de receptores nucleares e seus respectivos ligantes. Para o receptor de hormônio tireoidiano, foi demonstrado, através da análise das estruturas cristalográficas das duas isoformas do receptor ligados aos tiromimético Triac, que os componentes entálpicos visíveis nas estruturas não explicam a seletividade do ligante. Dados de dinâmica molecular confirmaram que a seletividade do hormônio tem um importante componente entrópico. Empregando a técnica de dinâmica molecular, estudamos a ligação do receptor de mineralocorticóide humano à aldosterona, ao cortisol, à espironolactona e à cortisona e simulamos ainda o efeito da mutação S810L, conhecida por converter a atividade antagonista da cortisona e da espironolactona em agonista. A análise das simulações revelou um perfil de ligações de hidrogênio similar na ligação do receptor selvagem ao cortisol e à aldosterona. A cortisona perde, por conta da inserção de uma hidroxila na posição 11, uma ligação de hidrogênio importante com a Asn770 e, por isso, tem menor energia potencial de ligação. A espironolactona perde a mesma ligação de hidrogênio ao mesmo tempo em que aumenta o número de contatos de van der Waals pela inserção do grupo tioacetil na posição 7. A mutação S810L simulada no complexo com cortisona, cortisol e espironolactona não interfere no padrão de ligações de hidrogênio estabelecidas entre o receptor e os ligantes, mas altera a mobilidade de uma das regiões propostas como rota de dissociação. Propomos, portanto, que a mutação interfere na cinética de dissociação dos ligantes e não no padrão de interações estabelecidas no equilíbrio. Simulações de dissociação induzida do ligante confirmam esta proposição. Na última etapa, utilizamos os modelos experimentalmente determinados para o receptor ativado por proliferadores peroxissomais gama para a busca de novos ligantes através da técnica de docking molecular. Neste trabalho, utilizamos uma base de dados com aproximadamente um milhão de compostos. Destes, quatro foram selecionados após o docking molecular e testados experimentalmente. Um dos compostos testados se mostrou ativo neste receptor, apresentando uma atividade de 60-70% da atividade da rosiglitazona, conhecido agonista total do PPARg. / Nuclear receptors are a superfamily of hormone-regulated transcriptional factors. This superfamily includes, for example, the receptor for thyroid hormone, estrogen, androgen, gluco and mineralocorticoid. In this work, we used structural biology and bioinformatic tools to study the interactions between some members of the nuclear receptor superfamily and its respective ligands. We showed by the analysis of the crystal structures of both thyroid hormone receptor isoforms bound to the thyromimetic Triac that the enthalpic components visible in the structures do not explain the ligand selectivity. Molecular dynamics simulation data confirmed later that the hormone selectivity has an important entropic component. Using the molecular dynamics simulation, we studied, in a second stage, the interaction between the human mineralocorticoid receptor bound to aldosterone, cortisol, spironolactone and cortisone and also simulated the effects of the mutations S810L, known to convert the antagonist properties of spironolactone and cortisone in an agonist activity. The analysis of the simulations showed a similar profile in hydrogen bonds established between the wild type receptor bound to cortisol and aldosterone. Cortisone looses an important hydrogen bond with Asn770 because of the insertion of a carbonyl group in the 11 position and shows a decreased binding potential energy. Spironolactone loses the same interaction but has an increased number of van der Waals contacts because of the insertion of a tioacetyl group in the 7 position. The mutant S810L simulated in complex with cortisol, cortisone and spironolactone showed that the mutation do not interfere with the hydrogen bond profile established between the receptor and the ligands but changes the mobility of a region in the receptor previously proposed as a ligand dissociation route. Ligand unbinding simulations through steered molecular dynamics (SMD) confirm that aldosterone and cortisol unbind differentially and the mutation S810L alters the unbinding profile. We then propose that the mutation changes the kinetics of ligand association/dissociation without changing the profile of the interactions established in the equilibrium. In the last stage, we used the experimentally determined structural model of the peroxissome proliferator-activated receptor gamma to search for novel ligands using the molecular docking technique. For this work, we used a database containing about 1 million compounds. Among those, four compounds were selected after the docking computation and experimentally tested. One of these compounds was found to be active in the receptor, showing about 60-70% of the agonistic activity of rosiglitzone, a known PPARg total agonist.